علينا أن نظهر ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للتصور المناعي للفئران بيريسيتيس microvascular الشبكية و أي البرد-أقسام والجامع–يتصاعد والعزلة ناقص التوتر لشبكة الأوعية الدموية.
بيريسيتيس الشبكية دوراً هاما في العديد من أمراض العين. المناعي تلطيخ التقنيات الشبكية السفن وميكروفاسكولار بيريسيتيس المركزي لبحوث طب العيون. من المهم أن تختار طريقة مناسبة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار. يصف لنا بيريسيتي ميكروفاسكولار الشبكية المناعي تلطيخ في البرد-أقسام وكل–يتصاعد وناقص التوتر المفرج المعزولة باستخدام الأجسام المضادة لعوامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات بيتا (PDGFRβ) والأعصاب/الدبقية مستضد 2 (NG2). وهذا يسمح لنا لتسليط الضوء على مزايا وعيوب كل من الأعمال التحضيرية ثلاثة أنسجة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار الشبكية. Cryo-أقسام تقديم التصور ترانسيكشونال من جميع طبقات الشبكية لكن تحتوي على إلا عدد قليل من التخفيضات عرضية عرضية ميكروفاسكولاتوري. الجامع-جبل يوفر لمحة عامة عن المفرج الشبكية كاملة، ولكن التصور ميكروفاسكولاتوري يمكن أن تكون مزعجة. ناقص التوتر العزل يوفر طريقة لتصور المفرج الشبكية كاملة بإزالة الخلايا العصبية، ولكن هذا يجعل الأنسجة هشة للغاية.
بيريسيتيس الشبكية هي تركيز العديد من مختبرات الأبحاث هذه الخلايا تلعب دوراً كبيرا في سلامة المفرج. الحالات المرضية مثل اعتلال الشبكية السكري1والاسكيمية2و3 من الزرق بخصائص الأوعية الدموية التي تنطوي على وظيفة بيريسيتيس. تم العثور على بيريسيتيس في بليكسوسيس الشعرية الشبكية الداخلية. وفروع الشريان الشبكية المركزية التي تزود الشبكية الداخلية في طبقتين من بليكسوسيس الشعرية. سرير الأوعية الداخلية يقع بين الخلية العقدة وطبقات النووية الداخلية. طبقة أعمق أكثر كثافة وتعقيداً وهو مترجم بين طبقات النووي الداخلي والخارجي4،5. وبالإضافة إلى ذلك، تحتوي بعض أجزاء من الشبكية أيضا على شبكة ثالثة تسمى الشعيرات الدموية بارابابيلاري شعاعي. هذه طويلة، مستقيم الشعيرات الدموية التي تقع بين الألياف العصبية ونادراً ما أناستوموسي مع بعضها البعض أو بليكسوسيس اثنين الأخرى6. داخل الجدار الشعرية، بيريسيتيس المضمنة في الغشاء الطابق السفلي وخط على الجانب أبلومينال من الخلايا البطانية في الأوعية الدموية.
وحتى الآن، هناك لا علامة بيولوجية فريدة من نوعها لهذه بيريسيتيس التي يمكن تمييزها عن غيرها من الخلايا والأوعية الدموية. عامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات بيتا (PDGFRβ) والأعصاب/الدبقية مستضد 2 (NG2) هي علامات شائعة الاستخدام الذي يقدم في بيريسيتيس ولكن أيضا غيرها من الخلايا والأوعية الدموية. تحديد بيريسيتيس تعقيداً بسبب وجود مجموعات فرعية بيريسيتي التي تختلف في التعبير مورفولوجيا والبروتين7. تعتمد حاليا، تحديد أفضل مزيج من علامات البروتين وتحديد المواقع المميزة من بيريسيتي في جدار الأوعية الدموية. علينا أن نظهر هنا ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للمناعي تلطيخ PDGFRβ/NG2 بيريسيتيس microvascular الشبكية الفئران، أي، cryo-أقسام، الجامع–يتصاعد، وناقص التوتر العزلة شبكة الأوعية الدموية.
مع البرد-المقاطع، يتم قطع الشبكية والصلبة عن طريق العصب البصري. وهذا يسمح للتصور من جميع هياكل طبقات من الخلايا العصبية. طبقات الشبكية عشرة متميزة الظاهر كجانب تتبادل الهياكل النووية ومحواري/الجذعية التي يمكن تصور مع بقع مثل الهيماتوكسيلين/ويوزين أو الفلورسنت النووية 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)8. تختلف متطلبات الأيض بين طبقات9 وأنه يوفر طريقة لتحديد سمك أو إجمالي غياب طبقة معينة (مثلاً، فقدان خلايا الشبكية العقدة إحدى السمات المميزة الاسكيمية الشبكية10، 11). ويتضح المفرج كما عرضية يخترق الشبكية، مما يجعل من الممكن لدراسة كل على حدة بليكسوسيس الشعرية داخل طبقات الشبكية كل منهما12،13.
أكثر تقليديا، تجري التحقيقات المتعلقة بشبكة الاتصال الشبكية المفرج في الشبكية كل–يتصاعد. مع هذا الإعداد الأنسجة، قطع شبكية العين وسويت بالأرض كبنية على شكل زهرة. الأسلوب هو أسلوب إعداد أنسجة سريعة نسبيا التي يمكن أن تسلط الضوء على المفرج الشبكية الشاملة في الهندسة المعمارية وذلك كثيرا ما تطبق في تحقيق نيوفاسكولاريزيشن في الشبكية موريني. التصور الناجح من ميكروفاسكولاتوري في الجامعة التي شنت شبكية العين يقال أيضا في وضع الماوس الولدان والفئران الشبكية14،،من1516،،من1718، 19-تكشف هذه الدراسات نشاطا بيريسيتيك أكثر تحديداً مع أكبر المناطق الخالية من شعري في الكبار مقارنة ب المواليد الشبكية14.
هو طريقة أخرى لتصور ميكروفاسكولاتوري الشبكية بعد عزلة ناقص التوتر. نتائج هذا الأسلوب إعداد الأنسجة في الأوعية الدموية الشبكية والشعيرات الدموية سراحهم من الخلايا العصبية. عادة هذا النوع من التصوير ثنائي الأبعاد لشبكة الأوعية الدموية الشبكية معزولة المنجزة بعد التربسين الشبكية الهضم20 والمستخدمة لتقييم تشوهات الأوعية الدموية اعتلال الشبكية السكري بما في ذلك فقدان بيريسيتي والشعرية تنكس20،،من2122. ويوفر طريقة العزل ناقص التوتر التحقيقات الجينات الأوعية الدموية الشبكية والاستجابات التنظيمية البروتين كما فعلوا مع RT-PCR وغرب النشاف23،،من2425. نحن نقدم هنا بروتوكولا لتلطيخ المناعي التعويم الحر للمفرج الشبكية معزولة ناقص التوتر كبديل الهضم التربسين لدراسة بيريسيتيس ميكروفاسكولار.
نحن نقدم ثلاث تقنيات إعداد الشبكية التي يمكن تطبيقها في دراسة ميكروفاسكولار بيريسيتيس الشبكية. فيما يلي، نقدم مقارنة بين كل من الطرق وتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في البروتوكولات.
مع تقطيع البرد، هو قطع الشبكية في أقسام السهمي و ومن ثم فإنه من الممكن الحصول على عينات عد?…
The authors have nothing to disclose.
الأبحاث بتمويل من مؤسسة Lundbeck، الدانمرك.
Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |