Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

doi: 10.3791/57733 Published: October 7, 2018

Summary

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Abstract

Retina perisitlerden, göz birçok hastalıkları için önemli bir rol oynamaktadır. İmmunohistokimyasal teknikler retina damarları ve mikrovasküler boyama perisitlerden Oftamolojik araştırma merkezi. Mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi uygun bir yöntem seçmek çok önemlidir. Cryo-bölümlerde, Bütün bağlar ve antikorlar trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) için kullanma hipotonik izole damarlara boyama Retina mikrovasküler pericyte immunohistokimyasal açıklar. Bu avantajları ve her Retina mikrovasküler perisitlerden görselleştirme üç doku hazırlıkları eksikliklerin vurgulamak için bize izin verir. Cryo-bölümler tüm Retina katmanları transsectional görselleştirme sağlar ancak yalnızca bir kaç ara sıra enine keser microvasculature içerir. Bütün Dağı tüm Retina damarlara genel bir bakış sağlar, ancak microvasculature görselleştirme zahmetli olabilir. Hipotonik yalıtım nöronal hücre kaldırma tarafından tüm Retina damarlara görselleştirmek için bir yöntem sağlar, ancak bu doku çok kırılgan yapar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu hücreler damarlara bütünlük içinde önemli bir rol oynamak gibi Retina perisitlerden birçok araştırma laboratuvarları odaklanmıştır. Diyabetik retinopati1, iskemi2ve glokom3 gibi patolojik durumların perisitlerden fonksiyonu içeren vasküler özellikleri vardır. Perisitlerden iç retinal kapiller plexuses bulunur. Kapiller plexuses iki kat iç retina malzemeleri santral retinal arter dalları. İç vasküler yatağın ganglion hücre ve iç nükleer katmanları arasında yer almaktadır. Daha derin tabaka daha yoğun ve karmaşık ve iç ve dış nükleer katmanlar4,5arasında yerelleştirilmiştir. Buna ek olarak, retinanın bazı bölümlerinin de radyal parapapillary kılcal olarak adlandırdığı bir üçüncü ağ içerir. Bunlar uzun, düz kılcal damarlar, sinir lifleri arasında ve nadiren başka bir veya diğer iki plexuses6ile anastomose. Kapiller duvarı içinde perisitlerden membran içinde gömülü ve vasküler endotel hücrelerinin abluminal yan hat.

Bu tarihe kadar bunları diğer vasküler hücrelerden ayırt bu perisitlerden hiçbir benzersiz biyolojik işaret vardır. Trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) yaygın olarak kullanılan işaretleri olan perisitlerden ama aynı zamanda diğer damar hücreleri üzerinde mevcut vardır. Perisitlerden tanımlaması daha fazla Morfoloji ve protein ifade7' farklılık pericyte alt kümeleri varlığını tarafından karmaşıktır. Şu anda, en iyi kimlik protein işaretleri bir arada ve damar duvarındaki pericyte karakteristik konumlandırma yararlanır. Biz burada sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, yani, cryo-bölümler, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım PDGFRβ/NG2 immunohistokimyasal boyama için üç farklı doku hazırlama teknikleri göstermek.

Cryo-bölümleri ile retina ve sklera ile optik sinir kesilir. Bu nöronların tüm katmanlı yapılar görselleştirme için sağlar. Retina farklı on kat hematoksilen eozin veya floresan nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8gibi lekeleri ile görüntülenmiştir nükleer ve aksonal/dendritik yapıları değişiminin olarak görünür. Katmanlar9 ve bu metabolik gereksinimleri farklıdır belirli bir katmanı kalınlığı veya toplam yokluğunda belirlemek için bir yöntem sağlar (Örneğin, Retina ganglion hücrelerinin kaybı biridir retinal iskemi10, işaretlerinden 11). Ayrı ayrı çalışma içinde anılan sıraya göre Retina katmanları12,13kapiller plexuses edinerek retina ile enine keser gibi damarlara belirgindir.

Daha geleneksel olarak, Retina damarlara ağ araştırmalar Retina bütün-dağ içinde gerçekleştirilir. Bu doku hazırlık ile retina kesme ve bir çiçek şeklindeki yapı olarak basık. Genel mimari Retina damarlara vurgulayabilirsiniz nispeten hızlı doku Hazırlama tekniği yöntemidir ve bu nedenle kez fare retina neovaskülarizasyon soruşturma uygulanır. Bütün Monte Retina microvasculature başarılı görselleştirme aynı zamanda gelişmekte olan yenidoğan fare ve sıçan retina14,15,16,17,18, bildirilmektedir 19. bu çalışmalar geniş kılcal içermeyen alanlar yenidoğan retina14' e göre yetişkin bir daha tanımlı pericytic aktivitesiyle ortaya koyuyor.

Görselleştirmenin başka bir retina microvasculature sonra hipotonik yalıtım yoludur. Bu doku hazırlama teknik retinal kan damarları ve kılcal nöronal hücrelerin serbest bırakılması ile sonuçlanır. İki boyutlu görüntüleme izole retinal damar ağının bu tür genellikle Retina tripsin sindirim20 sonra gerçekleştirilen ve diyabetik retinopati dahil pericyte kaybı ve kılcal damar anormallikleri değerlendirmek için kullanılan dejenerasyon20,21,22. Onlar yapılmıştır gibi RT-PCR ve western Blot23,24,25ile hipotonik yalıtım yöntemini retinal vasküler gen ve protein düzenleyici yanıt araştırmalar sunuyor. Burada ücretsiz-float immunohistokimyasal hipotonik izole Retina damarlara tripsin sindirim mikrovasküler perisitlerden incelemek için bir alternatif olarak boyama için bir protokol sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve yetişkin erkek albino sıçanlar üzerinde gösterdi. Tüm deneysel yordamlar, hayvan hayvanlar kullanım Ophthalmic ve vizyon araştırma için ARVO deyimi düzenlemeye göre tedavi edildi. Hayvanlar karbon dioksit ve sonraki servikal çıkığı tarafından euthanized.

1. fare Retina doku hazırlıkları

  1. Cryo-bölüm
    1. Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı, sıçan göz kapağı bir neşter ile yapmak.
      1. İsteğe bağlı: bir Diyatermi yazıcı kullanarak, göz iç açıyla katıştırma sırasında göz düzgün bir şekilde yönlendirmek ve optik sinir dikey cryostat kesit için izin vermek için işaretleyin.
    2. Forseps ile göz kapmak ve dikkatle çevreleyen doku ortaya çıkarmak için tarafına tilt. Göz bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesim yaparak enucleate.
      Dikkat: optik sinir üzerinde aşırı baskı Retina dekolmanı neden olabilir gibi göz çok zor çekmeyin.
    3. Göz kısaca fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bir bisturi ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus ilk bir deliğe yapmadan önce stabilize etmek için % 4 formaldehit sok.
    4. Mikroskop altında kornea limbus kornea kaldırın ve objektif forseps ile 2-4 h için PBS içinde % 4 formaldehit batış önce kaldırmak diseksiyon makası ile kesin.
    5. Sırayla Sörensen'ın fosfat tampon % 10 sukroz ve % 25 sükroz ile yıkayın.
    6. Yazulla orta % 3 jelatin domuz deri ve %30 albümin tavuk yumurta beyaz üzerinden hazırlanan katıştırın.
      Not: Protokol burada ile doku depolama-20 ° C'de duraklatılmış
  2. Bütün Dağı
    1. Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı bir neşter ile sıçan göz kapağı yapmak.
    2. Forseps ile göz kapmak ve dikkatle çevreleyen doku ortaya çıkarmak için tarafına tilt. Göz bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesim yaparak enucleate.
      Dikkat: optik sinir üzerinde aşırı baskı Retina dekolmanı neden olabilir gibi göz çok zor çekmeyin.
    3. Göz kısaca bir bisturi ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus ilk bir deliğe yapmadan önce stabilize etmek için PBS %4 formaldehit koymak.
    4. Mikroskop altında kornea limbus kornea kaldırın ve objektif forseps ile kaldırmak diseksiyon makası ile kesin.
    5. Retina retina pigment epiteli optik siniri doğru gelen büyük yırtılma önlemek için küçük açılış hareketleri kullanarak forseps ile ayırın.
    6. Optik sinir, retina diseksiyon makası ile ücretsiz ve optik sinir başı doğru Retina çevre üzerinden dört yırtmaçlı bir kaç milimetre uzunluğunda olun.
    7. Retina bir cam slayt üzerine yayılmış ve 5-10dk için kurutma sağlar.
    8. %4 formaldehit 20-30 dk içinde formaldehit retina üzerine damlama tarafından tamir.
      Dikkat: camı ayırarak gibi retina üzerinde doğrudan geçerli değildir.
    9. Durulama PBS ile. En iyi sonuçlar için doğrudan sonra durulama IMMUNO-leke.
  3. Hipotonik yalıtım
    1. Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı bir neşter ile sıçan göz kapağı yapmak.
    2. Forseps ile göz kapmak ve dikkatle çevreleyen doku ortaya çıkarmak için tarafına tilt. Göz bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesim yaparak enucleate.
      Dikkat: optik sinir üzerinde aşırı baskı Retina dekolmanı neden olabilir gibi göz çok zor çekmeyin.
    3. Bir bistüri ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus, ilk bir delik açın.
    4. Mikroskop altında kornea limbus kornea kaldırın ve objektif forseps ile kaldırmak diseksiyon makası ile kesin.
    5. Retina retina pigment epiteli optik sinir kafa doğru gelen büyük yırtılma önlemek için küçük açılış hareketleri kullanarak forseps ile ayırın.
    6. Optik sinir, retina diseksiyon makası ile ücretsiz, retina 1 mL deiyonize su bir 24-şey plaka yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 h için 1.5 mm titreşim yörünge ile 200 devirde sallamak.
      Not: Bundan sonra daha az kenarlarında tanımlanan retina görünür.
    7. Retina Pres'teki lysed hücre enkazı ayırmak ve oda sıcaklığında başka bir 30 dk için sallamak için 200 U DNaz 1 ekleyin.
      Not: Enkaz forma Wells başlayabilir.
    8. En az 3 kez nöronal hücre artıkları kaldırmak için 150 – 300 devir / dakikada sallayarak ile 5 min için deiyonize suyla durulayın. Retina ile her durulama nöronal hücresel enkaz kaldırma gösterge daha şeffaf hale gelmelidir.
      1. Karanlık bir arka plan şeffaf izole Retina damarlara açıkça görmek için 24-şey plaka aramak için kullanın.
      2. (İsteğe bağlı): damarlara bu noktada daha fazla durulama adımları ekleyebilirsiniz nöronal katmanları (yarı saydam) ücretsiz görünmüyorsa, sallama hızını artırmak veya bir damlalıklı damarlara üzerine sıvı Aspire için kullanın.
        Dikkat: İsteğe bağlı adımlardan birini damarlara zarar verebilir.
    9. 10 dk içinde PBS oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ve durulama 3 kez PBS 1 mL fix.
      Not: Protokol burada ile doku depolama 4 ° C'de duraklatılmış

2. immünhistokimya

  1. Cryo-bölümlerini boyama
    1. 10 µm cryo-bölümlerini dikey optik sinir kesit olarak jelatin gömülü retina keser ve cryo-bölümleri bir cam slayt ve izin kuru (en az 1 h) yerleştirir.
    2. PBS içinde cam kaymak ile % 0.25 daldırın Triton X-100 (PBS-T) 15 dakika.
    3. 1: 100 PDGFRβ ve 1:500 NG2 birincil antikorlar seyreltilmiş PBS-T + %1 BSA cryo-bölüme damla ve kuluçka odalarında 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
    4. Cam slayt 2 kez PBS-T 15 dakika içinde daldırın ve PBS-t % 3 BSA cryo-bölümler üzerine ile seyreltilmiş 1: 100 anti-fare Alexa Fluor 594 bağlantılı ve 1: 100 anti-tavşan FITC bağlı ikincil antikorları damla.
    5. Cam slayt karanlık oda sıcaklığında 1 h kuluçkaya.
    6. Cam slayt PBS-T 2 x 15 dakika yıkayın.
      Not: İsteğe bağlı: çift ve üç kişilik immünfloresan boyama için sıralı boyama 2.1.3 yordamına 2.1.6 iki ya da üç kez, sırasıyla yineleyerek gerçekleştirilebilir.
    7. Lekeli cryo-bölümleri montaj orta içeren DAPI ve bir coverslip Anti-solma ile bağlayın.
  2. Bütün-mount boyama
    1. PBS-T bütün Dağı damla ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. Ve 1: 100 PDGFRβ ve 1:500 NG2 birincil antikorlar seyreltilmiş PBS-T + %1 BSA damla ve gecede 4 ° C'de nemli odalarında kuluçkaya kapalı dökün.
    3. Kapalı dökün ve cam slayt 2 x 15 dk içinde durulama için PBS-t damla.
    4. PBS-t 1s içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında nemli bir odasında kuluçkaya için % 3 BSA ile seyreltilmiş 1: 100 anti-tavşan Cy2 ve 1: 100 anti-fare Cy3 bağlı ikincil antikor üzerinde damla ve kapalı dökün.
    5. 2 x 15 dk içinde belgili tanımlık karanlık durulama için PBS-t damla ve kapalı dökün.
      Not: İsteğe bağlı: çift ve üç kişilik immünfloresan boyama için sıralı boyama 2.2.2 yordamdan 2.2.5 için iki ya da üç kez, sırasıyla yineleyerek gerçekleştirilebilir.
    6. Lekeli bütün montaj montaj orta içeren DAPI ve bir coverslip Anti-solma ile bağlayın.
  3. Hipotonik izole damarlara boyama
    1. Hipotonik izole damarlara 100 rpm ve oda sıcaklığında 500 µL/iyi % 10 eşek serum PBS içinde seyreltilmiş sallayarak ile 1 h blok.
    2. Gecede oda sıcaklığında kuluçkaya ve 600 µL/kuyu 1: 100 PDGFRβ ve 1:500 NG2 birincil antikorlar PBS % 10 eşek serumda seyreltilmiş ile 100 RPM sallamak.
    3. Retina PBS 3 x 5 min için ağ ve 100 rpm ve oda sıcaklığında karanlık 1 h için PBS sallayarak içinde % 10 eşek serumda seyreltilmiş 1: 100 anti-fare Alexa Fluor 594 bağlantılı ve 1: 100 anti-tavşan FITC bağlı ikincil antikorları kuluçkaya durulama.
    4. PBS-T 5 min için durulama ve 0.2 ng/ml DAPI PBS-t PBS-t 3 x 5 dk durular karanlıkta ardından 15dk için kuluçkaya.
    5. Bir plastik Pasteur damlalıklı ucu kesilmiş, PBS-T ile nemlendirin ve Retina ağ 4-şey cam odası slayda aktarmak için kullanabilirsiniz.
      Not: Nemlendirme adım Retina damarlara Pasteur damlalıklı içeriye doğru yapışmasını önlemek önemlidir.
    6. Retina damarlara açılmak. Bu arapsaçı damarlara neden olabilir gibi Retina damarlara pens ile dokunmaktan kaçının.
      Not: Unfolding odası slayt ileri geri eğerek yapılabilir veya sıvı Retina damarlara üzerine alıyorum keser.
    7. Orta kuyulardan kaldırın. Yüzey gerilimi sıvı slayt alt üzerine damarlara dümdüz.
    8. Plastik kaldırma kuyuları odası slayttan önce mikroskop altında doğru elinde tutmasına emin olun.
    9. Anti-solma montaj orta ve bir coverslip ile lekeli damarlara bağlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Başarılı iletişim kuralları mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi için üç farklı Retina hazırlıklar sağlar. Bu yöntemlerin her biri PDGFRβ ve NG2 immunoreactivity Co yerelleştirme ve kapiller endotel foridentification sarın perisitlerden benzersiz konumunu kullanır.

Cryo-kesitler, nöronal katmanları DAPI etiketli çekirdeği ve iç floresan yoğunluğu tarafından belirlenebilir ve derin kapiller plexuses PDGFRβ ve NG2 immunoreactivity (Şekil 1) görüntülemek perisitlerden içerir. Perisitlerden eşsiz konumu damar duvarındaki dairesel veya at nalı şeklinde immunoreactivity (Şekil 1, oklar) gemilerin çevre olarak görülebilir veya ara sıra boyuna kesme gemiler (Şekil 1, ok ucu).

Bütün Dağı hazırlık yetişkin sıçan mikrovasküler perisitlerden başarılı görselleştirme14,20zor olabilir. Bütün Monte yetişkin retina PDGFRβ immunoreactivity sadece çok zayıf sinyal (gösterilmez) içinde sonuçlandı. NG2 boyama yoğun abluminal perisitlerden (Şekil 2) boyama ile iç vasküler ağ sıraladı.

Yetişkin fare retinanın vasküler ağ özetini elde etmek için immünhistokimya hipotonik izole sıçan retinal damar ağının tüm montaj için alternatif bir yöntem sağlar. Bu doku Hazırlama tekniği başarıyla gerçekleştirildiğinde, iç ve derin kapiller plexuses de dahil olmak üzere tüm Retina microvasculature genel bir bakış sağlar. Pericytic işaretleri ile boyama immunohistokimyasal NG2 immunoreactivity yoğun bir tepki ile belirli damar hücrelerinde (Şekil 3) gösterilen tüm mikrovasküler ağ sonuçlanır. Bu hücrelerinin bir kısmını da PDGFRβ immunoreactivity (Şekil 3) görüntüler.

Bir dikkatli doku unfolding Retina damarlara iyi bir bakış elde etmek önemlidir. Yetersiz unfolding zor (Şekil 4) görüntüleme floresan yapan birden çok odak katmanlarda düzenlenmesini damarlara içinde sonuçlanabilir. Unfolding nazik sallayarak, odası slayt ileri geri devirme veya Retina damarlara üzerine sıvı damla alıyorum tarafından kolaylaştırılabilir. Bu retinal kapiller plexuses anatomisi vasküler yatak ilişkin bazı bindirme yol açacak olması gerekmektedir. Bu nedenle, iç cam slayt basık zaman daha derin kapiller plexuses ayırmak için problemlidir.

Figure 1
Şekil 1: immunohistokimyasal cryo-bölümünü iç sıçan retina pericyte boyama çift. (A)NG2 (yeşil) immünhistokimya olumlu damarlarının retina iç kısmı içinde ortaya koymaktadır. Oklar, dairesel ve at nalı şeklinde immunoreactivity damarları gösterir. Ok ucu boyuna kesilmiş bir gemi işaret eder. (B) PDGFRβ (kırmızı) immünhistokimya reaktivite NG2 immunoreactivity benzer göster. Oklar ve ok ucu NG2 boyama gelince aynı yapıları üzerine getirin. (C) görüntü üç farklı filtreler superimposing tarafından bir birleştirme NG2, PDGFRβ ve DAPI (mavi) gösterir. İki antikorlar Co yerelleştirilmiş ortaya çıkar (yeşil + kırmızı sarı =). NF: sinir lifi tabakası, un: ganglion hücre katmanı, IPL: iç pleksiform tabaka, INL: iç nükleer tabaka, OPL: Dış pleksiform tabaka, dit: dış nükleer tabaka. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: immunohistokimyasal pericyte bütün monte sıçan retina boyama. NG2 (kırmızı) immunoreactivity yüzeysel damar networkwith abluminal perisitlerden boyama yoğun boyunca görülür. Görüntüler birleştirilmiş NG2 ve DAPI (mavi) göstermektedir. Nöronal hücre DAPI-mavi çekirdeği arasında NG2 lekeli microvasculature olarak görülebilir. Bütün Monte yetişkin retina PDGFRβ immunoreactivity sadece çok zayıf bir sinyal sonuçlandı ve bu nedenle bu şekilde dahil değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: immunohistokimyasal hipotonik izole sıçan retina damarlara pericyte boyama çift. (A). görüntü hipotonik izole sıçan retinal vasküler ağ immunohistokimyasal lekeli NG2 (yeşil) ve PDGFRβ (kırmızı) gösterir. Tam ağ NG2 immunoreactivity gösterdi. Ancak, PDGFRβ immunoreactivity hücre somas içinde bulundu. INSERT a Retina damarlara ağ DAPI ile (mavi) lekeli bir bakış niteliğindedir. (B) görüntü farklı konum ve daha yüksek büyütme (A) olarak numune aynı gösterir. PDGFRβ boyama sadece cep somas pericyte immunoreactivity gösteren damar ağındaki görüntülendiğinden emin açıktır. B Ekle damarlara yüksek büyütme oranlarını gösteren görüntüyü NG2 (yeşil), PDGFRβ (kırmızı) lekeli ve DAPI ile birleştirilmiş olur. NG2 ve PDGFRβ ile birlikte DAPI boyama da dahil olmak üzere üç perisitlerden (PDGFRβ-pozitif) ve iki tanımlanamayan gemi Duvar hücre ortaya koymaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: örnek bir yetersiz gelişeceğini hipotonik izole Retina damarlara. Yetersiz unfolding yığılmış damarlara neden olabileceğinden dikkatli hipotonik izole damarlara unfolding önemlidir. Resimleri farklı odak katmanlar halinde alınan ama aynı sitede Retina damarlara DAPI lekeli göster. (A)DAPI lekeli hücrelerde bir odak katmanı göster bir yaklaşık 25 µm kalınlığında kan damarı Retina damarlara. (B) DAPI lekeli hücrelerde ikinci bir odak katman (A) görüntülenen büyük damar üzerinde üst üste aynı sitesinde ince dallanma kılcal aydınlatmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz mikrovasküler Retina perisitlerden çalışmada uygulanan üç Retina hazırlama teknikleri mevcut. Aşağıda, yöntemlerinden her birinin arasında bir karşılaştırma sağlamak ve protokolleri kritik adımlar vurgulayın.

Cryo kesit ile retina sagittal bölümlerde kesilir ve bu nedenle, çok sayıda numune aynı retina elde etmek mümkün. Bu yöntemin sonucu sayısal bölümlerde antikor özgüllük ve gereksiz hayvan kurban engeller olarak titrasyon testi için ideal bir seçim yapmak. Hazırlık çalışmaları için iyi sonuç belirleyici olur. Göz göz çekmek değil ama gözün çevresinde tüm kasları kesmek için anatomi süre çok önemlidir. Kuvvet kullanılırsa, Retina dekolmanı riski vardır. Göz Kupası ince olduğu için bir çok uzun-meli saptamak değil. 2-4 h için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile daldırma doku ortadan kaldırır. Eğer artık bu sabit, antijen ilgi yok etme riski vardır. En iyi mümkün immunostainings oluşturmak için cama mümkün olduğunca düz olmak her bölüm için çok önemlidir. Bölümleri yalnızca birkaç ara sıra enine keser microvasculature içerdiğinden, bu doku hazırlıklar teknik microvasculature sadece aralıklı görselleştirme sunar. Bu nedenle, bu yöntem genel olarak damar mimarisi ve ölçülebilir perisitlerden tedbirlerinin çalışmaları için uygun değildir.

Genel damarlara bütün damarlara genel bir bakış sağlamak için montaj sonra lekeli. Bu teknik mastering nispeten küçük iş yükünü gerektiren hızlı doku hazırlık yordamı olabilir. Ancak, özellikle dikkat edilmesi gereken birkaç nokta vardır. Retina kırılgandır ve onları özenle idare ve yüksek düzeyli ve kesintileri önlemek için her şeyden önemlidir. Ayrıca, dikkatle retina işleme, süre kıvrımlar önlemek için anahtar öneme sahiptir ve bu montaj sırasında diğer crevasses daha sonra immunohistokimyasal Imaging etkileyebilir. 250-300 µm kalınlığında bağlı retina vardır ve antikor penetrasyon nöronal katmanların sorunlu olabilir. Pericyte görselleştirme açısından NG2 bütün Dağı protokolünde boyama sadece bir Cy3 bağlı ikincil antikor ile elde edilebilir ve bütün monte yetişkin retina PDGFRβ immunoreactivity neden böyle bir çok zayıf olarak gösterilmeyen sinyal rakam. Bu nedenle, Bütün Dağı boyama tekniği kullanışlılığı şiddetle başarılı boyama kullanılan esas olarak belirli birincil ve ikincil antikorlar üzerinde bağlı olarak tarafından engel oluyor. İletişim kuralı bir yetişkin fare retinanın görüntülenmeyecektir mikrovasküler plexuses için en iyi duruma getirmek için daha fazla öneriler zaman ve/veya inkübasyon sıcaklığı26değişen uzun bir süre için birincil antikor tarafından kuluçka olduğunu.

Bütün Monte kalınlığı nedeniyle, yanlışlıkla montaj kılcal içeren iç retina ile önlemek için optik sinir başı doğru Retina çevre üzerinden dört insizyon yaptıktan sonra retina yönünü farkında olmak önemlidir aşağı bakan. Yine de, daha derin mikrovasküler plexuses ve perisitlerden detaylı görselleştirme ile bu yöntem14,20zahmetli olabilir. Bütün Dağı yetişkin retina boyama derin kapiller pleksus zor olduğu için bu bazı yerlerinde avasküler görünen retina neden olabilir. İmmunohistokimyasal bütün monte yetişkin retina boyama Pres'teki perisitlerden yüzeysel kılcal pleksus ve bu nedenle, bu yöntem damarlarının astar ile parçalanmış bir bakış için yanlış negatif sonuçlar neden olabilir sağlar sıçan retina damarlara görselleştirme.

Tripsin sindirimi uzun altın standart Teknik yalıtım ve Retina damarlara20görselleştirme için kabul edilmiştir. Hipotonik yalıtım karmaşık üç boyutlu damar ağı'nın tamamında görselleştirme için alternatif bir yöntem sağlar ve birçok aynı başa zordur çok kırılgan doku ile çalışma sorunları yüzler. İki yöntem arasındaki retinal vasküler ürün benzerliği nedeniyle hipotonik yalıtım kaçınarak büyük gözyaşları ve dikkatli işleme önlemek için aynı sorunlar olarak tripsin sindirim20 dikkatli diseksiyon dahil olmak üzere birçok yüzler Pipetting ve forseps ile dokunaklı. Fiksasyonun yöntemleri arasında önemli bir fark var. Tripsin sindirim genelde sonra fiksasyon ve birkaç yıl20için sabitleştirici olmuştur korunmuş retina üzerinde başarılı bir şekilde uygulanabilir. Hipotonik yalıtım fiksasyon önce gerçekleştirilir ve böylece daha önce edebiyat23,24,25açıklandığı gibi çeşitli deneyleri içinde uygulanmasını sağlar. Hipotonik yalıtım saat içinde tamamlanabilir, ancak tripsin sindirim iki gün20gerçekleştirilir. Ayrıca, Hipotonik yalıtım Protokolü aşırı sindirim riski içermez ve membran işaretlerinin enzimatik bölünme pericyte tanıma için Örneğin PDGFRβ ve NG2 için tercih edilen bu yöntem sonraki yapmak, gerekli immunohistokimyasal mikrovasküler boyama.

Son olarak, hemen kapsamı dışında bu alt alta yazılmalıdır rağmen orada kalıyor büyük, bozulmamış mikrovasküler Pleksi kemirgen retina27dışında gelen izole daha az yaygın olarak bilinen ama çok yararlı tekniği. Retina özel cam odası ve coverslip yer alıyor. Coverslip, tamamen canlı oluşturmak için coverslip bağlı microvasculature kalıntıları kaldırılması üzerine (≈ % 98 hücre) doku yazdırma. Bu yöntemin en büyük avantajı bu gemiler ve immunostaining için sonraki fiksasyon fizyolojik çalışma için sağlanmıştır. Bir açık yöntem mikrovasküler ağın retina düz Dağı olarak görselleştirme/izolasyonu sağlamaz ve hipotonik hazırlıkları yapmak kısıtlamasıdır. Yine de, perisitlerden bu yöntemi27uygulama tarafından görüntülenmiştir.

Burada açıklanan üç doku hazırlama teknikleri her yöntemin avantajları ve eksiklikleri mikrovasküler perisitlerden görselleştirme için oluşur anlamda tamamlayıcı niteliktedir. Her yöntem potansiyelleri ve zayıf değerlendirilmesi mikrovasküler perisitlerden patolojik belirli koşullar altında soruşturma için en uygun yöntemi seçmek önemlidir. Kanıtlanmış yöntemleri genel olarak sadece pericyte işaretçileri için aynı zamanda mikrovasküler yapıları görselleştirme için boyama için genişletilebilir. Sonunda, söz konusu araştırma hipotezi göre uygun görselleştirme yöntemi seçmek bireysel araştırmacı içindir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Araştırma Lundbeck Vakfı, Danimarka tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geletin from porcine skin Sigma-Aldrich G2625-500G
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich A5253-500G
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D5025-15KU Dissolved in 0.15 M NaCl
Bovine serum albumin (BSA) VWR 0332-100G
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121, lot 129348
Rabbit anti-PDGFRβ Santa Cruz sc-432 1:100
Mouse anti-NG2 Abcam ab50009 1:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-585-152 1:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-151 1:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-225-152 1:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-165-150 1:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542-1MG Dissolved in DMSO
Anti-fading mounting medium Vector Laboratories H-1000
Anti-fading mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide Thermo Fisher Scientific 154526

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. (2017).
  2. Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. (2016).
  3. Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
  4. Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. Lagali, N. InTech. (2013).
  5. Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
  6. Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
  7. Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte? Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
  8. Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
  9. Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
  10. Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
  11. Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
  12. Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
  13. Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
  14. Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
  15. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. e50546 (2013).
  16. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
  17. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
  18. Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
  19. Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
  20. Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. e50489 (2013).
  21. Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
  22. Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
  23. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  24. Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
  25. Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
  26. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
  27. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes. J. Vis. Exp. (140), e57733, doi:10.3791/57733 (2018).More

Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes. J. Vis. Exp. (140), e57733, doi:10.3791/57733 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter