Summary
Her presenterer vi for å visualisere kalsium (Ca2 +) svar brakt frem av HeLa celler av Shigella. Optimalisere parametrene av bakteriell infeksjon og tenkelig med Ca2 + fluorescerende sonder, kjennetegnes atypisk globale og lokale Ca2 + signaler forårsaket av bakterier over et stort utvalg av infeksjon kinetics.
Abstract
Ca2 + er en allestedsnærværende ion involvert i alle kjente cellulære prosesser. Mens global Ca2 + svar kan påvirke celle skjebne, regulere lokale variasjoner i gratis Ca2 + cytosolic konsentrasjoner knyttet til å løsne fra interne butikker eller en strøm gjennom plasma membranen kanaler, kortikale celleprosesser. Patogener som overholder eller invadere verten cellene utløser en omorganisering av utgangen cytoskeleton underliggende vert plasma membran, som trolig påvirker både globale og lokale Ca2 + signalering. Fordi disse hendelsene kan oppstå på lave frekvenser i en pseudo Stokastisk måte over utvidede kinetikk, reiser analyse av Ca2 + signaler av patogener store tekniske utfordringer som må håndteres.
Her rapporterer vi protokoller for påvisning av globale og lokale Ca2 + signaler på en Shigella infeksjon i epitelceller. Disse protokollene gjenstander knyttet til en langvarig eksponering og photodamage knyttet til magnetisering av Ca2 + fluorescerende sonder er utført feilsøking ved å strengt kontrollere parameterne oppkjøpet over definerte tidsrom under en Shigella invasjon. Prosedyrer er implementert nøye analysere amplituden og hyppigheten av globale cytosolic Ca2 + signaler under utvidet infeksjon kinetics ved hjelp av kjemiske sonden Fluo-4.
Introduction
Ca2 + regulerer alle kjente celleprosesser, inkludert cellen cytoskjelett omorganisering, inflammatorisk svar og celle død veiene gjelder host-patogen interaksjoner1,2,3. Under fysiologiske forhold, basale cytosolic Ca2 + konsentrasjoner er lav, i hundrevis av nM utvalg, men kan utsettes for forbigående øker på Agonistiske stimulering. Disse variantene viser ofte oscillasjon atferd gjennom handling av pumper og kanaler på plasma og endoplasmatiske retikulum membraner. Mønsteret av disse svingninger er preget av perioden, varighet og amplituden av Ca2 + øker, og dekrypteres av celler som utløser bestemte reaksjoner i det som kalles Ca2 + koden4,5-igjen . En vedvarende konsentrasjonsøkning cytosolic Ca2 + under patologiske forhold kan føre til celledød knyttet til permeabilization av mitokondrie membraner og utgivelsen av pro-apoptotisk eller nekrose faktorer6, 7.
Shigella, den utløsende agenten av basillær dysenteri, invaderer epitelceller ved å injisere effektor inn vertsceller ved hjelp av en type III sekresjon system (T3SS)8,9. En Shigella invasjon av verten cellene er forbundet med lokale og globale Ca2 + signaler brakt frem av T3SS. Som for pore-forming miljøgifter, den T3SS translocon som setter inn i verten celle membraner og kreves for injeksjon av T3SS effektor trolig ansvarlig for aktivering av PLC og inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-avhengige Ca2 + utgivelsen. Kombinasjonen av lokaliserte PLC stimulering og akkumulering av polymerized utgangen på steder av et Shigella invasjonen resultat i en unormalt langvarig InsP3 avhengig av Ca2 + løslate10. Type III effektor IpgD, en phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfatase, begrenser lokale mengden av PIP2, og dermed kontrollere antallet tilgjengelige substrat for PLC å generere InsP3, som bidrar til confinement av lokale Ca2 + svar på bakteriell invasjonen nettsteder11,12. Disse lokale Ca2 + svar sannsynligvis bidra til utgangen polymerisasjon Shigella invasjonen nettsteder10. Globale Ca2 + svar som er også skapt av Shigella, men er unnværlig for bakteriell invasjonen prosessen men utløse åpning av connexin hemichannels i plasma membranen og utgivelsen av ATP i den ekstracellulære rommet. Frigitte ATP i en paracrine måte, stimulerer igjen Ca2 + oscillasjon svar i celler ved siden av de infiserte cellen. IpgD er også ansvarlig for å utarbeide globale Ca2 + svar til uberegnelig isolert svar med langsom dynamikk. Til slutt, på en langvarig bakteriell infeksjon fører IpgD til hemming av InsP3-mediert Ca2 + signaler. Gjennom sin innblanding Ca2 + signalering, IpgD forsinker en Ca2 +-avhengige calpain aktivisering fører til demontering av fokal vedheft strukturer og tidlig brøkdel av infiserte celler13.
Mens Ca2 + signaler er involvert i viktige aspekter av patogenesen, reiser bruk av en microorganism en rekke tekniske utfordringer som ikke er oppstått i klassisk Agonistiske studier. Protokollene beskrevet bruker her brukte lysstoffrør Ca2 + kjemisk indikatoren Fluo-4 som vi utviklet betegner lokale Ca2 + signaler under en Shigella infeksjon. Trinn kritisk for påvisning av disse signalene er diskutert, samt prosedyrer implementert for deres kvantitativ analyse som kreves for å karakterisere rollen bakteriell effektor i Ca2 + signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelser
-
Bakterier forberedelse
- Plate bakterier-Shigella vill-type belastning uttrykke AfaE adhesin (M90T-AfaE), på en trypticase soya (TCS) agar plate med 0,01% Kongo rød (CR) og ruge dem 18 h på 37 ° C.
Merk: For å øke deres reproduserbarhet, Shigella platene fikk i trinn 1.1.1 lagres på 4 ° C og bør brukes innen en uke, fordi alle kolonier på CR medium blir til slutt rødt over tid. - Vaksinere TCS kjøttkraft pre kultur ved å plukke 3 røde kolonier fra strek platene.
Merk: En vaksinering med 3 kolonier utføres for å begrense sannsynligheten for å plukke en enkel klone som virulens plasmider har gjennomgått en rekombinasjon. - Vokse flytende bakteriekulturer i en risting inkubator for 16 h på 37 ° C på 200 rpm. Legge ampicillin på en siste konsentrasjon av 75 mg/mL. Antibiotikumet konsentrasjonene bør ikke overstige 3 x minimal inhibitoriske konsentrasjon, som et overskudd av antibiotika kanskje føre til tap av store virulens plasmider.
Merk: Vedlikehold av Shigella virulens plasmider skal verifiseres ved plating bakteriekulturer på CR plater med passende antibiotikumet konsentrasjonene. Tilstedeværelsen av hvite kolonier angir plasmider tap. - Vaksinere TCS kulturen med bakteriell pre kultur på en 1: 100 fortynning. Inkuber det på 37 ° C i en risting inkubator for 2t 200 rpm. Sikre at optisk densitet ved 600 nm (OD600nm) er 0,2 - 0,4.
- Sentrifuge bakteriell kultur i 2 minutter på 13000 x g ved 21 ° C og resuspend pellet i en tilsvarende volum av EM medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glukose og 25 mM HEPES pH = 7.3).
- Fortynne bakteriell suspensjon i en EM buffer på en siste OD600nm 0,1 og bruke den umiddelbart eller lagre den på 21 ° C og bruke den innen de neste 60 min.
- Plate bakterier-Shigella vill-type belastning uttrykke AfaE adhesin (M90T-AfaE), på en trypticase soya (TCS) agar plate med 0,01% Kongo rød (CR) og ruge dem 18 h på 37 ° C.
-
Cellen forberedelse
- Kultur HeLa celler i DMEM med 1 g/L av glukose supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS) og dyrke dem på 37 ° C med 10% CO2. Vokse TC-7 vokst i DMEM med 4,5 finans av glukose, inneholder 10% FCS og ikke-essensielle aminosyrer i en 37 ° C inkubator inneholder 10% CO2.
- For cellen vedlikehold, dele cellene regelmessig for å unngå en vekst-kontakt hemming knyttet til confluent stater; Dette er avgjørende for en Ca2 + sonde lasting/transfection høyeffektiv.
