Her presenterer vi for å visualisere kalsium (Ca2 +) svar brakt frem av HeLa celler av Shigella. Optimalisere parametrene av bakteriell infeksjon og tenkelig med Ca2 + fluorescerende sonder, kjennetegnes atypisk globale og lokale Ca2 + signaler forårsaket av bakterier over et stort utvalg av infeksjon kinetics.
Ca2 + er en allestedsnærværende ion involvert i alle kjente cellulære prosesser. Mens global Ca2 + svar kan påvirke celle skjebne, regulere lokale variasjoner i gratis Ca2 + cytosolic konsentrasjoner knyttet til å løsne fra interne butikker eller en strøm gjennom plasma membranen kanaler, kortikale celleprosesser. Patogener som overholder eller invadere verten cellene utløser en omorganisering av utgangen cytoskeleton underliggende vert plasma membran, som trolig påvirker både globale og lokale Ca2 + signalering. Fordi disse hendelsene kan oppstå på lave frekvenser i en pseudo Stokastisk måte over utvidede kinetikk, reiser analyse av Ca2 + signaler av patogener store tekniske utfordringer som må håndteres.
Her rapporterer vi protokoller for påvisning av globale og lokale Ca2 + signaler på en Shigella infeksjon i epitelceller. Disse protokollene gjenstander knyttet til en langvarig eksponering og photodamage knyttet til magnetisering av Ca2 + fluorescerende sonder er utført feilsøking ved å strengt kontrollere parameterne oppkjøpet over definerte tidsrom under en Shigella invasjon. Prosedyrer er implementert nøye analysere amplituden og hyppigheten av globale cytosolic Ca2 + signaler under utvidet infeksjon kinetics ved hjelp av kjemiske sonden Fluo-4.
Ca2 + regulerer alle kjente celleprosesser, inkludert cellen cytoskjelett omorganisering, inflammatorisk svar og celle død veiene gjelder host-patogen interaksjoner1,2,3. Under fysiologiske forhold, basale cytosolic Ca2 + konsentrasjoner er lav, i hundrevis av nM utvalg, men kan utsettes for forbigående øker på Agonistiske stimulering. Disse variantene viser ofte oscillasjon atferd gjennom handling av pumper og kanaler på plasma og endoplasmatiske retikulum membraner. Mønsteret av disse svingninger er preget av perioden, varighet og amplituden av Ca2 + øker, og dekrypteres av celler som utløser bestemte reaksjoner i det som kalles Ca2 + koden4,5-igjen . En vedvarende konsentrasjonsøkning cytosolic Ca2 + under patologiske forhold kan føre til celledød knyttet til permeabilization av mitokondrie membraner og utgivelsen av pro-apoptotisk eller nekrose faktorer6, 7.
Shigella, den utløsende agenten av basillær dysenteri, invaderer epitelceller ved å injisere effektor inn vertsceller ved hjelp av en type III sekresjon system (T3SS)8,9. En Shigella invasjon av verten cellene er forbundet med lokale og globale Ca2 + signaler brakt frem av T3SS. Som for pore-forming miljøgifter, den T3SS translocon som setter inn i verten celle membraner og kreves for injeksjon av T3SS effektor trolig ansvarlig for aktivering av PLC og inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-avhengige Ca2 + utgivelsen. Kombinasjonen av lokaliserte PLC stimulering og akkumulering av polymerized utgangen på steder av et Shigella invasjonen resultat i en unormalt langvarig InsP3 avhengig av Ca2 + løslate10. Type III effektor IpgD, en phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfatase, begrenser lokale mengden av PIP2, og dermed kontrollere antallet tilgjengelige substrat for PLC å generere InsP3, som bidrar til confinement av lokale Ca2 + svar på bakteriell invasjonen nettsteder11,12. Disse lokale Ca2 + svar sannsynligvis bidra til utgangen polymerisasjon Shigella invasjonen nettsteder10. Globale Ca2 + svar som er også skapt av Shigella, men er unnværlig for bakteriell invasjonen prosessen men utløse åpning av connexin hemichannels i plasma membranen og utgivelsen av ATP i den ekstracellulære rommet. Frigitte ATP i en paracrine måte, stimulerer igjen Ca2 + oscillasjon svar i celler ved siden av de infiserte cellen. IpgD er også ansvarlig for å utarbeide globale Ca2 + svar til uberegnelig isolert svar med langsom dynamikk. Til slutt, på en langvarig bakteriell infeksjon fører IpgD til hemming av InsP3-mediert Ca2 + signaler. Gjennom sin innblanding Ca2 + signalering, IpgD forsinker en Ca2 +-avhengige calpain aktivisering fører til demontering av fokal vedheft strukturer og tidlig brøkdel av infiserte celler13.
Mens Ca2 + signaler er involvert i viktige aspekter av patogenesen, reiser bruk av en microorganism en rekke tekniske utfordringer som ikke er oppstått i klassisk Agonistiske studier. Protokollene beskrevet bruker her brukte lysstoffrør Ca2 + kjemisk indikatoren Fluo-4 som vi utviklet betegner lokale Ca2 + signaler under en Shigella infeksjon. Trinn kritisk for påvisning av disse signalene er diskutert, samt prosedyrer implementert for deres kvantitativ analyse som kreves for å karakterisere rollen bakteriell effektor i Ca2 + signalering.
Dette manuskriptet beskriver protokollen som vi utviklet for å følge lokale Ca2 + signaler i løpet av relativt kort kinetics av en Shigella invasjon, samt global Ca2 + svar under den utvidede kinetics av Shigella. Under nøkkel finner problemer som må håndteres for å optimalisere påvisning av Ca2 + signaler samtidig minimere interferens med biologiske prosesser.
Kjemisk vs kodet genetisk Ca2 + sonder:
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jenny-Lee Thomassin for hennes hjelp i redigering manuskriptet. Arbeidet ble støttet av ANR gir MITOPATHO og PATHIMMUN, gir Labex Memolife og PSL IDEX Shigaforce. Chunhui solen er en mottaker av en Ph.D. støtte fra Kina stipend rådet. Laurent Combettes og Guy Tran Van Nhieu er mottakere av en WBI-France utveksling Tournesol programmet N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche dans le kadre des Partenariats Hubert Curien).
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |