Summary
أن هدفنا وضع بروتوكول عملي لتقييم خلل mitochondrial المرتبطة بالتعب في مرضى السرطان. هذا البروتوكول المبتكرة هو الأمثل بالفصاده فقط القياسية التي تشمل الاستخدام السريري والإجراءات المختبرية الأساسية.
Abstract
التعب هي مشتركة وموهنة شرط أن يؤثر على معظم مرضى السرطان. وحتى الآن، اختبار التعب تظل ضعيفة تتسم لا تشخيص موضوعيا قياس شدة هذا الشرط. هنا يصف لنا أسلوب أمثل لتقييم الوظيفة المتقدرية من ببمكس التي جمعت من مرضى السرطان يعانون من الإجهاد. باستخدام نظام الجريان خارج الخلية المدمجة وحقن متسلسلة من مثبطات الجهاز التنفسي، قمنا بفحص الحالة الوظيفية المتقدرية PBMC بقياس التنفس المتقدرية القاعدية، وقطع غيار القدرات التنفسية، والنمط الظاهري في الطاقة، الذي يصف مسار الطاقة المفضل الاستجابة للتأكيد. ببمكس الطازجة متوفرة بسهولة في الإعداد السريرية باستخدام ضمادة القياسية. فحص كامل الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن تكتمل في أقل من 4 ساعات دون مشاركة التقنيات الكيميائية الحيوية المعقدة. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا طريقة تطبيع ما ضروري للحصول على البيانات القابلة لإعادة الإنشاء. الأساليب الإجرائية وتطبيع بسيطة عرضت السماح لجمع العينات المتكررة من نفس المريض وجيل من استنساخه من البيانات التي يمكن مقارنتها بين النقاط الزمنية لتقييم آثار العلاج المحتملة.
Introduction
التعب هو شرط انتشارا والمؤلم أن يخلف أثرا سلبيا على نوعية الحياة ل مرضى السرطان1. حتى هذا التاريخ، ما زال غير المحددة بوضوح التعب السرطان وتعتمد فقط على التقارير الذاتية بالمرضى2. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتحديد اختبار تشخيص المختبري يمكن تكييفها بسهولة لموضوعي تميز التعب في الإعداد السريرية3،4.
واقترحت الآليات الكامنة متعددة، بما في ذلك خلل الميتوكوندريا، تسبب التعب5. الميتوكوندريا هي العضيات قوة، توفير 95 في المائة احتياجات الطاقة الخلوية عن طريق الفسفرة، وتلعب دوراً هاما في إشارات الكالسيوم والمبرمج، مما يشير إلى المناعة وتنظيم أحداث أخرى داخل الخلايا مما يشير إلى6 . وبناء على ذلك، قد يسهم الاستقلاب المتقدرية البصر والعيوب في إنتاج الطاقة التعب. دعم هذه الفرضية، لاحظنا الدراسات السابقة طفرات في الحمض النووي في المرضى الذين يعانون من متلازمة التعب المزمن7. في حين أنه لم يتضح بعد ما إذا كان أصل الفيزيولوجية المرضية للتعب يكمن داخل الجهاز العصبي المركزي أو في الأنسجة المحيطية، مثل عضلات الهيكل العظمى8،9، يوجد حاليا لا توجد طريقة مباشرة إجراء تقييم دقيق خلل mitochondrial المتصلة بالتعب في الخلايا الحية، ريسبيرينج.
ويوفر العديد من المزايا باستخدام خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) لدراسة الوظيفة المتقدرية. أولاً، ببمكس متوفرة بسهولة في الإعداد السريرية باستخدام ضمادة القياسية، ويمكن أن تكون معزولة بسرعة باستخدام التقنيات المختبرية الأساسية. وثانيا، جمع الدم أقل الغازية من جمع أنسجة أخرى مثل خزعة العضلات. وهكذا، عينات الدم يمكن جمعها من المريض نفسه مرارا وتكرارا على مر الزمن، مما يسهل تقييم طولية من آثار العلاج. من المثير للاهتمام، يبدو الوظيفة المتقدرية في ببمكس يكون ارتباطاً جيدا مع مركز الكلي المتقدرية في نموذج حيوان10. وعلاوة على ذلك، استخدمت الميتوكوندريا الخلايا المناعية كوكيل للكشف عن التغييرات النظامية تحت المرض مختلف الظروف11،12. الميتوكوندريا في تعميم الخلايا المناعية خاصة حساسة للتغيرات في وظائف المناعة والمناعة مما يشير إلى جزيئات مثل السيتوكينات13،،من1415. على سبيل المثال، لوحظ أن ببمكس من المرضى الذين يعانون من أمراض التهابات الروماتيزمية الحادة يحمل الأساس ارتفاع استهلاك الأوكسجين14. وفي المقابل، انخفض استهلاك الأكسجين في ببمكس المعزولة من المرضى مع الجهازية الظروف الملتهبة بما في ذلك الانتان16. تحت ظروف التحريضية، والجذور الحرة التي تنتجها الميتوكوندريا مختلة قد يسهم مرتفعة الأكسدة والالتهاب المطول17. الدور المركزي الميتوكوندريا في إنتاج الطاقة فضلا عن الأكسدة يوحي بالفائدة المحتملة من استخدام الوظيفة المتقدرية كوكيل لدراسة التعب في مرضى السرطان 13.
الدراسات السابقة دراسة الوظيفة المتقدرية تستخدم تقنيات الكيمياء الحيوية، قياس محتمل غشاء الميتوكوندريا أو عزل السكان خلية معينة قد لا تكون سهولة التكيف في الإعداد السريرية5، 14،18. في السنوات الأخيرة، وضع فحوصات الجريان خارج الخلية قد أتاح الباحثون بسهولة ودقة دراسة التغيرات في معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) استجابة للحقن الآلي لمثبطات الجهاز التنفسي19،20 , 21 , 22-ومع ذلك، صممت معظم هذه الدراسات لأنواع محددة من الخلايا وقد لا تنطبق في إعداد سريرية شكل كبير الفائق. في هذه المخطوطة، يصف لنا بروتوكولا أمثل لدراسة الوظيفة المتقدرية للاستخدام السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة الحالية (NCT00852111) بالمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) للوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة)، بيثيسدا، ماريلاند. المشاركين المسجلين في هذه الدراسة من الرجال يوثيميك، 18 سنة من العمر أو الأكبر سنا، الذين تم تشخيص سرطان البروستاتا غير المنتشر مع أو بدون عملية استئصال غدة البروستاتا السابقة، وكان من المقرر أن تتلقى العلاج الإشعاعي شعاع خارجي (إبرت). تم استبعاد المشاركين المحتملين إذا كان لديهم مرض تقدمية التي يمكن أن تسبب التعب الكبير، كان المرض النفسي خلال السنوات الخمس الماضية، كان الغدة الدرقية التي لم يتم تصحيحها أو فقر الدم، أو كانت خبيثة ثانية. كما تم استبعاد الأفراد الذين استخدموا المهدئات أو المنشطات أو العوامل المضادة للالتهابات غير الستيرويدية. تم الحصول على عينات الدم مراقبة صحية في الطب "إدارة المعاهد الوطنية للصحة لنقل الدم" من المانحين صحي إطار بروتوكول وافق مجلس الهجرة واللاجئين (NCT00001846). يتم تجنيد جميع المشاركين في مركز الأبحاث الإكلينيكية ماغنوسون في المعاهد الوطنية للصحة. وتم الحصول على الموافقات المستنيرة الخطية الموقعة قبل المشاركة في الدراسة.
1. إعداد قياس الوظيفة المتقدرية (اليوم الأول من التجربة)
- هيدرات "خرطوشة الاستشعار" (انظر الجدول للمواد؛ تقريب المدة: 5 دقائق).
- قم بإزالة "خرطوشة استشعار" من الحزمة. إضافة 200 ميكروليتر كاليبرانت الحل في كل بئر من لوحة الأداة، ثم ملء كل الخندق مع 400 من حل كاليبرانت ميكروليتر.
- لوحة أجهزة الاستشعار العودة إلى لوحة الأداة، التي أصبحت الآن حل كاليبرانت في ذلك. هيدرات الخرطوشة في حاضنة 37 درجة مئوية غير CO2 بين عشية وضحاها.
ملاحظة: خرطوشة استشعار يحتاج إلى أن يكون رطب للحد ني ح 4 وأقصاها 72 ساعة.
2. إعداد نموذج السريرية (اليوم 2 من التجربة)
- قياس التعب استخدام البند 13 "الوظيفية تقييم من المزمن المرض العلاج"-التعب (FACIT-F)2،23،24 في خط الأساس (قبل بدء إبرت) ونقطة الوسط وإنجاز إبرت، ووظيفة 1-السنة-إبرت.
- استخدم 0-4 مقياس لكل استجابة البند، حيث يمثل 0 "لا على الإطلاق" و 4 يشير إلى أن المدعي عليه يتصل بالمقابلة بيان "كثيرا." يجب أن تتراوح إجمالي عشرات من 16-53، مع عشرات أقل مما يعكس كثافة عالية من التعب.
- تعريف التعب كنقاط FACIT-F أقل من 43، مع نقاط FACIT إف من إيه فور ثري التي تشير إلى غياب أو التعب لا سريرياً-معنى2.
ملاحظة: درجة FACIT-و 43 أفضل يقسم التعب العشرات من مرضى السرطان و السكان عامة2. - تتضمن البنود 13 التالية في الجدول التعب FACIT: 1) أشعر بالتعب؛ 2) أشعر بضعف جميع أنحاء؛ 3) أشعر فاتر ("جرفت")؛ 4) أشعر بالتعب؛ 5) لدى مشكلة عند بدء تشغيل الأشياء لأنني تعبت؛ 6) أجد صعوبة في إنهاء الأمور لأنني متعب؛ 7) لدى الطاقة؛ 8) وأنا قادرة على القيام بالأنشطة المعتادة بلدي؛ 9) لست بحاجة إلى النوم أثناء النهار؛ 10) أنا متعب جداً لتناول الطعام؛ 11) أحتاج إلى مساعدة في القيام بالأنشطة المعتادة بلدي؛ 12) أنا محبط من يجري متعب جداً للقيام بالأشياء التي أريد القيام به؛ و 13) يجب أن يحد من نشاطي الاجتماعي لأنني متعب.
- عزل ببمك من عينات الدم التي جمعت حديثا (التقريبي المدة: ح 1).
- جمع 8 مل دم إلى "أنبوب إعداد الخلايا وحيدات النوى" (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: ينبغي تجهيز عينات الدم ضمن ح 2 من المجموعة. نوعية ببمكس قد تتعرض للخطر في حالة معالجة عينات الدم أكثر من 2 ح بعد جمع العينات. - الطرد المركزي في 1,750 س ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). نقل الطبقة غائم إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة إلى 15 مل من برنامج تلفزيوني وعكس 5 مرات.
- الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية دون بيليه مثيرة للقلق. إعادة تعليق بيليه عن طريق إضافة إلى 10 مل برنامج تلفزيوني، وعكس 5 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل السائل طافية وتعليق إعادة الخلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني. نقل ببمكس 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب.
- الطرد المركزي في 610 x ز لمدة 10 دقائق. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1640 RPMI كاملة (ربمي-1640 تستكمل مع 10% FBS، 10 مم البنسلين/ستربتوميسين).
- جمع 8 مل دم إلى "أنبوب إعداد الخلايا وحيدات النوى" (انظر الجدول للمواد).
- معطف ألواح الخلية للخلايا غير ملتصقة (التقريبي المدة: 30 دقيقة).
- إعداد حل التصاق الخلايا والأنسجة (انظر الجدول للمواد) بتمييع الحل الأسهم في بيكربونات الصوديوم 0.1 M pH 8.0. ينبغي أن يكون الحل العامل في 3.5 ميكروغرام/سم2 من المساحة السطحية.
ملاحظة: يتضمن هذا الحل بوليفينوليك البروتينات المستخرجة من بلح البحر البحرية، Mytilus edulis. هذه البروتينات هي المكونات الرئيسية للغراء يفرزها بلح البحر لترسيخ نفسها على الأسطح. ونجد أن الخلية-تاك يعمل بشكل الأفضل مع ببمكس. - إضافة 100 ميكروليتر من الحل لاصقة المخفف لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تغسل ثلاث مرات مع دي الماء والهواء الجاف.
- إعداد حل التصاق الخلايا والأنسجة (انظر الجدول للمواد) بتمييع الحل الأسهم في بيكربونات الصوديوم 0.1 M pH 8.0. ينبغي أن يكون الحل العامل في 3.5 ميكروغرام/سم2 من المساحة السطحية.
3. قياس الوظيفة المتقدرية
- إعداد "مقايسة وسائط الإعلام" (التقريبي المدة: 10 دقيقة).
ملاحظة: تحليل وسائل الإعلام يجب أن يكون طازج اليوم من التجربة.- إضافة لام الجلوتامين، بيروفات، والجلوكوز قاعدة الوسائط (مكونات نفسه كالمتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو)، ولكن دون أي بيكربونات الصوديوم أو السكر، الجلوتامين، أو بيروفات صوديوم) جعل وسائل الإعلام المقايسة. الاحماء وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية، ثم ضبط pH إلى 7.4.
ملاحظة: تركيزات لام الجلوتامين، بيروفات، والسكر هي عادة نفس التركيزات في وسائط النمو العادي، ولكن يمكن تعديلها استناداً المقايسة.
- إضافة لام الجلوتامين، بيروفات، والجلوكوز قاعدة الوسائط (مكونات نفسه كالمتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو)، ولكن دون أي بيكربونات الصوديوم أو السكر، الجلوتامين، أو بيروفات صوديوم) جعل وسائل الإعلام المقايسة. الاحماء وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية، ثم ضبط pH إلى 7.4.
- إعداد ببمكس لاختبار "الإجهاد ميتو" (التقريبي المدة: ح 2).
- لوحة ببمكس ما يكفي من الخطوة 2 في كل بئر تصل إلى 80-90% كونفلوينسي. في تجربتنا، 1.5 × 105 خلايا/بئر نتائج أكثر اتساقا.
ملاحظة: آبار A و H هي آبار الخلفية وينبغي إلا تحتوي وسائط المقايسة مع أي من الخلايا. في الآبار ب ز، نوصي بالطلاء على الأقل 3-6 آبار كل عينة المريض لحساب القيم المتطرفة. - تدور لوحات أسفل في 200 غ س ل 2 دقيقة للسماح للخلايا على التمسك بالجزء السفلي من الآبار. تغسل الخلايا مرة واحدة مع وسائل الإعلام المقايسة. هذه الخطوة إزالة المصل وبيكربونات الصوديوم من وسائط النمو.
ملاحظة: في تجربتنا، خطوة الغسيل عادة إلى إزالة 20-30 ٪ خلايا. - إضافة ميكروليتر 180 مقايسة وسائط الإعلام في كل بئر، بما في ذلك الآبار الخلفية A و H. إينكوباتي في حاضنة غير CO2 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
- لوحة ببمكس ما يكفي من الخطوة 2 في كل بئر تصل إلى 80-90% كونفلوينسي. في تجربتنا، 1.5 × 105 خلايا/بئر نتائج أكثر اتساقا.
- تشغيل اختبار الإجهاد ميتو
- إعادة تشكيل المخدرات في "الطقم الإجهاد ميتو" بمقايسة وسائط الإعلام على النحو التالي:
- أوليجوميسين: إضافة ميكروليتر 252 مقايسة وسائط الإعلام إلى القنينة لإنشاء حل أسهم في 50 ميكرومتر.
- فككب: إضافة ميكروليتر 288 مقايسة وسائط الإعلام إلى القنينة لإنشاء حل أسهم في 50 ميكرومتر.
- أنتيميسين A/والروتينون: ميكروليتر 216 إضافة وسائط المقايسة إلى القنينة لإنشاء حل أسهم في 25 ميكرومتر.
- أعيد دوامة المخدرات لحوالي 1 دقيقة. تضعف إلى حلول العامل.
ملاحظة: تركيزات الحلول العامل ينبغي أن تكون معاير وتحدد مسبقاً قبل التجربة تبعاً لنوع الخلية. ببمكس، نجد أن 1 ميكرومتر من أوليجوميسين و 1 ميكرو فككب 0.5 ميكرو أنتيميسين A/والروتينون عمل الأفضل. - "الماصة؛" المخدرات في كل منفذ في خرطوشة استشعار تسلسلياً:
- ج: منفذ ماصة 20 ميكروليتر من 10 ميكرو أوليجوميسين، لتركيز نهائي في كل بئر من 1 ميكرومتر.
- المنفذ b: 22 ماصة ميكروليتر من 10 ميكرو فككب، لتركيز نهائي في كل بئر من 1 ميكرومتر.
- جيم: المنفذ 25 ماصة ميكروليتر من 5 ميكرومترات أنتيميسين A/والروتينون لتركيز نهائي في كل بئر من 0.5 ميكرومتر.
- إعادة تشكيل المخدرات في "الطقم الإجهاد ميتو" بمقايسة وسائط الإعلام على النحو التالي:
- حدد "اختبار الإجهاد ميتو" على أداة التمويه خارج الخلية. اتبع موجه الصك وإدراج خرطوشة الاستشعار. سيتم تنفيذ الصك تلقائياً معايرة أجهزة الاستشعار. إدراج لوحة الخلية بعد معايرة أجهزة الاستشعار، وهذا الصك سوف تنتهي بقية المقايسة. يتم قياس ديناميات الأكسجين في 530 نانومتر (الإثارة)/650nm (الانبعاث)، وهو قياس تركيز البروتون في 470 نانومتر (الإثارة)/530 نانومتر (الانبعاث).
4-تطبيع البيانات الوظيفة المتقدرية
- إعداد حل "خلية انتشار المقايسة" (التقريبي المدة: 5 دقائق).
- إضافة 48 ميكروليتر الحمض النووي وصمة عار (س 500) وميكروليتر 240 خلفية القامع لمل 11.7 PBS (2 x). وصمة الحمض النووي صبغة الحمض النووي ملزم خلية بيرمينت، والقامع الخلفية هو صبغة تقنيع الذي يمنع الخلايا الميتة أو الخلايا مع سلامة غشاء الخلية الشبهة من يجري الملون. ويضمن الجمع بين صبغ الحمض النووي ملزم والقامع الخلفية أن الخلايا الحية فقط ملطخة.
- إضافة تساوي حجم 2 × الحل العامل (180 ميكروليتر) مباشرة في المتوسط في كل بئر بعد اكتمال "اختبار الإجهاد ميتو".
- احتضان الخلايا حضور خلية انتشار المقايسة الحل في حاضنة 37 درجة مئوية على 45-60 دقيقة كوانتيفي عدد الخلايا الحية (الفلورسنت) على قارئ لوحة في 508 نانومتر (الإثارة)/527 نيوتن متر (الانبعاث) وتطبيع البيانات التعرف الضوئي على الحروف (التقريبي المدة: 10 دقيقة) .
ملاحظة: بالإضافة إلى عدد الخلايا الحية، المستخدمين قد أيضا اختيار تطبيع البيانات الخاصة بهم مع العدد الإجمالي للخلايا، وكمية من الحمض النووي، وتركيزات البروتين، إلخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اختبار الإجهاد ميتو يعتمد على قياس معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) بعد حقن متسلسلة من مثبطات الجهاز التنفسي المختلفة لتعيين ملف تعريف المتقدرية كاملة. القياسات التعرف الضوئي على الحروف بعد كل حقن المخدرات يمكن استخدامها لحساب المعلمات التالية ذات الصلة بالصحة المتقدرية: تقاس القاعدية التعرف الضوئي على الحروف أولاً قبل أي حقن المخدرات لتقييم استهلاك الأوكسجين اللازم للوفاء بالراحة مستوى ATP الطلب. ويحسب بطرح معدل التنفس غير الميتوكوندريا من الأساس التعرف الضوئي على الحروف قبل الحقن أوليجوميسين التنفس القاعدية. بعد ذلك، يتم حقن أوليجوميسين تمنع قناة بروتون ATP synthase (مجمع الخامس). الهبوط اللاحق في التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن أوليجوميسين يمثل استهلاك الأوكسجين المتصلة بإنتاج ATP. فككب (سيانيد الكربونيل 4-[تريفلوروميثوكسي] فينيلهيدرازوني)، إيونوفوري استخدامه لتعطيل التدرج بروتون وإمكانات غشاء الميتوكوندريا، ثم يستخدم للحصول على استهلاك الأوكسجين القصوى. التنفس القصوى يحسب بطرح غير المتقدرية التنفس من OCR كحد أقصى بعد حقن فككب. قطع غيار قدرة الجهاز التنفسي هو الفرق بين التنفس القصوى والقاعدية. أخيرا، أنتيميسين (مثبط الثالث معقدة) ووالروتينون (معقدة أنا المانع) يتم حقنها في نفس الوقت إيقاف تشغيل سلسلة النقل الإلكتروني. بحكم التعريف، تنفس غير المتقدرية مستقلة من سلسلة نقل الإلكترون (مثلاً، غير المتقدرية نادف أوكسيديز في الضامة، إلخ.) ويتم تمثيلها كقيم التعرف الضوئي على الحروف بعد أنتيميسين A/حقن والروتينون. اقتران الكفاءة يصف جزء صغير استهلاك الأوكسجين المتقدرية القاعدية المستخدمة لتركيب ATP، ويحسب كنسبة 100% x (OCR المتصلة بإنتاج ATP)/(basal respiration rate).
ينبغي أن يكون الأمثل لكل شرط تثقيف كثافة الخلية قبل إجراء اختبار إجهاد ميتو. في تجربتنا، يتحقق كونفلوينسي 80-90% بطلاء 1.5 × 105 خلايا/بئر ببمكس طازجة المعزولة من الدم البشري (الشكل 1أ). هذا كثافة الطلاء تمثل خطوة الغسيل الموصوفة في الخطوة 3.2.3. بالإضافة إلى تحديد الكثافة المثلى والطلاء، يجب إجراء المعايرة فككب لتحديد تركيز اللازمة لتوليد القصوى التعرف الضوئي على الحروف. في فككب اختبرت تركيزات-ميكرومترات 0.125 0.25 ميكرومتر، 0.5 ميكرومتر، 1 ميكرومتر و 2 ميكرومتر-التعرف الضوئي على الحروف زادت مع تركيز فككب التوصل إلى هضبة في 1 ميكرومتر، ولكنها انخفضت في 2 ميكرومتر (الشكل 1ب). يشير هذا إلى أن 1 ميكرومتر هو تركيز فككب المثلى التي ينبغي أن تستخدم لفحص الوظيفة المتقدرية PBMC.
نحن اختبار الوظيفة المتقدرية من نفس الدفعة من خلايا من نفس عينة الدم التي تم جمعها من المانحين صحي في نقاط زمنية مختلفة بعد عزلة ببمك. انخفض استهلاك الأكسجين القاعدية، فضلا عن التعرف الضوئي على الحروف القصوى أقرب ح 3 واستمرار الانخفاض في ح 5 و 8 بعد عزلة PBMC (الشكل 2أ). بعد ح 3، لم تتجاوز التنفس القصوى بحقن فككب (النقاط الزمنية 7-9) القاعدية التعرف الضوئي على الحروف، مما يوحي بأنه حتى في الخلايا الحية، وقطع الغيار الميتوكوندريا سرعة مرور الزمن انخفاض قدرة الجهاز التنفسي. وتم قياس معدل تحمض خارج الخلية (أكار) في نفس الوقت على أداة التمويه خارج الخلية. منذ أوليجوميسين يمنع المتقدرية ATP synthase، تحلل يتم تجنيده في غضون دقائق لتلبية الطلب على الطاقة وتعويض النقص في إنتاج ATP عن طريق الفسفرة، كما يتضح من الزيادة السريعة في عكر بعد أوليجوميسين حقن. أقرب وقت ح 3 بعد عزلة ببمك، كان هناك انخفاض في عكر، فضلا عن التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 2ب). على الرغم من أننا لم يلاحظ أي تغيير ملحوظ في بقاء الخلية في 1 و 3, 5 و 8 ح بعد عزلة PBMC، انخفضت الوظيفة المتقدرية سريعاً، مما يوحي بأن التوقيت هو المفتاح لالتقاط صورة الميتوكوندريا ببمكس ريسبيرينج، والعيش.
مجموعات عينة المرضى تميل إلى أن تحدث في أوقات مختلفة في أيام منفصلة؛ وبالتالي، من الأهمية بمكان لتطبيع البيانات لمقارنة العينات المختلفة والنقاط الزمنية. بينما الاعتداء أساليب التطبيع الأخرى مثل البروتين ويمكن استخدام القياس الكمي الحمض النووي، نجد أن تلطيخ الخلايا الحية بصبغ الحمض النووي ملزم والتقدير الكمي للخلايا الفلورية الخضراء في كل بئر هو تطبيع الأكثر كفاءة وموثوق بها الأسلوب. وترد بيانات تمثيلية من ببمكس التي تم جمعها من المانحين صحية مختلفة اثنين في يومين منفصلين في الشكل 3. اقحم هو صورة تمثيلية للوحة الخلية جيدا يظهر مجموع الخلايا (مرحلة التباين) والخلايا الحية الملون مع صبغ الحمض النووي ملزم (أخضر نيون) بعد اختبار الإجهاد ميتو. معدل استهلاك الأكسجين القاعدية، فضلا عن استهلاك الأوكسجين بعد كل حقن المخدرات تطبيع العيش الخلايا متشابهة في اثنين مختلفة صحية غير التعب من المانحين (الشكل 3).
بيانات الوظيفة المتقدرية الممثل من موضوع مرهق (نقاط FACIT-F < 43) مع سرطان البروستاتا (أحمر) والعمر/الجنس/العرق-مطابقة أنهكتهم غير صحية مانحا (أزرق) وترد في الشكل 4. على الرغم من أننا لم يلاحظ أي اختلاف في التعرف الضوئي على الحروف القاعدية (الشكل 4ب)، موضوع مرهق معارضها انخفض استهلاك الأوكسجين القصوى، فضلا عن قطع الغيار قدرة الجهاز التنفسي مقارنة بعنصر التحكم (الشكل 4ج، د). التعب تبدو مرتبطة بالانخفاض في قدرة الجهاز التنفسي قطع الغيار، لأنه لم تكن هناك فروق في استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية (الشكل 4ﻫ)، استهلاك الأوكسجين المتصلة ATP (الشكل 4و)، أو اقتران الكفاءة (الشكل 4ز). بيانات خط الأساس (قبل أي حقن المخدرات) والتنفس القصوى بعد حقن فككب يمكن تصور استخدام مؤامرة النمط الظاهري في الطاقة، الذي يكشف عن المسار المفضل (التعرف الضوئي على الحروف الفسفرة مقابل تحلل أكار) حضور زيادة الطلب على الطاقة (الشكل 4ح). المربعات الفارغة تشير إلى النمط الظاهري الطاقة القاعدية والمربعات الصلبة تشير إلى النمط الظاهري الطاقة استجابة للطلب ATP القصوى. المسافة بين القاعدية (مساحة فارغة) والأعلى (ساحة الصلبة) يشير إلى القدرة الاحتياطية، بينما المنحدر يشير إلى تفضيل الخلوية تجاه الفسفرة مقابل تحلل. كما هو موضح في الشكل 4ح، القدرة الاحتياطية في موضوع التعب انخفضت مقارنة بمراقبة صحية غير التعب. وبالإضافة إلى ذلك، النمط الظاهري الطاقة استجابة لزيادة الطلب ATP تميل نحو تحلل في موضوع مرهق مقارنة بمراقبة صحية (الشكل 4ح).
الشكل 1 : PBMC تصفيح الكثافة ومنحني الاستجابة للجرعة فككب. (أ) عزل طازجة كانت مطلي ببمكس 1.5 × 105 خلايا/بئر في الخلية المغلفة سيلتاك الثقافة مينيبلاتيس. بعد الغسيل وتغيير وسائط الإعلام، والخلايا ووزعت بالتساوي في كونفلوينسي 80-90%. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) زيادة التعرف الضوئي على الحروف مع زيادة تركيزات فككب ميكرو 0.125، 0.25 ميكرومتر، 0.5 ميكرومتر، تصل إلى ذروة التعرف الضوئي على الحروف في 1 ميكرومتر. انخفض التعرف الضوئي على الحروف في 2 ميكرومتر، مشيراً إلى أن 1 ميكرومتر الجرعة المثلى للحصول على التنفس القصوى في أشرطة PBMCs.Error تشير إلى الانحراف المعياري للقياسات المتسلسلة 3 بعد حقن المخدرات الأولية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التنفس المتقدرية تتناقص بمرور الوقت في ببمكس طازجة معزولة. التعرف الضوئي على الحروف (A) ، وكذلك عكر (ب) انخفضت سرعة مرور الوقت بعد عزلة ببمك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : البيانات التنفس المتقدرية الممثل مع التطبيع. تم إجراء اختبار الإجهاد ميتو باستخدام ببمكس جديدة معزولة عن اثنين من متطوعي صحية مختلفة في أيام مختلفة وتطبيعها باستخدام حمض النووي فلورسنت وصمة كمياً على قارئ صفيحة فلوري. داخلي: صورة تمثيلية للخلايا الحية (الأخضر) ومجموع الخلايا (مرحلة التباين) في بئر. شريط المقياس = 1,000 ميكرو الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تحليل الممثل من موضوع مرهق بالمقارنة مع عنصر تحكم صحية. (أ) "ممثل ميتو الإجهاد" اختبار التعرف الضوئي على الحروف الرسم البياني من موضوع مرهق مقارنة بالعمر/الجنس/العرق-مطابقة أنهكتهم غير صحية عنصر. شريط الرسوم البيانية القاعدية التعرف الضوئي على الحروف (ب)، التنفس القصوى (ج)، تجنيب قدرة الجهاز التنفسي (د)، يبين استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية (ه)وإنتاج ATP (و)، واقتران الكفاءة (ز) . يتم إظهار الأرض النمط الظاهري الطاقة من موضوع مرهق ومراقبة صحية (ح). المربعات الفارغة تشير إلى النمط الظاهري في الطاقة خط الأساس، والمربعات الصلبة تمثل النمط الظاهري أكد الطاقة تقاس بعد حقن فككب. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري 3 آبار مختلفة لكل مشارك في الدراسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعب في مرضى السرطان هو شرط منهكة التي ليست محددة بشكل جيد، أو وصف1. تشخيص التعب تتوقف كلياً على الإبلاغ الذاتي، ولا يوجد المعيار الحالي للتشخيص أو العلاج لهذا الشرط، إلى حد كبير بسبب عدم فهم في بل2. من الآليات المقترحة التي تقوم عليها التعب في مرضى السرطان، ضعف في الوظيفة المتقدرية واحد من المسارات الأكثر علاجية استهدافها. ولذلك، قمنا بتطوير طريقة سريعة وعملية لقياس الوظيفة المتقدرية في العينات السريرية التي يمكن استخدامها لتحديد المرضى المعرضين للخطر لتطوير السرطان السمية المتعلقة بالمعاملة بما في ذلك التعب، وذلك في وقت مبكر أن تبادر ويمكن أن تقام الإدارة.
يسمح بتقييم للحالة الوظيفية المتقدرية التكنولوجيا الجريان خارج الخلية في تركيبة مع حقن متسلسلة من مثبطات الجهاز التنفسي وقد استخدمت على حد سواء في المختبر و في فيفو نماذج19، 20،21. توسيع مجموعة العمل القائمة، ووضع أسلوب الأمثل لفحص خلل mitochondrial في العينات السريرية. استفادة من هذه الدراسة هو استخدام محلل الجريان خارج الخلية المدمجة. كما أظهرنا، توقيت التجربة حاسم بعد عزلة ببمكس جديدة من الدم البشري. بينما شكل أكبر (شكل 96-بئر أو آبار 24) هو الخيار الأمثل لتجربة إنتاجية عالية، يسمح نظام الجريان خارج الخلية المدمجة، التي تحتوي على 8 آبار، للتقييم الفردي لكل عينة مريض19. هذا الأسلوب أكثر عملية وفعالة من حيث التكلفة (سواء فيما يتعلق بالصك نفسه وإلى الكواشف المستخدمة للقيام التحليل)، لجمع العينات من مختلف المرضى تميل إلى أن تحدث في أوقات مختلفة في أيام مختلفة.
استخدام ببمكس لتقييم الوظيفة المتقدرية في مرضى السرطان يعانون من الإجهاد مزايا عديدة: 1) خزعة أنسجة مثل عضلات الهيكل العظمى قد يكون غير عملي في بعض الأحيان؛ 2) ببمكس متوفرة بسهولة ويمكن بسهولة أن المعزولة باستخدام أنابيب إعداد الخلية، مما يوفر ميزة عملية في إعداد سريرية؛ و 3) وقد أثبتنا أن الوظيفة المتقدرية يتناقص بعد أن كانت الخلايا المعزولة حديثا في الثقافة لأكثر من 3 ساعات، وعزل أنواع محددة من الخلايا عادة ما تستغرق عدة ساعات (أكثر من 3 ساعات). يمكن إعداد ببمكس في غضون ساعة، وبالتالي ضمان دقة قياس الوظيفة المتقدرية في الوقت الحقيقي. بينما نوصي باستخدام ببمكس للتحقيق السريرية الأولية في السكان المريض أونتشاراكتيريزيد سابقا، يمكن أيضا استخدام أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا اللمفية تي، الصفائح الدموية والعدلات ووحيدات مع البروتوكول الحالي بعد التحسين لطلاء الكثافة ومثبط للجهاز التنفسي تركيزات15،،من2526.
قبل اختبار الوظيفة المتقدرية في نظام جديد، من المهم أولاً تحديد كثافة الخلية المثلى وتركيزات فككب. في تجربتنا، تصفيح 1.5 × 105 الخلايا الواحدة وكذلك يضمن أن كثافة الخلية بعد الطلاء وروافد 80-90% يبقى خطوة الغسيل. وبالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان تحديد تركيزات فككب الأمثل لكل نوع من الخلايا. وينبغي اختبار تركيزات تتراوح من فككب وينبغي أن يستخدم تركيز فككب التي تنتج OCR القصوى دون المساس بصحة خلية. وأسفرت 1 ميكرومتر من فككب في تركيزات اختبارها، التنفس القصوى في ببمكس. هو خطوة حاسمة أخرى توقيت التجربة، كقطرات التنفس المتقدرية اندفاع 3 ساعات بعد عزلة ببمك. وهذا يعني أنه ينبغي إجراء اختبار الإجهاد ميتو ضمن 3 ساعات بعد جمع العينات التقاط بدقة وظيفة الميتوكوندريا في عينة سريرية. من الجدير بالذكر أن العديد من الباحثين قد فقط الحصول على العينات المجمدة. اختبرناها سابقا ببمكس بعد التجميد والذوبان، ووظائف هذه الخلايا المتقدرية معرضة للخطر إلى حد كبير. ولذلك، نوصي باستخدام الطازجة معزولة ببمكس في الدراسات السريرية، عندما يكون من الممكن.
جانب مهم آخر لتوليد بيانات استنساخه هو الأسلوب لتطبيع البيانات. في حين كان بعض المختبرات لها النجاح باستخدام اتفاق التعاون الأساسي البروتين التحديد الكمي لتطبيع البيانات التنفس المتقدرية، نجد أنه ليس دائماً ممكناً خاصة في خلية منخفضة كثافة. تطبيع الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يعتمد على العلاقة الخطية بين أرقام الخلية وانبعاث الأسفار من المجمعات حمض الصبغة النووية، ويمكن بدقة قياس الخلايا 10 إلى 50,00027. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح التطبيع باستخدام مزيج من الأحماض النووية الفلورسنت وصمة عار وقارئ صفيحة فلوري السريع التقدير الكمي للخلايا الحية بعد انتهاء التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب لا يتطلب تريبسينيزيشن الخلايا ملتصقة أو استخدام مكشطة خلية.
تحذير من البروتوكول أننا لا فصل ببمكس إلى أنواع محددة من الخلايا قبل إجراء تحليل وظيفي المتقدرية. وكما أظهرنا، التنفس المتقدرية يتناقص سريعاً مع مرور الوقت بعد عزلة ببمك. وهذا يوحي أن الاختلافات بين المرضى قد تكون غير دقيقة إذا أنجز التجربة بعد عزل السكان خلية مختلفة، والتي عادة ما تستغرق بضع ساعات. على الرغم من أن دراسة السكان مختلطة مثل ببمكس لا تكشف عن المعلومات الخاصة بنوع الخلية الهامة، يمكن أن تساعد المعلومات التي تم الحصول عليها من تجارب باستخدام ببمكس الدليل آليا إلى إجراء تحقيقات في المستقبل تركز على أنواع محددة من الخلايا. ببمكس بمثابة وكيل لخلل mitochondrial النظمية، وذات صلة بالاضطرابات الجهازية مثل السرطان التعب10،28. وينص البروتوكول الموصوفة في المخطوطة الحالية فقط قياس النفط خام من خلل mitochondrial دون إبراز قضية المراقبة. ولذلك، ينبغي توخي الحذر عند تفسير النتائج باستخدام هذه التكنولوجيا والإجراءات ويجب النظر في طبيعة المتعددة العوامل من التعب، مثل حدوث المشارك مع السلوكيات الأخرى (مثل الاكتئاب، والنوم، وضعف الإدراك) و الظروف (مثل حالة القلب، بوليفارماسي). الدراسات المستقبلية ينبغي أن تدرس التعديلات في وظائف المتقدرية في أنواع الخلايا المحددة (مثل الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية T وحيدات) ومختلف السكان السريرية (مثل مرضى السرطان التعب/غير-التعب و ضوابط صحية). في حين أنها خارج نطاق هذه المخطوطة الحالية، سوف نحدد الاقترانات بين شدة التعب السرطان وخلل mitochondrial، فضلا عن العلاقة بين الوظيفة المتقدرية القياسات والاختبارات البدنية من التعب مثل اختبار 6 دقائق سيرا على الأقدام، التحقيقات في المستقبل. وعلاوة على ذلك، الدراسات المستقبلية سيبحث أيضا خلل mitochondrial في أنواع السرطان الأخرى بغية تحديد ما إذا كانت مرتبطة بخلل mitochondrial التعب عبر مختلف أنواع السرطان. وفي الختام، قمنا بتطوير بروتوكول الأمثل لإجراء تقييم سريع للاختلالات المتقدرية العامة استخدام العينات السريرية. كذلك يمكن إجراء التحقيقات الميكانيكية لتحديد مشاركة مسارات محددة في هذا الشرط المنهكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة معتمد بشكل كامل "شعبة البحوث الداخلية" للمعهد الوطني للتمريض البحث من المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، ماريلاند.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).
