Immunology and Infection

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca^{2 +}応答をイメージング

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57728

Yasmine Smail^1,2,3,4, Chunhui Sun^1,2,3,4, Laurent Combettes⁵, Guy Tran Van Nhieu^1,2,3,4

¹Equipe Communication Intercellulaire et Infections Microbiennes, Centre de Recherche Interdisciplinaire en Biologie (CIRB), Collège de France, ²Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm), U1050, ³Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS), UMR7241, ⁴MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Sciences et Lettres, ⁵Inserm, UMRS1174, Université Paris Sud

Summary

ここでは、赤痢菌に感染した HeLa 細胞によるカルシウム (Ca^{2 +}) 応答を可視化するためのプロトコルを提案する.細菌感染のパラメーターを最適化して Ca^{2 +}蛍光プローブとイメージングにより、非定型グローバルおよびローカル Ca^{2 +}シグナルによる細菌感染速度の広い範囲に、特徴付けられます。

Abstract

Ca^{2 +}は、すべての知られている細胞プロセスにかかわるユビキタスイオンです。全体的な Ca^{2 +}応答は細胞の運命に影響を与える、無料 Ca^{2 +}細胞質濃度で、内部の店舗や細胞膜のチャネルを通じて流入からリリースにリンクされているローカルのバリエーションは皮質細胞プロセスを調整します。病原体に付着またはホスト細胞トリガーグローバルおよびローカル Ca^{2 +}シグナルに影響を与える可能性がありますホスト細胞膜の基礎となるアクチン細胞骨格の再編に侵入します。これらのイベントは、拡張動態上擬似確率的に低周波数で発生可能性があります、ために、病原体による Ca^{2 +}シグナルの解析は対処する必要がある主要な技術的な課題を発生させます。

ここで、上皮細胞の赤痢菌の感染時にグローバルとローカルの Ca^{2 +}シグナルの検出のためのプロトコルを報告します。これらのプロトコルの工芸品は、長期の暴露にリンクし、関連付けられている Ca^{2 +}蛍光プローブの励起光損傷は厳しく、中に定義された時間の期間にわたって集録パラメーターを制御することにより対処法赤痢菌侵略。厳密な化学プローブ蛍光 4 を使用して拡張の感染動態の中に振幅とグローバルのゾル性細胞質の Ca^{2 +}シグナルの頻度を分析する手順が実装されます。

Introduction

Ca^{2 +}細胞骨格の再編、炎症性応答、およびホスト病原体の相互作用¹^,²^,³に関連する細胞死経路を含むすべての知られている細胞プロセスを調整します。生理学的な条件の下で基底細胞内 Ca^{2 +}濃度低い nm の波長範囲の何百ものですが、アゴニスト刺激時に一過性に増加を受けることができます。これらのバリエーションは、プラズマと小胞体膜にポンプやチャネルの作用により振動現象をしばしば示します。これらの振動のパターンと期間、期間、および Ca^{2 +}増加の振幅によって特徴付けられる細胞は、ターンでは、Ca^{2 +}のコード⁴^,^{5 として知られている特定の応答をトリガーによって復号化}.病理学の条件下でのゾル性細胞質の Ca^{2 +}濃度の持続的な増加は、ミトコンドリア膜の透過と pro アポトーシスや壊死の要因⁶^{のリリースに関連する細胞死につながる可能性があります。} ⁷。

赤痢、細菌性赤痢の病原には、タイプ III の分泌システム (T3SS)⁸^,⁹を使用して宿主細胞にエフェクターを注入することで上皮細胞が侵入します。宿主細胞の赤痢菌の侵入は、ローカルおよびグローバルな Ca^{2 +}シグナル、T3SS によって誘発されるに関連付けられます。細孔形成に関しては毒素、宿主細胞膜に挿入し T3SS エフェクタの注入はほとんどの場合が必要 T3SS トランスロコン PLC と (1、4、5) イノシトール三リン酸 (InsP3) の活性化に関与-従属 Ca^{2 +}リリース。ローカライズされた PLC 刺激と赤痢菌侵入結果、になって長期 InsP3 依存性 Ca^{2 +}のサイトで重合のアクチンの蓄積の組み合わせ^{10 月}に発売します。タイプ III エフェクター IpgD、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2)-4-ホスファターゼ、PIP2、それによりローカル Ca^{2 +}の閉じ込めに貢献する InsP3 を生成する PLC の利用可能な基質の量を制御するローカル量に制限細菌の侵入サイト¹¹^,¹²の応答。赤痢菌の侵入サイト¹⁰でアクチンの重合に寄与するこれらローカル Ca^{2 +}応答可能性があります。ただし、赤痢菌、によって誘発される、またグローバルの Ca^{2 +}反応が細菌侵入プロセスに不可欠であるコネキシン hemichannels プラズマ膜の開口部と、細胞内 ATP の放出をトリガーコンパートメントです。リリースされた ATP パラクリン的演技が感染した細胞の隣の細胞内 Ca^{2 +}振動応答を刺激します。IpgD は遅いダイナミックスと常軌を逸した分離応答に全体的な Ca^{2 +}応答を形成するための責任も。最終的には、長期にわたる細菌感染時に IpgD は InsP3 を介した Ca^{2 +}シグナルの抑制につながります。Ca^{2 +}シグナル伝達とその干渉、IpgD 遅延 Ca^{2 +}-焦点接着構造の分解との早期剥離につながる依存カルパイン活性化感染細胞¹³。

一方、Ca^{2 +}シグナルは、病因の重要な側面に関与している、微生物の使用は古典的なアゴニスト研究では見られない技術的な課題の数を発生させます。説明プロトコルここでインジケーターを使用して一般的に使用される蛍光 Ca^{2 +}化学蛍光 4 我々は赤痢菌の感染時にローカル Ca^{2 +}信号の特性評価に設計されました。細菌のエフェクターの Ca^{2 +}シグナル伝達の役割の特性評価に必要なその定量的評価の実施手順と同様、これらの信号の検出のための重要な手順を説明します。

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Protocol

1. 準備

細菌の準備
1. 細菌をプレート-赤痢菌野生株 AfaE 双球菌 (M90T AfaE) を表現する-、トリプチ大豆 (TCS) 寒天プレート含む 0.01% コンゴーレッド (CR) と 37 ° C で 18 h にそれらをインキュベート
  注: その再現性を高めるため 1.1.1 手順で取得した赤痢菌プレートは 4 ° C で格納され、CR の媒体上のすべてのコロニーは最終的に時間をかけて赤回すために、一週間以内使用します。
2. 縞板から 3 の赤色のコロニーを選ぶことによって TCS スープ前培養を接種します。
  メモ: 3 植民地で接種はその病原性プラスミドは、遺伝子組換えを受けている単一のクローンを拾う確率を制限する実行されます。
3. 200 rpm で 37 ° C で 16 時間振動のインキュベーターで液体細菌文化を育てます。75 mg/mL の最終的な集中にアンピシリンを追加します。抗生物質の過剰が大きな病原性プラスミドの損失につながる可能性がありますので、抗生物質濃度は最小発育阻止濃度 x 3 を超えない。
  注:赤痢菌の病原性プラスミドの維持は、適切な抗菌薬濃度を添加したクロムプレートに細菌文化をメッキすることによって確認する必要があります。白人の植民地の存在は、プラスミドの損失を示します。
4. 1: 100 希釈で前培養と TCS 文化を接種します。2 h 200 rpm での振動のインキュベーターで 37 ° C でそれを孵化させなさい。600 の光学濃度は、nm (外径_{600 ナノメートル}) は 0.2 - 0.4。
5. 21 ° C で 13,000 x g で 2 分間培養を遠心し、EM 媒体 (の 120 mM の NaCl、7 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.8 mM MgCl₂、5 mM グルコースおよび 25 mM HEPES の同等のボリュームでペレットを再懸濁します、pH 7.3 を =)。
6. 0.1 の最終的な OD_{600 ナノメートル}で EM バッファー内細菌懸濁液を希釈してすぐに使用または 21 ° C で保存し、次の 60 分以内使用します。
セル準備
1. DMEM ブドウ糖 1 g/L と HeLa 細胞 10% 牛胎児血清 (FCS) を添加した 10% CO₂と 37 ° C で育てて.成長する TC-7 4.5 G/L グルコース、DMEM で成長 10 %fcs と 10% の CO₂を含む 37 ° C の定温器で非必須アミノ酸を含みます。
2. コンフルエントの状態にリンクされているセルメンテナンス、成長接触阻止を避けるために定期的にセルを分割します。これは Ca^{2 +}プローブ荷重/トランスフェクション効率にとって重要です。
3. 3 x 10⁵細胞/ウェル HeLa 細胞の実験の前に日の密度で 6 ウェルプレートで滅菌 25 mm 径円形カバーガラス上 HeLa 細胞をプレートします。
4. TC 7 セル、trypsinize し、セルをカウントします。4 x 10⁵細胞/ウェルでそれらの種子し、10% の CO₂の 37 ° C で 5 ~ 7 日間それらを孵化させなさい-偏光は、実験前にインキュベーター。
  1. 細胞培養液を実験の日まで毎日更新します。
    注: ガラス底直径 35 mm の使い捨て室は、coverslips 含む井戸の代替としても使用可能性があります。後者は使用すると、加熱ステージ温度制御や目標は不十分で、サーモスタットインキュベーション室にマウントされている場合、顕微鏡ステージが必要です。
実験の日メディアを取り出して、洗浄セル 3 x は 21 ° C で 1 mL EM 媒体
3 mm の蛍光 4時¹⁴ 21 ° C で 30 分間 EM バッファー内セルを読み込む
注意: サブ合流 HeLa 細胞の読み込みには、主要な問題は発生しません分極された TC 7 セルの読み込みが多くの場合異種と効率悪い。これらの細胞のための分散剤の添加により積載効率が向上することがわかった、プルロニック酸 — 最終濃度 0.1% と 20 μ M からの最終的な集中で陰イオン輸送阻害剤 bromosulfophtalein ので、蛍光色 4 AM 含有 EM。レシオメトリック化学の使用プローブまたは遺伝子エンコードは、フレットのプローブを必要とするデュアル取得はローカル Ca^{2 +}応答の計測に必要な取得の速度と互換性がありません。
サンプル 3 を洗って x EM をバッファーに格納し、さらに 1 mL の午前部の加水分解を許可する 21 ° C で EM バッファーにそれらを孵化させなさい。使用蛍光-4 は、すぐにまたは (21 ° C で維持される) 次の 90 分以内に細胞を読み込まれます。

2. 感染症およびローカル Ca^{2 +}応答画像集録

イメージングの商工会議所またはガラス下部室の蛍光色 4 ロードセルを含む coverslip を配置します。ガラス底使い捨ての部屋のセル換散から生じる可能性のある化合物を削除するのには EM バッファーで 3 x またはイメージング室のサンプルを洗います。1 mL の EM バッファーを追加します。
33 ° C に加熱倒立蛍光顕微鏡ステージでチャンバーを配置します。
注: この温度は、現地の反応を可視化する赤痢菌侵入プロセスと互換性のある最適な温度と Ca^{2 +}反応の減速間の妥協として選択されます。私たち使用浸漬油目的 X 63 (NA = 1.25) 位相コントラストリングを装備。
顕微鏡フィールドを選択し、集録パラメーター、露光時間を含むとビニング蛍光 4 蛍光信号を最適化するために、必要に応じてを設定します。
注: ローカル Ca^{2 +}イメージングの主要な課題は、低振幅と、応答の小さい持続期間少なくとも 30 さんの取得を必要とするいくつか市販裏面照射型 EM CCD や C-MOS カメラを提示必須蛍光色 4 を使用してローカルの Ca^{2 +}応答を検出する感度。検出感度がまた光損傷または高周波蛍光色 4 の蛍光励起にリンクされている自発的な応答などの工芸品を制限する重要な問題です。ここでは、470 の LED ベース照明 480 ± 40 nm バンドパス励起フィルター、ダイクロイックフィルターは 505 nm 1.0 中立的な密度のフィルターと組み合わせて、最大強度の 5% で使用される 527 ± 30 nm バンドパス排出と nm を用いてこれらの問題を最小限に抑える限られた期間の買収のストリーム。120 s ストリームのバッチによってローカル Ca^{2 +}シグナルの解析を定期的に行った。これらの低照明条件下で蛍光退色は 2 分ストリーム集録中に観察されなかった.別のフィールドを使用、同じサンプルの連続した買収を実行できます。一般的なルールとして最初取得ストリームは自発的な応答の不在の保障を細菌刺激のない状態でコントロールフィールドで実行されます。自発的な反応が認められた場合、応答が観察されなくなるまでサンプルが EM バッファーで洗浄しました。
細菌をサンプルに追加するには、商工会議所から 500 μ L の EM バッファーを削除し、最終的な OD_{600 ナノメートル}0.05 に対して選択した顕微鏡によるフィールドの移動を避けるために適切なケアを取得するステップ 1.1.6 で準備して細菌懸濁液 500 μ L を追加ボリュームは、細菌と細菌細胞のサンプルの上に均一に分布の適切な混合を確認します。
細菌の添加によって買収を実行します。また、買収 10 分使用条件下での細胞の上に土砂を細菌に必要な時間に対応する細菌の添加を行います。買収ストリームの最後には、細菌の細胞と細菌侵入サイトに関連付けられた膜フリルに連絡を視覚化する選択したフィールドの位相コントラストの画像を取得します。
画像関連の買収やファイル貯蓄、全体のプロセスをカバーする新しいフィールドの選択の期間に適している間隔でステップ 2.5 のように取得手続きを繰り返します。
注:赤痢菌がわかった 20 分の 5 分ごとを買収にストリーム次の侵略イベントの大部分をカバーできる 10 分の細菌堆砂
取得手続きの最後に、Ca^{2 +}イオノフォアイオノマイシンサンプル Ca^{2 +}信号の最大振幅を決定するための 2 μ M の最終的な集中を追加します。画像を集録信号安定化、通常 10 分以内までのすべての 3-5 秒。
10 mM の Ca^{2 +}蛍光信号を決定するための最終濃度 Ca^{2 +}グリコールエーテルジアミン四酢酸キレート剤を追加することによって従ってください。画像を集録信号安定化、通常 10 分以内までのすべての 3-5 秒。
注: グローバル Ca^{2 +}バリエーションの比較的低速のダイナミクスのため実行これらの買収 Ca^{2 +}連続治療中同じミクロな場にイメージングを可能にする (ストリーミングモード) ではないすべての 3-5 秒。

3. 分析

同じ収益率でベースライン蛍光 ΔF/F₀ΔF が利益 (率 ROI) の地域の平均蛍光強度の変化を表すと F₀の割合として時間をかけてゾル性細胞質の Ca^{2 +}バリエーションを表現、細胞に欠けている分野の非関連する領域が減算されます。
1. ベースラインレベルに対応する、様々な分野で各セルの基底蛍光レベルを削除します。これらのレベルは低周波により明確に定めることができるし、指定したストリーム取得のローカル Ca^{2 +}応答期間の比較的短い。
  注: は、質問への対応と検討した病原性モデルの顕著な特徴を定量化します。古典的なさまざまなパラメーターは、Ca^{2 +}シグナル、ローカルまたはグローバル Ca^{2 +}応答、持続時間、振幅、これらの応答の周波数を示す細胞の頻度などを分析する考慮されます。赤痢菌およびローカル応答の場合の分析の別の重要な側面の細菌侵入サイトと応答の空間関連付けることです。
グローバルまたはローカル応答を示す応答細胞の割合を定量化するには、時系列 4 蛍光強度の変化に対応する細胞で Roi を描画します。
1. 偽陽性を得点を避けるためにローカルの Ca^{2 +}応答振幅の平均蛍光強度セル基準の 3 倍の上記背景バリエーションや、少なくとも 200 ms の期間などを識別するために厳格なパラメーターを設定します。
  注: 一般的なルールとしても、小さなローカル Ca^{2 +}反応が自分のプロファイルで任意のバックグラウンドノイズと区別できます。Roi は、ローカル変化の検出を実現する十分な蛍光信号を統合するのに十分な大きさにする必要があります。4 蛍光検出の強さに応じてこれらの Roi は、2-5 mm の直径のサークルに対応があります。
2. 応答がローカルまたはグローバルかどうかを決定するため、同じセルの異なる地域の 2 地域で平均蛍光 4 蛍光強度の変化を測定します。
  注: 多数のセルの解析は、イメージングソフトウェアは、選択された領域の期間平均蛍光強度の変化のオンライン画面の表示を許可するの使用によって促進されます。市販のイメージングソフトウェア、そのようなオプションがありますが、これはROI 強度進化プラグインを使用して氷フリーウェアを使って行うこともできます。
3. ローカル応答を示す細胞の割合を決定します。
  ※ この割合をサポートするための十分な数にする必要があります [顕微鏡] フィールドで分析セルの合計数から算出しています、統計的に有意な非パラメトリックテストを使用します。
4. 現地の反応の期間を決定します。
  注: ローカル Ca^{2 +}応答さらに区別できる期間は彼らによると (すなわち、 500 ミリ秒未満、5 や 10 秒間以上の 10 s)、赤痢菌侵入サイトとの関連付け。
応答の振幅を定量化します。まず、最大 Ca^{2 +}およびセル背景レベルステップ 2.1.7 のように決定を調整します。蛍光色 4 負荷をセルごとに異なる場合がありますので、フィールドの個々のセルのこれらの決定を実行します。
1. 最大応答の相対的な割合として応答の振幅を表します。
2. サンプルの応答の振幅に潜在的な相違点を分析するパラメトリックテストに続いて、正規性の検定を利用した統計的テストを実行します。
3. 対応する位相コントラストの画像で視覚化される細菌膜フリルにそれぞれ局在により細菌侵入サイトと比較してこれらの応答の関連付けを決定します。

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Representative Results

赤痢菌の侵入は非定型の長期的なローカル Ca^{2 +}応答に関連付けられています。

上記のプロトコルに従い WT赤痢菌と挑戦された蛍光 4 読み込まれた HeLa 細胞と Ca^{2 +}信号を解析するストリームを買収を行った。代表的な実験は単一セルと対応する位相コントラスト (図 1 a、左の関心領域内平均 4 蛍光プローブの蛍光強度のコマ撮り画像シリーズを図 1に示すパネル)。赤痢菌侵入サイトは、位相コントラスト (図 1 a, 矢印) で検出された膜フリルが特徴です。無料の細胞内 ca^{2 +}が赤痢菌侵入サイトさまざまな振幅と感染の世界的な増加によって続いて 2.5-5 s (図 1 aと1 b矢印) に至る期間で観測された増加する非定型のローカルセル (図 1 b矢印)。

タイプ III エフェクター IpgD は、ローカルからグローバルな Ca^{2 +}応答の HeLa 細胞における赤痢菌によるへの移行を調節します。

III エフェクター IpgD、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸ホスファターゼ、この後者のひずみ誘起よりグローバルなより少ないことを示される野生型赤痢菌と型の同質遺伝子変異株欠損による Ca^{2 +}シグナルの解析11.3 ± 4.4 (SEM) と長い期間 (RATPs) と非定型のローカル応答 %、40.3 ± 7.5 (SEM) WT と ipgD 変異体、それぞれ (図 1)¹⁵の場合で全体的な応答と反応する電池の %。この ipgD 変異は、ローカル WT ひずみと同様の周波数応答を取得します。

赤痢菌は、InsP3 依存性グローバル Ca^{2 +}長期感染動態の中に HeLa 細胞の増加を抑制します。

拡張感染動態上グローバル Ca^{2 +}応答の計測は、30 分の野生型赤痢菌(図 2 a) の課題を次の応答の周波数の減少を指摘しました。Ca 2 + 応答の周波数の同じような減少は、野生型赤痢菌¹⁵と 30 分のため感染 TC 7 細胞で観察された.Ca^{2 +}アゴニストヒスタミンの用量依存的細胞反応の定量化は、赤痢菌感染の後期段階で、InsP3 依存性 Ca^{2 +}放出の抑制を示しています。WT赤痢菌は、さらに潜伏、振幅と Ca^{2 +}応答の頻度は急激に低下を認めた (図 2 b) 後の感染症の最初の 30 分の間に非定型の孤立した Ca^{2 +}反応にします。

図 1.赤痢菌の侵入の間にローカルおよびグローバルの Ca^{2 +}応答します。HeLa 細胞は蛍光 4時搭載され、WT赤痢菌に挑戦します。(A) 左側のパネルを示しています位相差像。右側のパネルは、右側に描かれている色コードと蛍光色 4 蛍光平均強度の時系列を示しています。集録の開始からの時間は、秒、細菌の挑戦後 10 分で示されます。矢印は、浸潤巣を示します。描かれているサークルは、対応する色でトレースが基準線の上蛍光 4 平均蛍光強度の変化を表す (B) の分析領域に対応します。矢印は、現地の反応を示します。矢印は、全体的な応答を示します。(C) Ca^{2 +}応答の持続時間の決定を描いたスキームです。水平の点線を示します基底 Ca^{2 +}濃度 (F₀);垂直のバーは、背景のバリエーションを示します。縦の点線は、応答の最大振幅を示します水平のバーは、半最大振幅に決定される応答の期間を示します。(D) これはローカル応答を示す応答細胞 ± SEM の割合、全体的な Ca^{2 +}応答誘発感染症 5 分後 WT赤痢菌(暗い灰色のバー) または ipgD 変異体 (明るい灰色のバー)。RATPs が最新の以上 5 s のNのローカルの ca 2 + 応答 = 4;> たびに、60 セルです。ウィルコクソン検定 *P < 0.05;P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.赤痢菌感染の拡張動態の中に全体的な Ca^{2 +}応答の抑制。(A) 上方の青色矢印が示された濃度で細菌およびヒスタミンのチャレンジのタイムスケールを表します。このパネルを示します単一細胞の代表的なトレースグローバル Ca^{2 +}バリエーション WT赤痢菌(緑) によって感染、次と ipgD 変異株 (オレンジ)。(B) このパネルは 90 分の示された株感染細胞の 0.5 μ M のヒスタミンの刺激時に、最大の応答に対する Ca^{2 +}応答の振幅の比率を示しています。固体の鉄棒は、最大の割合の平均値を表します。ウィルコクソン検定 * *P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

本稿では、我々は、全体的な Ca^{2 +}応答と同様に、赤痢菌侵入の比較的短い動態の中に赤痢菌の拡張動態の中にローカル Ca^{2 +}シグナルに従う設計プロトコルについて説明します。以下、Ca^{2 +}の検出能力を最適化に対処する必要がある問題を見つけることができますキーは生物的プロセスとの干渉を最小限に抑えながら信号します。

化学対Ca^{2 +}プローブをエンコードされた遺伝子。

ローカル Ca^{2 +}バリエーションのイメージは、その高い量子収率とその高速応答ダイナミクスのため蛍光 4 化学プローブを使用しました。取得に必要な速度はまたデュアル波長集録を実行できないためレシオメトリックプローブの使用を排除します。ただし、病原性微生物の使用は、Ca^{2 +}化学プローブを用いた標準的な手順を妨げる可能性があります。たとえば、長時間細胞感染赤痢菌で 60 分以上はホスト細胞の血しょう膜の病原体による変化のためおそらく化学プローブ装荷の任意のセルを防ぎます。一貫して、このプローブの細胞質の損失のための長い感染動態の中に細胞の蛍光色 4 蛍光性の低下が観察されます。したがって、買収の終わりに最大の Ca^{2 +}濃度で蛍光を決定するイオノマイシン添加などのコントロールを実装する応答性細胞を識別するために重要です。また、偏光腸管上皮細胞の病原体感染に関連する表示と Ca^{2 +}プローブの荷重を難治性ある特定のローディングのプロシージャを必要します。遺伝子にエンコードされた Ca^{2 +}記者 (GECR) の使用は、いくつかのこれらの問題を解決するために役立つかもしれないが、それはまた他の課題を紹介します。ホスト細胞システムでトランスフェクション効率悪い感染収量と重ね合わせるという場合は特に重大な制限があります。さらに、ほとんど GECRs の Ca^{2 +}バリエーションに対する反応性の特徴は、ローカル Ca^{2 +}解析に必要な高速動力学と互換性がありません。最後に、GECR の式は病原体媒介のプロセスを妨げる可能性があります。我々は Ca^{2 +}ホスト病原体の相互作用の中にシグナル伝達の研究用に GECR の使用を説明することはしません。さまざまな「高速応答」GECR の最近および進行中の工学研究者が将来の研究での使用を再検討に値するだろうおそらく。

細菌感染の間にローカル Ca^{2 +}応答の取得のタイミング。

ローカル Ca^{2 +}応答の計測では、画像集録 4 蛍光プローブの持続的な蛍光励起を十三の高速が必要です。高周波数獲得にリンク光損傷のため蛍光励起光の強度は我々が持っていた 30 さんを超えない露光時間で十分な信号対雑音比を取得する必要がある最小化され、特に重要です。その最大強度の 5% で LED システムを使用して良い結果取得セットアップ手順 2.1.4 と 1.0 光学密度フィルターと組み合わせて使用。これらの条件下でもしかし、我々は取得期間 2 分以上のストリームモード獲得に必要な連続的な照明を許可しなかったことを発見します。強い照明や買収の期間がこの制限を超えるは、おそらく光損傷にリンクの細菌侵入プロセスの抑制および/または非特異的で全体的な Ca^{2 +}応答可能性があります。一方、ローカル Ca^{2 +}応答長い動態上の画像は、現状そのようなイメージングは 15 分赤痢菌侵入プロセスの期間限定一部経由でのみ実行することができますでより高感度の検出手段とも可能です。全体のプロセスをカバーするには、連続した 2 分ストリーミング買収を行った。この時間間隔で応答に続く初期ローカルおよびグローバルな Ca^{2 +}感染プロセスの開始時に、赤痢菌野生型株とその同質遺伝子の ipgD 変異¹⁶に有意差を確立するに十分です。高感度カメラの開発は、さらに蛍光照明の強度を低減し実行ローカル Ca^{2 +}イメージング拡張期間にわたって、多くの一時的な Ca 2 +^{の時間分解能を向上させる研究者を許すことができます。}信号。

ローカル Ca^{2 +}応答と細菌侵入の空間相関:

微生物による主セルシグナリングイベントの地元の側面のため、病原体ホスト細胞の相互作用のサイトとの関連付けに関してローカル Ca^{2 +}シグナルを研究することが重要です。これは 2 種類の考慮事項が発生します。最初に、すべてのセルを感染していないことがありますとすべての微生物はいないシグナル伝達を引き起こす可能性があります。赤痢菌細菌の少数だけトリガーは侵略とすべてのセルが感染していないことがあります。その 1 つのセルを形成して、0.7 -、MOI が調整された実験では、細菌の侵入の 1 焦点。巣/セルの数字が大きいほど個々の侵略イベントの分析のための可能な干渉につながる可能性がありますそして、逆に、低い番号可能性がありますレンダリング分析複雑すぎる特に一時的に transfected セルを勉強しています。トランスフェクション効率を管理しやすい番号に複製の実験数ダウンをもたらす細胞の少なくとも 30% に達する必要があることがわかった。第二に、位相差顕微鏡による赤痢菌侵入サイトを容易に検出できます。他のプロセスの他の蛍光ベースの検出方法をされる可能性があります。重要な側面は、最も実験的セットアップでローカル Ca^{2 +}イメージングに必要な買収ストリーム排除期間中に獲得の他の種類。これは、分析プロセスローカル Ca^{2 +}シグナルとの空間的関係を許可するようにこのストリームの中に重要な運動を表示しないことを関係づけます。数分以上を同じセル領域にローカライズする赤痢菌侵入イベントの場合は、高い運動性プロセス管理できない場合があります。または短い集録ストリームはおそらく必要と。

得点とのローカル Ca^{2 +}応答解析:

全体的な Ca^{2 +}応答を容易に検出、小さな振幅と持続時間のローカル Ca^{2 +}応答の検出上記蛍光信号の取得の最適化が必要です。背景変化より上の信号を区別するために厳格な基準を適用することが重要です。原則として我々は Ca^{2 +}シグナルとして、少なくとも 3 つの連続した 30 ms 買収のベースライン変動 x 3 に達する平均蛍光 4 蛍光強度の増加を獲得します。この応答は、同じ平均蛍光強度を示すセルの別の地域ではそのような増加が表示されない場合は、ローカルと見なされます。ローカル Ca^{2 +}反応さまざまなサンプルでの得点は発生しません大きな問題体系的にこれらの規則が適用される場合。私たちの手で細菌の侵略に関連付けられているローカル Ca^{2 +}信号の低周波と主要なハードルを表す分析セルの 5-20% に至る。を超えて前の段落では、分析された浸潤過程の一部にも対応するストリームのみがこの低周波に貢献する事実の詳細な生物学的変化。この低周波のためサンプルの違いを確立する可能性がありますを巻き込む統計的有意性に到達するためのサンプルサイズを推定するためのパイロット実験電源テストを実行します。

将来のアプリケーション:

プロトコルがローカル Ca^{2 +}を分析する赤痢菌の侵入の間には、空間のまますべてのプロセスに対するイメージローカル Ca^{2 +}応答に役立つ限定取得期間中に信号を働いたことと考えています。Ca^{2 +}シグナルは汎用性の高い、ローカル Ca^{2 +}シグナルは、プラズマまたは信号の初期に点光源が存在する細胞内の膜に発生するプロセスに最も関連する可能性があります。このように、微生物-宿主細胞の相互作用の間にローカル Ca^{2 +}シグナルかもしれませんプラズマ膜接着または侵襲的なプロセスに関連する、または病原体を含む細胞内の膜で発生する空胞。その一方で、考案した拡張の感染動態上グローバル Ca^{2 +}信号を解析するプロトコルが転写プログラムの規制など、感染中に一般的な細胞生理学に影響を与えるプロセスに関連する可能性があります。または病原体による細胞死経路。

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Disclosures

著者申告するものがあります。

Acknowledgments

ジェニー・リー Thomassin は、編集原稿で彼女の助けを感謝いたします。仕事は、ANR によって支えられた助成金 MITOPATHO や PATHIMMUN、Labex Memolife と PSL アイデックス Shigaforce から付与します。春暉太陽中国公費から博士の付与の受信者であります。ローラン Combettes 男 Tran ヴァン状態、WBI フランス exchange Tournesol プログラム N ° 31268YG の受信者 (Wallonie ブリュッセル国際、フォンデラ凝った日仏、ミニステール Français デアフェール étrangères et アーツアンドクラフツ、ミニステールデ期高等エデラ凝った dans ル幹部デ Partenariats ヒューバート Curien)。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin