Summary
Нашей целью было разработать практический протокол для оценки митохондриальной дисфункции, связанные с усталостью в раковых больных. Этот инновационный протокол оптимизирован для клинического использования с участием только стандартные кровопускания и основных лабораторных процедур.
Abstract
Усталость является общей и изнурительных условие, которое затрагивает большинство больных раком. На сегодняшний день, усталость остается плохо характеризуется не диагностический тест объективно измерить тяжесть этого состояния. Здесь мы описываем оптимизированный метод для оценки митохондриальной функции получения, собранных из усталость раковых больных. Используя компактный внеклеточного потока системы и впрыска респираторные ингибиторы, мы изучили КСДОР митохондриальной функциональное состояние, измеряя базальную митохондриальное дыхание, запасные дыхательных емкости и фенотип энергии, который описывает предпочтительной энергии путь реагировать на стресс. Свежий получения легко доступны в клинических условиях, с использованием стандартных кровопускания. Весь assay, указанных в настоящем Протоколе может быть завершена в менее чем 4 часа без участия сложных биохимических методов. Кроме того мы описываем метод нормализации, который необходим для получения воспроизводимых данных. Простые процедуры и нормализации представленные методы позволяют повторных проб от того же пациента и поколения воспроизводимость данных, которые могут быть сопоставлены между моментами времени оценить потенциальные эффекты лечения.
Introduction
Усталость является распространенным и мучительное условие, что оказывает негативное воздействие на качество жизни больных раком1. К этой дате усталость рак остается плохо определены и полагается только на субъективных отчетности больных2. Таким образом существует настоятельная необходимость определить легко адаптируемые диагностических лабораторных испытаний объективно характеризовать усталость в клинических условиях3,4.
Были предложены несколько основных механизмов, включая дисфункцию митохондрии, вызвать усталость5. Митохондрии являются органеллы электростанция, обеспечивая 95% потребностей клеточной энергии через окислительное фосфорилирование и играть важную роль в сигнализации кальция, апоптоз, иммунные сигнализации и регулирование других внутриклеточных сигнальных события6 . Соответственно нарушение митохондриальной биоэнергетики и дефекты в производстве энергии может способствовать усталости. Поддерживая эту гипотезу, предыдущих исследований наблюдали мутации в митохондриальной ДНК у больных с синдромом хронической усталости7. Хотя она остается неясным ли патофизиологические происхождения усталости лежит в пределах центральной нервной системы или периферических тканях, например, скелетных мышц8,9, в настоящее время нет прямой метод, чтобы точно оценить митохондриальной дисфункции, относящиеся к усталости в живой, дышащими клетками.
С помощью мононуклеаров периферической крови (получения) для изучения функции митохондрий предлагает несколько преимуществ. Во-первых получения легко доступны в клинических условиях, с использованием стандартных кровопускания и могут быть изолированы, быстро, используя основные лабораторные методы. Во-вторых сбор крови менее инвазивна, чем сбор других тканей, таких как биопсия мышц. Таким образом могут быть собраны образцы крови из той же пациентки неоднократно с течением времени, что облегчает Продольная Оценка эффектов лечения. Интересно, что функции митохондрий в репликацию, как представляется, быть хорошо коррелирует с митохондриальных статус почек в животной модели10. Кроме того иммунных клеток митохондрий используются в качестве прокси-сервера для обнаружения системных изменений при различных заболевания условия11,12. Митохондрий в циркулирующие иммунные клетки особенно чувствительны к изменениям в иммунной функции и иммунных сигнальных молекул, таких как цитокинов13,14,15. Например было отмечено, что получения от пациентов с острой ревматической воспалительных заболеваний exhibit потребление кислорода высокой базовой14. Напротив потребление кислорода был сокращен в репликацию, изолированы от пациентов с системных воспалительных процессах, включая сепсис16. При воспалительных процессах свободные радикалы, производимые неблагополучных митохондрий может способствовать дальнейшему повышенный Оксидативный стресс и длительное воспаление17. Центральная роль митохондрий в производстве энергии, а также окислительного стресса предполагает потенциальную полезность использования функции митохондрий как прокси для изучения усталость в раковых больных 13.
Предыдущие исследования, изучение митохондриальной функции используются биохимические методы, измерение потенциала митохондриальной мембраны или изоляции определенных клеточных популяций, которые не могут быть легко адаптированы в клинических условиях5, 14,18. В последние годы развитие внеклеточного потока анализов позволило исследователям легко и точно проанализировать изменения в скорости потребления кислорода (OCR) в ответ на автоматизированных инъекции респираторные ингибиторы19,20 , 21 , 22. Однако большинство из этих исследований предназначены для типов конкретных клеток и большой формат высокой пропускной способности не могут быть применимы в клинических условиях. В этой рукописи мы описываем оптимизированный протокол для изучения митохондриальной функции для клинического использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Текущие исследования (NCT00852111) был утвержден институционального обзора Совет (IRB) национальных институтов здравоохранения (НИЗ), Бетесда, штат Мэриленд. Участники, поступил в этом исследовании были euthymic мужчины, 18 лет или старше, которые были диагностированы с не метастатического рака предстательной железы с или без предварительного простатэктомия и были планируется получить внешний пучка излучения терапии (ДГТ). Потенциальные участники были исключены, если они имели прогрессирующее заболевание, которое может привести к значительным усталость, имели психиатрические заболевания в течение последних пяти лет, нескорректированной гипотиреоз или анемии, или имели второй злокачественности. Люди, которые использовали седативные, стероиды или нестероидные противовоспалительные агенты были также исключены. Образцы крови здорового управления были получены в низ Департамента трансфузионной медицины от здоровых доноров под IRB-утвержден протоколом (NCT00001846). Все участники набираются Магнусон Клинический исследовательский центр на низ. До участия в исследовании были получены подписанного письменного информированного согласия.
1. митохондриальной функции измерения подготовка (1 день эксперимента)
- Гидрат датчик картриджа (см. Таблицу материалов; приблизительная продолжительность: 5 мин).
- Выньте картридж датчик из пакета. Добавить 200 мкл Calibrant решение в каждой скважине утилита пластины, а затем заполнить каждый ров с 400 мкл Calibrant решения.
- Обратный датчик пластины к пластине утилиты, которая теперь имеет Calibrant решение в нем. Гидрат картридж в инкубаторе 37 ° C-CO2 на ночь.
Примечание: Датчик картриджа необходимо быть увлажненной минимум 4 часа и более 72 ч.
2. Клинический пробоподготовки (день 2 эксперимента)
- Мера усталости с помощью 13-пункт функциональной оценки хронической болезни терапии - усталость (FACIT-F)2,,2324 базовой линии (до начала ДГТ), медианы и завершение ДГТ и 1-год пост ДГТ.
- Используйте 0 - 4 шкала для каждого элемента ответа, где 0 представляет «не на всех», и 4 указывает, что ответчик относится соответствующее заявление «очень много.» Всего баллов должны варьироваться от 16-53, с более низкие баллы, отражающие высокая усталостная интенсивности.
- Определите усталость как FACIT-F Оценка ниже, чем 43, со счетом FACIT-F ≥43, указывающие на отсутствие или не установлено клинически значимого усталость2.
Примечание: FACIT-F балл 43 Лучший делит усталость десятки больных раком и общего населения2. - Включить следующие пункты 13 в шкале усталость FACIT: 1) я чувствую усталость; 2) я чувствую себя слабым повсюду; 3) я чувствую себя вялым («вымываются»); 4) я чувствую усталость; 5) я имею проблемы с запуском вещи, потому что я устал; 6) я имею проблемы с отделкой вещи, потому что я устал; 7) я имею энергии; 8) я могу сделать мой обычной деятельности; 9) мне нужно спать в течение дня; 10) я слишком устал, чтобы поесть; 11) мне нужна помощь, делая моей обычной деятельности; 12) я разочарование, будучи слишком устал, чтобы делать вещи, которые я хочу сделать; и 13) у меня ограничить моей социальной активности, потому что я устал.
- Изолировать КСДОР из свеже собранных крови (приблизительная продолжительность: 1 ч).
- Собрать 8 мл крови в трубу подготовки мононуклеарных клеток (см. Таблицу материалы).
Примечание: Образцы крови должны быть обработаны в течение 2 ч коллекции. Если образцы крови обрабатываются более 2 ч после взятия пробы, качество получения может быть нарушена. - Центрифуга на 1750 x г за 30 мин при комнатной температуре (18-25 ° C). Передать облачный слой 15 мл Конические трубки. Добавить до 15 мл PBS и инвертировать 5 раз.
- Центрифуга на 300 x g 15 минут при 4 ° C. Осторожно снимите и выбросьте супернатант без тревожных Пелле. Вновь приостановить гранулы, добавив до 10 мл PBS и инвертировать 5 раз.
- Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Отменить супернатанта жидкости и вновь приостановить клеток в 1 мл PBS. Передача репликацию до 1,5 мл отцентрифугировать.
- Центрифуга на 610 x g за 10 минут. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в полной RPMI 1640 (RPMI 1640 с 10% FBS, 10 мм пенициллина/стрептомицина).
- Собрать 8 мл крови в трубу подготовки мононуклеарных клеток (см. Таблицу материалы).
- Слой клеток пластины для non сторонник клетки (приблизительная продолжительность: 30 мин).
- Подготовка клеток и тканей клеевой раствор (см. Таблицу материалы) путем разбавления Стоковый раствор бикарбоната натрия 0,1 М рН 8.0. Рабочая решение должно быть на 3,5 мкг/см2 площади поверхности.
Примечание: Это решение содержит полифенольные белки, извлеченные из морской мидии Mytilus edulis. Эти белки являются ключевыми компонентами клея, выделяемый мидий на якорь самой поверхности. Мы находим, что клетки-так работает лучше с получения. - Добавьте 100 мкл разбавленного клея решения для каждой скважины и инкубировать в течение по крайней мере 20 минут при комнатной температуре. Промойте три раза ди воду и воздух сухой.
- Подготовка клеток и тканей клеевой раствор (см. Таблицу материалы) путем разбавления Стоковый раствор бикарбоната натрия 0,1 М рН 8.0. Рабочая решение должно быть на 3,5 мкг/см2 площади поверхности.
3. митохондриальной функции измерения
- Подготовка анализа СМИ (приблизительная продолжительность: 10 мин).
Примечание: Assay СМИ должны быть свежеприготовленный на день эксперимента.- Добавьте L-глютамина, пируват и глюкозы основывать средства массовой информации (же составляющие как средний Дульбекко изменение орла (DMEM), но без бикарбонат натрия, глюкоза, глютамин или пируват натрия) чтобы сделать анализ средств массовой информации. Разогреть СМИ до 37 ° C, затем скорректировать рН 7,4.
Примечание: Концентрация L-глютамин, пируват и глюкозы, как правило, то же самое, как концентрации в СМИ нормального роста, но может быть скорректирована на основании анализа.
- Добавьте L-глютамина, пируват и глюкозы основывать средства массовой информации (же составляющие как средний Дульбекко изменение орла (DMEM), но без бикарбонат натрия, глюкоза, глютамин или пируват натрия) чтобы сделать анализ средств массовой информации. Разогреть СМИ до 37 ° C, затем скорректировать рН 7,4.
- Подготовить репликацию для Mito стресс-тест (приблизительная продолжительность: 2 h).
- Плиты достаточно получения из шага 2 в каждой скважине до 80-90% confluency. По нашему опыту 1,5 x 105 клеток/также принесли наиболее последовательных результатов.
Примечание: Колодцы A и H фон колодцев и должен содержать только пробирного СМИ не клетками. В скважинах B-G мы рекомендуем, покрытие по крайней мере 3-6 скважин на пациента сэмпл с целью учета выбросов. - Вращаются пластины вниз на 200 x g за 2 мин позволить клетки придерживаться нижней части скважины. Вымойте клетки один раз с Assay СМИ. Этот шаг удаляет из питательных сред сыворотки и бикарбоната натрия.
Примечание: В нашем опыте, Стиральная шаг обычно удаляет 20-30% клеток. - Добавьте 180 мкл Assay СМИ в каждой скважины, включая колодцы фон A и H. инкубировать в инкубатор-CO2 37 ° C за 45-60 мин.
- Плиты достаточно получения из шага 2 в каждой скважине до 80-90% confluency. По нашему опыту 1,5 x 105 клеток/также принесли наиболее последовательных результатов.
- Выполнение стресс-тест Mito
- Воссоздания наркотиков в Mito стресс комплект с Пробирной СМИ следующим образом:
- Oligomycin: Добавьте 252 мкл пробирного СМИ в пробирку для создания Стоковый раствор на 50 мкм.
- FCCP: Добавьте 288 мкл пробирного СМИ в пробирку для создания Стоковый раствор на 50 мкм.
- Antimycin A / ротенон: добавить 216 мкл пробирного СМИ в пробирку для создания Стоковый раствор на 25 мкм.
- Вихревой воссоздана препаратов для примерно 1 минуту. Развести в рабочие решения.
Примечание: Концентрации рабочих растворов следует титруют и заранее до эксперимента в зависимости от типа ячейки. Для получения, мы находим, что 1 мкм Oligomycin, 1 мкм FCCP и 0,5 мкм antimycin A / ротенон работать лучше. - Пипетка наркотики в каждый порт картриджа датчика последовательно:
- Порт A: Пипетка 20 мкл 10 мкм Oligomycin, для окончательного концентрации в каждой скважине 1 мкм.
- Порт B: пипеткой 22 мкл 10 мкм FCCP, для окончательного концентрации в каждой скважине 1 мкм.
- Порт C: Пипеткой 25 мкл 5 мкм antimycin A / ротенон для конечной концентрации в каждой скважине 0,5 мкм.
- Воссоздания наркотиков в Mito стресс комплект с Пробирной СМИ следующим образом:
- Выберите «Mito стресс-тест» на инструменте внеклеточного потока. Выполните запрос документа и вставьте датчик картридж. Этот документ будет автоматически выполнять калибровку датчика. Вставьте ячейки пластины после калибровки датчика и инструмент будет закончить остальной части assay. Динамика кислорода измеряется на 530 Нм (возбуждение) / 650нм (выбросов), и Протон концентрация измеряется в 470 Нм (возбуждение) / 530 Нм (выбросов).
4. Нормализация данных митохондриальной функции
- Приготовляют раствор распространения Assay клетки (приблизительная продолжительность: 5 мин).
- Добавить 48 мкл пятен нуклеиновой кислоты (500 x) и 240 мкл подавитель фона в 11,7 мл PBS (2 x). Пятен нуклеиновой кислоты клетки permeant ДНК связывающих красителя, и подавитель фона маскирования краситель, который блокирует отмершие клетки или клетки с нарушенной клеточной мембраны целостности от будучи окрашенных. Сочетание ДНК связывающих красителя и подавитель фона гарантирует, что только живые клетки витражи.
- Добавьте одинаковый объем 2 x рабочего раствора (180 мкл) непосредственно в среду в каждой скважине после завершения Mito стресс-тест.
- Инкубации клеток при наличии клеток распространения пробирного решение в инкубаторе 37 ° C на 45-60 мин Quantify количество живых клеток (флуоресцентный) на пластину читателя на 508 Нм (возбуждение) / 527 Нм (выбросов) и нормализации данных OCR (приблизительная продолжительность: 10 min) .
Примечание: в дополнение к количество живых клеток, пользователи могут также выбрать нормализовать свои данные с общее количество клеток, количество нуклеиновой кислоты, концентрации белка, и т.д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стресс-тест Mito опирается на измерения скорости потребления кислорода (OCR) после впрыска различных респираторные ингибиторы на карте митохондриальной полный профиль. OCR измерений после каждой инъекции наркотиков может использоваться для вычисления следующие параметры, относящиеся к митохондриального здоровья: Базальной OCR сначала измеряется до любых наркотиков путем инъекций для оценки потребления кислорода, необходимых для удовлетворения отдыха уровня АТФ спроса. Базальные дыхания рассчитывается путем вычитания не митохондриальное дыхание ставки от базовой линии OCR до oligomycin инъекции. Далее oligomycin вводят подавляют протонный канал АТФ-синтазы (комплекс V). Последующее падение в OCR после инъекции oligomycin представляет собой потребление кислорода, связанных с производством СПС. FCCP (цианистый Карбонильная группа 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), ionophore, используется для нарушить градиент протона и митохондриальной мембраны потенциал, затем используется для получения потребление кислорода Максимальная. Максимальная дыхания рассчитывается путем вычитания не митохондриальное дыхание от максимальной OCR после инъекции FCCP. Запасные дыхательных вместимость -разница между максимальной и базальной дыхания. Наконец, antimycin (комплекс III ингибитор) и ротенон (комплекс я ингибитор) вводят в то же время выключить электрон-транспортной цепи. По определению, не митохондриальное дыхание является независимым от электрон-транспортной цепи (например, не митохондриальной NADPH оксидаза макрофагов и т.д.) и представлена как OCR значения после antimycin A / ротенон инъекции. Сцепка эффективности описывает долю потребления базальной митохондриальной кислорода используется для синтеза АТФ и вычисляется как 100% x (ATP связанных с производством OCR) /(basal respiration rate).
Плотность клеток для каждого культивирования условия должны быть оптимизированы перед выполнением mito стресс-тест. По нашему опыту 80-90% confluency достигается путем покрытия 1,5 x 105 клеток/колодец свежевыделенных получения из крови человека (рис. 1А). Эта обшивка плотность составляет Стиральная шаг, описанный в шаге 3.2.3. Помимо определения оптимального покрытия плотности, FCCP титрования должны быть выполнены для определения концентрации, необходимые для создания максимальной OCR. В FCCP концентрациях испытания - 0,125 мкм, 0.25 мкм, 0,5 мкм, 1 мкм и 2 мкм - OCR увеличился с FCCP концентрация достигает плато на 1 мкм, но сократилось на 2 мкм (рис. 1Б). Это означает, что 1 мкм-это оптимальная концентрация FCCP, который должен использоваться для изучения КСДОР митохондриальной функции.
Мы протестировали митохондриальной функции той же партии клеток из того же образца крови, собранные от здорового донора в различные моменты времени после КСДОР изоляции. Потребления базальной кислорода, а также максимальной OCR сократилась как еще 3 h и продолжает уменьшаться в 5 и 8 ч после КСДОР изоляции (рисA). После 3 ч Максимальная дыхания, вызвало FCCP инъекции (пункты 7-9 время) не превышает базальной OCR, предполагая, что даже в живые клетки, митохондрии запасные дыхательных емкость уменьшается быстро со временем. Внеклеточные подкисления ставка (ECAR) одновременно измеряется на инструменте внеклеточного потока. Поскольку oligomycin Подавляет митохондриальную АТФ-синтазы, гликолиза набирается в течение нескольких минут для удовлетворения спроса на энергоносители и компенсировать нехватку производства АТФ через окислительное фосфорилирование, как свидетельствует быстрое увеличение ECAR после oligomycin инъекции. 3 ч после КСДОР изоляции, в кратчайшие сроки было снижение ECAR, а также OCR (рис. 2B). Хотя мы не наблюдали каких-либо заметных изменений в жизнеспособность клеток в 1, 3, 5 и 8 ч после КСДОР изоляции, митохондриальной функции сократилось быстро, предполагая, что сроки является ключом для захвата митохондриальной профиль live, дышащими получения.
Пациент образец коллекции, как правило, происходят в разное время на отдельных дней; Таким образом важно нормализовать данные для сравнения различных образцов и моменты времени. В то время как пробирного другие нормализации методы, такие как белки и нуклеиновые кислоты количественной оценки могут быть использованы, мы находим, что окрашивание живой клетки с ДНК связывающих красителя и количественная оценка Зеленый флуоресцентный клеток в каждой скважине является наиболее эффективным и надежным нормализации метод. Репрезентативных данных репликацию, собранных из двух различных здоровых доноров на два отдельных дней показаны на рисунке 3. Врезка образ представителя плиты клетки также показаны всего клетки (Фазовый контраст) и живой клетки запачкается с ДНК связывающих краситель (Зелёный флуоресцентный) после mito стресс-тест. Норма расхода базальной кислорода, а также потребления кислорода после каждого употребления наркотиков путем инъекций нормированный жить клетки были похожи в двух различных здоровых-усталость доноров (рис. 3).
Представитель митохондриальной функции данных усталость субъекта (оценка FACIT-F < 43) с раком простаты (красный) и возраст/пол/гонки соответствует без иссякает здоровых доноров (синий) показан на рисунке 4. Хотя мы не наблюдали никакой разницы в базальной OCR (Рисунок 4B), усталость предметом выставлены сократилось потребление кислорода Максимальная, а также запасные дыхательных потенциал, по сравнению с контролем (рис. 4C, D). Усталость-видимому быть связаны с сокращением объемов запасных дыхания, потому что там было выявлено различий в не митохондрий кислородом потреблении (Рисунок 4E), связанных с СПС кислорода (Рисунок 4F), или увязка эффективности (Рисунок 4G). Базовые данные (до любых наркотиков путем инъекций) и максимальная дыхания после FCCP инъекции могут быть визуализированы с помощью энергии фенотип сюжет, который раскрывает предпочтительный путь (OCR Оксидативное фосфорилирование против ECAR гликолиз) в присутствии из увеличилась спрос на энергию (рис. 4H). Пустые квадраты показывают базальной энергии фенотип и твердых квадраты показывают фенотип энергии в ответ на требование максимальной СПС. Расстояние между базальную (пустой квадрат) и максимального (сплошной квадрат) указывает запасные емкости, а склон сотовой предпочтение Оксидативное фосфорилирование против гликолиза. Как показано на рис. 4H, резервных мощностей в теме усталость сократилось по сравнению с без иссякает здорового контроля. Кроме того фенотип энергии в ответ на повышенный спрос АТФ, перекос в сторону гликолиза в усталом состоянии субъекта, по сравнению с здорового управления (рис. 4H).
Рисунок 1 : КСДОР обшивки плотности и FCCP кривой доза ответ. (A) свеже изолированные получения были позолоченными 1,5 x 105 клеток/хорошо в CellTak покрытием клетки культуры минипластинами. После мытья и изменить СМИ, клетки были равномерно распределены на 80-90% confluency. Шкалы бар = 100 мкм. (B) OCR увеличился с ростом концентрации FCCP в 0,125 мкм, 0.25 мкм, 0,5 мкм, достигнув пика OCR на 1 мкм. OCR упала на 2 мкм, указав, что 1 мкм является оптимальная доза добиться максимальной дыхания в барах PBMCs.Error указать стандартное отклонение 3 последовательных измерения после первоначального употребления наркотиков путем инъекций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Митохондриальное дыхание уменьшается с течением времени в свежевыделенных репликацию. OCR (A) , а также ECAR (B) быстро снизился со временем после КСДОР изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Данные представителя митохондриальное дыхание с нормализацией. Стресс-тест Mito выполнялось с помощью свежие получения изолированы от двух различных здоровых добровольцев в разные дни и нормализуется с использованием пятно флуоресцентный нуклеиновых кислот, количественно на флуоресцентные пластины читателя. Вставка: представитель изображение живых клеток (зеленый) и общая клетки (Фазовый контраст) в колодец. Шкалы бар = 1000 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель анализ усталость субъекта по сравнению с здорового управления. (A) представитель Mito стресс тест OCR граф усталость субъекта по сравнению с возраст/пол/гонки соответствует без иссякает здорового контроля. Бар графики базальной OCR (B), максимальная дыхания (C), свободная мощность дыхания (D), показано потребление не митохондриальной кислорода (E), производства АТФ (F)и эффективности сцепления (G) . Фенотип участок энергии усталом состоянии предмета и здорового управления показано (H). Пустые квадраты показывают базовой энергии фенотип, твердых квадраты представляют собой фенотип подчеркнул энергии измеряется после инъекции FCCP. Планки погрешностей указать стандартное отклонение 3 различных скважин для каждого участника исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Усталость в онкологических больных является изнурительной условии, что не является хорошо определенным или характеризуется1. Диагноз усталости полностью основывается на субъективной отчетности и нет текущий стандарт диагностики или лечения этого состояния, во многом объясняется отсутствием понимания в своем pathobiology2. Предлагаемых механизмов, лежащих в основе усталость в раковых больных обесценение в митохондриальной функции является одним из наиболее терапевтически ориентации пути. Таким образом мы разработали быстрый и практичный способ для измерения митохондрий в клинических образцах, которые можно применять для упреждающего выявления больных группы риска для разработки токсичности связанных с лечением рака, включая усталость, так что рано Управление может быть возбуждено.
Внеклеточные потока технологии в сочетании с впрыска респираторные ингибиторы позволяют для оценки функционального состояния митохондриальных и был использован для обоих в пробирке и в естественных условиях модели19, 20,21. Мы расширили существующие тело работы и разработала метод оптимизирован для изучение митохондриальной дисфункции в клинических пробах. Преимуществом этого исследования является использование анализатор компактный внеклеточного потока. Как мы показали, сроки эксперимента важно после изоляции свежие получения от человеческой крови. Хотя расширенном формате (формат 96-луночных или 24-а) является идеальным выбором для эксперимента высокая пропускная способность, компактный внеклеточного поток системы, которая содержит 8 скважин, позволяет для индивидуальной оценки каждого пациента образца19. Этот метод является более практичным и экономически (как в отношении самой Конвенции и реагентов, используемых для выполнения анализа), потому что образец коллекции от разных пациентов, как правило, происходят в разное время в разные дни.
Использование репликацию для оценки митохондриальной функции у больных раком усталость имеет ряд преимуществ: 1) биопсия тканей, таких как скелетных мышц может быть непрактичным временами; 2) получения легко доступны и могут легко быть изолированы с использованием клеток подготовка трубы, который предлагает практическое преимущество в клинических условиях; и 3) мы продемонстрировали, что митохондриальной функции уменьшается после свежевыделенных клеток в культуре уже более чем на 3 часа и изоляции определенных ячеек типы обычно занимает несколько часов (более 3 часов). Получения может быть подготовлен в течение часа, обеспечивая таким образом точность измерения в реальном времени функции митохондрий. Хотя мы рекомендуем использовать репликацию для первоначального клинического расследования в ранее uncharacterized популяциях пациентов, другие типы клеток, таких как Т-лимфоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и моноцитов также может использоваться с нынешним протоколом после оптимизации из обшивки плотности и респираторные ингибиторы концентрации15,25,26.
Перед началом испытаний митохондриальной функции в новой системе, важно сначала определить оптимальное ячейки плотности и концентрации FCCP. По нашему опыту покрытие 1,5 x 105 клеток на хорошо гарантирует, что плотность клеток после покрытия и стиральная шаг остается 80-90% притока. Кроме того важно определить оптимальные концентрации FCCP для каждого типа клеток. Диапазон FCCP концентрации должны быть проверены и концентрации FCCP, которая производит максимальной OCR без ущерба для здоровья ячейки должны использоваться. В концентрациях, тестирование 1 мкм FCCP привели к максимальной дыхания в репликацию. Еще один важный шаг — сроков проведения эксперимента, как капли митохондриальное дыхание обрывисто 3 часа после КСДОР изоляции. Это означает, что стресс-тест mito должно быть выполнено в течение 3 часов после сбора проб для точного захвата митохондрий в клинической пробе. Стоит отметить, что многие исследователи имеют доступ только к замороженных образцов. Ранее мы протестировали репликацию после замораживания и оттаивания, и митохондриальной функции этих клеток сильно скомпрометирован. Поэтому мы рекомендуем использование свежей изолированные репликацию в клинических исследованиях, когда это возможно.
Еще одним важным аспектом создания воспроизводимых данных является метод нормализации данных. Хотя некоторые лаборатории имели успех, используя BCA белка квантификации для нормализации данных митохондриальное дыхание, мы находим, что это не всегда возможно, особенно на низких клеток плотности. Нормализация метода, описанного в настоящем Протоколе основывается на линейной корреляции между числа клеток и выбросов флуоресценции комплексов краситель нуклеиновых кислот и может точно подсчитать 10 до 50 000 ячеек27. Кроме того нормализации, используя комбинацию флуоресцентные нуклеиновых кислот пятна и флуоресцентные пластины читателя позволяет для быстрой квантификации живых клеток после завершения эксперимента. Кроме того этот метод не требует trypsinization адэрентных клеток или скребком ячейки.
Ограничение протокола в том, что мы не отделяем репликацию в типы конкретных клеток перед выполнением митохондриальной функционального анализа. Как мы показали, митохондриальное дыхание быстро уменьшается с течением времени после КСДОР изоляции. Это предполагает, что различия между пациентами могут быть неточными, если эксперимент проводился после изоляции различных клеточных популяций, который обычно занимает несколько часов. Даже несмотря на то, что изучение смешанным населением как репликацию не выявить важные ячейки определенного типа информации, полученной от экспериментов с помощью получения информации может помочь руководство будущих механистический исследования сосредоточены на конкретных клеток. Получения выступать в качестве прокси для системного митохондриальной дисфункции, которая имеет отношение к системных расстройств, таких как рак усталость10,28. Протокол, описанные в текущей рукописи только обеспечивает сырой измерение митохондриальной дисфункции без точного определения причины наблюдения. Таким образом, выводы, с использованием этой технологии и процедуры следует интерпретировать с осторожностью и необходимо рассмотреть многофакторный характер усталость, например ее совместного появления с другими поведения (например, депрессия, сон, когнитивные нарушения) и условия (например, сердечно-легочными статус, полипрагмазии). Будущие исследования должны изучить изменения в митохондриальной функции в типах конкретных клеток (например, естественные киллеры, Т-лимфоцитов и моноцитов) и в различных клинических групп населения (например, больных раком, усталость/не уставшие и здоровые элементы управления). Хотя это выходит за рамки текущей рукописи, мы будем определять ассоциации между тяжесть усталость рака и митохондриальной дисфункции, а также взаимосвязь между митохондриальной функции измерения и испытания физических свойств усталости, такие как тест 6-ти минутах ходьбы, в будущих расследований. Кроме того будущие исследования также изучит митохондриальной дисфункции в других типов рака для того чтобы определить, связан ли с митохондриальной дисфункции усталость через различных типов рака. В заключение мы разработали протокол, оптимизированный для быстрой оценки общей митохондриальной дисфункции, с помощью клинических образцов. Дальнейшее механистический расследований может выполняться для точного определения причастности конкретных путей в этой изнурительной условии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование полностью поддерживается Отделом интрамуральных исследований из Национального института сестринского исследований низ, Бетесда, штат Мэриленд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).
