Summary
यहां, हम मौजूद प्रोटोकॉल कैल्शियम कल्पना करने के लिए (Ca2 +) प्रतिक्रियाओं हेला द्वारा संक्रमित कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत शिगेला। बैक्टीरियल संक्रमण और2 + फ्लोरोसेंट जांच, असामान्य वैश्विक और स्थानीय सीए के साथ इमेजिंग के मापदंडों के अनुकूलन के द्वारा2 + संक्रमण कैनेटीक्स की एक बड़ी रेंज पर बैक्टीरिया द्वारा प्रेरित संकेत विशेषता हैं ।
Abstract
Ca2 + सभी ज्ञात सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल एक सर्वव्यापी आयन है । जबकि ग्लोबल ca2 + प्रतिक्रियाएं सेल भाग्य को प्रभावित कर सकते हैं, मुक्त ca2 + cytosolic सांद्रता में स्थानीय रूपांतरों, आंतरिक भंडार या प्लाज्मा झिल्ली चैनलों के माध्यम से एक आमद से जारी करने के लिए लिंक, cortical सेल प्रक्रियाओं को विनियमित । रोगज़नक़ों कि करने के लिए या आक्रमण मेजबान कोशिकाओं actin cytoskeleton के एक पुनर्गठन मेजबान प्लाज्मा झिल्ली अंतर्निहित है, जो संभावना दोनों वैश्विक और स्थानीय Ca2 + सिग्नलिंग प्रभावित करता है) ट्रिगर । क्योंकि इन घटनाओं में कम आवृत्तियों पर एक छद्म stochastic तरीके से विस्तारित कैनेटीक्स पर हो सकता है, Ca के विश्लेषण2 + रोगजनकों द्वारा प्रेरित संकेतों प्रमुख तकनीकी चुनौतियों है कि जरूरत को संबोधित कर उठाती है ।
यहां, हम वैश्विक और स्थानीय सीए का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट2 + उपकला कोशिकाओं के एक शिगेला संक्रमण पर संकेत. इन प्रोटोकॉल में, कलाकृतियों एक लंबे समय तक प्रदर्शन और Ca के उत्तेजना2 + फ्लोरोसेंट जांच के साथ जुड़े धूप से जुड़े एक के दौरान निर्धारित समय अवधि से अधिक इसरो अधिग्रहण मापदंडों को नियंत्रित करने से troubleshot है शिगेला आक्रमण. प्रक्रियाओं को कड़ाई से आयाम और वैश्विक cytosolic Ca की आवृत्ति का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं2 + सिग्नल विस्तारित संक्रमण के दौरान कैनेटीक्स रासायनिक जांच Fluo-4 का उपयोग कर.
Introduction
Ca2 + सभी ज्ञात सेल प्रक्रियाओं, cytoskeletal पुनर्गठन, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, और सेल मौत रास्ते मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत1,2,3से संबंधित सहित नियंत्रित करता है । शारीरिक स्थितियों के तहत, बेसल cytosolic Ca2 + सांद्रता कम कर रहे हैं, एनएम रेंज के सैकड़ों में, लेकिन एगोनिस्ट उत्तेजना पर क्षणिक वृद्धि के अधीन किया जा सकता है । इन रूपों अक्सर पंपों और प्लाज्मा और endoplasmic जालिका झिल्ली पर चैनलों की कार्रवाई के माध्यम से थरथरानवाला व्यवहार दिखा । इन दोलनों के पैटर्न अवधि, अवधि, और ca के आयाम की विशेषता है2 + बढ़ाता है, और जो, बारी में, जो ca के रूप में जाना जाता है में विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए कोशिकाओं द्वारा डिक्रिप्ट किया जाता है2 + कोड4,5 . cytosolic Ca में निरंतर वृद्धि2 + रोग की स्थिति के तहत एकाग्रता mitochondrial झिल्ली के permeabilization के साथ जुड़े सेल मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और समर्थक अपोप्तोटिक या गल कारकों की रिहाई6, 7.
शिगेला, bacillary पेचिश के प्रेरणा का एजेंट, एक प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS)8,9का उपयोग कर मेजबान कोशिकाओं में प्रभाव इंजेक्शन द्वारा उपकला कोशिकाओं पर हमला । मेजबान कोशिकाओं के एक शिगेला आक्रमण स्थानीय और वैश्विक Ca के साथ जुड़ा हुआ है2 + संकेत T3SS द्वारा बटोरा । ताकना-बनाने विषाक्त पदार्थों के लिए के रूप में, T3SS translocon कि मेजबान सेल झिल्ली में आवेषण और T3SS प्रभाव के इंजेक्शन के लिए आवश्यक है पीएलसी और inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) के सक्रियकरण के लिए जिंमेदार होने की संभावना है-निर्भर Ca2 + निर्गमन. स्थानीयकृत पीएलसी उत्तेजना का संयोजन और एक शिगेला आक्रमण परिणाम की साइटों पर एक असामान्य रूप से लंबे समय से स्थाई InsP3-निर्भर Ca2 + रिलीज10में पॉलिमर actin के संचय । प्रकार III प्रभाव IpgD, एक phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2) -4-फॉस्फेट, PIP2 की स्थानीय राशि सीमा, इस तरह पीएलसी के लिए उपलब्ध सब्सट्रेट की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए InsP3 उत्पन्न करने के लिए, जो स्थानीय Ca की प्रसूति के लिए योगदान देता है2 + बैक्टीरियल आक्रमण साइटों पर प्रतिक्रियाएं11,12। इन स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाएं संभावना actin बहुलकीकरण में शिगेला आक्रमण साइटों10में योगदान । ग्लोबल Ca2 + प्रतिक्रियाएं भी शिगेलाद्वारा निकाले जाते हैं, तथापि, जीवाणु आक्रमण प्रक्रिया के लिए औषधालय हैं, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली पर connexin hemichannels के उद्घाटन और extracellular में एटीपी की रिहाई को ट्रिगर डिब्बे. एक paracrine तरीके से जारी एटीपी अभिनय, बारी में, संक्रमित कोशिका के बगल में कोशिकाओं में Ca2 + थरथरानवाला प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित करता है । IpgD भी ग्लोबल Ca को आकार देने के लिए जिंमेदार है2 + प्रतिक्रियाओं धीमी गतिशीलता के साथ अनिश्चित अलग प्रतिक्रियाओं में । अंत में, एक लंबे समय तक जीवाणु संक्रमण पर, IpgD InsP3 की बाधा की ओर जाता है-मध्यस्थता Ca2 + संकेतों. सीए2 + संकेतन के साथ इसके हस्तक्षेप के माध्यम से, IpgD देरी एक ca2 +-निर्भर calpain सक्रियण फोकल आसंजन संरचनाओं के विधानसभा और संक्रमित कोशिकाओं13के समयपूर्व टुकड़ी के लिए अग्रणी ।
जबकि सीए2 + संकेत रोगजनन के महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं, एक सूक्ष्मजीवों का उपयोग शास्त्रीय एगोनिस्ट अध्ययन में सामना नहीं कर रहे है कि तकनीकी चुनौतियों का एक नंबर उठाती है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित आमतौर पर इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट सीए2 + रासायनिक संकेतक Fluo-4 है कि हम एक शिगेला संक्रमण के दौरान स्थानीय सीए2 + संकेतों की विशेषताएं इंजीनियर । इन संकेतों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा कर रहे हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अपने मात्रात्मक विश्लेषण है कि सीए में बैक्टीरियल effects की भूमिका की आवश्यकता है के लिए लागू प्रक्रियाओं2 + संकेतन ।
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Protocol
1. तैयारी
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बैक्टीरिया की तैयारी
- प्लेट जीवाणु-शिगेला जंगली-प्रकार तनाव एएफएए/adhesin (M90T-एएफएए/) व्यक्त-एक trypticase सोया (टीसीएस) आगर प्लेट ०.०१% कांगो लाल (सीआर) से युक्त है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए उंहें मशीन ।
नोट: उनके reproducibility को बढ़ाने के लिए, 1.1.1 चरण में प्राप्त शिगेला प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाता है और एक सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि सीआर माध्यम पर सभी कालोनियों अंततः समय के साथ लाल हो जाएगा । - Inoculate टीसीएस शोरबा पूर्व संस्कृति लकीर प्लेटों से 3 लाल कालोनियों से उठा ।
नोट: 3 कालोनियों के साथ एक टीका एक क्लोन जिसका डाह प्लाज्मिड एक आनुवंशिक पुनर्संयोजन आया है उठा की संभावना को सीमित किया जाता है । - ३७ डिग्री पर २०० rpm पर 16 घंटे के लिए एक मिलाना मशीन में तरल बैक्टीरियल संस्कृतियों हो जाना । ७५ मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता में एम्पीसिलीन जोड़ें । एंटीबायोटिक सांद्रता 3x से अधिक नहीं होना चाहिए ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता, एंटीबायोटिक के एक अतिरिक्त के रूप में बड़े डाह प्लाज्मिड के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
नोट: शिगेला डाह प्लाज्मिड के रखरखाव के उपयुक्त एंटीबायोटिक सांद्रता के साथ पूरक सीआर प्लेटों पर बैक्टीरियल संस्कृतियों चढ़ाना द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए । सफेद कालोनियों की मौजूदगी प्लाज्मिड नुकसान का संकेत देती है । - एक 1:100 कमजोर पड़ने पर बैक्टीरियल पूर्व संस्कृति के साथ टीसीएस संस्कृति Inoculate । यह ३७ ° c में एक मिलाना मशीन में २०० rpm पर 2 घंटे के लिए मशीन । सुनिश्चित करें कि ६०० एनएम (ओडी600nm) पर ऑप्टिकल घनत्व ०.२-०.४ है ।
- 21 डिग्री सेल्सियस पर १३,००० x g पर 2 मिनट के लिए बैक्टीरियल संस्कृति केंद्रापसारक और EM मध्यम (१२० mm NaCl, 7 mm KCl, १.८ mm CaCl2, ०.८ mm MgCl2, 5 mm ग्लूकोज, और 25 मिमी HEPES के एक समकक्ष मात्रा में गोली reसस्पेंड , पीएच = ७.३) ।
- ०.१ के एक अंतिम आयुध डिपो600nm पर एक EM बफर में बैक्टीरियल निलंबन पतला और इसे तुरंत उपयोग या 21 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान और अगले ६० मिनट के भीतर इसका इस्तेमाल करते हैं ।
- प्लेट जीवाणु-शिगेला जंगली-प्रकार तनाव एएफएए/adhesin (M90T-एएफएए/) व्यक्त-एक trypticase सोया (टीसीएस) आगर प्लेट ०.०१% कांगो लाल (सीआर) से युक्त है और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए उंहें मशीन ।
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सेल की तैयारी
- संस्कृति हेला कोशिकाओं के साथ DMEM में 1 g/L के साथ पूरक ग्लूकोज की 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और उन्हें बढ़ने के साथ ३७ ° c 10% CO2. बढ़ती टीसी-7 ४.५ g/L के साथ DMEM में बढ़ी ग्लूकोज की, 10% FCS और गैर-आवश्यक अमीनो एसिड युक्त एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 10% CO.2युक्त मशीन ।
- सेल के रखरखाव के लिए, कोशिकाओं को नियमित रूप से विभाजित करने के लिए एक विकास से संपर्क करें-धाराप्रवाह राज्यों से जुड़ी बाधा से बचने के; यह एक उच्च Ca के लिए महत्वपूर्ण है2 + जांच लोड हो रहा है/अभिकर्मक दक्षता ।
- प्लेट हेला कोशिकाओं बाँझ पर 25 मिमी व्यास परिपत्र coverslips में 6-अच्छी तरह से प्लेटों के घनत्व पर 3 x 105 कोशिकाओं/हेला कोशिकाओं के लिए प्रयोग के पहले दिन ।
- टीसी के लिए-7 कोशिकाओं, trypsinize और गिनती कोशिकाओं । उंहें बीज 4 x 105 कोशिकाओं में/अच्छी तरह से और उंहें 5-7 दिनों में ३७ ° c में एक 10%CO2-मशीनी प्रयोगों से पहले एक ध्रुवीकरण के लिए अनुमति देने के लिए ।
- प्रयोग के दिन तक सेल कल्चर मीडियम को हर दिन रिफ्रेश करें ।
नोट: ग्लास नीचे ३५ मिमी व्यास डिस्पोजेबल कक्षों भी coverslips-युक्त कुओं के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । बाद इस्तेमाल किया जाता है, एक गर्म मंच या उद्देश्य के माध्यम से तापमान नियंत्रण पर्याप्त नहीं है, और एक थर्मोस्टेट मशीन चैंबर माइक्रोस्कोप मंच पर घुड़सवार की आवश्यकता है.
- प्रयोग के दिन तक सेल कल्चर मीडियम को हर दिन रिफ्रेश करें ।
- प्रयोग के दिन, मध्यम निकालें और 1 एमएल EM मध्यम से 21 डिग्री सेल्सियस के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें ।
- 3 मिमी Fluo के साथ कोशिकाओं को लोड-4-AM14 में 21 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक EM बफर में.
नोट: उप-धाराप्रवाह हेला कोशिकाओं की लोडिंग प्रमुख समस्याओं को बढ़ाने नहीं करता है, जबकि, ध्रुवीकरण टीसी-7 कोशिकाओं की लोडिंग अक्सर विषम और खराब कुशल है । इन कोशिकाओं के लिए, हमने पाया है कि लोडिंग दक्षता dispersing एजेंट के अलावा द्वारा बढ़ाया है-pluronic एसिड-०.१% की एक अंतिम एकाग्रता पर और आयनों के 20 µ m के एक अंतिम एकाग्रता में ट्रांसपोर्टर अवरोधक bromosulfophtalein के लिए Fluo-4-हूं-उंहें युक्त । ratiometric रासायनिक जांच का उपयोग करें या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग-झल्लाहट जांच दोहरे-अधिग्रहण की आवश्यकता है स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाओं के इमेजिंग के लिए आवश्यक अधिग्रहण की गति के साथ संगत नहीं है । - एम के बफर के साथ 3x नमूने धो और आगे उंहें 21 डिग्री सेल्सियस में em बफर के 1 मिलीलीटर में मशीन हूं moiety के hydrolysis के लिए अनुमति देते हैं । तुरंत या अगले ९० मिनट के भीतर (21 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा) Fluo-4 लोड कोशिकाओं का उपयोग करें ।
2. संक्रमण और स्थानीय Ca की छवि अधिग्रहण2 + प्रतिक्रियाएं
- एक इमेजिंग चैंबर या ग्लास नीचे चैंबर में Fluo-4 लोड कोशिकाओं युक्त coverslip रखें । इमेजिंग चैंबर या ग्लास में नमूने धोने EM बफर के साथ नीचे प्रयोज्य चैंबर 3x संभावित सेल lysis से उत्पंन यौगिकों को दूर करने के लिए । EM बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- ३३ डिग्री सेल्सियस पर गरम एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप मंच पर चैंबर प्लेस ।
नोट: इस तापमान इष्टतम तापमान के बीच एक समझौता के रूप में शिगेला आक्रमण की प्रक्रिया के साथ संगत और Ca के नीचे धीमा2 + प्रतिक्रियाओं स्थानीय प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए चुना गया है. हम एक 63X विसर्जन तेल उद्देश्य (NA = १.२५) चरण कंट्रास्ट के छल्ले के साथ सुसज्जित का उपयोग करें । - एक सूक्ष्म क्षेत्र का चयन करें और जोखिम समय और यदि आवश्यक हो, Fluo-4 फ्लोरोसेंट संकेत का अनुकूलन सहित अधिग्रहण मापदंडों, सेट ।
नोट: स्थानीय Ca की प्रमुख चुनौतियां2 + इमेजिंग कम आयाम और प्रतिक्रियाओं की छोटी अवधि के हैं, अधिग्रहण की आवश्यकता होती है कम से कम हर 30 ms. कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वापस प्रबुद्ध EM-सीसीडी या सी-राज्यमंत्री कैमरों आवश्यक वर्तमान स्थानीय Ca का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता2 + प्रतिसाद Fluo-4 का उपयोग कर । खोज संवेदनशीलता भी एक महत्वपूर्ण मुद्दा है धूप या कलाकृतियों ऐसे सहज Fluo के फ्लोरोसेंट उत्तेजना से जुड़े प्रतिक्रियाओं के रूप में एक उच्च आवृत्ति पर सीमा । यहां, ४७० एनएम के एक एलईडी आधारित रोशनी, एक ४८० ± ४० एनएम बैंड के साथ-पास उत्तेजना फ़िल्टर, एक ५०५ एनएम dichroic फिल्टर, और एक ५२७ ± 30 एनएम बैंड-पास उत्सर्जन अपनी अधिकतम एक १.० तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ संयुक्त तीव्रता का 5% से कम इस्तेमाल किया गया इन समस्याओं को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया सीमित अवधि के अधिग्रहण की एक धारा के तहत । १२० s धाराओं के बैचों द्वारा स्थानीय Ca2 + संकेतों का एक विश्लेषण नियमित रूप से किया गया था. इन कम रोशनी की स्थिति के तहत, fluorophore photobleaching 2 मिनट के दौरान नहीं देखा था धारा अधिग्रहण । एक ही नमूने पर क्रमिक अधिग्रहण किया जा सकता है, बशर्ते विभिंन क्षेत्रों का उपयोग किया जाता है । एक सामांय नियम के रूप में, एक पहली अधिग्रहण स्ट्रीम बैक्टीरिया उत्तेजना के अभाव में एक नियंत्रण क्षेत्र पर सहज प्रतिक्रियाओं के अभाव को सुनिश्चित किया जाता है । यदि सहज प्रतिसाद स्वीकार्य हैं, तो नमूने EM बफ़र के साथ कोई प्रतिसाद नहीं स्वीकार्य है जब तक धोए जाते हैं । - नमूने के लिए बैक्टीरिया को जोड़ने के लिए, चैंबर से EM बफर के ५०० µ एल निकालें और चयनित माइक्रोस्कोपी क्षेत्र में जाने से बचने के लिए उचित देखभाल के साथ, ०.०५ के एक अंतिम ओडी600nm प्राप्त करने के लिए चरण 1.1.6 में तैयार बैक्टीरियल सस्पेंशन के ५०० µ l को जोड़ें; मात्रा बैक्टीरिया और कोशिका नमूनों पर बैक्टीरिया का एक सजातीय वितरण के एक उचित मिश्रण सुनिश्चित करते हैं ।
- बैक्टीरियल इसके अलावा पर एक अधिग्रहण करते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक अधिग्रहण 10 ंयूनतम प्रदर्शन बैक्टीरियल इसके अलावा, जो उपयोग की शर्तों के तहत कोशिकाओं पर तलछट के लिए बैक्टीरिया के लिए आवश्यक समय से मेल खाती है । अधिग्रहण स्ट्रीम के अंत में, चयनित क्षेत्र के एक चरण विपरीत छवि के लिए कोशिकाओं से संपर्क बैक्टीरिया और झिल्ली असंतोष जीवाणु आक्रमण साइटों के साथ जुड़े कल्पना करने के लिए अधिग्रहण ।
- प्राप्ति प्रक्रिया चरण २.५ के रूप में दोहराएँ, अंतराल पर छवि प्राप्ति, फ़ाइलें बचत, और पूरी प्रक्रिया को कवर करने के लिए एक नई फ़ील्ड का चयन की अवधि के लिए उत्तरदायी हैं ।
नोट: शिगेलाके लिए, हमने पाया है कि अधिग्रहण धाराओं 20 मिनट के लिए हर 5 मिनट, 10 मिनट बैक्टीरियल अवसादन के बाद, आक्रमण की घटनाओं के बहुमत को कवर करने की अनुमति दी. - अधिग्रहण प्रक्रिया के अंत में, ca के 2 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता2 + ionophore ionomycin नमूने सीए2 + संकेतों के अधिक से अधिक आयाम निर्धारित करने के लिए जोड़ें । प्राप्त छवियां हर 3-5 एस जब तक संकेत स्थिरीकरण, आमतौर पर कम 10 मिनट के लिए ।
- ca2 + chelator EGTA 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ने के द्वारा पालन के लिए सीए2 +के अभाव में प्रतिदीप्ति संकेत निर्धारित करते हैं । प्राप्त छवियां हर 3-5 एस जब तक संकेत स्थिरीकरण, आमतौर पर कम 10 मिनट के लिए ।
नोट: क्योंकि वैश्विक ca के अपेक्षाकृत धीमी गति से2 + विविधताओं, इन अधिग्रहणों प्रदर्शन हर 3-5 एस (नहीं स्ट्रीमिंग मोड में), Ca के लिए अनुमति देताहै 2 + एक ही सूक्ष्म क्षेत्र पर इमेजिंग के दौरान लगातार उपचार ।
3. विश्लेषण
- एक्सप्रेस cytosolic Ca2 + ΔF/F0के प्रतिशत के रूप में समय के साथ रूपांतरों, जहां ΔF ब्याज के क्षेत्र (रॉय) और एफ0 के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की भिन्नता का प्रतिनिधित्व करता है एक ही रॉय में आधारभूत प्रतिदीप्ति, जो करने के लिए एक कक्षों से रहित फ़ील्ड का गैर-संगत क्षेत्र घटाया गया है ।
- विभिन्न क्षेत्रों में प्रत्येक कोशिका के लिए बेसल प्रतिदीप्ति स्तरों को हटाने, आधारभूत स्तर के अनुरूप; इन स्तरों स्पष्ट रूप से कम आवृत्ति और स्थानीय Ca के अपेक्षाकृत कम अवधि के कारण निर्धारित किया जा सकता है2 + किसी दिए गए स्ट्रीम अधिग्रहण में प्रतिक्रियाएं ।
नोट: पूछे जाने वाले प्रश्नों से संबंधित प्रतिक्रियाओं के हड़ताली सुविधाओं को बढ़ाता है और रोगजनक मॉडल का अध्ययन किया । प्रतिष्ठित, विभिंन मापदंडों खाते में लिया जाता है ca2 + संकेतों का विश्लेषण करने के लिए, स्थानीय या वैश्विक ca2 + प्रतिक्रियाओं, और साथ ही अवधि, आयाम, और इन प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति दिखा कोशिकाओं की आवृत्ति सहित. शिगेला और स्थानीय प्रतिक्रियाओं के मामले में, विश्लेषण का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू जीवाणु आक्रमण स्थलों के साथ प्रतिक्रियाओं के स्थानिक संघ है ।
- विभिन्न क्षेत्रों में प्रत्येक कोशिका के लिए बेसल प्रतिदीप्ति स्तरों को हटाने, आधारभूत स्तर के अनुरूप; इन स्तरों स्पष्ट रूप से कम आवृत्ति और स्थानीय Ca के अपेक्षाकृत कम अवधि के कारण निर्धारित किया जा सकता है2 + किसी दिए गए स्ट्रीम अधिग्रहण में प्रतिक्रियाएं ।
- वैश्विक या स्थानीय प्रतिक्रियाएं दिखाने वाले उत्तरदायी कक्षों का प्रतिशत, कक्षों में ROIs को आरेखित करना, समय-श्रृंखला में Fluo-4 तीव्रता के रूपांतरों के अनुरूप होना.
- स्थानीय Ca की पहचान करने के लिए सख्त पैरामीटर सेट करें2 + प्रतिसाद, जैसे एक आयाम के रूप में तीन गुणा औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता कक्ष आधारभूत की पृष्ठभूमि भिन्नता, या एक झूठी सकारात्मक स्कोरिंग से बचने के लिए न्यूनतम २०० ms की अवधि ।
नोट: एक सामांय नियम के रूप में, यहां तक कि छोटे स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाओं उनके प्रोफ़ाइल द्वारा किसी भी पृष्ठभूमि शोर से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । ROIs पर्याप्त पर्याप्त प्रतिदीप्ति संकेतों को एकीकृत करने के लिए स्थानीय रूपांतरों का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए । Fluo-4 का पता लगाने की तीव्रता के आधार पर, इन ROIs 2-5 mM से लेकर व्यास के साथ हलकों के अनुरूप हो सकता है । - निर्धारित करें कि क्या प्रतिसाद स्थानीय या वैश्विक हैं, एक ही कक्ष के एक अलग क्षेत्र में 2 क्षेत्रों में औसत Fluo-4 प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूपांतरों को मापने ।
नोट: कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण इमेजिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग की सुविधा के लिए चयनित क्षेत्रों के लिए समय पर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूपांतरों की लाइन स्क्रीन प्रदर्शन की अनुमति है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर इस तरह के एक विकल्प है, लेकिन यह भी बर्फील े फ्रीवेयर का उपयोग कर, रॉय तीव्रता विकास प्लगइन का उपयोग किया जा सकता है । - स्थानीय प्रतिसाद दिखाने वाले कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें ।
नोट: यह प्रतिशत एक गैर पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग कर एक सांख्यिकीय महत्व का समर्थन करने के लिए पर्याप्त संख्या में होना चाहिए जो सूक्ष्म क्षेत्र में विश्लेषण कोशिकाओं की कुल संख्या से गणना की है. - स्थानीय प्रतिक्रियाओं की अवधि निर्धारित करें ।
नोट: स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाएं आगे उनकी अवधि पर्वतमाला (यानी, कम से ५०० ms, 5 और 10 एस, या 10 से ऊपर के बीच) और शिगेला आक्रमण साइटों के साथ उनके सहयोग के अनुसार प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
- स्थानीय Ca की पहचान करने के लिए सख्त पैरामीटर सेट करें2 + प्रतिसाद, जैसे एक आयाम के रूप में तीन गुणा औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता कक्ष आधारभूत की पृष्ठभूमि भिन्नता, या एक झूठी सकारात्मक स्कोरिंग से बचने के लिए न्यूनतम २०० ms की अवधि ।
- प्रतिक्रियाओं के आयाम को बढ़ाता है । सबसे पहले, अधिक से अधिक सीए2 + और सेल पृष्ठभूमि स्तर 2.1.7 चरण में के रूप में निर्धारित जांचना । चूंकि Fluo-4 लोड प्रत्येक कक्ष के लिए भिंन हो सकते हैं, तो फ़ील्ड में व्यक्तिगत कक्षों के लिए ये निर्धारण करें ।
- प्रतिक्रियाओं के आयाम के रूप में अधिक से अधिक प्रतिक्रिया के एक रिश्तेदार प्रतिशत व्यक्त करते हैं ।
- सांख्यिकीय परीक्षण, एक पैरामीट्रिक परीक्षण के बाद नमूनों के बीच प्रतिक्रियाओं के आयाम में संभावित मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए का उपयोग कर सांख्यिकी परीक्षण करते हैं ।
- बैक्टीरियल झिल्ली के लिए उनके संबंधित स्थानीयकरण द्वारा बैक्टीरियल आक्रमण साइटों के सापेक्ष इन प्रतिक्रियाओं के संघ का निर्धारण करने के लिए इसी चरण कंट्रास्ट छवियों में visualized व्याकुलता ।
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Representative Results
शिगेला आक्रमण असामान्य लंबे समय से स्थाई स्थानीय Ca के साथ जुड़ा हुआ है2 + प्रतिक्रियाएं:
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद, Fluo-4-लोडेड हेला कोशिकाओं को WT शिगेला के साथ चुनौती दी गई और धारा अधिग्रहण को सीए2 + संकेतों का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया गया । एक प्रतिनिधि प्रयोग चित्रा 1में दिखाया गया है, समय के साथ चूक छवियों श्रृंखला के प्रतिदीप्ति तीव्रता के Fluo-4 जांच एक एकल सेल के लिए ब्याज की एक क्षेत्र में औसत, और इसी चरण कंट्रास्ट छवि (आंकड़ा 1a, छोड़ दिया पैनल) । शिगेला आक्रमण स्थल के चरण विपरीत छवि (चित्रा 1a, तीर) में पाया झिल्ली असंतोष की विशेषता है । नि: शुल्क cytosolic Ca में असामान्य स्थानीय बढ़ जाती है2 + एक अलग आयाम और २.५-5 एस से लेकर अवधि (आंकड़े 1a और 1b, तीर), संक्रमित में वैश्विक वृद्धि के बाद के साथ शिगेला आक्रमण स्थल पर मनाया जाता है कक्ष (आरेख 1b, ऐरोहेड) ।
प्रकार III प्रभाव IpgD वैश्विक Ca करने के लिए स्थानीय से संक्रमण को नियंत्रित करता है2 + हेला कोशिकाओं में शिगेला द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाएं:
Ca के विश्लेषण2 + जंगली प्रकार शिगेला और एक isogenic उत्परिवर्ती तनाव प्रकार III प्रभाव IpgD, एक phosphatidyl 4, 5 bisphosphate फॉस्फेट के लिए कमी से प्रेरित संकेत है, संकेत दिया कि इस बाद तनाव और अधिक वैश्विक प्रेरित और कम लंबी अवधि के साथ असामान्य स्थानीय प्रतिक्रियाओं (RATPs) के साथ ११.३ ± ४.४ (sem)% और ४०.३ ± ७.५ (sem)% कोशिकाओं के मामले में वैश्विक प्रतिक्रियाओं के साथ उत्तरदायी एक WT और ipgD उत्परिवर्ती, क्रमशः (चित्र 1 डी)15. इस ipgD उत्परिवर्ती WT तनाव के रूप में एक समान आवृत्ति पर स्थानीय प्रतिक्रियाओं प्राप्त करता है ।
शिगेला बाधित InsP3-निर्भर वैश्विक Ca2 + लंबे समय तक संक्रमण कैनेटीक्स के दौरान हेला कोशिकाओं में बढ़ जाती है:
ग्लोबल Ca इमेजिंग2 + विस्तारित संक्रमण कैनेटीक्स प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति में कमी की ओर इशारा 30 मिनट जंगली प्रकार शिगेला (चित्रा 2a) के साथ चुनौती के बाद । Ca2 की आवृत्ति में एक समान कमी + प्रतिक्रियाएं टीसी-7 जंगली प्रकार शिगेला15के साथ 30 मिनट के लिए संक्रमित कोशिकाओं में मनाया गया । ठहराव की खुराक-निर्भर कक्ष प्रतिक्रियाओं के ca2 + एगोनिस्ट हिस्टामिन एक शिगेला संक्रमण की देर चरणों पर एक InsP3-निर्भर Ca2 + रिलीज़ के निषेध दिखाता है । WT शिगेला असामान्य पृथक ca करने के लिए सुराग2 + संक्रमण के पहले 30 मिनट के दौरान और आगे की मशीन के बाद, आयाम और सीए की आवृत्ति में एक भारी कमी2 + प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2 बी) मनाया गया था ।
चित्र 1 . शिगेला आक्रमण के दौरान स्थानीय और वैश्विक Ca2 + प्रतिक्रियाएं । हेला कोशिकाओं Fluo-4-AM के साथ लोड किया गया था और WT शिगेलाके साथ चुनौती दी । (A) बायां फलक चरण-कंट्रास्ट छवियां दिखाता है । सही पैनल रंग कोड के साथ Fluo-4 प्रतिदीप्ति औसत तीव्रता के समय श्रृंखला से पता चलता है सही पर चित्रित । अधिग्रहण के शुरू से समय सेकंड में संकेत दिया है, बैक्टीरियल चैलेंज के बाद 10 मिनट । तीर आक्रमण घावों को इंगित करता है । दर्शाया हलकों में विश्लेषण क्षेत्रों के अनुरूप (ख) जहां इसी रंग के साथ निशान Fluo में बदलाव का प्रतिनिधित्व-4 औसत आधार रेखा से अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता । तीर स्थानीय प्रतिसादों को इंगित करते हैं । ऐरोहेड वैश्विक प्रतिसादों को इंगित करता है । (ग) यह एक योजना Ca2 + प्रतिक्रियाओं की अवधि के निर्धारण का चित्रण है । क्षैतिज डॉटेड रेखा बेसल Ca2 + स्तर (F0) को इंगित करती है; अनुलंब पट्टियां पृष्ठभूमि भिंनताएं इंगित करती हैं । ऊर्ध्वाधर बिंदीदार रेखा प्रतिक्रिया के अधिक से अधिक आयाम को इंगित करता है; क्षैतिज सलाखों के आधे-अधिकतम आयाम पर निर्धारित प्रतिक्रिया की अवधि का संकेत है । (घ) यह उत्तरदाई कोशिकाओं ± SEM के प्रतिशत स्थानीय प्रतिक्रियाओं और ग्लोबल Ca दिखा रहा है2 + प्रतिक्रियाएं WT शिगेला (डार्क ग्रे सलाखों) या ipgD उत्परिवर्ती (प्रकाश ग्रे सलाखों) के साथ 5 मिनट के बाद संक्रमण प्रेरित । RATPs स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाएं है जो 5 से अधिक एस N = 4 के लिए अंतिम है; > हर बार के लिए 60 कोशिकाओं । Wilcoxon परीक्षण, *P < 0.05; * *P < 0.01 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . वैश्विक Ca के निषेध शिगेला संक्रमण की विस्तारित कैनेटीक्स के दौरान2 + प्रतिक्रियाएं । (क) ऊपरी नीले तीर संकेत सांद्रता पर जीवाणु और हिस्टामिन चुनौती के समय के पैमाने का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस पैनल के एकल सेल ग्लोबल Ca के प्रतिनिधि अंश से पता चलता है2 + WT शिगेला (ग्रीन) और ipgD उत्परिवर्ती तनाव (नारंगी) द्वारा संक्रमण के बाद बदलाव । (ख) इस पैनल के आयाम के प्रतिशत से पता चलता है Ca2 + प्रतिक्रियाओं के सापेक्ष अधिक से अधिक प्रतिक्रिया, पर एक उत्तेजना पर ०.५ माइक्रोन कोशिकाओं के हिस्टामिन संकेत उपभेदों से संक्रमित ९० मिनट के लिए । ठोस क्षैतिज पट्टी औसत अधिकतम प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है । Wilcoxon परीक्षण, * *P < 0.01 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस पांडुलिपि प्रोटोकॉल है कि हम स्थानीय ca का पालन करें इंजीनियर का वर्णन2 + एक शिगेला आक्रमण के अपेक्षाकृत कम कैनेटीक्स के दौरान संकेतों, साथ ही साथ वैश्विक ca2 + प्रतिक्रियाएं शिगेलाकी विस्तारित कैनेटीक्स के दौरान । नीचे, प्रमुख मुद्दों पाया जा सकता है कि की जरूरत है सीए का पता लगाने का अनुकूलन करने के लिए संबोधित करने के लिए2 + जबकि जैविक प्रक्रियाओं के साथ किसी भी हस्तक्षेप को कम करने का संकेत ।
रासायनिक बनाम आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग Ca2 + जांच:
स्थानीय छवि के लिए2 + विविधताओं, हम अपने उच्च क्वांटम उपज और इसकी तेजी से प्रतिक्रिया गतिशीलता के कारण Fluo-4 रासायनिक जांच का इस्तेमाल किया । अधिग्रहण के लिए आवश्यक गति भी ratiometric जांच का उपयोग precludes, के बाद से एक दोहरी तरंग दैर्ध्य अधिग्रहण नहीं किया जा सकता है । हालांकि, रोगजनक सूक्ष्मजीवों के उपयोग, सीए2 + रासायनिक जांच का उपयोग कर मानक प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, शिगेला द्वारा ६० मिनट पर एक लंबे समय तक सेल संक्रमण रासायनिक जांच के साथ किसी भी सेल लदान को रोकता है, संभवतः क्योंकि रोगज़नक़-मेजबान सेल प्लाज्मा झिल्ली के परिवर्तन प्रेरित किया । लगातार, कोशिका की कमी से जुड़े Fluo-4 प्रतिदीप्ति लंबे संक्रमण कैनेटीक्स के दौरान मनाया जाता है, इस जांच के cytoplasmic नुकसान के कारण । इसलिए, इस तरह के ionomycin के अलावा के रूप में एक नियंत्रण को लागू करने के लिए अधिक से अधिक Ca पर प्रतिदीप्ति का निर्धारण2 + अधिग्रहण के अंत में सांद्रता उत्तरदाई कोशिकाओं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, ध्रुवीय आंत्र उपकला एक रोगज़नक़ संक्रमण के लिए प्रासंगिक कोशिकाओं को सीए की एक लोडिंग के लिए दुर्दम्य हो2 + जांच और विशिष्ट लोडिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है । एक आनुवंशिक रूप से एंकोडेड Ca के उपयोग के दौरान2 + रिपोर्टर (GECR) इन समस्याओं में से कुछ को हल करने में मदद कर सकता है, यह अंय चुनौतियों का भी परिचय देता है । मेजबान सेल सिस्टम में अभिकर्मक दक्षता एक गंभीर सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, विशेष रूप से अगर यह एक गरीब संक्रामक उपज के साथ superimposes । इसके अलावा, ca के लिए एक जवाबदेही की विशेषताओं2 + सबसे GECRs के रूपांतरों स्थानीय सीए2 + विश्लेषण के लिए आवश्यक तेजी से कैनेटीक्स के साथ संगत नहीं कर रहे हैं । अंत में, GECR की अभिव्यक्ति रोगजनकों मध्यस्थता प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । हम Ca के अध्ययन के लिए GECR के उपयोग पर चर्चा नहीं करेंगे2 + एक मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के दौरान संकेतन. हाल ही में और विभिंन "फास्ट के इंजीनियरिंग जा रही" GECR शायद शोधकर्ताओं के लायक भविष्य के अध्ययन में उनके उपयोग पर फिर से आना होगा ।
बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाओं के समय अधिग्रहण:
स्थानीय Ca के इमेजिंग2 + प्रतिक्रियाओं) Fluo-4 जांच के एक निरंतर प्रतिदीप्ति उत्तेजना फंसाने की छवि अधिग्रहण की एक उच्च गति की आवश्यकता है । क्योंकि उच्च आवृत्ति अधिग्रहण से जुड़े धूप की, यह महत्वपूर्ण है कि fluorophore उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता के लिए एक पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक ंयूनतम करने के लिए रखा गया है एक जोखिम समय 30 ms से अधिक नहीं के साथ शोर अनुपात । अच्छा परिणाम अपनी अधिक से अधिक तीव्रता के 5% पर एक एलईडी प्रणाली का उपयोग, अधिग्रहण सेट अप के साथ एक १.० ऑप्टिकल घनत्व फिल्टर के साथ संयुक्त के रूप में कदम 2.1.4 में वर्णित है । यहां तक कि इन शर्तों के तहत, तथापि, हमने पाया है कि निरंतर रोशनी स्ट्रीम मोड अधिग्रहण के लिए आवश्यक 2 मिनट से अधिक एक अधिग्रहण अवधि के लिए अनुमति नहीं दी । एक मजबूत रोशनी या अधिग्रहण इस सीमा से अधिक अवधि के गैर में परिणाम कर सकते है विशिष्ट वैश्विक Ca2 + प्रतिक्रियाओं और/या जीवाणु आक्रमण प्रक्रियाओं, संभवतः धूप से जुड़ा के निषेध में । जबकि इमेजिंग स्थानीय Ca के2 + प्रतिक्रियाओं पर अब कैनेटीक्स अधिक संवेदनशील का पता लगाने का मतलब है, के साथ संभव हो सकता है वर्तमान राज्य ऐसी इमेजिंग केवल 15 मिनट शिगेला आक्रमण प्रक्रिया के एक सीमित समय अंश पर प्रदर्शन किया जा सकता है । पूरी प्रक्रिया को कवर करने के लिए, हम 2-ंयूनतम स्ट्रीमिंग अधिग्रहण की लगातार श्रृंखला का प्रदर्शन किया । इस समय अंतराल प्रारंभिक स्थानीय और वैश्विक Ca का पालन करने के लिए पर्याप्त है2 + संक्रमण प्रक्रिया की शुरुआत पर प्रतिक्रियाएं और शिगेला वंय-प्रकार तनाव और उसके isogenic ipgD उत्परिवर्ती16में महत्वपूर्ण अंतर स्थापित करने के लिए । एक अति संवेदनशील कैमरे के विकास के लिए और अधिक fluorophore रोशनी की तीव्रता को कम करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति हो सकती है और विस्तारित समय पर स्थानीय ca2 + इमेजिंग प्रदर्शन, इस प्रकार और अधिक क्षणिक सीए 2 के समय संकल्प में सुधार+ संकेत ।
स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाओं और बैक्टीरियल आक्रमण साइटों के बीच स्थानिक सहसंबंध:
सूक्ष्मजीवों द्वारा प्रेरित संकेत घटनाओं के स्थानीय पहलू के कारण, यह स्थानीय सीए का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है2 + रोगज़नक़-मेजबान सेल बातचीत की साइटों के साथ उनके सहयोग के संबंध में संकेत । यह दो प्रकार के विचार उठे । सबसे पहले, सभी कोशिकाओं को संक्रमित नहीं किया जा सकता है, और सभी सूक्ष्मजीवों संकेतन ट्रिगर नहीं हो सकता है । शिगेलाके लिए, केवल एक अल्पसंख्यक जीवाणुओं के आक्रमण को ट्रिगर करते हैं, और सभी कोशिकाएं संक्रमित नहीं हो सकती हैं । हमारे प्रयोगों में, MOI इतना समायोजित किया गया था कि एक कोशिका जीवाणु आक्रमण के एक ०.७-1 फोकस रूपों. घावों की उच्च संख्या/सेल व्यक्तिगत आक्रमण की घटनाओं के विश्लेषण के लिए एक संभव हस्तक्षेप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और, इसके विपरीत, कम संख्या विशेष रूप से क्षणिक transfected कोशिकाओं का अध्ययन करते समय, विश्लेषण भी जटिल प्रदान कर सकते हैं. हमने पाया है कि अभिकर्मक दक्षता कोशिकाओं के कम से 30% तक पहुंचने के लिए प्रबंधनीय संख्या को दोहराने प्रयोगों की संख्या नीचे लाने की जरूरत है । दुसरा, शिगेला आक्रमण करेल आसानी से चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है. अन्य प्रक्रियाओं के लिए, अन्य प्रतिदीप्ति-आधारित खोज विधियों का उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि अधिकांश प्रयोगात्मक सेट-अप में, स्थानीय Ca के लिए आवश्यक अधिग्रहण स्ट्रीम2 + इमेजिंग precludes अवधि के दौरान अधिग्रहण के अंय प्रकार हैं । यह फंसाती है कि इस प्रक्रिया का विश्लेषण इस धारा के दौरान महत्वपूर्ण गति दिखाने के लिए स्थानीय Ca के साथ अपने स्थानिक सहसंबंध2 + संकेतों की अनुमति नहीं होनी चाहिए । हालांकि इस शिगेला आक्रमण की घटनाओं है कि कई मिनट से अधिक एक ही सेल क्षेत्र के लिए स्थानीयकरण के लिए मामला है, उच्च gram प्रक्रियाओं प्रबंधनीय नहीं किया जा सकता है या शायद छोटे अधिग्रहण धाराओं की आवश्यकता होगी ।
स्कोरिंग और स्थानीय Ca के विश्लेषण2 + प्रतिक्रियाएं:
जबकि ग्लोबल ca2 + प्रतिक्रियाएं आसानी से पता चला रहे हैं, स्थानीय ca के2 + प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के छोटे आयाम और अवधि के ऊपर वर्णित फ्लोरोसेंट संकेतों के अधिग्रहण के अनुकूलन की आवश्यकता है । यह भी महत्वपूर्ण है कि सख्त मानदंड पृष्ठभूमि विविधताओं के ऊपर संकेतों अंतर लागू कर रहे हैं । एक नियम के रूप में, हम एक Ca के रूप में स्कोर2 + औसत Fluo-4 प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि संकेत है कि कम से तीन लगातार 30 एमएस अधिग्रहण में बेसलाइन रूपांतरों तक पहुंचता है । यह प्रतिक्रिया स्थानीय के रूप में माना जाता है अगर एक ही औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखा सेल के किसी अंय क्षेत्र ऐसी वृद्धि नहीं दिखा । स्थानीय Ca के स्कोरिंग2 + विभिन्न नमूनों में प्रतिसाद यदि इन नियमों को व्यवस्थित रूप से लागू किए जाते हैं, तो बड़ी कठिनाइयों का कारण नहीं होना चाहिए । हमारे हाथ में, स्थानीय Ca के कम आवृत्ति2 + बैक्टीरियल आक्रमण के साथ जुड़े संकेतों और सेल के 5-20% से लेकर विश्लेषण एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व किया । जैविक पिछले पैराग्राफ में विस्तृत विविधताओं के अलावा, तथ्य यह है कि केवल एक विश्लेषित आक्रमण की प्रक्रिया के एक अंश को इसी धारा भी इस कम आवृत्ति के लिए योगदान देता है । इस कम आवृत्ति के कारण, नमूनों के बीच अंतर स्थापित करने के लिए एक सांख्यिकीय महत्व तक पहुँचने के लिए नमूना आकार का अनुमान लगाने के लिए पायलट प्रयोगों पर एक शक्ति परीक्षण प्रदर्शन कर सकते हैं.
भविष्य अनुप्रयोगों:
हमें विश्वास है कि प्रोटोकॉल बाहर काम किया स्थानीय ca का विश्लेषण करने के लिए2 + एक शिगेला आक्रमण के दौरान संकेत छवि स्थानीय सीए के लिए मददगार होगा सभी प्रक्रियाओं है कि अधिग्रहण अवधि के दौरान विशेष रूप से सीमित रहने के लिए2 + प्रतिक्रियाएं । जबकि सीए2 + सिग्नलिंग बहुमुखी है, स्थानीय ca2 + संकेत प्लाज्मा या intracellular झिल्ली पर होने वाली प्रक्रियाओं के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक हो सकता है, जहां संकेतों के प्रारंभिक बिंदु स्रोत रहते हैं । इस प्रकार, माइक्रोबियल-मेजबान सेल बातचीत के दौरान, स्थानीय Ca2 + संकेत प्लाज्मा झिल्ली पर चिपकने वाला या इनवेसिव प्रक्रियाओं या रोगज़नक़ युक्त रिक्तिकाएं की intracellular झिल्ली पर होने वाली करने के लिए प्रासंगिक हो सकता है । दूसरी ओर, हम विस्तारित संक्रमण कैनेटीक्स पर वैश्विक Ca2 + संकेतों का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल किसी संक्रमण के दौरान सामांय कक्ष फिजियोलॉजी को प्रभावित करने वाली प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक हो सकते हैं, जैसे किसी transcriptional प्रोग्राम का विनियमन या कोशिका मौत रास्ते रोगजनकों द्वारा ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.
Acknowledgments
हम धंयवाद जेनी ली Thomassin पांडुलिपि संपादन में उसकी मदद के लिए । इस कार्य को ANR पलाश MITOPATHO और PATHIMMUN, पलाश से Labex Memolife और पीएसएल IDEX Shigaforce के सहयोग से किया गया । Chunhui सूर्य चीन छात्रवृत्ति परिषद से एक पीएच. डी अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है । लौरेंत Combettes और गाइ ट्रॅन वान Nhieu एक WBI-फ़्रांस एक्सचेंज Tournesol प्रोग्राम के प्राप्तकर्ता है N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, शौकीन्स डे ला सभ्य Scientifique, Ministère Français des चक्कर étrangères एट européennes, Ministère डे l'Enseignement supérieur एट डे ला सभ्य लीए ले काडर देस Partenariats Hubert Curien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
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