Мы показываем три методы приготовления различных тканей для визуализации иммуногистохимических сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
Сетчатки pericytes играют важную роль во многих заболеваний глаза. Иммуногистохимическое окрашивание методы сосудов сетчатки и микрососудистой pericytes являются центральными для офтальмологических исследований. Важно выбрать подходящий метод визуализации микрососудистой pericytes. Мы описываем сетчатки микрососудистой перицит иммуногистохимическое окрашивание в крио секции, всего кронштейны и гипотонической изолированных сосудистую, с использованием антител для тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Это позволяет нам подчеркнуть преимущества и недостатки каждого из трех ткани препаратов для визуализации сетчатки микрососудистой pericytes. Крио разделы обеспечивают transsectional визуализация всех слоев сетчатки, но содержат только несколько иногда поперечные срезы microvasculature. Целом гора обеспечивает обзор всей сетчатки сосудистую, но визуализация microvasculature может быть хлопотно. Гипотонический изоляции обеспечивает метод визуализировать всю сосудистую сетчатки, удаление нейрональных клеток, но это делает ткани очень хрупкие.
Сетчатки pericytes находятся в центре внимания многих научно-исследовательских лабораторий, как эти клетки играют важную роль в целостности сосудистую. Патологических состояний, таких как диабетическая ретинопатия1, ишемия2и глаукомы3 имеют сосудистой характеристики, которые включают функцию pericytes. Pericytes находятся в внутренний сетчатки капиллярной сплетения. Центральной артерии сетчатки, которая поставляет внутреннюю сетчатки разветвляется на два слоя капиллярного сплетений. Внутренняя сосудистого русла находится между клеток ганглия и внутренние ядерного слои. Глубокий слой более плотным и сложных и локализуется между внутренней и наружной ядерных слои4,5. Кроме того некоторые части сетчатки также содержат третья сеть называется радиальной parapapillary капилляров. Эти длинные, прямые капилляров, которые лежат среди нервных волокон и редко анастомозируют с друг с другом или другие два сплетения6. В стенке капилляров pericytes встраиваются в базальной мембраны и линии с abluminal стороны сосудистой эндотелиальных клеток.
К этой дате существует не уникальный биологический маркер эти pericytes, которые могут дифференцировать их от других сосудистых клеток. Часто используемых маркеров, которые представляют на pericytes, но и другие сосудистые клетки тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Выявление pericytes еще больше осложняется существование перицит подмножеств, которые различаются по морфологии и белка выражение7. В настоящее время лучшие идентификации опирается на комбинацию белковых маркеров и характерным позиционирования перицит в сосудистой стенке. Мы демонстрируем здесь три методы приготовления различных тканей для иммуногистохимическое окрашивание PDGFRβ/NG2 сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
С крио секции сетчатки и склера прорваться через зрительный нерв. Это позволяет для визуализации всех слоистых структур нейронов. Собственный десяти слоев сетчатки являются очевидными как Перепутывание ядерного и аксональной/дендритных структуры, которые могут быть визуализированы с пятнами как гематоксилином/эозином или флуоресцентные ядерной 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Метаболические требования отличаются между слоями9 и он предоставляет метод для определения толщины или полное отсутствие конкретного слоя (например, потеря клеток сетчатки ганглия является одной из отличительных особенностей сетчатки ишемии10, 11). Сосудистую очевиден, как поперечный прорезает сетчатки, что делает его возможным отдельно изучить капиллярного сплетения в соответствующих слоях сетчатки12,13.
Традиционно в целом сетчатки-монтирует проводятся исследования сетчатки сосудистую сеть. С подготовкой этой ткани Сетчатка вырезать и уплощенная как цветок shaped структуры. Метод представляет собой метод подготовки сравнительно быстро ткани, который можно выделить общую архитектуру сетчатки сосудистую и поэтому он часто применяется в расследовании неоваскуляризация в мышиных сетчатки. Успешной визуализации microvasculature в целом монтируется сетчатки также сообщается в развивающихся неонатальной мыши и крысы сетчатки14,,1516,17,18, 19. Эти исследования выявили более определенным pericytic активности с больших капиллярно свободно OBLASTей в взрослого, по сравнению с новорожденным сетчатки14.
Еще один способ визуализации является microvasculature сетчатки после гипотонический изоляции. Этот метод подготовки ткани приводит к сетчатки кровеносных сосудов и капилляров, освобождается нейрональных клеток. Этот тип двумерных изображений изолированной сетчатки сосудистой сети обычно выполняется после переваривания трипсином сетчатки20 и использованы для оценки сосудистые аномалии диабетической ретинопатии, включая потерю перицит и капиллярные 20,дегенерация21,22. Гипотонический изоляции метод предлагает расследования сетчатки сосудистого генов и белков регулирования ответы, как они было сделано с RT-PCR и западных blotting23,24,25. Здесь мы предоставляем протокол для свободно плавать иммуногистохимическое окрашивание гипотонический изолированных сетчатки сосудистую как альтернатива Пищеварение трипсина для изучения микрососудистой pericytes.
Мы представляем три сетчатки подготовка техники, которые могут быть применены в исследовании микрососудистой pericytes сетчатки. Ниже мы предлагаем сравнение между каждым из методов и выделить важные шаги в протоколах.
С крио секционирование, сетчатки режется в сагиттально…
The authors have nothing to disclose.
Исследование финансировалось Lundbeck фонд, Дания.
Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |