Imaging Ca^{2 +} svar under Shigella infektionen af epitelceller

Summary

Vi præsenterer her, protokoller for at visualisere calcium (Ca^{2 +}) svar fremkaldes ved HeLa celler inficeret af Shigella. Ved at optimere parametre af bakteriel infektion og imaging med Ca^{2 +} fluorescerende sonder, er atypiske globale og lokale Ca^{2 +} signaler fremkaldt af bakterier over en lang række infektion kinetik karakteriseret.

Abstract

Ca^{2 +} er en allestedsnærværende ion involveret i alle kendte cellulære processer. Mens globale Ca^{2 +} svar kan påvirke celle skæbne, regulere lokale variationer i gratis Ca^{2 +} cytosole koncentrationer, knyttet til at frigive fra interne butikker eller en tilstrømning gennem plasmamembran kanaler, kortikale celle processer. Patogener, overholde eller invadere vært celler udløser en reorganisering af actin cytoskelettet underliggende vært plasmamembran, som sandsynligvis påvirker både globale og lokale Ca^{2 +} signalering. Fordi disse begivenheder kan forekomme ved lave frekvenser i et pseudo stokastiske måde over udvidede kinetik, rejser analyse af Ca^{2 +} signaler induceret af patogener store tekniske udfordringer, der skal løses.

Her rapporterer vi protokoller til påvisning af globale og lokale Ca^{2 +} signaler på en Shigella infektionen af epitelceller. I disse protokoller, artefakter knyttet til en langvarig eksponering og solskader tilknyttet excitation af Ca^{2 +} fluorescerende sonder er foretaget fejlfinding ved nøje at kontrollere parametrene erhvervelse over definerede perioder under en Shigella invasion. Procedurer er implementeret for at nøje analysere amplitude og frekvens af globale cytosole Ca^{2 +} signaler under udvidede infektion kinetik ved hjælp af kemiske sonden Fluo-4.

Introduction

Ca^{2 +} regulerer alle kendte celle processer, herunder cytoskeletal reorganisering, inflammatoriske respons og celle død veje relateret til vært-patogen interaktioner^1,2,3. Fysiologiske betingelser, basal cytosole Ca^{2 +} koncentrationerne er lave, i hundredvis af nM rækkevidde, men kan være udsat for forbigående stigninger på agonist stimulation. Disse variationer viser ofte oscillerende adfærd gennem handling af pumper og kanaler på plasma og endoplasmatiske reticulum membraner. Mønstret for disse svingninger er karakteriseret ved periode, varigheden og amplitude af Ca^{2 +} stiger, og er dekrypteret af celler, som igen udløser specifikke svar på hvad er kendt som den Ca^{2 +} kode^4,5 . En vedvarende stigning i det cytosole Ca^{2 +} koncentration patologiske betingelser kan føre til celledød er forbundet med permeabilization af mitokondrie membraner og udgivelsen af pro-apoptotiske eller nekrotisk faktorer^{6, 7}.

Shigella, det agens af dysenteri, invaderer epitelceller ved at indsprøjte effektorer i værtsceller ved hjælp af en type III sekretion system (T3SS)^8,9. Shigella invasion af værtsceller er forbundet med lokale og globale Ca^{2 +} signaler fremkaldes ved T3SS. Hvad angår poreformede toksiner, T3SS translocon, der indsættes i vært cellemembraner og er nødvendige for injektion af T3SS effektorer er sandsynligvis ansvarlige for aktivering af PLC og inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-afhængige Ca^{2 +} Release. Kombinationen af lokalisere PLC stimulering og ophobning af polymeriseret actin på lokaliteter af Shigella invasion resultatet i en atypisk langvarig InsP3-afhængige Ca^{2 +} frigive¹⁰. Type III effektor IpgD, en phosphatidylphosphatid 4,5 bisfosfat (PIP2) -4-fosfatase, begrænser den lokale mængde PIP2, derved kontrollere mængden af tilgængelig substrat for PLC til at generere InsP3, som bidrager til indkapsling af lokale Ca^{2 +} svar på bakteriel invasion websteder^11,12. Disse lokale Ca^{2 +} svar sandsynligvis bidrage til aktin polymerisering på Shigella invasion sites¹⁰. Globale Ca^{2 +} svar, der er også fremkaldes af Shigella, dog er undværes for bakteriel invasion proces men udløse åbningen af connexin hemichannels på plasma membran og udgivelsen af ATP i den ekstracellulære rum. Frigivne ATP handler på en paracrine måde, stimulerer til gengæld Ca^{2 +} oscillerende svar i celler ved siden af den inficerede celle. IpgD er også ansvarlige for udformningen af globale Ca^{2 +} svar i uregelmæssig isolerede svar med langsom dynamics. I sidste ende, efter en langvarig bakteriel infektion fører IpgD til hæmning af InsP3-medieret Ca^{2 +} signaler. Gennem sin interferens med Ca^{2 +} signalering, IpgD forsinker en Ca^{2 +}-afhængige calpain aktivering fører til afmontering af fokale vedhæftning strukturer og tidlig udstationering af inficerede celler¹³.

Mens Ca^{2 +} signaler er involveret i kritiske aspekter af patogenese, rejser anvendelse af en mikroorganisme en række tekniske udfordringer, der ikke er fundet i klassisk agonist undersøgelser. De protokoller er beskrevet bruger her den almindeligt anvendte fluorescerende Ca^{2 +} kemiske indikator Fluo-4, der vi manipuleret til at karakterisere lokale Ca^{2 +} signaler under en Shigella infektionen. Trin kritisk til påvisning af disse signaler er diskuteret, samt procedurer, der gennemføres for deres kvantitative analyser, der kræves til at karakterisere rollen af bakteriel effektorer i Ca^{2 +} signalering.

Protocol

1. præparater

1. Bakterier forberedelse
   1. Plade bakterier —Shigella vildtype stamme udtryk for AfaE adhesin (M90T-AfaE) — på en trypticase soja (TCS) agar plade indeholdende 0,01% Congo rød (CR) og dem der inkuberes i 18 timer ved 37 ° C.
      Bemærk: For at øge deres reproducerbarhed, Shigella plader fremstillet i trin 1.1.1 opbevares ved 4 ° C og bør anvendes inden for en uge, fordi alle kolonier på CR medium vil i sidste ende bliver røde over tid.
   2. Podes TCS bouillon før kultur ved at udvælge 3 røde kolonier fra streak plader.
      Bemærk: En podning med 3 kolonier er udført for at begrænse sandsynligheden for picking en enkelt klon hvis virulens plasmid har undergået en genetiske rekombination.
   3. Vokse flydende bakteriel kulturer i en rystende inkubator i 16 timer ved 37 ° C ved 200 rpm. Tilføje ampicillin i en endelig koncentration på 75 mg/mL. Antibiotikaet koncentrationer bør ikke overstige 3 x den minimale hæmmende koncentration, som et overskud af antibiotika kan føre til tab af store virulens plasmid.
      Bemærk: Vedligeholdelse af Shigella virulens plasmid skal verificeres ved plettering bakteriel kulturer på CR plader suppleres med passende antibiotikaet koncentrationer. Tilstedeværelsen af hvide kolonier angiver plasmid tab.
   4. Podes TCS kultur med pre bakteriekulturen ved 1: 100. Der inkuberes ved 37 ° C i en rystende inkubator i 2 timer ved 200 rpm. Sikre, at den optiske tæthed på 600 nm (OD_600nm) er 0,2 - 0,4.
   5. Centrifugeres bakteriekulturen for 2 min på 13.000 x g ved 21 ° C og resuspenderes i et tilsvarende volumen af EM medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 5 mM glukose og 25 mM HEPES pH = 7.3).
   6. Fortyndes den bakterielle suspension i en EM buffer på en endelige OD_600nm af 0,1 og bruge det samme eller gemme det ved 21 ° C og bruge det inden for de næste 60 min.
2. Celle forberedelse
   1. Kultur HeLa celler i DMEM med 1 g/L med glucose suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og dyrke dem ved 37 ° C med 10% CO₂. Vokse TC-7 dyrkes i DMEM med 4,5 g/L af glucose, der indeholder 10% FCS og ikke-essentielle aminosyrer i et 37 ° C inkubator som indeholder 10% CO₂.
   2. For celle vedligeholdelse, Opdel celler regelmæssigt for at undgå en vækst-kontakt hæmning knyttet til sammenflydende stater; Dette er kritisk for en høj Ca^{2 +} probe læsning/Transfektion effektivitet.
   3. Plade HeLa celler på sterile 25-mm diameter cirkulære coverslips i 6-godt plader med en tæthed på 3 x 10⁵ celler/brønd dagen før eksperimentet for HeLa celler.
   4. For TC-7 celler, trypsinize og tælle celler. Seed dem på 4 x 10⁵ celler/brønd og Inkuber dem 5-7 dage ved 37 ° C i en 10% CO₂-inkubator før eksperimenter til at tillade en polarisering.
      1. Opdater cellekulturmedium hver dag indtil dag i eksperimentet.
         Bemærk: Glas-bund 35-mm diameter engangs kamre kan også bruges som et alternativ til de coverslips-holdige brønde. Hvis sidstnævnte er brugt, temperaturkontrol via en opvarmet fase eller mål er ikke tilstrækkelige, og en termostat inkubation kammer monteret på er stadiet mikroskop påkrævet.
3. Dag i eksperimentet, fjerne medium og vaske cellerne 3 x med 1 mL EM medium på 21 ° C.
4. Indlæse celler med 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ i en EM buffer i 30 min. ved 21 ° C.
   Bemærk: Mens indlæsningen af sub sammenflydende HeLa celler ikke rejser større problemer, indlæsning af polariseret TC-7 celler er ofte heterogene og dårligt effektiv. For disse celler, fandt vi, at lastning effektivitet er forbedret ved tilsætning af sprede agenten — pluronic syre — i en endelig koncentration på 0,1% og af anion-transporter hæmmer bromosulfophtalein i en endelig koncentration på 20 µM til den Fluo-4-AM-holdige EM. Brugen af ratiometric kemiske sonder eller genetisk kodet-FRET sonder kræver dual-erhvervelse ikke er kompatibel med hastigheden af erhvervelse kræves til billeddannelse af lokale Ca^{2 +} svar.
5. Vaske prøver 3 x med EM buffer og yderligere Inkuber dem i 1 mL af EM buffer ved 21 ° C til hydrolyse af AM-gruppe. Brug Fluo-4 indlæst celler straks eller inden for de næste 90 min (opretholdt ved 21 ° C).

2. infektion og Image erhvervelse af lokale Ca^{2 +} svar

1. Placer coverslip med Fluo-4 indlæst celler i en billeddannelse kammer eller glas-bunden kammer. Vaske prøverne i den billeddiagnostiske afdeling eller glas-bund engangs kammer 3 x med EM buffer til at fjerne forbindelser potentielt som følge af celle lysering. Der tilsættes 1 mL af EM buffer.
2. Sted i salen på en inverteret fluorescens mikroskop scenen opvarmet på 33 ° C.
   Bemærk: Denne temperatur er valgt som et kompromis mellem de optimale temperaturer kompatibel med Shigella invasion proces og opbremsning af Ca^{2 +} svar at visualisere lokale svar. Vi bruger en 63 X nedsænkning olie mål (NA = 1,25) udstyret med fase kontrast ringe.
3. Vælg et felt, mikroskopi og konfigurere erhvervelse parametre, herunder eksponeringstid og udsmidningen om nødvendigt at optimere Fluo-4 fluorescerende signal.
   Bemærk: De største udfordringer for lokale Ca^{2 +} imaging er lav amplitude og små varigheden af svarene, der kræver erhvervelse mindst hver 30 ms. flere kommercielt tilgængelige back-belyste EM-CCD eller C-MOS kameraer præsentere de nødvendige sensitivitet til at opdage lokale Ca^{2 +} svar ved hjælp af Fluo-4. Påvisning følsomhed er også vigtigt at begrænse solskader eller artefakter som spontane reaktioner forbundet med fluorescerende excitation af Fluo-4 på en høj frekvens. Her, en LED-baseret belysning af 470 nm, med en 480 ± 40 nm båndpas excitation filter, et 505-nm dichroic filter og en 527 ± 30 nm båndpas emission anvendes på 5% af sin maksimal intensitet kombineret med en 1,0 neutralfiltre blev brugt til at minimere disse problemer under en strøm af erhvervelser af begrænset varighed. En analyse af lokale Ca^{2 +} signaler af partier af 120 s vandløb blev rutinemæssigt udført. På disse betingelser, lav belysning, blev fluorophore photobleaching ikke observeret under de 2 min.-stream erhvervelser. Successive anskaffelser på samme prøve kan udføres, forudsat at forskellige felter anvendes. Som en generel regel udføres en første erhvervelse stream på et kontrol felt i mangel af bakterier stimulation at sikre fravær af spontane reaktioner. Hvis spontane svar er observeret, vasket prøverne med EM buffer, indtil ingen svar er observeret.
4. For at tilføje bakterier til prøven, fjerne 500 µL af EM buffer fra salen og tilsættes 500 µL af bakteriel suspensionen forberedt i trin 1.1.6 at opnå en endelig OD_600nm på 0,05, med den passende omhu for at undgå at flytte feltet valgte mikroskopi. mængderne, der sikrer en ordentlig blanding af bakterier og en homogen fordeling af bakterier på celle prøver.
5. Udføre en erhvervelse ved bakteriel tilsætning. Alternativt kan du udføre en erhvervelse 10 min efter den bakterielle tillæg, der svarer til den nødvendige tid til bakterier til sediment på celler betingelser anvendes. For enden af erhvervelse stream erhverve en fase-kontrast billede af det markerede felt til at visualisere bakterier at kontakte cellerne og membran flæser forbundet med bakteriel invasion websteder.
6. Gentag erhvervelse procedure som i trin 2.5, med mellemrum, der er indstillet til varigheden af billede anskaffelser, filer besparelser og udvælgelse af et nyt felt til at dække hele processen.
   Bemærk: For Shigellafandt vi at erhvervelse vandløb hvert 5 min til 20 min, efter 10 min bakteriel sedimentering, lov til at dække størstedelen af hændelserne invasion.
7. I slutningen af proceduren for erhvervelse, tilføje en endelig koncentration på 2 µM af Ca^{2 +} ionophor ionomycin prøver at bestemme den maksimale amplitude af Ca^{2 +} signaler. Erhverve billeder hver 3-5 s indtil signal stabilisering, normalt i mindre end 10 minutter.
8. Følg ved at tilføje Ca^{2 +} chelator EGTA i en endelig koncentration på 10 mM til at bestemme fluorescens signal i mangel af Ca^{2 +}. Erhverve billeder hver 3-5 s indtil signal stabilisering, normalt i mindre end 10 minutter.
   Bemærk: På grund af den relativt langsomme dynamikken i de globale Ca^{2 +} variationer, udføre disse erhvervelser hvert 3-5 s (ikke i streaming-tilstand), giver mulighed for Ca^{2 +} imaging på samme mikroskopifeltets under de successive behandlinger.

3. analyse

1. Express cytosole Ca^{2 +} variationer over tid som procentdelen af ΔF/F₀, hvor ΔF repræsenterer en variation af gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af regionen af interesse (ROI) og F₀ baseline fluorescens i samme ROI, som en ikke-relevante region af feltet celler trækkes.
   1. Fjerne basal fluorescens niveauer for hver celle i forskellige felter, svarende til baseline niveauer; disse niveauer entydigt kan bestemmes på grund af lav frekvens og korte relativt varighed af lokale Ca^{2 +} svar i en given stream erhvervelse.
      Bemærk: Kvantificere slående træk ved de svar, relateret til de stillede spørgsmål og patogene model studerede. Klassisk, er forskellige parametre taget hensyn til at analysere Ca^{2 +} signaler, herunder hyppigheden af celler viser lokale eller globale Ca^{2 +} svar, samt varigheden, amplitude og frekvens af disse svar. Shigella og lokale svar er et andet vigtigt aspekt af analysen den rumlige sammenslutning af svarene med bakteriel invasion websteder.
2. For at kvantificere procentdelen af lydhør celler viser globale eller lokale svar, tegne ROIs i celler, i tidsserier svarende til variationer af Fluo-4 intensitet.
   1. Sæt strenge parametre til at identificere lokale Ca^{2 +} svar, som en amplitude på tredobbelt ovenstående baggrund variationer af den gennemsnitlige fluorescens intensitet celle basislinje, eller en varighed på mindst 200 ms, for at undgå scoring en falsk positiv.
      Bemærk: Som hovedregel selv små lokale Ca^{2 +} svar kan skelnes fra nogen baggrundsstøj på deres profil. ROIs bør være stor nok til at integrere nok fluorescens signaler at muliggøre påvisning af lokale variationer. Afhængigt af intensiteten af Fluo-4 detektion, kan disse ROIs svarer til cirkler med diametre spænder fra 2-5 mM.
   2. Måle variationer af den gennemsnitlige Fluo-4 fluorescens intensitet i 2 regioner i et særskilt område i den samme celle, til at afgøre, om svarene er lokal eller global.
      Bemærk: Analyse af et stort antal celler lettes ved hjælp af imaging software tillader on-line skærmvisningen af varianterne af den gennemsnitlige fluorescens intensitet over tid for de udvalgte regioner. Kommercielt tilgængelige billedbehandlingsprogrammer har sådan en mulighed, men dette kan også udføres ved hjælp af Icy freeware, ved hjælp af ROI intensitet Evolution plugin.
   3. Bestemme procentdelen af celler viser lokale svar.
      Bemærk: Denne procentdel er beregnet ud fra det samlede antal celler analyseres i feltet mikroskopi, som bør være i tilstrækkeligt antal til at støtte en statistisk betydning ved hjælp af en ikke-parametrisk test.
   4. Bestemme varigheden af de lokale reaktioner.
      Bemærk: Lokale Ca^{2 +} svar kan yderligere inddeles efter deres varighed intervaller (dvs. mindre end 500 ms, mellem 5 og 10 s eller over 10 s) og deres tilknytning til Shigella invasion websteder.
3. Kvantificere amplitude af svarene. Først, kalibrere de maksimal Ca^{2 +} og celle baggrundsværdier bestemmes som i trin 2.1.7. Da Fluo-4 belastning kan variere for hver celle, skal du udføre disse bestemmelser for enkelte celler i feltet.
   1. Express amplituden af svarene som en relative procentdel af maksimal respons.
   2. Udføre statistiske test ved hjælp af en normalitet test, efterfulgt af en parametrisk test til at analysere potentielle forskelle i amplitude af svarene mellem prøver.
   3. Bestemme sammenslutningen af disse svar i forhold til bakteriel invasion websteder ved deres respektive lokalisering til bakteriel-induceret membran flæser visualiseret i de tilsvarende fase kontrast billeder.

Representative Results

Shigella invasion er forbundet med atypiske langvarig lokale Ca^{2 +} svar:

Efter den protokol, der er nævnt ovenfor, Fluo-4-loaded HeLa celler blev udfordret med WT Shigella og stream opkøb blev udført for at analysere Ca^{2 +} signaler. En repræsentativ eksperiment er vist i figur 1, med time-lapse billeder serie af fluorescens-intensiteten af Fluo-4 sonden i gennemsnit i en region af interesse for en enkelt celle, og den tilsvarende fase kontrast billede (figur 1A, venstre panel). Shigella invasion site er karakteriseret ved membran flæser opdaget i fase kontrast billede (figur 1A, pil). Atypiske lokale øger i gratis cytosole Ca^{2 +} observeres på webstedet Shigella invasion med en varierende amplitude og varigheder spænder fra 2,5-5 s (tal 1A og 1B, pile), efterfulgt af globale stigninger i den inficerede celle (figur 1B, pilespidser).

Type III effektor IpgD regulerer overgangen fra lokal til global Ca^{2 +} svar induceret af Shigella i HeLa celler:

Analyse af Ca^{2 +} signaler induceret af vildtype Shigella og en isogene mutant stamme mangelfuld for typen III effektor IpgD, en phosphatidylphosphatid 4, 5 bisfosfat fosfatase, anført, at denne sidstnævnte stamme induceret mere globale og mindre atypiske lokale svar med lang varighed (RATPs) med 11,3 ± 4.4 (SEM) % og 40.3 ± 7,5 (SEM) % af celler reagerer med globale svar i tilfælde af en WT og ipgD mutant, henholdsvis (fig. 1 d)¹⁵. Denne ipgD mutant opnår lokale svar på et lignende frekvens som WT stamme.

Shigella hæmme InsP3-afhængige globale Ca^{2 +} øger i HeLa celler under langvarig infektion kinetik:

Billeddannelse af globale Ca^{2 +} svar over udvidede infektion kinetik pegede på et fald i hyppigheden af svar 30 min efter udfordring med vildtype Shigella (figur 2A). Et lignende fald i hyppigheden af Ca2 + Reaktionerne blev observeret i TC-7 celler inficeret i 30 min med vildtype Shigella¹⁵. Kvantificering af dosisafhængig celle svar til Ca^{2 +} agonist histamin illustrerer hæmning af en InsP3-afhængige Ca^{2 +} release på sene stadier af en Shigella infektionen. WT Shigella fører til atypiske isolerede Ca^{2 +} svar i løbet af de første 30 min af infektionen, og efter yderligere inkubation, et drastisk fald i amplitude og frekvens af Ca^{2 +} Reaktionerne blev observeret (figur 2B).

Figur 1 . Lokale og globale Ca^{2 +} svar under Shigella invasion. HeLa celler blev lastet med Fluo-4-AM og udfordret med WT Shigella. (A) panelet til venstre viser fase-kontrast billeder. Højre panel viser tidsserier af Fluo-4 fluorescens gennemsnitlige intensitet med farvekode afbildet til højre. Tid fra starten af erhvervelse angives i sekunder, 10 min efter den bakterielle udfordring. Pilen angiver invasion brændpunkter. Cirkler afbildet svare til regionerne analyseres i (B) hvor spor med den tilsvarende farve repræsenterer variationerne i Fluo-4 gennemsnitlige fluorescens intensitet over grundlinjen. Pilene angiver lokale svar. Pilespidserne angive globale svar. (C) Dette er en ordning, der skildrer fastlæggelse af varigheden af Ca^{2 +} svar. Den vandrette stiplede linje angiver de basale Ca^{2 +} niveauer (F₀); lodrette bjælker angiver baggrunden variationer. Den lodrette stiplede linje angiver den maksimal amplitude af svar; de vandrette søjler angiver varigheden af reaktion bestemmes ved halv-maksimal amplitude. (D) Dette er andelen af responderende celler ± SEM viser lokale svar og globale Ca^{2 +} svar induceret 5 min efter infektionen med WT Shigella (mørk grå barer) eller ipgD mutant (lys grå søjler). RATPs er lokale Ca2 + svar, der vare for mere end 5 s. N = 4; > 60 celler for hver gang. Wilcoxon test, *P < 0,05; P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 . Hæmning af globale Ca^{2 +} svar under udvidede kinetik af Shigella infektionen. (A) den øverste blå pile repræsenterer tidsskala for bakteriel og histamin udfordringen ved de angivne koncentrationer. Dette panel viser de repræsentative spor af enkelt celle globale Ca^{2 +} variationer efter infektionen fra WT Shigella (grøn) og ipgD mutant stamme (orange). (B) dette panel viser procentdelen af amplituden af Ca^{2 +} svar i forhold til den maksimale respons, efter en stimulation på 0,5 μM histamin i celler inficeret med de angivne stammer i 90 min. Den solide vandrette linje repræsenterer den gennemsnitlige maksimale procentdel. Wilcoxon test, **P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette manuskript beskriver den protokol, vi manipuleret til at følge lokale Ca^{2 +} signaler i den relativt korte kinetik af en Shigella invasion, samt global Ca^{2 +} svar under den udvidede kinetik af Shigella. Nedenfor signaler nøglen spørgsmål kan findes der skal løses for at optimere påvisning af Ca^{2 +} samtidig minimere enhver indblanding med de biologiske processer.

Kemiske vs kodet genetisk Ca^{2 +} sonder:

For at billede lokale Ca^{2 +} variationer, brugte vi Fluo-4 kemisk sonden på grund af sin høje kvanteudbytte og dets hurtige svar dynamik. Den hastighed, der kræves til erhvervelse også udelukker brugen af ratiometric sonder, da en dobbelt bølgelængde erhvervelse ikke kan udføres. Brugen af patogene mikroorganismer, men kan forstyrre standard procedurer ved hjælp af Ca^{2 +} kemiske sonder. For eksempel, forhindrer en langvarig celle infektion over 60 min af Shigella enhver celle indlæsning med kemiske sonder, formentlig på grund af patogen-inducerede ændringer i plasma vært cellemembraner. Konsekvent, er et fald på celle-associerede Fluo-4 fluorescens iagttaget under lange infektion kinetik, på grund af cytoplasmatisk tabet af denne sonde. Derfor er gennemfører en kontrol såsom tilsætning af ionomycin til at bestemme fluorescens på maksimal Ca^{2 +} koncentrationerne i slutningen af erhvervelser kritisk at identificere de responsive celler. Også, polariseret intestinal epitelceller, der er relevante for en patogen infektion synes at være ildfaste en læsning af Ca^{2 +} sonde og kræver specifikke lastning procedurer. Mens brugen af en genetisk kodet Ca^{2 +} reporter (GECR) kan bidrage til at løse nogle af disse spørgsmål, indføres der også andre udfordringer. Transfektion effektivitet i celle værtssystemer kan udgøre en alvorlig begrænsning, især hvis det superimposes med en dårlig smitsomme udbytte. Desuden er Karakteristik af en lydhørhed over for Ca^{2 +} variationer af de fleste GECRs ikke kompatibel med den hurtige kinetik kræves for lokale Ca^{2 +} analyse. Endelig, et udtryk for GECR kan interferere med patogener-medieret processer. Vi vil ikke diskutere brugen af GECR til undersøgelse af Ca^{2 +} signalering under en vært-patogen interaktion. Den nylige og igangværende manipulation af forskellige "hurtig-reagerer" GECR ville sandsynligvis fortjener forskere for at gense deres brug i fremtidige undersøgelser.

Timing erhvervelse af lokale Ca^{2 +} svar under bakteriel infektion:

Billeddannelse af lokale Ca^{2 +} svar kræver en høj hastighed på billede erhvervelse implicere en vedvarende fluorescens excitation af Fluo-4 sonden. På grund af solskader knyttet til højfrekvens erhvervelse, er det kritisk, at intensiteten af fluorophore excitations lys holdes på det minimum, der kræves for at opnå en tilstrækkeligt signal / støj-forhold med en eksponeringstid, ikke overstiger 30 ms. vi havde gode resultater ved hjælp af et LED system på 5% af sin maksimale intensitet, kombineret med en 1,0 optisk tæthed filter med erhvervelse set-up som beskrevet i trin 2.1.4. Disse betingelser, men fandt vi, kontinuerlig belysning kræves for stream mode erhvervelse ikke gav mulighed for en overtagelse periode over 2 min. En stærkere belysning eller erhvervelser periode overstiger denne grænse kan resultere i ikke-specifikke globale Ca^{2 +} svar og/eller hæmning af bakteriel invasion processer, formentlig knyttet til solskader. Mens billeddannelse af lokale Ca^{2 +} svar over længere kinetik kan være muligt med mere følsomme påvisning midler, nuværende tilstand sådan imaging kan kun udføres i en begrænset periode brøkdel af 15 min Shigella invasion proces. For at dække hele processen, udførte vi successive serie af 2-min streaming erhvervelser. Dette tidsinterval er nok til at følge indledende af lokale og globale af Ca^{2 +} svar i starten af infektion oparbejde og etablere betydelige forskelle i Shigella vildtype stamme og sin isogene ipgD mutant¹⁶. Udviklingen af en yderst følsom kamera kan tillade forskere at reducere intensiteten af fluorophore belysningen og udføre lokale Ca^{2 +} imaging over længere perioder, hvilket forbedrer tidsopløsning af mere forbigående Ca^{2 +} signaler.

Rumlige korrelationen mellem lokale Ca^{2 +} svar og bakteriel invasion websteder:

På grund af det lokale aspekt af signalering begivenheder fremkaldt af mikroorganismer, er det vigtigt at studere lokal Ca^{2 +} signaler med hensyn til deres tilknytning til websteder af celle pathogen-værtssammenspil. Dette rejste to typer af overvejelser. Første, alle celler kan ikke blive smittet, og alle mikroorganismer kan ikke udløse signalering. For Shigella, kun et mindretal af bakterier udløse en invasion, og alle celler kan ikke blive smittet. I vores forsøg, MOI blev justeret, således at én celle danner en 0,7 - 1 fokus bakteriel invasion. Højere antal foci/celle kan føre til en eventuel interferens til analyse af enkelte invasion begivenheder, og omvendt, lavere tal kan gøre analysen alt for kompliceret, især når man studerer forbigående transfekteret celler. Vi fandt, at Transfektion effektivitet skal nå op på mindst 30% af cellerne til at nedbringe antallet af replikat eksperimenter til håndterbare numre. Andet, Shigella invasion websteder kan opdages let ved fase kontrast mikroskopi. For andre processer, der kunne anvendes andre fluorescens-baseret detektionsmetoder. Et vigtigt aspekt, er imidlertid, at erhvervelse stream kræves for lokale Ca^{2 +} imaging i mest eksperimenterende set-ups, udelukker andre former for erhvervelse i perioden. Det er belastende at processen analyseret ikke bør vise betydelig bevægelse under denne stream til at tillade deres rumlige korrelationen med lokale Ca^{2 +} signaler. Mens dette er tilfældet for Shigella invasion begivenheder at Lokaliser til den samme celle område over flere minutter, meget motile processer kan ikke være håndterbar eller ville sandsynligvis kræve kortere erhvervelse vandløb.

Scoring og analyse af lokale Ca^{2 +} svar:

Mens globale Ca^{2 +} svar som nemt kan opdages, kræver påvisning af lokale Ca^{2 +} svar af lille amplitude og varighed optimering af erhvervelse af fluorescerende signaler beskrevet ovenfor. Det er også vigtigt, at strenge kriterier anvendes for at skelne mellem signaler over baggrunden variationer. Som regel score vi Ca^{2 +} signalerer en stigning i den gennemsnitlige Fluo-4 fluorescens intensitet, når mindst 3 x baseline variationer i tre på hinanden følgende 30 ms erhvervelser. Dette svar er betragtes som lokale, hvis et andet område af cellen viser den samme gennemsnitlige fluorescens-intensiteten ikke viser sådan forhøjelse. Scoring af lokale Ca^{2 +} svar i forskellige prøver bør ikke medføre større vanskeligheder, hvis disse regler anvendes systematisk. I vores hænder, lav frekvens af lokale Ca^{2 +} signaler tilknyttet den bakterielle invasion og spænder fra 5-20% af cellen analyseret repræsenteret en stor forhindring. Ud over de biologiske variationer udførligt beskrevet i det foregående afsnit, det faktum, at kun en strøm svarende til en brøkdel af den analyserede invasion proces også bidrager til denne lavfrekvente. På grund af denne lavfrekvente, kan etablering af forskelle mellem prøver belaste udfører en magt test på pilotforsøg at anslå stikprøvestørrelse for at nå en Statistisk signifikans.

Fremtidige ansøgninger:

Vi mener, at protokollerne, der arbejdede til at analysere lokale Ca^{2 +} -signaler under en Shigella invasion vil være nyttigt at billedet lokale Ca^{2 +} svar for alle processer, der forbliver rumligt begrænset periode erhvervelse. Mens Ca^{2 +} signalering er alsidig, kan lokal Ca^{2 +} signalering være mest relevante for processer, der forekommer på plasma eller intracellulære membraner, hvor de oprindelige punktkilder signaler bor. Således under mikrobielle-vært celle interaktioner, lokale Ca^{2 +} signaler kan være relevante for klæbende eller invasive processer på plasma membran eller forekommende på intracellulære membraner af patogen-holdige vacuoles. På den anden side kan de protokoller, der designede vi analysere global Ca^{2 +} signaler over udvidede infektion kinetik være relevante for processer, der påvirker den generelle celle fysiologi under en infektion, såsom regulering af en transcriptional program eller celle død veje af patogener.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin