Summary
Ons doel was het ontwikkelen van een praktische protocol om te evalueren van de mitochondriale dysfunctie vermoeidheid bij kankerpatiënten is gekoppeld. Dit innovatieve protocol is geoptimaliseerd voor klinisch gebruik waarbij alleen standaard phlebotomy en basic Labor procedures.
Abstract
Vermoeidheid is een gemeenschappelijk en het afmatten voorwaarde dat de meeste patiënten met kanker beïnvloedt. Tot op heden, test vermoeidheid blijft slecht gekenmerkt met geen diagnostische voor objectief maatregel de ernst van deze aandoening. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor de beoordeling van de mitochondriale functie van PBMCs verzameld uit vermoeid kankerpatiënten. Met een compacte extracellulaire flux-systeem en de sequentiële injectie van respiratoire remmers, onderzochten we PBMC mitochondriale functionele status door het meten van de basale mitochondriale ademhaling en luchtwegen reservecapaciteit energie fenotype, waarin wordt beschreven het traject van de voorkeur energie om te reageren op stress. Verse PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy. De hele test beschreven in dit protocol kan worden afgerond in minder dan 4 uur zonder de betrokkenheid van complexe biochemische technieken. Daarnaast beschrijven we een normalisatie-methode die nodig is voor reproduceerbare gegevens te verkrijgen. De eenvoudige procedure en de normalisatie methoden gepresenteerd mogelijk voor herhaalde sample collectie van dezelfde patiënt en generatie van reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen de tijdstippen te evalueren van potentiële effecten van de behandeling.
Introduction
Vermoeidheid is een overwegend en pijnlijke aandoening die een negatief effect op de kwaliteit van leven van kanker patiënten1 heeft. Tot op heden, kanker vermoeidheid blijft slecht gedefinieerde en vertrouwt alleen op subjectieve rapportage door patiënten2. Daarom is er dringend behoefte aan een eenvoudig aan te passen diagnostisch laboratoriumtest objectief karakteriseren vermoeidheid in de klinische setting3,4te identificeren.
Meerdere onderliggende mechanismen, met inbegrip van de mitochondriën dysfunctie, hebben voorstellen gedaan tot vermoeidheid5. Mitochondriën zijn de krachtpatser organellen, met 95% van cellulaire energiebehoefte via oxidatieve fosforylatie, en een belangrijke rol spelen bij calcium signalering, apoptosis, immuun signalering en regulering van de andere intracellulaire signalering gebeurtenissen6 . Dienovereenkomstig, verminderde mitochondriale Bioenergetica en gebreken in de energieproductie kunnen bijdragen aan vermoeidheid. Ter ondersteuning van deze hypothese, hebben vorige studies waargenomen mutaties in het mitochondriaal DNA bij patiënten met chronische vermoeidheid syndroom7. Terwijl het blijft onduidelijk of de pathofysiologische oorsprong van vermoeidheid ligt binnen het centrale zenuwstelsel of perifere weefsels, zoals skeletspieren8,9, is er momenteel geen directe methode om nauwkeurig beoordelen mitochondriale dysfunctie gerelateerde tot vermoeidheid in live, respiring cellen.
Met behulp van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te bestuderen van mitochondriale functie biedt een aantal voordelen. Eerst PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy en kunnen worden geïsoleerd snel met behulp van eenvoudige laboratoriumtechnieken. Ten tweede, is de bloedinzameling minder invasief dan het verzamelen van andere weefsels zoals een biopsie van spier. Zo kunnen bloedmonsters worden verzameld uit de dezelfde patiënt herhaaldelijk na verloop van tijd, dat longitudinale beoordeling van de effecten van de behandeling vergemakkelijkt. Interessant, leek mitochondriale functie in PBMCs te worden goed gecorreleerd met nier mitochondriale status in een diermodel10. Bovendien hebben immuun cel mitochondriën is gebruikt als een proxy voor het opsporen van systemische veranderingen onder andere ziekte voorwaarden11,12. Mitochondriën in circulerende immune cellen zijn vooral gevoelig voor veranderingen in immuun functies en immuun signalering van moleculen zoals cytokines13,14,15. Men heeft bijvoorbeeld opgemerkt dat PBMCs van patiënten met acute reumatische inflammatoire ziekten hoge basislijn zuurstof verbruik14 vertonen. Daarentegen was zuurstofverbruik in PBMCs geïsoleerd van patiënten met systemische inflammatoire voorwaarden waaronder sepsis16verlaagd. Inflammatoire voorwaarden, kunnen de vrije radicalen geproduceerd door disfunctionele mitochondriën verder bijdragen tot verhoogde oxidatieve stress en langdurige ontsteking17. De centrale rol van mitochondria in de productie van de energie zo goed zoals in oxidatieve stress suggereert het potentiële nut van het gebruik van mitochondriale functie als een proxy voor de studie van vermoeidheid in kanker patiënten 13.
