Imaging Ca^{2 +} ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

Summary

Здесь мы представляем протоколы визуализировать ответы кальция (Ca^{2 +}), вызвало НеЬа клетки, инфицированные Shigella. Путем оптимизации параметров бактериальной инфекции и изображений с Ca^{2 +} флуоресцентных зондов, характеризуются нетипичных глобальных и местных Ca^{2 +} сигналы вызванных бактериями в большом диапазоне кинетики инфекции.

Abstract

CA^{2 +} является вездесущий Ион участвует во всех известных клеточных процессах. В то время как глобальные Ca^{2 +} ответы могут повлиять на судьбу клеток, местные вариации концентраций бесплатно Ca^{2 +} цитозольной, связан с освободить от внутренних магазинов или приток через каналы плазматической мембраны, нормализует процессы корковых клеток. Патогенов, придерживаться или вторгнуться принимающей ячейки триггер реорганизации Цитоскелет актина, лежащие в основе хост плазматической мембраны, которая скорее всего влияет как на глобальном, так и на местном Ca^{2 +} сигнализации. Потому, что эти события могут происходить на низких частотах в псевдо-стохастических образом над расширенной кинетики, анализ Ca^{2 +} сигналов, вызванных микроорганизмами, поднимает основные технические проблемы, которые необходимо решить.

Здесь мы приводим протоколы для обнаружения сигналов глобальных и местных Ca^{2 +} после инфекции Shigella эпителиальных клеток. В этих протоколах артефакты, связанные с длительного воздействия и фотоповреждения, связанные с возбуждением Ca^{2 +} флуоресцентных зондов возникновения, строго контролируя параметры приобретения за определенный период времени во время Бактерии Shigella вторжения. Процедуры осуществляются тщательно анализировать амплитуду и частоту сигналов глобальной цитозольной Ca^{2 +} во время расширенной инфекции кинетики, используя химические зонд Fluo-4.

Introduction

CA^{2 +} регулирует все известные клеточных процессов, включая цитоскелета реорганизации, воспалительных реакций и пути смерти клетки, связанных с хост возбудитель взаимодействия^1,2,3. В физиологических условиях базальный цитозольной Ca^{2 +} концентрации являются низкими, в сотни Нм диапазона, но может подвергаться переходных увеличивается после стимуляции агонистов. Эти варианты часто показывают колебательной поведение через действие насосов и каналов на мембраны плазмы и эндоплазматического ретикулума. Эти колебания характеризуется период, продолжительность и амплитуды Ca^{2 +} увеличивается и расшифровывается клетками, которые, в свою очередь, вызывают конкретные ответы в то, что известно как Ca^{2 +} код^4,5 . Устойчивый рост в цитозольной Ca^{2 +} концентрации в патологических условиях может привести к смерти клетки, связанные с permeabilization митохондриальных мембран и выпуска pro-apoptotic или некротических факторов^{6, 7}.

Шигеллы, возбудитель бактериальной дизентерии, поражает эпителиальные клетки путем впрыскивать эффекторов в клетки хозяина, с использованием типа III секреторной системы (T3SS)^8,9. Шигеллы вторжения клеток хозяина ассоциируется с местными и глобальными Ca^{2 +} сигналы с T3SS. Что касается порами формирования токсинов, translocon T3SS, который вставляет узел клеточных мембран и требуется для инъекций эффекторов T3SS скорее всего отвечает за активацию PLC и инозитол (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-зависимых Ca^{2 +} релиз. Сочетание локализованных стимуляции PLC и накопление полимеризованной актина на участках в результате вторжения шигеллы в нетипово долгосрочного InsP3-зависимых Ca^{2 +} выпуск¹⁰. Тип III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4,5 Бисфосфат (PIP2) -4-фосфатазы, ограничивает количество местных PIP2, таким образом контролируя количество доступных субстрат для PLC для создания InsP3, которая способствует сосредоточение местных Ca^{2 +} ответы бактерий вторжения сайтов^11,12. Эти местные Ca^{2 +} ответы могут способствовать актина полимеризации Shigella вторжения сайты¹⁰. Глобальные Ca^{2 +} ответы, которые также вызвало, шигеллы, однако, являются необязательным для процесса бактерий вторжения, но инициировать открытие connexin hemichannels на плазматической мембраны и выпуска АТФ в внеклеточного отсека. Выпущенные СПС, действуя в духе паракринными, в свою очередь, стимулирует Ca^{2 +} колебательных реакций в клетках рядом с инфицированной клетки. IpgD также отвечает за формирование глобальных Ca^{2 +} ответы в неустойчивой изолированных ответов с медленной динамики. В конце концов после длительной бактериальной инфекции, IpgD приводит к ингибированию InsP3-опосредованной Ca^{2 +} сигналов. Через свое вмешательство с Ca^{2 +} сигнализации, IpgD задержки Ca^{2 +}-зависимой calpain активации, ведущих к разборке адгезии координационных структур и преждевременная отслойка инфицированных клеток¹³.

В то время как Ca^{2 +} сигналы участвуют в критические аспекты патогенеза, использования микроорганизма поднимает ряд технических проблем, которые не встречаются в классической агонист исследований. Протоколы, описанные здесь использовать часто используемые флуоресцентные Ca^{2 +} химический индикатор Fluo-4, который мы спроектирован, чтобы характеризовать местных Ca^{2 +} сигналов во время инфекции Shigella . Обсуждаются шаги критических для обнаружения этих сигналов, а также процедуры для их количественного анализа, который необходим для характеризуют роли бактериальной эффекторов в Ca^{2 +} сигнализации.

Protocol

1. Подготовка

1. Подготовка бактерий
   1. Пластина бактерии —шигелла одичал тип деформации выражая AfaE адгезина (M90T-AfaE) — на trypticase сои (TCS) агар пластины содержащий 0,01% Конго красный (CR) и инкубировать их в течение 18 часов при 37 ° C.
      Примечание: Для увеличения их воспроизводимость, шигеллы пластины, полученный на шаге 1.1.1 хранятся при температуре 4 ° C и должны использоваться в течение одной недели, потому что все колонии на носителе CR покраснеть в конечном итоге с течением времени.
   2. Прививать TCS бульон до культуры, выбирая 3 красные колонии от тарелки подряд.
      Примечание: Прививки с 3 колоний выполняется ограничить вероятность выбора одного клона, чьи вирулентности плазмида претерпела генетическая рекомбинация.
   3. Растут жидкого бактериальных культур в тряску инкубатор для 16 ч при 37 ° C и 200 об/мин. Добавление ампициллин в конечной концентрации 75 мг/мл. Концентрации антибиотиков не должен превышать 3 x минимальный тормозной концентрации, как избыток антибиотика может привести к потере большого вирулентности плазмиды.
      Примечание: Поддержание плазмида вирулентности Shigella должна проверяться путем покрытия бактериальных культур на CR пластины с соответствующей концентрации антибиотиков. Наличие белых колоний указывает на потерю плазмиды.
   4. Прививать культуру TCS с бактериальной культурой предварительно в разведении 1: 100. Проинкубируйте ее при 37 ° C в тряску инкубатор для 2 ч при 200 об/мин. Убедитесь, что оптическая плотность 600 Нм (OD_600nm) составляет 0,2 - 0,4.
   5. Центрифуга для бактериальной культуры на 2 мин на 13 000 x g при 21 ° C и Ресуспензируйте гранулы в эквивалентный объем EM среды (120 мм NaCl, 7 мм KCl, 1,8 мм CaCl₂, 0,8 мм MgCl₂, глюкозы 5 мм и 25 мм HEPES pH = 7,3).
   6. Разбавить бактериальных подвеска в буфере EM в заключительном ОД_600nm 0.1 и использовать его немедленно или храните его при температуре 21 ° C и использовать его в течение следующих 60 мин.
2. Подготовка клетки
   1. Культура клетки HeLa в среде DMEM с 1 г/Л глюкозы с 10% плода телячьей сыворотки (FCS) и вырастить их при 37 ° C с 10% CO₂. Растут TC-7 вырос в среде DMEM с 4,5 г/Л глюкозы, содержащие 10% FCS и несущественные аминокислот в инкубаторе 37 ° C, содержащие 10% CO₂.
   2. Для ячейки обслуживание, разбить ячейки регулярно, чтобы избежать ингибирование роста контакт связан с вырожденная государств; Это критически важно для высокой Ca^{2 +} зонд загрузки/трансфекции эффективности.
   3. Пластина НеЬа клетки на стерильные 25-мм диаметр круговой coverslips в 6-ну пластины на плотности 3 x 10⁵ клеток/хорошо за день до этого эксперимента для клеток HeLa.
   4. TC-7 клеток trypsinize и подсчитать ячейки. Семя их в 4 x 10⁵ клеток/Ну и инкубировать их 5-7 дней при 37 ° C в 10% CO₂-инкубатор перед эксперименты для поляризации.
      1. Обновление клеток культуры среднего каждый день до дня проведения эксперимента.
         Примечание: Стекло дно диаметром 35-мм одноразовые камеры также могут использоваться как альтернатива coverslips содержащих скважин. Если они используются, контроль температуры с помощью Подогреваемый столик или цель не является достаточным, и палата инкубации термостат установлен на микроскопа не требуется.
3. В день эксперимента, удалите среды и вымыть клетки 3 x с 1 мл Эм среднего на 21 ° C.
4. Тензометрические силоизмерители с 3 мм¹⁴ Fluo-4-ам в буфере EM за 30 мин при 21 ° C.
   Примечание: в то время как Загрузка югу вырожденная НеЬа клетки не вызывает серьезных проблем, Загрузка поляризованные TC-7 клеток часто гетерогенных и недостаточно эффективным. Для этих клеток, мы нашли, что эффективность загрузки усиливается добавлением диспергатор — плюрониевого кислота — в конечной концентрации 0,1% и АБС битор bromosulfophtalein анион транспортер в конечной концентрации 20 мкм до FLUO-4-AM-содержащих EM. Использование ratiometric химические датчики или генетически закодированный ладу зондами, которые требуют двойной приобретение не совместим с скорость приобретения необходимых для изображений местных Ca^{2 +} ответы.
5. Стирать образцы 3 x с EM буфер и далее инкубировать их в 1 мл Эм буфера при 21 ° C для гидролиза остаток утра. Использование Fluo-4 загружен клетки, немедленно или в течение следующих 90 мин (поддерживается при температуре 21 ° C).

2. инфекции и изображения приобретение местных Ca^{2 +} ответы

1. Место coverslip, содержащие Fluo-4 загружен клетки в тепловизионной камеры или стекло дно камеры. Стирать образцы в тепловизионной камере или одноразовые стекло дно камеры 3 x с EM буфер для удаления соединений, потенциально связанные с лизис клеток. Добавьте 1 mL EM буфера.
2. Камеры на сцене Перевернутый флуоресцентным микроскопом отопляемых на 33 ° C.
   Примечание: Эта температура выбирается в качестве компромисса между оптимальной температуры, совместимы с процессом вторжения Shigella и замедление Ca^{2 +} ответы для визуализации местных реакций. Мы используем 63 X погружения нефти цель (NA = 1,25) с фазы контраст кольца.
3. Выберите поле микроскопии и Настройка параметров получения, включая время экспозиции и биннинга если необходимо оптимизировать Fluo-4 флуоресцентного сигнала.
   Примечание: Основные проблемы местных Ca^{2 +} изображений низкой амплитуде и небольшой продолжительности ответов, требующих приобретение по крайней мере каждые 30 г-жа несколько коммерчески доступные задней подсветкой EM-CCD или C-MOS камеры представляют необходимые чувствительность для выявления местных Ca^{2 +} ответы с помощью Fluo-4. Чувствительность обнаружения также является важным вопросом для ограничения фотоповреждения или артефактов, таких как спонтанное ответы, связанные с флуоресцентные возбуждения флуоресценции-4 на высоких частотах. Здесь, на основе LED освещение 470 Нм, с 480 ± 40 Нм полосовой фильтр возбуждения, 505-нм Дихроичный фильтр и 527 ± 30 Нм полосовые выбросов на 5% от его максимальной интенсивности, в сочетании с 1,0 фильтр нейтральной плотности, были использованы для минимизации этих проблем под струей приобретения ограниченной длительности. Регулярно проводился анализ местных Ca^{2 +} сигналов партиями 120 s потоков. В этих условиях низкой освещенности Флюорофор Фотообесцвечивание не наблюдалось в течение 2 мин поток приобретений. Последовательных приобретений на том же образце могут выполняться, условии, что используются различные поля. Как правило поток первого приобретения осуществляется на поле элемента управления в отсутствие стимуляции бактерий для обеспечения отсутствия спонтанного ответов. Если наблюдаются спонтанной реакции, пробы промываются с EM буфера до тех пор, пока нет ответов наблюдаются.
4. Чтобы добавить бактерий в образце, удалите 500 мкл буфера EM из камеры и 500 мкл бактериальных подвески на шаге 1.1.6 готовы получить окончательный ОД_600nm 0,05, с соответствующей осторожностью, чтобы избежать перемещения поля выбранного микроскопии; объемы обеспечить надлежащее смешивание бактерий и равномерное распределение бактерий на образцы клетки.
5. Выполните приобретения на бактериальных сложения. Кроме того выполните приобретения 10 мин после бактериальной Добавление, которое соответствует времени, необходимого для бактерий отложений на клетки в условиях использования. В конце потока приобретения приобрести фазово контрастной изображение выбранного поля для визуализации бактерий, клеток и оборками мембраны, связанные с сайтами бактерий вторжения.
6. Повторите процедуру приобретения как шаг 2.5, интервалы, которые поддаются продолжительность приобретений изображения, файлы сбережений и выбор нового поля, чтобы покрыть весь процесс.
   Примечание: Для шигеллы, мы нашли что приобретение потоков каждые 5 минут за 20 мин, после 10 мин бактериальных седиментации, позволило охватить большинство событий вторжения.
7. В конце процедуры приобретения добавьте конечная концентрация 2 мкм Ca^{2 +} ionophore ionomycin образцов для определения максимальной амплитуды Ca^{2 +} сигналов. Получение изображений каждые 3-5 s до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 мин.
8. Следовать за путем добавления Ca^{2 +} хелатором EGTA в конечной концентрации 10 мм для определения сигнала флуоресценции в отсутствие Ca^{2 +}. Получение изображений каждые 3-5 s до стабилизации сигнала, обычно менее чем за 10 мин.
   Примечание: Из-за относительно медленной динамики глобального Ca^{2 +} вариации, выполните эти приобретения каждые 3-5 s (не в потоковом режиме), позволяя для Ca^{2 +} изображений на том же микроскопическом поле во время последовательных процедур.

3. анализ

1. Экспресс цитозольной Ca^{2 +} вариации со временем как процент ΔF/Ф₀, где ΔF представляет собой вариации интенсивности средний флуоресценции региона интерес (ROI) и F₀ базовых флуоресценции в же ROI, к которому без соответствующего региона поля лишенный клетки вычитается.
   1. Удалить уровень базальной флуоресценции для каждой ячейки в различных областях, соответствующей исходных уровней; Эти уровни могут недвусмысленно определены из-за низкой частоты и сравнительно короткая продолжительность местной Ca^{2 +} ответы в приобретении данного потока.
      Примечание: Количественно яркие черты ответы на вопросы, относящиеся и патогенных модель учился. Классически различные параметры учитываются для анализа Ca^{2 +} сигналов, включая частоту клеток, показаны локальные или глобальные Ca^{2 +} ответы, а также продолжительность, амплитуду и частоту этих ответов. В случае Shigella и местные реакции еще одним важным аспектом анализа является пространственной ассоциацией ответов с бактерий вторжения сайтов.
2. Для количественного определения процент клеток реагировать, показаны глобальные или локальные ответы, нарисуйте ROIs в клетках, в ряды соответствует вариации интенсивности флуоресценции-4.
   1. Установить строгие параметры для выявления местных Ca^{2 +} ответы, например амплитудой трехкратное выше фона вариации исходных клеток интенсивность средняя флуоресценции или продолжительностью по крайней мере 200 мс, чтобы избежать скоринга ложный положительный.
      Примечание: Как правило, даже небольшие местные Ca^{2 +} ответы можно отличить от любого фонового шума в их профиле. ROIs должно быть достаточно большим, чтобы интегрировать сигналы достаточно флуоресценции для выявления местных вариаций. В зависимости от интенсивности флуоресценции-4 обнаружения эти ROIs могут соответствовать круги диаметром от 2-5 мм.
   2. Измерьте изменения средней интенсивности флуоресценции Fluo-4 в 2 регионах в различные области той же ячейке, чтобы определить, являются ли ответы локальные или глобальные.
      Примечание: Анализ большого числа клеток облегчается использование изображений программное обеспечение, позволяющие он-лайн экран вариации интенсивности средний флуоресценции со временем для отдельных регионов. Коммерчески доступных изображений программное обеспечение имеет такую возможность, но это может также производиться с использованием Icy freeware, используя плагин ROI интенсивности эволюции .
   3. Определите процент клеток, показаны местных реакций.
      Примечание: Этот процент вычисляется исходя из общего числа клеток, анализа в микроскопии поле, которое должно быть в достаточном количестве для поддержки статистически значение с использованием непараметрических тестов.
   4. Определите продолжительность местных реакций.
      Примечание: Местные Ca^{2 +} ответы можно далее выделить по диапазонам продолжительность (то есть, менее чем 500 мс, между 5 и 10 s, или выше 10 s) и их связь с шигеллезом вторжения сайтов.
3. Количественно амплитуда ответов. Во-первых калибровки максимальная Ca^{2 +} и ячейки фоновых уровней определяется как шаг 2.1.7. Поскольку нагрузка Fluo-4 могут отличаться для каждой ячейки, выполните эти решения для отдельных ячеек в области.
   1. Экспресс амплитуда ответов как относительный процент максимальной реакции.
   2. Проверка статистических с помощью теста нормальной жизни, следуют параметрические испытания для анализа потенциальных различий между выборками в амплитуде ответов.
   3. Определите ассоциацию этих ответов относительно бактерий вторжения сайты, их соответствующих локализации для оборки индуцированного бактериальной мембраны, визуализируется в соответствующей фазе контрастность изображения.

Representative Results

Шигеллы вторжения ассоциируется с нетипичным долгосрочные местные Ca^{2 +} ответы:

После протокол, упомянутых выше Fluo-4-загружен НеЬа клетки были оспорены с WT Shigella и поток приобретений были исполнены анализировать сигналы Ca^{2 +} . Представитель эксперимента показан на рис. 1, с покадровой фотографии серии интенсивности флуоресценции зонда Fluo-4, в среднем в регионе интерес для одной ячейки и соответствующего этапа контраст изображения (Рисунок 1A, слева Группа). Сайт вторжения Shigella характеризуется оборками мембраны обнаружен в фазе контраст изображения (рис. 1A, стрелка). Атипичные местное увеличение бесплатные цитозольной Ca^{2 +} наблюдаются на сайте вторжения Shigella с различной амплитуды и длительности, начиная от 2,5-5 s (цифры 1A и 1B, стрелки), следуют глобальный рост ВИЧ-инфицированных ячейка (рис. 1B, стрелок).

Тип III эффекторных IpgD регулирует переход от местного к глобальной Ca^{2 +} ответы, вызванных Shigella в НеЬа клетки:

Анализ Ca^{2 +} сигналов индуцированных одичал тип Shigella и isogenic мутантный штамм недостаточным для типа III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4, 5 Бисфосфат фосфатазы, указал, что этот последний штамм индуцированной более глобального и менее атипичные местные ответные меры с длинные длительности (RATPs) с 11,3 ± 4,4 (SEM) % и 40.3 ± 7,5 (SEM) % клеток реагировать с глобальных ответных мер в случае WT и ipgD мутант, соответственно (рис. 1 d)¹⁵. Этот мутант ipgD получает местные ответы на аналогичные частоте как штамм WT.

Шигеллы ингибируют InsP3-зависимых глобальной Ca^{2 +} увеличение клеток HeLa во время кинетики длительной инфекции:

Визуализация глобального Ca^{2 +} ответы над расширенной инфекции кинетики указал на снижение частоты ответов 30 мин после проблема с одичал тип Shigella (рисунок 2A). В TC-7 клетки, инфицированные 30 мин с одичал тип Shigella¹⁵было отмечено аналогичные снижение частоты Ca2 + ответы. Количественная оценка дозы зависимой ячейки ответы на Ca^{2 +} агонист гистамин иллюстрирует ингибитирование InsP3-зависимых Ca^{2 +} выпуска на поздних стадиях инфекции Shigella . WT Shigella приводит к нетипичным изолированных Ca^{2 +} ответы в течение первых 30 мин инфекции и после дальнейшей инкубации, резкое уменьшение амплитуды и частоты Ca^{2 +} ответов было отмечено (рис. 2B).

Рисунок 1 . Местные и глобальные Ca^{2 +} ответы во время вторжения Shigella . НеЬа клетки были погружены с Fluo-4-ам и оспорены с WT Shigella. (A) левой панели показывает этап контраст изображения. Правая панель показывает рядов динамики средней интенсивности флуоресценции Fluo-4 с цветовой код, изображенный на право. Время от начала приобретения указывается в секундах, 10 мин после бактериальной вызов. Стрелка указывает вторжения очагов. Окружностей изображен соответствуют регионам, анализируется в пункте (B), где следы с соответствующим цветом представляют собой вариации интенсивности средняя флуоресценции Fluo-4 над базовой линией. Стрелки указывают местных реакций. Стрелки указывают глобальных ответных мер. (C) это схема с изображением определение продолжительности Ca^{2 +} ответов. Горизонтальной пунктирная линия указывает на базальную Ca^{2 +} уровнях (F₀); вертикальные полосы показывают фон вариации. Вертикальная пунктирная линия указывает максимальная амплитуда ответа; горизонтальные полоски указывают продолжительность определяется на половину максимальная амплитуда ответа. (D) это процент реагировать клетки ± SEM показаны ответы местных и глобальных Ca^{2 +} ответы искусственного 5 мин после инфекции с WT Shigella (тёмно серые полосы) или ipgD мутанта (светло серые полосы). RATPs являются местные Ca2 + ответы, которые последний для более чем 5 s. N = 4; > 60 ячейки для каждого времени. Вилкоксон тест, *P < 0,05; P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Ингибирование глобальных Ca^{2 +} ответы во время расширенной кинетики Shigella инфекции. (A) Верхняя синяя стрелки представляют шкале времени бактериальных и гистамин Challenge на указанных концентрациях. Эта панель показывает представитель следы одной ячейки глобальной Ca^{2 +} вариации после инфекции WT Shigella (зеленый) и ipgD мутантный штамм (оранжевый). (B) Эта группа показывает процент амплитуды Ca^{2 +} ответы относительно максимального ответ, после стимуляции на 0,5 мкм гистамин клеток, инфицированных штаммами указанных 90 мин. Сплошной горизонтальной панели представляет собой средний максимальный процент. Вилкоксон тест, **P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Эта рукопись описывает протокол, который мы спроектирован, чтобы следовать местные Ca^{2 +} сигналов в течение относительно короткого кинетика Shigella вторжения, а также глобальные Ca^{2 +} ответы во время расширенной кинетика Shigella. Ниже ключ можно найти проблемы, которые необходимо решить для оптимизации обнаружения Ca^{2 +} сигналов при сведении к минимуму вмешательства с биологических процессов.

Химические против генетически закодированный Ca^{2 +} датчики:

Для изображения местные Ca^{2 +} вариации, мы использовали Fluo-4 химических зонд из-за его высокой квантовой урожайности и динамика его быстрый ответ. Скорость, необходимых для приобретения также не исключает использования ratiometric зонды, поскольку приобретение двойной длины волны не может быть выполнена. Использование патогенных микроорганизмов, однако, может помешать с стандартными процедурами, с помощью Ca^{2 +} химическая зондов. Например продолжительное клеток инфекции более 60 мин, шигеллы предотвращает любую ячейку, загрузки с химические датчики, предположительно из-за возбудителя индуцированные изменения принимающей мембран клеток плазмы. Последовательно в течение долго инфекции кинетики, благодаря цитоплазматических потеря этот зонд наблюдается снижение флуоресценции клеток связанные Fluo-4. Таким образом реализации элемента управления, такие как добавление ionomycin чтобы определить флуоресценции в максимальной Ca^{2 +} концентрациях в конце приобретений имеет решающее значение для выявления клеток реагировать. Кроме того поляризованные кишечных эпителиальных клеток, соответствующего возбудителя инфекции, как представляется, огнеупорные для загрузки Ca^{2 +} зонда и требует загрузки конкретных процедур. В то время как использование генетически закодированный Ca^{2 +} репортер (GECR) может помочь решить некоторые из этих вопросов, он также вводит другие проблемы. Эффективность трансфекции в принимающей ячейки системах может представлять серьезное ограничение, особенно если она начитан с бедными инфекционным доходности. Кроме того характеристики реагировать Ca^{2 +} вариации большинство GECRs не совместимы с быстрой кинетики, необходимых для местных Ca^{2 +} анализа. Наконец выражение GECR может мешать возбудителей опосредованной процессов. Мы не будем обсуждать использование GECR для изучения Ca^{2 +} сигнализации во время взаимодействия хост патогена. Недавние и текущие техники различных GECR «быстрого реагирования», вероятно, заслуживают исследователи пересмотреть их использования в будущих исследованиях.

Сроки приобретения местных Ca^{2 +} ответы во время бактериальной инфекции:

Визуализация местных Ca^{2 +} ответы требует высокую скорость загрузки изображений, подразумевающие возбуждения устойчивый флуоресценции зонда Fluo-4. Из-за повреждений, связанных с приобретением высокой частоты важно, что интенсивность света возбуждения Флюорофор хранится до минимума, необходимого для получения достаточной соотношение сигнал шум с временем экспозиции, не превышает 30 г-жа у нас хорошие результаты, используя светодиодные системы в 5% от его максимальной интенсивности, в сочетании с 1.0 оптической плотности фильтра с приобретения настройки, как описано в шаге 2.1.4. Даже в этих условиях однако, мы обнаружили, что непрерывное освещение, необходимые для приобретения режиме потока не позволяют на приобретение период в течение 2 мин. Сильнее освещение или приобретения период, превышающий этот предел может привести в неспецифической глобальные Ca^{2 +} ответы и/или ингибирование процессов бактерий вторжения, предположительно связанных с фотоповреждения. Хотя изображения местных Ca^{2 +} ответы более длиннее кинетики возможно с более чувствительной средства обнаружения, в настоящее время государства, что таких изображений может быть выполнена только за ограниченное время часть 15 мин Shigella вторжения процесса. Чтобы охватить весь процесс, мы провели последовательные серии 2-мин потокового приобретений. Этот интервал времени достаточно, чтобы следить за первоначальный местные и глобальные Ca^{2 +} ответы на начальном этапе процесса инфекции и создать значительные различия в штамм бактерии Shigella одичал тип и его isogenic ipgD¹⁶мутантов. Разработка высокочувствительных камеры может разрешить исследователей для дальнейшего сокращения интенсивности освещения Флюорофор и выполнять местные Ca^{2 +} изображений в течение длительного времени, таким образом улучшая время резолюции более переходных Ca^{2 +} сигналов.

Пространственная корреляция между местными Ca^{2 +} ответы и бактерий вторжения сайты:

Из-за местных аспект сигнализации событий, вызванных микроорганизмами важно изучить местные Ca^{2 +} сигналов в отношении их связи с сайтами взаимодействий клеток возбудителя хост. Это породило два вида соображений. Во-первых все клетки не могут быть заражены, и все микроорганизмы не могут вызвать сигнализацию. Для шигеллытолько меньшинство бактерий вызывать вторжение, и все клетки не могут быть инфицированы. В наших экспериментах, МВД был скорректирован так что одну ячейку формы 0,7 - 1 фокус бактерий вторжения. Увеличение числа очагов/клеток может привести к возможного вмешательства для анализа отдельных вторжения событий и, наоборот, низкие показатели могут сделать анализ слишком сложным, в частности при изучении временно transfected клеток. Мы обнаружили, что эффективность трансфекции должен достичь по крайней мере 30% клеток снизить количество повторных экспериментов к управляемым чисел. Во-вторых шигеллы вторжения сайты могут быть легко обнаружены фазово-контрастной микроскопии. Для других процессов могут использоваться другие методы на основе флуоресценции обнаружения. Важным аспектом, однако, является, что в самых экспериментальных установок, поток приобретение необходимых для местных Ca^{2 +} изображений не исключает других видов приобретения период. Это подразумевает, что процесс анализа не должен показать значительное движение во время этого потока, чтобы разрешать их пространственные корреляции с местными Ca^{2 +} сигналов. Хотя это дело Shigella вторжения событий, которые локализовать к одной и той же ячейки области в течение нескольких минут, очень подвижные процессы не могут быть управляемыми или вероятно потребует короче приобретение потоков.

Озвучивание и анализ местных Ca^{2 +} ответы:

В то время как глобальные Ca^{2 +} ответы легко обнаруживаются, выявления местных Ca^{2 +} ответы небольшие амплитуды и длительности требует оптимизации приобретения флуоресцентные сигналов, описанных выше. Важно также, что строгие критерии применяются для различения сигналов выше вариантов фона. Как правило мы как Ca^{2 +} сигнал Оценка увеличения средней интенсивности флуоресценции Fluo-4, которая достигает по крайней мере 3 x базовые вариации в трех последовательных 30 мс приобретений. Этот ответ считается локальным, если другой регион показаны же интенсивность средняя флуоресценции клеток не показывать такое увеличение. Озвучивание местных Ca^{2 +} ответы в различных образцах не должно вызывать серьезные трудности, если систематически применяются эти правила. В наших руках низкой частоты местных Ca^{2 +} сигналов связанные с бактерий вторжения и начиная от 5-20% клеток проанализирована представлены главным препятствием. За рамки биологической вариации, подробно описаны в предыдущем пункте, тот факт, что только поток, соответствующий часть анализируемого вторжения процесса также способствует укреплению этой низкой частоты. Из-за этой низкой частоты установление различия между образцами могут обвинить выполнения тестирования питания на пилотных экспериментов для оценки размера выборки для достигло статистической значимости.

Будущих приложений:

Мы считаем, что протоколы работал для анализа местных Ca^{2 +} сигналов во время вторжения Shigella будет полезным для изображения местных Ca^{2 +} ответы для всех процессов, которые остаются пространственно ограничиваться в период приобретения. В то время как Ca^{2 +} сигнализации является универсальным, местные Ca^{2 +} сигнализация может быть наиболее актуальными для процессов, происходящих в плазме или внутриклеточные мембраны, где проживают первоначальный точечных источников сигналов. Таким образом, во время микробной клетки-взаимодействий, местные Ca^{2 +} сигналы могут быть отношение к клей или инвазивных процессов на плазматической мембраны или происходящие на внутриклеточные мембраны патогена, содержащего вакуоли. С другой стороны протоколы, которые мы разработали для анализа глобальных Ca^{2 +} сигналы над расширенной инфекции кинетики могут быть актуальными для процессов, влияющих на общую камеру физиологии во время инфекции, такие как регулирование транскрипционный анализ программы или путей смерти клетки патогенных микроорганизмов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin