Summary
Vårt mål var att utveckla en praktisk protokoll för att utvärdera mitokondriell dysfunktion är associerad med trötthet hos patienter med cancer. Detta innovativa protokoll är optimerad för klinisk användning involverar endast standard flebotomi och grundläggande laboratorierutiner.
Abstract
Trötthet är ett vanligt och handikappande tillstånd som drabbar de flesta cancerpatienter. Hittills, test trötthet förblir dåligt kännetecknas med inga diagnostiska för att objektivt mäta svårighetsgraden av detta tillstånd. Här beskriver vi en optimerad metod för att bedöma mitokondriefunktion av PBMC samlas in från trött cancerpatienter. Använda en kompakt extracellulära flux system och sekventiell insprutning av respiratoriska hämmare, granskat vi PBMC mitokondriell funktionella status genom mätning av basal mitokondriell respiration, respiratorisk reservkapacitet och energi fenotyp, som beskriver den Rekommenderad energi väg att reagera på stress. Färsk PBMC är lätt tillgängliga i den kliniska inställningen använder standard flebotomi. Hela analysen beskrivs i detta protokoll kan utföras i mindre än 4 timmar utan inblandning av komplexa biokemiska tekniker. Dessutom beskriver vi en normalisering-metod som är nödvändiga för att erhålla reproducerbara data. De enkla förfarandet och normalisering metoder presenteras tillåter upprepad provtagning från samma patient och generering av reproducerbara data som kan jämföras mellan tidpunkter att utvärdera potentiella behandlingseffekter.
Introduction
Trötthet är ett utbrett och smärtsamt tillstånd som har en negativ inverkan på livskvaliteten av cancer patienter1. Till detta datum, cancer trötthet är fortfarande dåligt definierade och bygger endast på subjektiv rapportering av patienter2. Därför finns det ett brådskande behov av att identifiera en lätt anpassningsbar diagnostiska laboratorietest för att objektivt karakterisera trötthet i klinisk miljö3,4.
Flera underliggande mekanismer, inklusive mitokondrier dysfunktion, har föreslagits att orsaka trötthet5. Mitokondrier är kraftpaket organeller, som ger 95% av cellulära energibehov via oxidativ fosforylering, och spelar en viktig roll i Kalciumsignalering, apoptos, immun signalering och reglering av andra Intracellulär signalering händelser6 . Nedsatt mitokondriell Bioenergetik och defekter i energiproduktionen kan följaktligen bidra till trötthet. Stöder denna hypotes, har tidigare studier observerat mutationer i mitokondrie-DNA hos patienter med kronisk trötthet syndrom7. Medan det är oklart huruvida patofysiologiska beskärningen av trötthet ligger inom centrala nervsystemet eller perifera vävnader, såsom muskler8,9, finns det för närvarande ingen direkt metod att korrekt bedöma mitokondriell dysfunktion relaterade till trötthet i live, respiring celler.
Med perifera mononukleära blodceller (PBMC) för att studera mitokondriefunktion erbjuder flera fördelar. Först PBMC är lätt tillgängliga i den kliniska inställningen använder standard flebotomi och kan isoleras snabbt med hjälp av grundläggande laboratorietekniker. Andra är blodinsamling mindre invasiv än att samla andra vävnader såsom en muskelbiopsi. Således, blodprov kan tas från samma patient upprepade gånger över tid, vilket underlättar längsgående utvärdering av behandlingseffekter. Intressant, föreföll mitokondriell funktion i PBMC vara väl korrelerad med njure mitokondriell status i en djurmodell10. Dessutom har immunceller mitokondrierna använts som en proxy för att upptäcka systematiska förändringar under olika sjukdomen villkor11,12. Mitokondrierna i cirkulerande immunceller är särskilt känslig för förändringar i immunförsvaret och immun signalmolekyler som cytokiner13,14,15. Exempelvis har det observerats att PBMC från patienter med akuta reumatiska inflammatoriska sjukdomar uppvisar hög baslinjen syre förbrukning14. Däremot minskade syreförbrukningen i PBMC isolerade från patienter med systemiska inflammatoriska tillstånd inklusive sepsis16. Under inflammatoriska tillstånd, kan fria radikaler produceras av dysfunktionella mitokondrier ytterligare bidra till förhöjda oxidativ stress och långvarig inflammation17. Centralrollen av mitokondrier i energiproduktion samt liksom oxidativ stress tyder på potentiella nyttan av att använda mitokondriefunktion som en proxy för att studera trötthet i cancer patienter 13.
Tidigare studier undersöker mitokondriefunktion utnyttjas biokemiska tekniker, mitokondriella membranet potentiella mätning eller isolering av specifika cellpopulationer som inte kanske är lätt anpassningsbar i klinisk miljö5, 14,18. Under senare år har utvecklingen av extracellulära flux analyser har låtit forskare att enkelt och undersöka noggrant förändringar i syre materialåtgången (OCR) som svar på automatiserade injektioner av respiratoriska hämmare19,20 , 21 , 22. men de flesta av dessa studier är utformade för specifika celltyper och formatet stor hög genomströmning kan inte tillämpas i en klinisk miljö. I detta manuskript beskriver vi ett optimerat protokoll för att pröva mitokondriefunktion för klinisk användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den aktuella studien (NCT00852111) godkändes av den institutionella granskning Board (IRB) av den National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Deltagarna inskrivna i denna studie var euthymic män, 18 år eller äldre, som diagnostiserades med icke-metastaserande prostatacancer med eller utan föregående prostatektomi och var planerad att ta emot extern strålbehandling (EBRT). Potentiella deltagare exkluderades om de hade en progressiv sjukdom som kan orsaka betydande trötthet, hade psykiatrisk sjukdom inom de senaste fem åren hade okorrigerad hypotyreos eller anemi, eller hade en andra malignitet. Individer som använt sömnmedel, steroider eller icke-steroida antiinflammatoriska medel uteslöts också. Friska kontroll blodprov erhölls vid NIH institutionen av Transfusion medicin från friska donatorer under ett IRB-godkända protokoll (NCT00001846). Alla deltagare rekryteras på Magnuson Clinical Research Center vid NIH. Undertecknat skriftligt informerat medgivande har erhållits före studien deltagande.
1. mitokondriefunktion mätning förberedelse (dag 1 av experimentet)
- Återfukta Sensor patron (se Tabell för material, Ungefärlig tidsåtgång: 5 min).
- Ta Sensor patronen ur förpackningen. Lägga till 200 μL standard lösning i varje brunn av verktyget plattan, sedan fylla varje vallgrav med 400 μL standard lösning.
- Returnera sensorplatta till verktyget plattan, som nu har standard lösning i den. Hydrate patronen i en inkubator med icke-CO2 i 37 ° C under natten.
Obs: Sensor patronen behöver vara hydrerade för minst 4 h och högst 72 h.
2. kliniska Provberedning (dag 2 av experimentet)
- Mäta trötthet med 13-objektet funktionell bedömning av kronisk sjukdom terapin - trötthet (FACIT-F)2,23,24 vid baseline (före EBRT initiering), mittpunkten och slutförandet av EBRT och 1 års inlägg-EBRT.
- Använd en 0 - 4 skala för varje objekt svar, där 0 representerar ”inte alls” och 4 anger att svaranden avser motsvarande uttalande ”så mycket”. Total poäng bör variera från 16-53, med lägre poäng återspeglar hög trötthet intensitet.
- Definiera trötthet som ett FACIT-F Poäng lägre än 43, med FACIT-F poängen ≥43 anger inte föreligger eller inte-kliniskt trötthet2.
Obs: En FACIT-F poäng på 43 bästa delar trötthet betyg för cancerpatienter och den allmänna befolkning2. - Inkludera följande 13 produkter i FACIT trötthet skalan: 1) jag känner mig trött; (2) känns svaga över; (3) Jag känner mig håglös (”tvättas”); (4) Jag känner mig trött; (5) Jag har problem med att starta saker eftersom jag är trött; (6) Jag har svårt att avsluta saker eftersom jag är trött; (7) Jag har energi; (8) Jag kan göra min vanliga aktiviteter; 9) Jag behöver sova under dagen; 10) Jag är för trött för att äta; 11) Jag behöver hjälp med att göra min vanliga aktiviteter; 12) jag frustrerad av att vara för trött för att göra saker jag vill göra; och 13) måste jag begränsa min sociala aktivitet eftersom jag är trött.
- Isolera PBMC från nyligen uppsamlat blodprov (Ungefärlig tidsåtgång: 1 h).
- Samla 8 mL blod i en mononukleära celler förberedelse Tube (se Tabell för material).
Obs: Blodprov bör bearbetas inom 2 h av samling. Kvaliteten på PBMC kan äventyras om blodprov bearbetas mer än 2 h efter provtagning. - Centrifugera vid 1 750 x g i 30 min i rumstemperatur (18-25 ° C). Överföra det molniga lagret till en 15 mL koniska rör. Lägg till upp till 15 mL PBS och Invertera 5 gånger.
- Centrifugera 300 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Försiktigt bort och kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten. Resuspendera pelleten genom att lägga till upp till 10 mL PBS och Invertera 5 gånger.
- Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna vätska supernatanten och slamma cellerna i 1 mL PBS. Överföra PBMC till ett 1,5 mL mikrofugrör.
- Centrifugera vid 610 x g i 10 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten i komplett RPMI-1640 (RPMI-1640 kompletteras med 10% FBS, 10 mM Penicillin/Streptomycin).
- Samla 8 mL blod i en mononukleära celler förberedelse Tube (se Tabell för material).
- Coat cell plattor för icke-anhängare celler (Ungefärlig tidsåtgång: 30 min).
- Förbereda cell- och självhäftande lösning (se Tabell för material) genom att späda ut stamlösning i 0,1 M natriumbikarbonat pH 8,0. Arbetslösning bör vara 3,5 μg/cm2 yta.
Obs: Denna lösning innehåller polyphenolic proteiner som utvunnits från Marina musslan, Mytilus edulis. Dessa proteiner är viktiga komponenter i limmet utsöndras av musslan att förankra sig till ytor. Vi tycker att Cell-Tak fungerar bäst med PBMC. - Tillsätt 100 μL av den utspädda självhäftande lösningen till varje brunn och inkubera i minst 20 min i rumstemperatur. Tvätta tre gånger med DI vatten och luften torr.
- Förbereda cell- och självhäftande lösning (se Tabell för material) genom att späda ut stamlösning i 0,1 M natriumbikarbonat pH 8,0. Arbetslösning bör vara 3,5 μg/cm2 yta.
3. mitokondriefunktion mätning
- Beredning av Assay Media (Ungefärlig tidsåtgång: 10 min).
Obs: Assay media måste vara nyberedd på dagen för experimentet.- Lägga till L-glutamin, pyruvat och glukos för att basera media (samma beståndsdelar som Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM), men utan natriumbikarbonat, glukos, glutamin, eller natrium pyruvat) för att göra analysen media. Värma media upp till 37 ° C, sedan justera pH till 7,4.
Obs: Koncentrationer av L-glutamin, pyruvat och glukos är oftast detsamma som koncentrationer i normal tillväxt medier, men kan justeras baserat på analysen.
- Lägga till L-glutamin, pyruvat och glukos för att basera media (samma beståndsdelar som Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM), men utan natriumbikarbonat, glukos, glutamin, eller natrium pyruvat) för att göra analysen media. Värma media upp till 37 ° C, sedan justera pH till 7,4.
- Förbereda PBMC Mito Stress-test (Ungefärlig tidsåtgång: 2 h).
- Tallrik tillräckligt PBMC från steg 2 i varje brunn att nå 80-90% konfluens. Vår erfarenhet gav 1,5 x 105 celler per brunn mest konsekventa resultat.
Obs: Wells A och H är bakgrunden brunnar och bör endast innehålla assay media med inga celler. I wells B-G rekommenderar vi plätering minst 3-6 wells per patientprov för extremvärden. - Snurra plattor nere vid 200 x g i 2 min att tillåta celler att följa botten av brunnarna. Tvätta cellerna en gång med Assay media. Detta steg tar bort serum och natriumbikarbonat från tillväxt medier.
Obs: Vår erfarenhet avlägsnar steget tvätt vanligtvis 20-30% av cellerna. - Lägga till 180 μL Assay media i varje brunn, inklusive bakgrunden brunnarna A och H. Inkubera i en icke-CO2 37 ° C inkubator för 45-60 min.
- Tallrik tillräckligt PBMC från steg 2 i varje brunn att nå 80-90% konfluens. Vår erfarenhet gav 1,5 x 105 celler per brunn mest konsekventa resultat.
- Kör Mito stresstestet
- Rekonstituera droger i Mito Stress Kit med assay media enligt följande:
- Oligomycin: Lägga till 252 μL assay media i injektionsflaskan med att generera en stamlösning vid 50 μM.
- FCCP: Tillsätt 288 μL av assay media i injektionsflaskan med att generera en stamlösning vid 50 μM.
- Antimycin A / Rotenon: lägga till 216 μL av assay media i injektionsflaskan med att generera en stamlösning vid 25 μM.
- Vortex ombildade droger i cirka 1 minut. Späd till fungerande lösningar.
Obs: Arbetande lösningarnas koncentrationer bör titreras och förutbestämda före experimentet beroende på cellen. För PBMC, finner vi att 1 μM av Oligomycin, 1 μM FCCP och 0,5 μM antimycin A / Rotenon fungerar bäst. - Pipettera droger i varje port i sensorn patronen sekventiellt:
- Port A: Pipett 20 μL 10 μM Oligomycin, för en slutlig koncentration i varje brunn 1 μM.
- Port B: pipett 22 μl 10 μM FCCP, för en slutlig koncentration i varje brunn 1 μM.
- Port C: Pipettera 25 μL av 5 μM antimycin A / Rotenon för en slutlig koncentration i varje brunn 0,5 μM.
- Rekonstituera droger i Mito Stress Kit med assay media enligt följande:
- Välj ”Mito Stress Test” på ett extracellulära flux instrument. Följ instrument prompt och tonerkassetten sensor. Instrumentet kommer att automatiskt utföra kalibrering. Infoga cell plattan efter kalibrering och instrumentet kommer att avsluta resten av analysen. Syre dynamics mäts på 530 nm (excitation) / 650nm (utsläpp), och protonkoncentration mäts vid 470 nm (excitation) / 530 nm (utsläpp).
4. normalisering av mitokondriefunktion Data
- Förbereda Cell Proliferation Assay lösning (Ungefärlig tidsåtgång: 5 min).
- Lägga till 48 μl nukleinsyra fläcken (500 x) och 240 μl bakgrund suppressor till 11,7 mL PBS (2 x). Nukleinsyra fläcken är ett cell-diffusionskoefficient DNA-bindande färgämne, och den bakgrund UNDERTRYCKARE är maskering färgämne som blockerar döda celler eller celler med komprometterad cellmembranet integritet från att vara målat. Kombinationen av DNA-bindande färgämnet och den bakgrund UNDERTRYCKARE säkerställer att endast levande celler är färgade.
- Lägg till lika stor volym av 2 x arbetslösning (180 μL) direkt i mediet i varje brunn efter Mito Stress-Test har slutförts.
- Inkubera cellerna i närvaro av cell proliferation assay lösning i en 37 ° C inkubator för 45-60 min. kvantifiera antalet levande celler (fluorescerande) på en tallrik läsare på 508 nm (excitation) / 527 nm (utsläpp) och normalisera OCR data (Ungefärlig tidsåtgång: 10 min) .
Obs: utöver antalet levande celler, användare kan också välja att normalisera sina data med det totala antalet celler, beloppet av nukleinsyra, protein koncentrationer, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mito stresstestet bygger på att mäta syre materialåtgången (OCR) efter sekventiell insprutning av olika respiratoriska hämmare att mappa en komplett mitokondriell profil. OCR mätningar efter varje injektionsmissbruk kan användas för att beräkna följande parametrar relaterade till mitokondriell hälsa: Basal OCR mäts först innan någon injektionsmissbruk att bedöma syreförbrukning som behövs för att möta vila nivå ATP efterfrågan. Basala respiration beräknas genom att subtrahera icke-mitokondriell respiration klassar från baslinjen OCR före oligomycin injektion. Nästa, oligomycin injiceras för att hämma proton kanalen av ATP synthase (komplex V). Den påföljande nedgången i OCR efter oligomycin injektion representerar ATP produktionsrelaterade syreförbrukning. FCCP (Karbonylklorid cyanid 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), en jonofor som används för att störa Protonlutning och mitokondriella membranet potential, sedan används för att framkalla maximal syreförbrukning. Maximal andning beräknas genom att subtrahera icke-mitokondriell andning från maximal OCR efter FCCP injektion. Respiratoriska reservkapacitet är skillnaden mellan maximal och basala respiration. Slutligen antimycin en (komplex III-hämmare) och Rotenon (komplex jag hämmare) injiceras på samma gång för att stänga av elektron transportkedjan. Definitionsmässigt icke-mitokondriell respiration är oberoende från elektron transportkedjan (t.ex. icke-mitokondriell NADPH-oxidas i makrofager, etc.) och representeras som OCR värden efter antimycin A / Rotenon injektion. Koppling effektivitet beskriver del av basala mitokondriell syreförbrukning som används för ATP-syntes och beräknas som 100% x (ATP produktionsrelaterade OCR) /(basal respiration rate).
Cell densiteten för varje culturing villkor bör optimeras innan du utför en mito stresstest. Vår erfarenhet är 80-90% konfluens uppnås genom plätering 1,5 x 105 celler per brunn av nymalen isolerade PBMC från humant blod (figur 1A). Plätering densiteten står för tvätt steg beskrivs i steg 3.2.3. Förutom att bestämma det optimala plätering densitet, måste FCCP titrering utföras för att bestämma den koncentration som behövs för att generera maximal OCR. På FCCP testats koncentrationer - 0,125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, 1 μM och 2 μM - OCR ökade med FCCP koncentrationen når en platå på 1 μM, men minskade på 2 μM (figur 1B). Detta indikerar att 1 μM är den optimala FCCP-koncentrationen som ska användas för att pröva PBMC mitokondriefunktion.
Vi testade mitokondriefunktion av samma parti av celler från samma blodprov insamlade från en frisk givare vid olika tidpunkter efter PBMC isolering. Basala syreförbrukning samt maximal OCR minskade så tidigt som 3 h och fortsatte att minska på 5 och 8 h efter PBMC isolering (figur 2A). Efter 3 h överskrider maximal andning framkallas av FCCP injektion (tidpunkter 7-9) inte basal OCR, vilket tyder på att mitokondrierna även i levande celler, skona respiratoriska kapacitet minskar snabbt över tiden. Extracellulära försurning var (ECAR) samtidigt mätt på extracellulära flux instrument. Eftersom oligomycin hämmar mitokondriell ATP-syntas, rekryteras glykolys inom minuter att möta energiefterfrågan på och för att kompensera för bristen på ATP produktionen via oxidativ fosforylering, vilket framgår av den snabba ökningen ECAR efter oligomycin injektion. Så tidigt som 3 h efter PBMC isolering, fanns det en minskning av ECAR samt OCR (figur 2B). Även om vi inte observerat någon anmärkningsvärd förändring i cellernas viabilitet på 1, 3, 5 och 8 h efter PBMC isolering, mitokondriefunktion minskade snabbt, tyder på att timing är knappen för att fånga levande, respiring PBMC mitokondriell profil.
Patientprov samlingar tenderar att ske vid olika tidpunkter på olika dagar. Därför är det avgörande att normalisera data för att jämföra olika prover och tidpunkter. Medan andra normalisering metoder såsom protein assay och nukleinsyra kvantifiering kan användas, finner vi att färgning levande celler med DNA-bindande färgämne och kvantifiering av grön fluorescerande celler i varje brunn är den mest effektiva och tillförlitliga normaliseringen metoden. Representativa uppgifter av PBMC samlas in från två olika friska donatorer på två separata dagar visas i figur 3. Infälld är en representativ bild av en cell plattan väl visar totala (faskontrast) och levande celler färgas med DNA-bindande färgämnet (grön fluorescerande) efter mito stresstest. Basala syre materialåtgången, liksom syreförbrukning efter varje injektionsmissbruk normaliserade till levande celler var liknande i två olika friska icke-trött givare (figur 3).
Representativa mitokondriefunktion data av en trött ämne (FACIT-F Poäng < 43) med prostatacancer (röd) och en ålder/kön/race-matchade icke-trött friska givare (blå) visas i figur 4. Även om vi inte observera någon skillnad i de basala OCR (figur 4B), minskade trött föremål utställda maximal syreförbrukning samt respiratoriska reservkapacitet jämfört med kontroll (figur 4C, D). Trötthet verkade vara relaterade till en minskning i luftvägarna reservkapacitet, eftersom det fanns inga skillnader i icke-mitokondriell syreförbrukning (figur 4E), ATP-relaterade syreförbrukning (figur 4F), eller koppling effektivitet (figur 4G). Originalplansdata (före någon drog injektion) och maximal respiration efter FCCP injektion kan visualiseras med hjälp av en energi fenotyp tomten, som avslöjar den Rekommenderad väg (OCR oxidativ fosforylering kontra ECAR glykolys) i närvaro av ökade efterfrågan på energi (figur 4H). Tomma rutor anger basala energi fenotyp och solid rutor anger energi fenotypen svar på maximal ATP efterfrågan. Avståndet mellan basal (tom ruta) och maximal (solid square) visar reservkapacitet, medan backen indikerar cellulära preferens mot oxidativ fosforylering kontra glykolys. Som visas i figur 4H, reservkapacitet i trötthet ämnet minskade jämfört med icke-trött frisk kontroll. Dessutom ökad den energi fenotypen som svar på ATP efterfrågan skev mot glykolys i trött ämnet jämfört med den friska kontrollgruppen (figur 4H).
Figur 1 : PBMC plätering densitet och FCCP dos-respons kurva. (A) färskt isolerade var PBMC klädd på 1,5 x 105 celler per brunn i CellTak-belagda cell kultur miniplates. Efter tvätt och media ändrar, celler var jämnt fördelade på 80-90% konfluens. Skalstapeln = 100 μm. (B) OCR ökade med ökande koncentrationer av FCCP på 0,125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, nå topp OCR på 1 μM. OCR tappade på 2 μM, vilket indikerar att 1 μM är den optimala dosen framkalla maximal andning i PBMCs.Error barer anger standardavvikelsen för 3 sekventiella mätningar efter den inledande injektionsmissbruk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mitokondriell andningen avtar nymalen isolerade PBMC. OCR (A) samt ECAR (B) sjönk snabbt över tid efter PBMC isolering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa mitokondriell respiration data med normalisering. Mito stresstest utfördes med hjälp av färska PBMC isolerade från två olika friska frivilliga på olika dagar och normaliseras med hjälp av en fluorescerande nukleinsyra fläck kvantifieras på en fluorescerande Plattläsare. Infällt: en representativ bild av levande celler (grön) och totalt celler (faskontrast) i en brunn. Skalstapeln = 1.000 μm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativ analys av ett trött ämne jämfört med en frisk kontroll. (A) representativa Mito Stress test OCR grafen av en trött ämne jämfört med en ålder/kön/race-matchade icke-trött frisk kontroll. Stolpdiagram basala OCR (B), maximal andning (C), spare respiratoriska kapacitet (D), icke-mitokondriell syreförbrukning (E)och ATP produktionen (F)koppling effektivitet (G) visas. Energi fenotyp tomten trött ämne och frisk kontroll visas (H). Tomma rutor anger baslinjen energi fenotyp, solid rutor representerar stressad energi fenotypen mätt efter FCCP injektion. Felstaplar visar standardavvikelsen för 3 olika brunnar för varje studie deltagare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trötthet hos cancerpatienter är ett handikappande tillstånd som inte är väl definierad eller kännetecknas1. Diagnos av trötthet bygger helt på subjektiva rapportering och det finns ingen aktuell diagnostiskt standard eller behandling för detta tillstånd, till stor del på grund av bristande förståelse i sin patobiologi2. Av de föreslagna mekanismerna bakom trötthet hos patienter med cancer, är nedskrivningar i mitokondriefunktion en av de mest terapeutiskt targetable vägarna. Därför utvecklade vi en snabb och praktisk metod för att mäta mitokondriefunktion i kliniska prover som kan användas för att proaktivt identifiera patienter i riskzonen för att utveckla cancer behandlingsrelaterad toxicitet, inklusive trötthet, så att tidigt Management kan väckas.
Den extracellulära flux tekniken i kombination med sekventiell insprutning av respiratoriska hämmare möjliggör bedömning av mitokondriell funktionella status och har använts för både in vitro- och in-vivo modeller19, 20,21. Vi utökat befintlig kroppen av arbete och utvecklat en metod som optimerats för granskning av mitokondriell dysfunktion i kliniska prover. En fördel med studien är utnyttjandet av kompakt extracellulära flux analysatorn. Som vi har visat, är tidpunkten för experimentet avgörande efter isolering av färska PBMC från humant blod. Det större formatet (96 brunnar eller 24 brunnar format) är det perfekta valet för en hög genomströmning experiment, möjliggör kompakt extracellulära flux systemet, som innehåller 8 brunnar, individuell bedömning av varje patientprov19. Denna metod är mer praktisk och kostnadseffektiv (både vad gäller själva instrumentet och de reagens som används för att utföra analysen), eftersom provtagning från olika patienter tenderar att ske vid olika tidpunkter på olika dagar.
Utnyttjandet av PBMC att bedöma mitokondriefunktion trött cancerpatienter har flera fördelar: 1) biopsi av vävnader såsom skelettmuskulaturen kan vara opraktiskt ibland; (2) PBMC finns tillgängliga och kan enkelt isoleras med cell förberedelse rör, som erbjuder en praktisk fördel i en klinisk miljö; och 3) har vi visat att mitokondriell funktion minskar efter nyligen isolerade celler har varit i kultur i mer än 3 timmar och isolera specifika celltyper vanligtvis tar flera timmar (mer än 3 timmar). PBMC kan förberedas inom en timme, vilket säkerställer noggrannheten för mätning i realtid mitokondriefunktion. Vi rekommenderar att du använder PBMC för den initiala kliniska undersökningen i tidigare uncharacterized patientgrupper, kan andra celltyper som T-lymfocyter, trombocyter, neutrofiler och monocyter också användas med det nuvarande protokollet efter optimering av plätering densitet och respiratoriska hämmare koncentrationer15,25,26.
Före testning mitokondriell funktion i ett nytt system, är det viktigt att först bestämma den optimala cell densiteten och FCCP koncentrationer. Vår erfarenhet säkerställer plating 1,5 x 105 celler per brunn att-cell densiteten efter bordläggningen och tvätt steg återstår 80-90% konfluenta. Det är dessutom viktigt att fastställa de optimala FCCP koncentrationerna för varje celltyp. Ett utbud av FCCP koncentrationer bör testas och FCCP koncentration som producerar maximal OCR utan att äventyra hälsan hos en cell ska användas. Vid de koncentrationer som testats, resulterade 1 μM av FCCP i maximal andning i PBMC. Ett annat viktigt steg är timingen av experimentet, som mitokondrie respiration droppar precipitously 3 timmar efter PBMC isolering. Detta innebär att mito stress-test bör utföras inom 3 timmar efter provtagning exakt fånga mitokondriell funktion i ett kliniskt prov. Det är värt att påpeka att många forskare har bara tillgång till frysta prover. Vi har tidigare testat PBMC efter frysning och upptining och mitokondriella funktioner av dessa celler skadas avsevärt. Därför rekommenderar vi använder färska isolerade PBMC i kliniska studier, när det är möjligt.
En annan viktig aspekt av generera reproducerbara data är metoden för datanormalisering. Medan vissa laboratorier har haft framgång med BCA protein kvantifiering för att normalisera mitokondriell respiration data, finner vi att det inte är alltid genomförbart speciellt vid en låg cell densiteten. Den normalisering metod som beskrivs i detta protokoll bygger på det linjära sambandet mellan cell nummer och fluorescens utsläpp av färgämne-nucleic acid komplexen, och kan exakt kvantifiera 10 till 50.000 celler27. Dessutom tillåter normalisering med en kombination av fluorescerande nukleinsyra fläcken och en fluorescerande Plattläsare för snabb kvantifiering av levande celler efter slutförandet av experimentet. Denna metod kräver dessutom inte trypsinization av vidhäftande celler eller använda en cell-skrapa.
En varning i protokollet är att vi inte separata PBMC till specifika celltyper innan du utför mitokondriell funktionell analys. Som vi har visat, avtar mitokondriell andningen snabbt efter PBMC isolering. Detta tyder på att skillnader mellan patienter kan vara felaktiga om experimentet utfördes efter isolera olika cellpopulationer, normalt tar ett par timmar. Trots att studera blandade populationer såsom PBMC inte avslöjar viktig cell typ-specifik information, kan information som erhållits från experiment med PBMC hjälpa guide framtida mekanistiska undersökningar fokuserade på specifika celltyper. PBMC fungera som en proxy för systemisk mitokondriell dysfunktion, som är relevanta för systemiska sjukdomar såsom cancer trötthet10,28. Protokollet beskrivs i det nuvarande manuskriptet ger endast en grov mätning av mitokondriell dysfunktion utan precisera orsaken till observationen. Därför resultaten med hjälp av denna teknik och förfarandet bör tolkas med försiktighet och måste beakta multifaktoriella natur av trötthet, såsom dess Samförekomst med andra beteenden (t.ex. depression, sömn, kognitiv svikt) och förhållanden (t.ex. hjärt status, Polyfarmaci). Framtida studier bör undersöka förändringar i mitokondriella funktioner i specifika celltyper (t.ex. naturliga mördarceller, T-lymfocyter och monocyter) och i olika kliniska populationer (t.ex. trött/icke-trött cancerpatienter och friska kontroller). Det är utanför ramen för det nuvarande manuskriptet, bestämmer vi associationerna mellan cancer trötthet svårighetsgrad och mitokondriell dysfunktion, liksom sambandet mellan mitokondriefunktion mätningar och fysiska tester av trötthet som ett 6-minuters gångtest, i framtida undersökningar. Dessutom framtida studier kommer också att granska mitokondriell dysfunktion i andra typer av cancer för att avgöra om trötthet över olika cancertyper är associerade med mitokondriell dysfunktion. Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett protokoll som optimerats för en snabb bedömning av allmänna mitokondriella dysfunktioner använda kliniska prover. Ytterligare kan mekanistiska undersökningar utföras för att lokalisera medverkan av specifika vägar i detta försvagande tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöds fullt ut av avdelningen för intern forskning av nationella institutet för omvårdnad forskning av NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).
