Summary

Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протоколы визуализировать ответы кальция (Ca2 +), вызвало НеЬа клетки, инфицированные Shigella. Путем оптимизации параметров бактериальной инфекции и изображений с Ca2 + флуоресцентных зондов, характеризуются нетипичных глобальных и местных Ca2 + сигналы вызванных бактериями в большом диапазоне кинетики инфекции.

Abstract

CA2 + является вездесущий Ион участвует во всех известных клеточных процессах. В то время как глобальные Ca2 + ответы могут повлиять на судьбу клеток, местные вариации концентраций бесплатно Ca2 + цитозольной, связан с освободить от внутренних магазинов или приток через каналы плазматической мембраны, нормализует процессы корковых клеток. Патогенов, придерживаться или вторгнуться принимающей ячейки триггер реорганизации Цитоскелет актина, лежащие в основе хост плазматической мембраны, которая скорее всего влияет как на глобальном, так и на местном Ca2 + сигнализации. Потому, что эти события могут происходить на низких частотах в псевдо-стохастических образом над расширенной кинетики, анализ Ca2 + сигналов, вызванных микроорганизмами, поднимает основные технические проблемы, которые необходимо решить.

Здесь мы приводим протоколы для обнаружения сигналов глобальных и местных Ca2 + после инфекции Shigella эпителиальных клеток. В этих протоколах артефакты, связанные с длительного воздействия и фотоповреждения, связанные с возбуждением Ca2 + флуоресцентных зондов возникновения, строго контролируя параметры приобретения за определенный период времени во время Бактерии Shigella вторжения. Процедуры осуществляются тщательно анализировать амплитуду и частоту сигналов глобальной цитозольной Ca2 + во время расширенной инфекции кинетики, используя химические зонд Fluo-4.

Introduction

CA2 + регулирует все известные клеточных процессов, включая цитоскелета реорганизации, воспалительных реакций и пути смерти клетки, связанных с хост возбудитель взаимодействия1,2,3. В физиологических условиях базальный цитозольной Ca2 + концентрации являются низкими, в сотни Нм диапазона, но может подвергаться переходных увеличивается после стимуляции агонистов. Эти варианты часто показывают колебательной поведение через действие насосов и каналов на мембраны плазмы и эндоплазматического ретикулума. Эти колебания характеризуется период, продолжительность и амплитуды Ca2 + увеличивается и расшифровывается клетками, которые, в свою очередь, вызывают конкретные ответы в то, что известно как Ca2 + код4,5 . Устойчивый рост в цитозольной Ca2 + концентрации в патологических условиях может привести к смерти клетки, связанные с permeabilization митохондриальных мембран и выпуска pro-apoptotic или некротических факторов6, 7.

Шигеллы, возбудитель бактериальной дизентерии, поражает эпителиальные клетки путем впрыскивать эффекторов в клетки хозяина, с использованием типа III секреторной системы (T3SS)8,9. Шигеллы вторжения клеток хозяина ассоциируется с местными и глобальными Ca2 + сигналы с T3SS. Что касается порами формирования токсинов, translocon T3SS, который вставляет узел клеточных мембран и требуется для инъекций эффекторов T3SS скорее всего отвечает за активацию PLC и инозитол (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-зависимых Ca2 + релиз. Сочетание локализованных стимуляции PLC и накопление полимеризованной актина на участках в результате вторжения шигеллы в нетипово долгосрочного InsP3-зависимых Ca2 + выпуск10. Тип III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4,5 Бисфосфат (PIP2) -4-фосфатазы, ограничивает количество местных PIP2, таким образом контролируя количество доступных субстрат для PLC для создания InsP3, которая способствует сосредоточение местных Ca2 + ответы бактерий вторжения сайтов11,12. Эти местные Ca2 + ответы могут способствовать актина полимеризации Shigella вторжения сайты10. Глобальные Ca2 + ответы, которые также вызвало, шигеллы, однако, являются необязательным для процесса бактерий вторжения, но инициировать открытие connexin hemichannels на плазматической мембраны и выпуска АТФ в внеклеточного отсека. Выпущенные СПС, действуя в духе паракринными, в свою очередь, стимулирует Ca2 + колебательных реакций в клетках рядом с инфицированной клетки. IpgD также отвечает за формирование глобальных Ca2 + ответы в неустойчивой изолированных ответов с медленной динамики. В конце концов после длительной бактериальной инфекции, IpgD приводит к ингибированию InsP3-опосредованной Ca2 + сигналов. Через свое вмешательство с Ca2 + сигнализации, IpgD задержки Ca2 +-зависимой calpain активации, ведущих к разборке адгезии координационных структур и преждевременная отслойка инфицированных клеток13.

В то время как Ca2 + сигналы участвуют в критические аспекты патогенеза, использования микроорганизма поднимает ряд технических проблем, которые не встречаются в классической агонист исследований. Протоколы, описанные здесь использовать часто используемые флуоресцентные Ca2 + химический индикатор Fluo-4, который мы спроектирован, чтобы характеризовать местных Ca2 + сигналов во время инфекции Shigella . Обсуждаются шаги критических для обнаружения этих сигналов, а также процедуры для их количественного анализа, который необходим для характеризуют роли бактериальной эффекторов в Ca2 + сигнализации.

Protocol

1. Подготовка Подготовка бактерий Пластина бактерии —шигелла одичал тип деформации выражая AfaE адгезина (M90T-AfaE) — на trypticase сои (TCS) агар пластины содержащий 0,01% Конго красный (CR) и инкубировать их в течение 18 часов при 37 ° C.Примечание: Для увеличения их воспроизв?…

Representative Results

Шигеллы вторжения ассоциируется с нетипичным долгосрочные местные Ca2 + ответы: После протокол, упомянутых выше Fluo-4-загружен НеЬа клетки были оспорены с WT Shigella и поток приобретений были исполнены анализировать сигналы Ca<sup…

Discussion

Эта рукопись описывает протокол, который мы спроектирован, чтобы следовать местные Ca2 + сигналов в течение относительно короткого кинетика Shigella вторжения, а также глобальные Ca2 + ответы во время расширенной кинетика Shigella. Ниже ключ можно найти проблемы, которые необ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Дженни-ли Thomassin за ее помощь в редактировании рукопись. Работа была поддержана ANR предоставляет MITOPATHO и PATHIMMUN, гранты от Labex Memolife и Shigaforce IDEX ПДП. Chunhui солнце является получателем доктора грант от Совета стипендию Китая. Лоран Combettes и парень Чан Ван Nhieu являются получателями WBI-Франс обмена Tournesol программы N ° 31268YG (Fonds de la Recherche Scientifique, Министерство Français des дел Валлонии-Брюсселя International et европейских сообществ, Ministère де высшего образования et de la исследований dans le cadre des Partenariats Юбера Курьена).

Materials

Fluo-4 AM Invitrogen F14201
Metamorph version 7.7 Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2 Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high  IBIDI 81156
Trypticase Soy (TCS) broth Thermofisher B11768
TCS agar Thermofisher B11043
Congo red Sigma-Aldrich 75768
M90T-AfaE Sun et al. 2017 Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE Sun et al. 2017 isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin

References

  1. Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  3. Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
  4. Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
  5. Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
  6. Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
  7. Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
  8. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
  9. Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
  10. Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
  11. Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
  12. Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
  13. Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
  14. Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
  15. Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
  16. Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).

Play Video

Cite This Article
Smail, Y., Sun, C., Combettes, L., Tran Van Nhieu, G. Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (135), e57728, doi:10.3791/57728 (2018).

View Video