- Plate HeLa celler på sterilt 25 mm diameter runde coverslips i 6-vel plater på en tetthet av 3 x 105 celler/Vel dagen før eksperimentet HeLa cellene.
- TC-7 celler, trypsinize og telle celler. Frø dem på 4 x 105 celler/godt og Inkuber dem 5-7 dager på 37 ° C i en 10% CO2-inkubator før eksperimenter å tillate en polarisering.
- Oppdatere celle kultur medium hver dag frem til dagen av eksperimentet.
Merk: Glass-bottom 35 mm diameter disponibel kamre kan også brukes som et alternativ til coverslips inneholder brønnene. Hvis er brukt, temperaturkontroll gjennom en oppvarmet scenen eller mål er ikke tilstrekkelig, og en termostat inkubasjon kammer montert på er mikroskopet scenen nødvendig.
- Oppdatere celle kultur medium hver dag frem til dagen av eksperimentet.
- Eksperimentet, fjerne mediet og vaske cellene 3 x med 1 mL EM medium på 21 ° C.
- Laste inn cellene med 3 mM Fluo-4-AM14 i en EM buffer i 30 min på 21 ° C.
Merk: Mens lasting av sub confluent HeLa celler ikke øker store problemer, lasting av polarisert TC-7 celler er ofte heterogene og dårlig effektiv. For disse cellene, fant vi at lasting effektiviteten er forbedret med tillegg av dispersing agent-pluronic syre-i en siste konsentrasjon av 0,1% og anion-transporter hemmer bromosulfophtalein i en endelig konsentrasjon på 20 µM til den Fluo 4-AM-inneholder EM. Bruk av ratiometric kjemiske sonder eller genetisk kodet-bånd sonder krever to Kjøp ikke er kompatibel med hastigheten på oppkjøp kreves for avbilding av lokale Ca2 + svar. - Vask prøvene 3 x med EM buffer og ytterligere Inkuber dem i 1 mL av EM buffer ved 21 ° C å tillate hydrolyse av AM moiety. Bruk Fluo-4 lastet celler umiddelbart eller innen de neste 90 min (opprettholdt på 21 ° C).
2. infeksjoner og bilde lokale Ca2 + svar
- Plass dekkglassvæske som inneholder Fluo-4 lastet cellene i en tenkelig kammer eller glass bunn kammer. Vask prøvene i tenkelig kammeret eller glass bunn engangsbladet kammer 3 x med EM buffer fjerne forbindelser potensielt skyldes celle lysis. Legg 1 mL av EM buffer.
- Plass kammer på en invertert fluorescens mikroskop scenen oppvarmet på 33 ° C.
Merk: Denne temperaturen er valgt som et kompromiss mellom optimal temperaturene kompatibel med Shigella invasjonen prosessen og bremse ned av Ca2 + Svar å visualisere lokale tiltak. Vi bruker en 63 X nedsenking oljeobjektiv (NA = 1,25) utstyrt med fase kontrast ringer. - Velger en mikroskopi-feltet, og oppkjøpet parametere, inkludert eksponeringstid og binning nødvendig for å optimalisere Fluo-4 fluorescerende signalet.
Merk: De store utfordringene av lokale Ca2 + imaging er lav amplituden og små varigheten av svarene, krever oppkjøpet hver 30 ms. flere kommersielt tilgjengelig rygg-opplyste EM-CCD eller C-MOS kameraer presentere nødvendig følsomheten å oppdage lokale Ca2 + svar bruker Fluo-4. Gjenkjenning følsomhet er også en viktig sak å begrense photodamage eller gjenstander som spontan svar knyttet til fluorescerende magnetisering av Fluo-4 med en høy frekvens. Her, en LED-basert belysning av 470 nm, med et 480 ± 40 nm båndpass eksitasjon filter, et 505-nm dichroic filter og en 527 ± 30 nm båndpass utslipp på 5% av maksimal intensitet kombinert med en 1,0 Nøytralfilter ble brukt til å minimere problemene under en strøm av oppkjøp av begrenset varighet. En analyse av lokale Ca2 + signaler ved grupper av 120 s ble rutinemessig utført. Under disse forholdene for lav belysning, ble fluorophore photobleaching ikke observert under 2 min-stream oppkjøp. Påfølgende oppkjøp på samme prøven kan utføres, forutsatt ulike felt er brukt. Som en generell regel utføres en første oppkjøpet strøm på et felt i fravær av bakterier stimulering å sikre fravær av spontane svar. Hvis spontan svar er observert, er prøvene vasket med EM buffer til ingen svar er observert. - For å legge bakterier prøven, fjerne 500 µL EM bufferen fra kammeret og legge til 500 µL av bakteriell suspensjon forberedt i trinn 1.1.6 å få en endelig OD600nm av 0,05, med riktig pleie unngår å flytte valgte mikroskopi feltet. volumene sikrer en riktig blanding av bakterier og en homogen distribusjon av bakterier på cellen prøvene.
- Utføre en anskaffelse på bakteriell tillegg. Du kan også utføre en anskaffelse 10 min etter bakteriell tillegg, som tilsvarer tiden som kreves for bakterier sediment på celler under betingelser brukes. På slutten av oppkjøpet, erverve en kontrast bilde av det merkede feltet til visualisere bakterier kontakter cellene og membran ruffles forbundet med bakteriell invasjonen nettsteder.
- Gjenta oppkjøpet som i trinn 2.5, ved intervaller som er mottakelig for varigheten av bildet oppkjøp, filer besparelser og valg av et nytt felt å dekke hele prosessen.
Merk: For Shigellafant vi at oppkjøpet strømmer hver 5 min for 20 min, etter 10 min bakteriell sedimentering, lov til å dekke fleste invasjonen hendelsene. - På slutten av oppkjøpet prosedyren, Legg en siste konsentrasjon av 2 µM av de Ca2 + ionophore ionomycin prøvene å bestemme maksimal amplituden av Ca2 + signaler. Hente bilder hver 3-5 s til signalet stabilisering, vanligvis på mindre enn 10 min.
- Følg ved å legge til Ca2 + chelator EGTA i en endelig konsentrasjon av 10 mM å bestemme fluorescens signalet i fravær av Ca2 +. Hente bilder hver 3-5 s til signalet stabilisering, vanligvis på mindre enn 10 min.
Merk: På grunn av relativt treg dynamikken i global Ca2 + varianter, utføre disse oppkjøpene hver 3-5 s (ikke i streaming-modus), slik at Ca2 + imaging for samme mikroskopiske felt under de etterfølgende behandlingene.
3. analyse
- Express cytosolic Ca2 + variasjoner over tid som prosent ΔF/F0, der ΔF representerer variasjonen av gjennomsnittlig fluorescens intensiteten i regionen rundt (ROI) og F0 planlagte fluorescens i samme Avkastningen, som en ikke-relevante regionen i feltet uten cellene er trukket.
- Fjerne basale fluorescens nivåene for hver celle i ulike felt, planlagt nivå; disse nivåene kan bestemmes entydig på grunn av den lave frekvensen og kort relativt varighet av lokale Ca2 + svar i en gitt strømmen oppkjøpet.
Merk: Kvantifisere slående trekk ved svar knyttet til spørsmål og patogene modellen studerte. Klassisk, er ulike parametere tatt hensyn til å analysere Ca2 + signaler, inkludert antallet celler viser lokale eller globale Ca2 + svar, samt den varighet, amplitude og hyppigheten av disse svarene. Ved Shigella og lokale tiltak er en annen viktig del av analysen romlige tilknytningen av svarene bakteriell invasjonen nettsteder.
- Fjerne basale fluorescens nivåene for hver celle i ulike felt, planlagt nivå; disse nivåene kan bestemmes entydig på grunn av den lave frekvensen og kort relativt varighet av lokale Ca2 + svar i en gitt strømmen oppkjøpet.
- For å måle andelen forståelsesfull celler viser global eller lokal svar, tegne ROIs i celler, i tid-serien tilsvarer variasjoner av Fluo-4.
- Angi strenge parametere til å identifisere lokale Ca2 + svar, for eksempel en amplituden til tre ganger over bakgrunnen varianter av gjennomsnittlig fluorescens intensitet celle grunnlinjen eller en varighet på minst 200 ms, for å unngå scoring en falsk positiv.
Merk: Som en generell regel, kan selv små lokale Ca2 + svar skilles fra bakgrunnsstøyen av profilen. ROIs bør være store nok til å integrere nok fluorescens signaler å tillate oppdaging av lokale variasjoner. Avhengig av intensiteten av Fluo-4 deteksjon, kan disse ROIs tilsvare sirkler med diameter fra 2-5 mM. - Mål variasjonene av gjennomsnittlig Fluo-4 fluorescens intensiteten i 2 områder i et tydelig i samme celle, å avgjøre om svarene er lokal eller global.
Merk: Analyse av et stort antall celler er tilrettelagt av bruk av bildebehandlingsprogrammer tillater online skjermvisningen av variasjonene av gjennomsnittlig fluorescens intensiteten over tid for de valgte områdene. Kommersielt tilgjengelige bilderedigeringsprogrammer har slikt alternativ, men dette kan også utføres ved hjelp av Icy freeware, bruker Avkastningen intensitet utviklingen plugin. - Angi prosenten av celler viser lokale tiltak.
Merk: Denne prosentandelen beregnes ut fra totalt antall celler analysert i feltet mikroskopi, som bør være i tilstrekkelig antall å støtte en statistisk betydning ved hjelp av en ikke-parametriske test. - Varigheten til de lokale tiltak.
Merk: Lokal Ca2 + svar kan videre skilles etter deres varighet områder (dvs. mindre enn 500 ms, mellom 5 og 10, eller over 10 s) og tilknytningen Shigella invasjonen nettsteder.
- Angi strenge parametere til å identifisere lokale Ca2 + svar, for eksempel en amplituden til tre ganger over bakgrunnen varianter av gjennomsnittlig fluorescens intensitet celle grunnlinjen eller en varighet på minst 200 ms, for å unngå scoring en falsk positiv.
- Kvantifisere amplituden til svarene. Først kalibrere maksimalt Ca2 + og celle bakgrunn nivåene bestemt som i trinn 2.1.7. Siden Fluo-4 belastningen kan variere for hver celle, kan du utføre disse bestemmelser for enkeltceller i feltet.
- Uttrykke amplituden til svarene som en relativ prosentandel av maksimal svaret.
- Utføre statistiske tester med en normalitet test, etterfulgt av en parametrisk test for å analysere potensial forskjeller i amplituden til svar mellom eksempler.
- Bestemme foreningen av disse svarene i forhold til webområdene bakteriell invasjonen av deres respektive lokaliseringen å bakteriell-indusert membran ruffles visualisert i tilsvarende fase kontrast bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Shigella invasjonen er tilknyttet atypisk langvarig lokale Ca2 + svar:
Fluo-4-loaded HeLa celler ble utfordret med WT Shigella protokollen ovenfor, og strømmen oppkjøp ble utført for å analysere Ca2 + signaler. En representant eksperiment er vist i figur 1, med time-lapse bilder rekke fluorescens intensiteten av Fluo-4 sonden gjennomsnitt i en region av interesse for en enkeltcelle, og tilsvarende fase kontrast bildet (figur 1A, venstre panel). Shigella invasjonen nettstedet er preget av membran ruffles oppdaget i fase kontrast bildet (figur 1A, pil). Atypisk lokale øker i gratis cytosolic Ca2 + er observert på Shigella invasjonen nettstedet med en varierende amplituden og varigheten fra 2.5-5 s (tall 1A og 1B, piler), etterfulgt av globale økningen i den infiserte celle (figur 1B, pilspisser).
Type III effektor IpgD regulerer overgangen fra lokale til globale Ca2 + svar av Shigella i HeLa celler:
Analyse av Ca2 + signaler indusert av vill-type Shigella og en isogenic mutert stamme mangelfull for type III effektor IpgD, en phosphatidyl 4, 5 bisphosphate fosfatase, indikerte at denne siste belastningen indusert mer global og mindre atypisk lokale tiltak med lang varighet (RATPs) med 11.3 ± 4.4 (SEM) % og 40.3 ± 7.5 (SEM) % av celler responsiv med globale svar i en WT og ipgD mutant, henholdsvis (figur 1 d)15. Denne ipgD mutant henter lokale svar på en lignende frekvens som WT belastningen.
Shigella hemme InsP3-avhengige globale Ca2 + øker i HeLa celler under langvarig infeksjon kinetics:
Avbilding av globale Ca2 + svar over utvidede infeksjon kinetics pekte på en nedgang i svarfrekvensen 30 min etter utfordringen med vill-type Shigella (figur 2A). En tilsvarende reduksjon i frekvensen av Ca2 + svar ble observert i TC-7 celler smittet 30 min med vill-type Shigella15. Kvantifisering av doseavhengig celle svar på Ca2 + Agonistiske histamin illustrerer hemming av en InsP3-avhengige Ca2 + utgivelse på slutten stadier av en Shigella infeksjon. WT Shigella fører til atypisk isolert Ca2 + svar under den første 30 min av infeksjonen og etter ytterligere inkubering, en drastisk reduksjon i amplitude og hyppigheten av Ca2 + svar ble observert (figur 2B).
Figur 1 . Lokale og globale Ca2 + svar under Shigella invasjonen. HeLa celler ble lastet med Fluo-4-AM og utfordret med WT Shigella. (A) informasjonsvinduet viser kontrast bilder. Panelet til høyre viser tidsserier Fluo-4 fluorescens gjennomsnittlig intensitetsnivåer med fargekode avbildet til høyre. Tiden fra starten av oppkjøpet angis i sekunder, 10 min etter bakteriell utfordringen. Pilen viser på invasjonen bildet. Sirkler som tilsvarer regionene analysert i (B) der spor med tilsvarende farge representerer variasjoner i Fluo-4 gjennomsnittlig fluorescens intensitet over grunnlinjen. Pilene angir lokale tiltak. Pilhodene Angir globale svar. (C) Dette er en ordning som viser fastsettelse av varigheten av Ca2 + svarene. Den vannrette prikkete linjen angir den basale Ca2 + nivået (F0); den vertikale barer angi bakgrunn varianter. Den vertikale stiplede linjen Angir maksimal amplituden til svaret. vannrette stolper angir varigheten av svaret på halv maksimal amplituden. (D) Dette er prosentandelen av forståelsesfull celler ± SEM viser lokale tiltak og globale Ca2 + svar indusert 5 min etter infeksjon med WT Shigella (mørk grå barer) eller ipgD mutant (lys grå barer). RATPs er lokale Ca2 + svar som vare for mer enn 5 s. N = 4; > 60 celler for hver gang. Diversified test, *P < 0,05; P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Hemming av globale Ca2 + svar under utvidet kinetics Shigella infeksjon. (A) den øvre blå piler Representer tidsskalaen av bakteriell og histamin utfordringen i de angitte konsentrasjonene. Dette panelet viser representant spor av enkeltcelle globale Ca2 + varianter etter infeksjon av WT Shigella (grønn) og ipgD mutert stamme (oransje). (B) dette panelet viser prosentandelen av amplituden av Ca2 + svar i forhold til maksimal svaret, på en stimulering på 0,5 μM histamin cellene infisert med angitte påkjenningene for 90 min. Den solide vannrette linjen representerer den gjennomsnittlige maksimale prosentandelen. Diversified test, **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver protokollen som vi utviklet for å følge lokale Ca2 + signaler i løpet av relativt kort kinetics av en Shigella invasjon, samt global Ca2 + svar under den utvidede kinetics av Shigella. Under nøkkel finner problemer som må håndteres for å optimalisere påvisning av Ca2 + signaler samtidig minimere interferens med biologiske prosesser.
Kjemisk vs kodet genetisk Ca2 + sonder:
For å bilde lokale Ca2 + varianter, brukte vi Fluo-4 kjemiske sonden på grunn av sin høye quantum avkastning og dens rask respons dynamikk. Samme hastighet oppkjøpet også utelukker bruk av ratiometric sonder, siden en dobbel bølgelengde oppkjøpet ikke kan utføres. Bruk av sykdomsfremkallende mikroorganismer, men kan forstyrre standard prosedyrer som bruker Ca2 + kjemisk sonder. En langvarig celle infeksjon over 60 min av Shigella forhindrer for eksempel en celle lasting kjemiske sonder, antagelig på grunn av patogen-induserte endringer av verten celle plasma membraner. Konsekvent, er en nedgang på celle-assosiert Fluo-4 fluorescens observert under lange infeksjon kinetikk, på grunn av cytoplasmatiske tap av denne sonde. Derfor er implementerer en kontroll som tillegg av ionomycin å bestemme fluorescens på maksimalt Ca2 + konsentrasjonen på slutten av oppkjøp avgjørende for å identifisere forståelsesfull cellene. Også synes polarisert intestinal epitelceller relevante for en patogen infeksjon å være gjenstridig å en lasting av Ca2 + sonden og krever bestemte lasting prosedyrer. Mens bruken av en genetisk kodet Ca2 + reporter (GECR) kan bidra til å løse noen av disse problemene, introduserer det også andre utfordringer. Hva effektiviteten i cellen vertssystemer kan representere en alvorlig begrensning, spesielt hvis det superimposes med en dårlig smittsomme avkastning. Videre er kjennetegner en respons til Ca2 + varianter av de fleste GECRs ikke kompatibel med den raske kinetics kreves for lokale Ca2 + analyse. Til slutt, uttrykk for GECR kan forstyrre patogener formidlet prosesser. Vi vil ikke diskutere bruk av GECR for studiet av Ca2 + signalering under en vert-patogen samhandling. De senere og pågående prosjektering av ulike "fast-svarer" GECR ville sannsynligvis fortjener forskere å besøke deres bruk i fremtidige studier.
Timing oppkjøpet av lokale Ca2 + svar under bakteriell infeksjon:
Avbilding av lokale Ca2 + svar krever høy hastighet av bildeopptak implicating en vedvarende fluorescens magnetisering av Fluo-4 sonden. På grunn av photodamage knyttet til høyfrekvente oppkjøp, er det avgjørende at intensiteten av fluorophore magnetisering lett holdes til et minimum for å få en tilstrekkelig signal-til-støy-forhold med en eksponeringstid ikke overstiger 30 ms. vi hadde gode resultater med en LED-system på 5% av maksimal intensitet, kombinert med en 1,0 optisk tetthet filter med oppkjøpet oppsett som beskrevet i trinn 2.1.4. Selv under disse forholdene, men fant vi at kontinuerlig belysning kreves for produksjon modus oppkjøpet ikke tillater en oppkjøpet periode over 2 min. En sterkere belysning eller oppkjøp periode overskredet denne grensen kan resultere i ikke-spesifikk globale Ca2 + svar og/eller i Hemming av bakteriell invasjonen prosesser, antagelig knyttet til photodamage. Mens avbilding av lokale Ca2 + svar over lengre kinetics kan være mulig med mer følsomme Gjenkjenningsmerknad means, på nåværende tilstand slike bildebehandling kan bare utføres over en tidsbegrenset brøkdel av 15 min Shigella invasjonen prosessen. For å dekke hele prosessen, utført vi påfølgende serie 2-min streaming oppkjøp. Dette tidsintervallet er tilstrekkelig til å følge første lokale og globale Ca2 + svar på utbruddet av smitte prosessen og betydelige forskjeller i Shigella vill-type belastning og dens isogenic ipgD mutant16. Utviklingen av en svært følsom kameraet kan tillate forskere å redusere intensiteten i fluorophore belysning og utføre lokale Ca2 + tenkelig over lengre perioder, dermed forbedre tid oppløsningen av flere forbigående Ca2 + signaler.
Romlig sammenheng mellom lokale Ca2 + svar og bakteriell invasjonen nettsteder:
På grunn av det lokale aspektet av signalnettverk hendelser forårsaket av mikroorganismer, er det viktig å studere lokal Ca2 + signaler med hensyn til tilknytning områder av patogen-verten celle interaksjoner. Dette løftet to typer hensyn. Først alle celler kan ikke være infisert, og alle mikroorganismer kan ikke utløse signalering. Shigella, bare et mindretall av bakterier utløse en invasjon og alle celler kan ikke være infisert. I vårt forsøk, MOI ble justert slik at én celle danner en 0,7 - 1 fokus på bakteriell invasjonen. Høyere antall foci/mobiltelefon kan føre til en eventuell interferens for analyse av individuelle invasjonen hendelser og omvendt, tallene kan gjøre analyse for komplisert, spesielt når studere transiently transfekterte celler. Vi fant at transfection effektiviteten må nå minst 30% av cellene å få ned antallet Repliker eksperimenter håndterbare tall. Andre kan Shigella invasjonen områder være lett oppdaget av fase kontrast mikroskopi. For andre prosesser, kan andre fluorescens-baserte oppdagingsmetoder brukes. Et viktig aspekt, er imidlertid at i mest set-ups, oppkjøp strømmen kreves for lokale Ca2 + imaging utelukker andre typer kjøp i perioden. Dette impliserer at prosessen analysert ikke å vise betydelig bevegelse i denne strømmen å tillate deres romlige sammenheng med lokale Ca2 + signaler. Selv om dette er tilfelle for Shigella invasjonen hendelser som Lokaliser til samme celle området over flere minutter, svært motile prosesser kan ikke være håndterbart eller ville trolig kreve kortere anskaffelse datastrømmer.
Scoring og analyse av lokale Ca2 + svar:
Mens global Ca2 + svar oppdages lett, krever oppdagelsen av lokale Ca2 + svar av små amplituden og varigheten optimalisering av oppkjøpet av fluorescerende signaler som beskrevet ovenfor. Det er også viktig at strenge kriteriene brukes for å skille signaler over bakgrunnen variasjoner. Som regel score vi som en Ca2 + signal en økning på gjennomsnittlig Fluo-4 fluorescens intensiteten som når minst 3 x planlagte variasjoner i tre påfølgende 30 ms oppkjøp. Dette svaret er regnet som lokale hvis en annen region i cellen viser samme gjennomsnittlig fluorescens intensitet ikke vises slik økning. Scoring av lokale Ca2 + svar i forskjellige prøver bør ikke føre til store problemer hvis disse reglene er systematisk brukt. I våre hender, den lave frekvensen av lokale Ca2 + signaler forbundet med bakteriell invasjonen og varierer fra 5 til 20% av cellen analysert representerte et stort hinder. Utover de biologiske variasjonene i forrige avsnitt, at bare en strøm tilsvarer en brøkdel av analysert invasjonen prosessen også bidrar til denne lav frekvens. På grunn av denne lav frekvens, kan etablere forskjeller mellom eksempler implisere utfører en kraftprøve på piloten eksperimenter å anslå utvalgsstørrelsen for å nå en statistisk betydning.
Fremtidige programmer:
Vi tror at protokollene jobbet ut analysere lokale Ca2 + signaler under en Shigella invasjonen vil bli nyttig bilde lokale Ca2 + svar for alle prosesser som forblir romlig begrenset i oppkjøpet perioden. Ca2 + signalnettverk er allsidig, kan lokale Ca2 + signalene være mest relevant for prosesser på plasma eller intracellulær membraner der de første punktkilder signaler ligge. Således under mikrobiell-verten celle interaksjoner, lokale Ca2 + signaler kan være relevant for klebende eller invasiv prosesser i plasma membranen eller forekommende på intracellulær membraner av patogen inneholder vacuoles. Derimot, kan protokollene som vi utviklet for å analysere global Ca2 + signaler over utvidede infeksjon kinetics være relevant for prosesser som påvirker de generelle celle fysiologi under en infeksjon, for eksempel regulering av et transcriptional program eller celle død veier av patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å fortolle.
Acknowledgments
Vi takker Jenny-Lee Thomassin for hennes hjelp i redigering manuskriptet. Arbeidet ble støttet av ANR gir MITOPATHO og PATHIMMUN, gir Labex Memolife og PSL IDEX Shigaforce. Chunhui solen er en mottaker av en Ph.D. støtte fra Kina stipend rådet. Laurent Combettes og Guy Tran Van Nhieu er mottakere av en WBI-France utveksling Tournesol programmet N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le kadre des Partenariats Hubert Curien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
- Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
- Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
- Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
- Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
- Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
- Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
- Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
- Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
- Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
- Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
- Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
- Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