Eerdere studies onderzoeken van mitochondriale functie gebruikt biochemische technieken, mitochondriale membraan potentiële meting of isolatie van specifieke cel populaties die niet mag gemakkelijk aanpasbaar in de klinische setting5, 14,18. In de afgelopen jaren de ontwikkeling van extracellulaire flux tests hebben onderzoekers gemakkelijk en nauwkeurig onderzoeken van wijzigingen in zuurstof verbruik tarief (OCR) in reactie op geautomatiseerde injecties van respiratoire remmers19,20 , 21 , 22. echter, de meeste van deze studies zijn ontworpen voor specifieke celtypes en het grote formaat van de hoge gegevensdoorvoer mogelijk niet van toepassing in een klinische setting. In dit manuscript beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de behandeling van mitochondriale functie voor klinisch gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie (NCT00852111) werd goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van de National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Deelnemers ingeschreven in deze studie werden euthymic mannen, 18 jaar of ouder, die niet-gemetastaseerd prostaatkanker met of zonder voorafgaande prostatectomie werden gediagnosticeerd en waren gepland om te ontvangen van de lichtbundel van de externe radiotherapie (EBRT). Potentiële deelnemers waren uitgesloten indien zij had een progressieve ziekte die leiden grote vermoeidheid tot kan, psychiatrische ziekte binnen de afgelopen vijf jaar had, had ongecorrigeerd hypothyreoïdie of bloedarmoede, of had een tweede maligniteit. Personen die sedativa, steroïden of niet-steroïdale anti-inflammatoire agenten gebruikte werden ook uitgesloten. Gezonde controle werden bloedmonsters bij de NIH departement van transfusiegeneeskunde van gezonde donoren onder een IRB-goedgekeurde protocol (NCT00001846). Alle deelnemers worden gerekruteerd bij de Magnuson Clinical Research Center op de NIH. Ondertekende schriftelijke geïnformeerde toestemming zijn verkregen vóór deelname van de studie.
1. de mitochondriale functie meting voorbereiding (dag 1 van het Experiment)
- Hydrate Sensor Cartridge (Zie Tabel of Materials; geschatte duur: 5 minuten).
- Sensor Cartridge uit pakket verwijderen. Voeg 200 μl kalibrant oplossing in elk putje van de plaat hulpprogramma, vul dan elke gracht met 400 μL kalibrant oplossing.
- Sensor plaat terug naar de utility-plaat, die inmiddels kalibrant oplossing erin. Hydrateer de Cartridge in een niet-CO2 -37 ° C incubator's nachts.
Opmerking: Sensor Cartridge moet worden gehydrateerd voor een minimum van 4 uur en een maximum van 72 uur.
2. klinische monstervoorbereiding (dag 2 van het Experiment)
- Meten van vermoeidheid met behulp van de 13-item functionele beoordeling van chronische ziekte therapie - vermoeidheid (FACIT-F)2,23,24 op basislijn (vóór EBRT initiatie), middelpunt en voltooiing van EBRT, en de 1-jarige post-EBRT.
- Gebruik een 0 - 4 schaal voor elk item antwoord, waar een 0 geeft aan dat "helemaal niet" en een 4 geeft aan dat de verweerder heeft betrekking op de overeenkomstige instructie "heel erg." Totaalscores moeten variëren van 16-53, met lagere scores als gevolg van hoge vermoeidheid intensiteit.
- Vermoeidheid als een FACIT-F-score lager dan 43, met een score van de FACIT-F van ≥43 aangeeft, ontbreken van of niet klinisch-zinvol vermoeidheid2definiëren.
Opmerking: Een score FACIT-F van 43 beste verdeelt vermoeidheid scores van kankerpatiënten en de algemene bevolking2. - De volgende 13 items worden opgenomen in de FACIT vermoeidheid schaal: 1) ik voel me vermoeid; 2) Ik voel me zwak helemaal; 3) Ik voel me lusteloos ("gewassen"); 4) Ik voel me moe; 5) ik problemen ondervindt bij het starten van dingen, want ik moe ben; 6) ik problemen ondervindt bij het afwerken van dingen, want ik moe ben; 7) Ik heb energie; 8) Ik ben in staat om te doen van mijn gebruikelijke activiteit; 9) Ik nodig om te slapen tijdens de dag; 10) Ik ben te moe om te eten; 11) behoeftehulp van I doen van mijn gebruikelijke activiteiten; 12) Ik ben gefrustreerd door het wordt te moe om te doen de dingen die ik wil doen; en 13) ik moet mijn sociale activiteit te beperken omdat ik moe ben.
- PBMC isoleren van vers verzameld bloedmonsters (geschatte duur: 1 uur).
- Verzamelen van 8 mL bloed in een mononucleaire cellen Preparation Tube (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Bloedmonsters moeten worden verwerkt binnen 2 uur van collectie. De kwaliteit van PBMCs kan worden aangetast als bloedmonsters meer dan 2 uur na sample collectie verwerkt worden. - Centrifugeer bij 1.750 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C). De bewolkte laag overbrengen in een conische tube van 15 mL. Voeg maximaal 15 mL PBS en 5 keer omkeren.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant zonder storende pellet. Resuspendeer de pellet door tot 10 mL PBS toe te voegen, en 5 keer omkeren.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Negeren van vloeibare supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS. De PBMCs overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis.
- Centrifugeer bij 610 x g gedurende 10 minuten. Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet in volledige RPMI-1640 (RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10 mM penicilline/streptomycine).
- Verzamelen van 8 mL bloed in een mononucleaire cellen Preparation Tube (Zie Tabel van materialen).
- Jas van cel platen voor niet-aanhanger cellen (geschatte duur: 30 min).
- Bereiden van cel- en weefseltransplantaties zelfklevende oplossing (Zie Tabel van materialen) door verdunning van de stockoplossing in 0,1 M natriumbicarbonaat pH 8,0. De werkoplossing dient bij 3.5 μg/cm2 van oppervlakte.
Opmerking: Deze oplossing bevat polyphenolic eiwitten de mariene Mossel, Mytilus edulisis onttrokken. Deze eiwitten zijn belangrijke onderdelen van de lijm uitgescheiden door de Mossel om zelf op oppervlakken te verankeren. Wij vinden dat cel-Tak het beste met PBMCs werkt. - Voeg 100 μl van de verdunde lijm oplossing aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel driemaal met DI water en lucht droog.
- Bereiden van cel- en weefseltransplantaties zelfklevende oplossing (Zie Tabel van materialen) door verdunning van de stockoplossing in 0,1 M natriumbicarbonaat pH 8,0. De werkoplossing dient bij 3.5 μg/cm2 van oppervlakte.
3. mitochondriale functie meting
- Voorbereiding van Assay Media (geschatte duur: 10 min).
Opmerking: Assay media moet vers worden bereid op de dag van het experiment.- L-glutamine, pyruvaat en glucose naar de basis van de media (de dezelfde bestanddelen als de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM), maar zonder natrium-bicarbonaat, glucose, glutamine, of natrium pyruvaat) zodat assay media toevoegen. Media opwarmen tot 37 ° C, pH aan 7.4 vervolgens aanpassen.
Opmerking: Concentraties van L-glutamine, glucose en pyruvaat zijn meestal hetzelfde als concentraties in normale groeiomstandigheden en media, maar kunnen worden aangepast op basis van de bepaling.
- L-glutamine, pyruvaat en glucose naar de basis van de media (de dezelfde bestanddelen als de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM), maar zonder natrium-bicarbonaat, glucose, glutamine, of natrium pyruvaat) zodat assay media toevoegen. Media opwarmen tot 37 ° C, pH aan 7.4 vervolgens aanpassen.
- PBMCs voorbereiden op de Mito Stress-test (geschatte duur: 2 h).
- Plaat genoeg PBMCs uit stap 2 in elk putje 80-90% confluentie bereiken. In onze ervaring, 1.5 x 105 cellen/well de meest consistente resultaten opgeleverd.
Opmerking: Wells A en H zijn achtergrond putten en mag alleen assay media met geen cellen bevatten. In putten B tot en met G, is het raadzaam minimaal 3-6 wells per patiënt monster plating om rekening voor uitschieters. - Spin platen neer bij 200 x g gedurende 2 min aan cellen vast te houden aan de onderkant van de putten toestaan. Wassen van de cellen een keer met Assay media. Deze stap verwijdert serum en natriumbicarbonaat uit de media groei.
Opmerking: In onze ervaring, het wassen stap meestal verwijdert 20-30% van de cellen. - 180 μL Assay media toevoegen aan elk putje, met inbegrip van achtergrond wells A en H. Incubate in een niet-CO2 -37 ° C incubator voor 45-60 min.
- Plaat genoeg PBMCs uit stap 2 in elk putje 80-90% confluentie bereiken. In onze ervaring, 1.5 x 105 cellen/well de meest consistente resultaten opgeleverd.
- De Mito stresstest uitvoeren
- Reconstrueren drugs in de Mito Stress Kit met assay media als volgt:
- Oligomycin: Voeg 252 μL assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing bij 50 μM.
- FCCP: Voeg 288 μL van assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing bij 50 μM.
- Antimycin A / rotenon: 216 toevoegen μL van assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing op 25 μM.
- Vortex gereconstitueerd drugs voor ongeveer 1 minuut. Verdun in werkende oplossingen.
Opmerking: Concentraties van de werkoplossing moeten worden getitreerd en vooraf bepaalde voorafgaand aan het experiment afhankelijk van het celtype. Voor PBMCs, vinden we dat 1 μM van Oligomycin, 1 μM FCCP en 0,5 μM antimycin A / rotenon werken het beste. - Pipetteer de drugs in elke haven in de sensor patroon opeenvolgend:
- Haven A: Pipetteer 20 μL van 10 μM Oligomycin, voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 1 μM.
- Poort B: Pipetteer 22 μL van 10 μM FCCP, voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 1 μM.
- Haven C: Pipetteer 25 μL van 5 μM antimycin A / rotenon voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 0,5 μM.
- Reconstrueren drugs in de Mito Stress Kit met assay media als volgt:
- Selecteer "Mito Stress Test" op een instrument dat extracellulaire flux. Volg instrument prompt en plaats de sensor cartridge. Het instrument zal automatisch sensor kalibratie uit te voeren. Voeg cel plaat nadat sensor kalibratie, en het instrument zal de rest van de bepaling. Dynamiek van de zuurstof wordt gemeten op 530 nm (excitatie) / 650nm (emissie), en proton-concentratie wordt gemeten op 470 nm (excitatie) / 530 nm (emissie).
4. normalisatie van mitochondriale functie gegevens
- Bereid cel proliferatie Assay-oplossing (geschatte duur: 5 minuten).
- 48 μl nucleïnezuur vlek (500 x) en 240 μL achtergrond suppressor toevoegen aan 11,7 mL PBS (2 x). De vlek nucleïnezuur is een cel-permeant DNA-bindende kleurstof en de achtergrond suppressor is een maskeren kleurstof die dode cellen of cellen met gekraakte celmembraan integriteit van gekleurd wordt geblokkeerd. De combinatie van de DNA-bindende kleurstof en de achtergrond suppressor zorgt ervoor dat alleen levende cellen zijn gekleurd.
- Voeg gelijk volume 2 x werkoplossing (180 μL) direct in het medium in elk putje nadat de Mito Stress-Test is voltooid.
- Incubeer de cellen in het bijzijn van cel proliferatie assay oplossing in een 37 ° C incubator voor 45-60 min. Quantify het aantal levende cellen (TL) op een afleesapparaat op 508 nm (excitatie) / 527 nm (emissie) en normaliseren van OCR-gegevens (geschatte duur: 10 min) .
Opmerking: naast het aantal levende cellen, gebruikers kunnen ook kiezen om te normaliseren hun gegevens met het totale aantal cellen, het bedrag van nucleic zuur, eiwit-concentratie, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Mito Stress Test berust op het meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) na sequentiële injectie van verschillende respiratoire remmers een compleet mitochondriale profiel toewijzen. OCR metingen na de injectie van elke drug kan worden gebruikt voor het berekenen van de volgende parameters in verband met mitochondriale gezondheid: Basale OCR wordt eerst gemeten vóór elke drug injectie te beoordelen zuurstofverbruik nodig om te voldoen aan niveau ATP vraag rusten. Basale ademhaling wordt berekend door aftrekken van de niet-mitochondriale ademhalingsfrequentie vanaf basislijn OCR vóór oligomycin injectie. Oligomycin wordt vervolgens geïnjecteerd om te remmen het proton-kanaal van de ATP-synthase (complexe V). De daaropvolgende afname van de OCR na oligomycin injectie vertegenwoordigt ATP productie-gerelateerde zuurstofverbruik. FCCP (Carbonyl cyanide 4-[trifluormethoxy] phenylhydrazone), een ionophore gebruikt voor het verstoren van de proton kleurovergang en mitochondriaal membraanpotentiaal, wordt vervolgens gebruikt voor het uitlokken van maximaal zuurstofverbruik. Maximale ademhaling wordt berekend door aftrekken van de niet-mitochondriale ademhaling van de maximale OCR na FCCP injectie. Respiratoire reservecapaciteit is het verschil tussen maximale en basale ademhaling. Tot slot, een (complexe III-remmer) antimycin en rotenon (complexe ik remmer) op hetzelfde moment te sluiten uit de keten elektronentransport worden geïnjecteerd. Per definitie, niet-mitochondriale ademhaling is onafhankelijk van het elektronentransport keten (bijvoorbeeld niet-mitochondriale NADPH oxidase in macrofagen, enz.) en wordt vertegenwoordigd als OCR waarden na antimycin A / rotenon injectie. Koppeling van de efficiëntie wordt beschreven van de Fractie van de basale mitochondriale zuurstofverbruik gebruikt voor ATP-synthese, en wordt berekend als 100% x (ATP productie-gerelateerde OCR) /(basal respiration rate).
Celdichtheid voor elke kweken voorwaarde moet worden geoptimaliseerd voor het uitvoeren van een stresstest mito. In onze ervaring, wordt 80-90% confluentie bereikt door plating 1.5 x 105 cellen/putje van vers geïsoleerde PBMCs uit menselijk bloed(Figuur 1). Deze beplating dichtheid is verantwoordelijk voor het wassen stap beschreven in stap 3.2.3. Naast het bepalen van de optimale plating-dichtheid, moet FCCP titratie worden uitgevoerd om te bepalen van de concentratie die nodig is voor het genereren van maximale OCR. Op de FCCP concentraties getest - 0,125 μM, 0.25 μM, 0,5 μM, 1 μM en 2 μM - OCR verhoogd met de FCCP concentratie bereikt een plateau op 1 μM, maar daalde op 2 μM (Figuur 1B). Dit geeft aan dat 1 μM is de optimale concentratie van de FCCP die moet worden gebruikt voor de behandeling van PBMC mitochondriale functie.
We testten mitochondriale functie van dezelfde batch van cellen uit hetzelfde bloedmonster verzameld van een gezonde donor op verschillende tijdstippen na PBMC isolatie. Basale zuurstofverbruik evenals maximale OCR daalde zo vroeg als 3 h en bleef dalen op 5 en 8 h na PBMC isolatie(Figuur 2). Na 3U, maximale ademhaling ontlokte door FCCP injectie (tijd punten 7-9) niet meer dan basale OCR, suggereren dat zelfs in levende cellen, de mitochondriën respiratoire capaciteit daalt snel na verloop van tijd sparen. Extracellulaire verzuring tarief (ECAR) werd gelijktijdig gemeten over een extracellulaire flux-instrument. Aangezien oligomycin mitochondriale ATP-synthase remt, is glycolyse aangeworven binnen minuten om te voldoen aan de vraag naar energie en om te compenseren voor het ontbreken van de ATP productie via oxidatieve fosforylatie, zoals blijkt uit de snelle toename ECAR na oligomycin injectie. Zo spoedig 3 h na PBMC isolatie, werd er een afname van de ECAR evenals OCR (Figuur 2B). Hoewel we een opmerkelijke wijziging niet in de levensvatbaarheid van de cellen op 1, 3, 5 en 8 h na PBMC isolatie waarnemen deed, mitochondriale functie daalde snel, wat suggereert dat timing is de sleutel tot het vastleggen van de mitochondriale Profiel van live, respiring PBMCs.
Patiënt monstercollecties neiging om optreden op verschillende tijdstippen op verschillende dagen; het is dus cruciaal voor het normaliseren van de gegevens om te vergelijken verschillende monsters en tijd punten. Terwijl andere normalisatie methoden zoals eiwit assay en nucleïnezuur kwantificering kan worden gebruikt, vinden we dat kleuring van levende cellen met een DNA-bindende kleurstof en kwantificering van groene fluorescerende cellen in elk putje de meest efficiënte en betrouwbare normalisatie is methode. Representatieve gegevens van PBMCs verzameld van twee verschillende gezonde donoren op twee verschillende dagen zijn afgebeeld in Figuur 3. Inzet is een representatief beeld van een plaat van de cel goed weergegeven: totaal aantal cellen (fase contrast) en levende cellen gekleurd met de DNA-bindende kleurstof (groen fluorescent) na mito stress test. Basale zuurstof verbruik tarief, alsook zuurstofverbruik na elke drug injectie genormaliseerd naar levende cellen waren vergelijkbaar in twee verschillende gezonde niet-vermoeid donoren (Figuur 3).
Representatieve mitochondriale functie gegevens van een vermoeid onderwerp (FACIT-F score < 43) met prostaatkanker (rood) en een leeftijd/geslacht/race-matched niet-vermoeid gezonde donor (blauw) worden weergegeven in Figuur 4. Hoewel we deed niet zien geen verschil in de basale OCR (Figuur 4,B), daalde het vermoeid onderwerp tentoongesteld maximale zuurstofverbruik evenals respiratoire reservecapaciteit ten opzichte van het besturingselement (Figuur 4C, D). Vermoeidheid leek te worden gerelateerd aan de vermindering van in de luchtwegen reservecapaciteit, want er waren geen verschillen gevonden in niet-mitochondriale zuurstofverbruik (Figuur 4E), ATP-gerelateerde zuurstofverbruik (Figuur 4F), of koppeling efficiëntie (Figuur 4G). Basislijngegevens (voorafgaand aan een drug-injectie) en maximale ademhaling na FCCP injectie kan worden gevisualiseerd met behulp van een energie fenotype plot, die de voorkeur traject (OCR oxidatieve fosforylatie versus ECAR glycolyse onthult) in aanwezigheid van steeg energievraag (Figuur 4H). Lege vakjes geven basale energie fenotype en solide pleinen geven het fenotype van de energie in reactie op maximale ATP vraag. De afstand tussen de basale (leeg plein) en maximale (effen vierkantje) geeft vrije capaciteit, terwijl de helling cellulaire voorkeur voor oxidatieve fosforylatie versus glycolyse aangeeft. Zoals aangetoond in Figuur 4H, reservecapaciteit in het onderwerp van de vermoeidheid daalde ten opzichte van de niet-vermoeid gezonde controle. Daarnaast verhoogd het fenotype van de energie in reactie op ATP vraag scheef naar glycolyse in de vermoeid onderwerp in vergelijking met de gezonde controle (Figuur 4H).
Figuur 1 : PBMC plating dichtheid en FCCP dosis - responscurve. (A) vers geïsoleerd waren PBMCs uitplaten aan 1.5 x 105 cellen/well in cel CellTak beklede cultuur miniplates. Na het wassen en media wijzigen, cellen werden gelijkmatig verdeeld op 80-90% confluentie. Schaal bar = 100 μm. (B) OCR verhoogd met toenemende concentraties van FCCP bij 0,125 μM, 0.25 μM, 0,5 μM, bereiken peak OCR op 1 μM. OCR liet op 2 μM, die aangeeft dat 1 μM is de optimale dosis te verduidelijken met maximale ademhaling in PBMCs.Error balken geven de standaarddeviatie van 3 opeenvolgende metingen na de injectie van de eerste drug. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Mitochondriale ademhaling vermindert na verloop van tijd in vers geïsoleerde PBMCs. OCR (A) evenals ECAR (B) daalde snel na verloop van tijd na PBMC isolatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Vertegenwoordiger mitochondriale ademhaling gegevens met normalisatie. Mito stresstest werd uitgevoerd met behulp van verse PBMCs geïsoleerd van twee verschillende gezonde vrijwilligers op verschillende dagen en genormaliseerd met behulp van een fluorescerende nucleïnezuur vlek gekwantificeerd op een TL-afleesapparaat. Inzet: een representatief beeld van levende cellen (groen) en total cellen (fase contrast) in een put. Schaal bar = 1.000 μm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatieve analyse van een vermoeid onderwerp in vergelijking met een gezonde controle. (A) representatieve Mito Stress test OCR grafiek van een vermoeid onderwerp ten opzichte van een leeftijd/geslacht/race-matched niet-vermoeid gezonde besturingselement. Bar grafieken van basale OCR (B), maximale ademhaling (C), sparen respiratoire capaciteit (D), niet-mitochondriale zuurstofverbruik (E), productie van ATP (F)en koppeling efficiëntie (G) worden weergegeven. De energie fenotype plot van het vermoeid onderwerp en gezonde besturingselement wordt weergegeven (H). Lege vakjes aangeven basislijn energie fenotype, solide pleinen vertegenwoordigen gestresst energie fenotype gemeten na FCCP injectie. Foutbalken geven standaarddeviatie van 3 verschillende putten voor elke deelnemer van de studie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vermoeidheid bij kankerpatiënten is een invaliderende aandoening die is niet goed gedefinieerd of1gekenmerkt. Diagnose van vermoeidheid is volledig gebaseerd op subjectieve rapportage en er is geen huidige diagnostische standaard of behandeling voor deze aandoening, grotendeels te wijten aan een gebrek aan inzicht in de pathobiology2. Van de voorgestelde mechanismen ten grondslag liggen aan de vermoeidheid bij kankerpatiënten, is bijzondere waardeverminderingen in mitochondriale functie een van de meest therapeutische targetable trajecten. Daarom ontwikkelden we een snelle en praktische methode voor het meten van mitochondriale functie in klinische monsters die kan worden gebruikt voor het proactief identificeren van patiënten risicogroepen voor het ontwikkelen van kanker behandeling-gerelateerde toxicities met inbegrip van vermoeidheid, dus dat vroeg beheer kan worden aangespannen.
De extracellulaire flux-technologie in combinatie met sequentiële injectie van respiratoire remmers toestaan voor beoordeling van mitochondriale functionele toestand en heeft geweest tweedehands voor beide in vitro en in vivo modellen19, 20,21. We uitgebreid de bestaande hoeveelheid werk en ontwikkelde een methode die is geoptimaliseerd voor onderzoek van mitochondriale dysfunctie in klinische monsters. Een voordeel van de studie is het gebruik van de compacte extracellulaire flux-analyzer. Zoals we hebben aangetoond, is timing van het experiment van cruciaal belang na isolatie van verse PBMCs uit menselijk bloed. Terwijl het grotere formaat (96-Wells- of 24-well formaat) de ideale keuze voor een hoge doorvoersnelheid experiment is, zorgt de compacte extracellulaire flux-systeem, waarin 8 putten, voor individuele beoordeling van elke patiënt monster19. Deze methode is meer praktisch en kostenbesparend (zowel met betrekking tot het instrument zelf en de reagentia gebruikt voor het uitvoeren van de test), omdat sample collectie van verschillende patiënten de neiging om het optreden op verschillende tijdstippen op verschillende dagen.
Het gebruik van PBMCs te beoordelen van mitochondriale functie in vermoeid kankerpatiënten heeft verschillende voordelen: 1) biopsie van weefsels, zoals skeletspieren mogelijk onpraktisch soms; 2) PBMCs zijn direct beschikbaar en kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd met behulp van cel voorbereiding buizen, die biedt een praktische voordeel in een klinische setting; en 3) we hebben aangetoond dat mitochondriale functie afneemt nadat vers geïsoleerde cellen in cultuur gedurende meer dan 3 uur zijn en isoleren van specifieke celtypes meestal enkele uren (meer dan 3 uur duurt). PBMCs kunnen bereid worden binnen een uur, zodat de nauwkeurigheid van de meting van real-time mitochondriale functie. Terwijl het is raadzaam PBMCs te gebruiken voor de eerste klinisch onderzoek in eerder genfunctieonderzoek patiënt populaties, kunnen andere celtypes zoals T lymfocyten, trombocyten neutrofiele granulocyten en monocyten ook worden gebruikt met het huidige protocol na optimalisatie van plating dichtheid en respiratoire remmer concentraties15,25,26.
Voorafgaand aan het testen van mitochondriale functie in een nieuw systeem, is het belangrijk om eerst de optimale celdichtheid en FCCP concentraties. In onze ervaring, plating 1.5 x 105 cellen per putje zorgt ervoor dat de celdichtheid na beplating en het wassen stap blijft 80-90% heuvels. Daarnaast, is het cruciaal om te bepalen van de optimale FCCP concentraties voor elk celtype. Een bereik van FCCP concentraties moeten worden getest en de concentratie van de FCCP die maximale OCR produceert zonder afbreuk te doen aan de gezondheid van een cel moet worden gebruikt. Bij de concentraties getest, resulteerde 1 μM van FCCP in maximale ademhaling in PBMCs. Een andere belangrijke stap is de timing van het experiment, als mitochondriale ademhaling drops plotsklaps 3 uur na PBMC isolatie. Dit betekent dat de mito stress-test moet worden uitgevoerd binnen 3 uur na sample collectie nauwkeurig vastleggen mitochondriale functie in een klinisch monster. Het is de moeite waard erop te wijzen dat veel onderzoekers alleen toegang tot bevroren monsters hebben. We hebben eerder PBMCs getest na bevriezen en ontdooien, en de mitochondriale functies van deze cellen zijn sterk aangetast. Daarom is het raadzaam met behulp van vers geïsoleerd PBMCs in klinische studies, wanneer het mogelijk is.
Een ander belangrijk aspect van het genereren van reproduceerbare gegevens is de methode van gegevens normaliseren. Hoewel sommige laboratoria hebben gehad succes met behulp van BCA eiwit kwantificering te normaliseren van de gegevens van de mitochondriale ademhaling, vinden we dat het is niet altijd haalbaar vooral bij een laag celdichtheid. De in dit protocol beschreven methode van normalisatie is afhankelijk van de lineaire correlatie tussen cel nummers en de uitstoot van de fluorescentie van de kleurstof-nucleic zuur complexen, en kan nauwkeurig het kwantificeren van 10 tot 50.000 cellen27. Normalisatie met behulp van een combinatie van fluorescent nucleïnezuur vlek en een TL-afleesapparaat voorziet bovendien in snelle kwantificering van levende cellen na afloop van het experiment. Deze methode vereist bovendien geen trypsinebehandeling of Adherente cellen met behulp van een cel schraper.
Een waarschuwing van het protocol is dat we niet PBMCs in specifieke celtypes scheiden doen alvorens mitochondriale functionele analyse uit te voeren. Zoals we hebben aangetoond, mitochondriale ademhaling neemt snel af na verloop van tijd na PBMC isolatie. Dit suggereert dat de verschillen tussen patiënten verkeerde resultaten opleveren kunnen wanneer het experiment werd uitgevoerd na isoleren van andere cel populaties, die duurt meestal een paar uur. Hoewel bestuderen van gemengde bevolkingsgroepen zoals PBMCs belangrijk cell type-specifieke informatie niet onthullen, kan experimenten met behulp van PBMCs verkregen informatie helpen gids toekomstige mechanistisch onderzoek gericht op specifieke celtypes. PBMCs dienen als een proxy voor systemische mitochondriale dysfunctie, die relevant is voor systemische aandoeningen zoals kanker vermoeidheid10,28. Het protocol wordt beschreven in het huidige manuscript biedt alleen een ruwe meting van mitochondriale dysfunctie zonder de oorzaak van de observatie aanwijzen. Daarom bevindingen met behulp van deze technologie en de procedure moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en moeten nadenken over de multifactoriële aard van vermoeidheid, zoals deze mede zich voordoet met andere gedragingen (bijvoorbeeld depressie, slaap, cognitieve stoornissen) en voorwaarden (bijvoorbeeld cardiopulmonale status, Polyfarmacie). Toekomstige studies moeten wijzigingen in de mitochondriale functies in specifieke celtypen (bijvoorbeeld natural killer cellen, T lymfocyten en monocyten) en in diverse klinische populaties onderzoeken (bijvoorbeeld vermoeid/niet-vermoeid kankerpatiënten en gezonde controles). Terwijl het valt buiten het bestek van het huidige manuscript, bepalen wij de associaties tussen kanker vermoeidheid ernst en mitochondriale dysfunctie, evenals de correlatie tussen de mitochondriale functie metingen en fysieke testen van vermoeidheid zoals een 6 minuten-test, in de toekomst onderzoeken. Bovendien zal de toekomstige studies mitochondriale dysfunctie in andere soorten kanker ook onderzoeken om te bepalen of de vermoeidheid over de verschillende soorten van kanker geassocieerd met mitochondriale dysfunctie is. Tot slot hebben we een protocol dat is geoptimaliseerd voor een snelle beoordeling van algemene mitochondriale stoornissen met behulp van klinische monsters. Verder kunnen mechanistisch onderzoek worden verricht om aan te wijzen van de betrokkenheid van specifieke studierichtingen in deze invaliderende aandoening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie is volledig ondersteund door de divisie van intramurale onderzoek van het National Institute of Nursing Research van de NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).
