Summary
本稿の目的は、二重チャンバー容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能を評価するための推奨される手順の詳細な説明を提供するためにです。
Abstract
体ボックス内で自発的に呼吸意識件名によって作成された空気の体積変化は、脈波、人体で実験動物の呼吸機能のいくつかの機能を非侵襲的に評価するための技術の基礎です。今回は小動物でダブル室脈 (DCP) のアプリケーションに焦点を当てください。正常に非侵襲的な方法で動物を自発的に呼吸を意識し、呼吸機能を評価するための詳細なステップバイ ステップの手順と同様に、方法論に関する背景情報を提供します。DCP は、繰り返し、並列、同様選択した期間にわたって噴霧物質による変化を識別するために複数の動物の呼吸の機能を監視する使用できます。関連の利点および欠点を議論に制御とアレルギー マウスに関する実験も本手法の有用性を示す、関連付けられている結果パラメーターを説明する使用します。全体的にみて、DCP は、ベースライン時と噴霧物質と課題後の両方の意識の小動物の呼吸機能を評価する信頼できる有効かつ理論的に音の読み出しを提供します。
Introduction
モデル人間の呼吸器疾患に小動物の使用の増加は、これらの動物の呼吸器系の機能を定量的に評価する手法の開発を求めています。現在、強制振動法 (FOT) は、小動物1,2呼吸力学を評価する最も正確な方法として認識されます。ただし、表現型解析の不確定性原理によって示されるように、FOT の測定精度で得られる何がトレードオフの非侵襲性3の損失に対して。確かに、FOT 測定機械換気; と同様、麻酔、気管切開術または経口挿管を必要とする高度に制御の実験条件下で取得します。現実から遠いシナリオ。
実験的要件が麻酔剤の使用を禁止したり、動物の自然な生理学的な状態からほとんど、あるいは全くの偏差のコールの状況で二重チャンバー容積脈波 (DCP) を見なすことができます。その名前が示すようには、動物の頭 (鼻)、前室、その胸郭から可能な限り密閉分離に建てられた 2 つの接続された剛体部屋 DCP セットアップ後部チャンバー内で構成されます。セットアップ内で動物は意識は、拘束されている間自発的に呼吸します。部屋の壁は、展開または撤回できない、ために対応する後部室内周囲の空気の圧縮/圧縮解除の結果として逆の波形が動物のロットアウトの空気の動きを生成します。チェンバー前部と後部室で胸部の運動にかかわるもの鼻流による波形はこうして分離し、同時にキャプチャできます。DCP 設定のデザインに応じてそれぞれ燃焼室圧力や気流、室の入出庫に時間の関数として変更を記録する圧力トランスデューサーまたは pneumotachographs のセットを使用してこれらの波形を取得ことができます。後者のアプローチは、今日ではより一般的です。
状況が一回換気量と換気関連パラメーター (例えば、分時換気量の定量のための同じではない動物の呼吸周波数を正確に決定するには、容積脈波技術の任意の種類によって中、呼気量、等)。ボックス信号4,5から動物の一回換気量を推定は全身プレチスモ グラフ (WBP) テクニックではなくは、DCP 手法は、一回換気量の正確な評価を提供します。これは呼吸時に肺気量の変化に比例している後部室で動物の胸部の動きの直接の取得に関連します。
呼吸サイクルの形でいくつかの障害は、これら正確な換気パラメーター (例えば、一回換気量、呼吸周波数と分時換気量)、に加えて、支配神経の側面を調査するも使用できます、呼吸ドライブまたは呼吸反射。そのアプリケーションの具体例を上気感覚ニューロン6吸入物質の苛立ちの潜在性の評価となります。ここでは、有効期限の開始時に一時停止の期間は、終了吸気ポーズ (EIP) ブレーキ6の期間とも呼ばれますと呼ばれるパラメーターを使用して決定されます。刺激性物質による一時停止の延長は有効期限6、7の最初の部分でブレーキの測定期間を引き起こしている動物の声門の閉鎖に関連付けられます。
DCP のもう一つの重要な利点は、気流閉塞に敏感な 2 つの検証および明白なパラメーターを提供することです。1 つは半ば呼気呼気量で流れと呼びます、省略 EF508,9,10です。有効期限中に中間量潮呼吸のたびに空気の流れです。EF50 胸部フロー トレースから抽出され、(すなわち頭を構成で) 前室なし従って測定することができます。もう一つは特定の気道抵抗と省略 sRaw11,12,13です。SRaw の定量には、インスピレーションの終わりに流量ゼロの時点でこれらの別の呼吸のトレース間の遅延時間から計算される動物の鼻と呼吸器の流れの同時記録が必要です。この遅延が sRaw に関連する基礎を説明する理論的根拠は題して以前11。肺気量の変化を単に置く、圧力勾配は、順番に車で空気の流れを開発する必要があるので空気の動きの前に。静かな呼吸健康な動物、この遅延は通常非常に小さいです。ただし、(例えば、十分な換気を提供するための十分な流れ) 与えられた流れに対応するために必要な圧力勾配は、気道抵抗の程度に影響されます。気道攣縮、中にたとえば、与えられた流れに対応するために必要な圧力の勾配が大きい、一生懸命呼吸をしている動物を意味します。動物の胸腔内の圧力の大きい勾配も意味は、チェンバー後部の入出庫の流れの大部分が減圧/合計胸部拡大/収縮の部分である胸郭内の空気の圧縮のため鼻の流れとフェーズのうち。気道攣縮による抵抗の増加は、リアとフロントの部屋間の遅延が長くなります、sRaw をそれにより増加します。空気を肺のロットアウト ドライブ圧力勾配は最初胸部体積 (TGV) によっても影響されます。大きい TGV でたとえば、与えられた圧力勾配を生成するために必要な胸郭の拡張/収縮が大きい (単に圧力の指定したグラデーションを生成するために必要な容積が大きいので)、またことを意味する、動物は、呼吸も懸命に仕事を持っています。もう一度、これらの余分な胸部変位胸郭内の空気の圧縮/圧縮に必要なもの、したがって鼻フローの位相ずれに。だから、増加の TGV は両院間の遅延も増えます、sRaw をそれにより増加します。見られる、気道攣縮および増加の TGV はロットアウト肺の空気を描画するより重要な努力の結果します。これは、本質的に、吸入後の生理学的な意味です。5,14を呼吸のために必要な作業を表します。
SRaw 2 つの異なる要因に影響を与えることを理解することが重要ですこのように: 気道抵抗および TGV。実際には、吸入後は気道抵抗および TGV11の製品として表現できます。意識した動物は、与えられた環境への換気を適合させる予定で、TGV を変更できます。動物の自然な生理状態が変更された、このような条件下でそれはない従って sRaw で変更茎の気道抵抗の変化、TGV、変更または 2 つのミックスからかどうかを識別します。したがって、呼吸力学および/または FOT1,15によって提供されるような肺気量のさらに侵襲的な測定と DCP の評価を補完することをお勧めします。
日には、DCP を各種研究用途で使用されています。テクニックに頭の商工会議所の有無定量的と使える薬剤、アレルゲン、刺激または他のメディエーターなどの様々 な物質の意識した小動物の呼吸機能に及ぼす影響を正確に評価16,17,18。前室を噴霧物質またはさまざまなガス濃度(低酸素、炭酸ガス等)19公開室として使用もできます。便利に、それは付随して急性影響これらのエクスポー ジャーを測定する 1 つことができます。実際には、DCP の一般的な用途の 1 つは呼吸器疾患20,21,22,23,の異なるモデルで噴霧メサコリンに対する反応性の程度を評価するためには24,25。
DCP 法は一見簡単ですが、いくつかの実践的な課題でした可能性のある経験の浅いユーザーを阻止または正確さと、結果の再現性を損ないます。本稿では、意識、自発呼吸抑制マウスの DCP によって正常にレコードの呼吸機能に推奨される手順の詳細な説明を提供します。説明が記載されている機器に固有の (材料の表を参照してください)。肺のアレルギー性炎症でベースライン テスト マウス 2 系統および噴霧メサコリンに応答の一般的なモデルにユーティリティと DCP の値も示します。
Protocol
次の手順は、カナダの理事会に動物ケア (CCAC) のガイドラインに従ってケベック心臓・肺研究所動物ケア委員会によって承認されました。
1. 準備
- 研究
- (重要です)どんな実験を実行する前に、適切な承認 (例えばIACUC) とトレーニング (例えば、動物取り扱い) を取得します。
- 機器、オペレーティング ソフトウェアを理解します。ユーザー マニュアルを読むし、必要に応じて信号、アナライザー、およびパラメーターを入力、サイトの数を定義する構成ファイルを作成します。
注:高いサンプリング レート (2 KHz) を選択することを確認します。 - 目的のパラメーターのアナライザーの設定を構成します。
- ツール バーし、アナライザーからチューニングを選択します。
- 呼吸を正しく分ける値をフローのしきい値を調整 (マウス: 0.5 mL/秒)、 Ti + テ呼吸率を計算するを選ぶ。
- 気圧 (760 mmhg) の値を設定し、有効と見なされる息の吸気/呼気量の最大偏差を指定 (マウス: 20%)。
- 受け入れの制限を調整する計算パラメーターフィールドの設定をクリックします。
注:次の設定が記述されているマウス実験のため使用された: インスピレーシヨンの時間、50 に 170 ms;有効期限、40 に 180 ms;450 に 30 bpm; 呼吸の頻度特定の気道抵抗、0 に 15 cmH2O·s;少なくとも 3 桁の精度で midexpiratory の流れ。 - 完了する選択適用して閉じるダイアログ ウィンドウを終了します。
- ツール バー メニューから再度チューニングしストレージ目的のデータ ストレージの速度を設定するに移動します。[、適用して閉じる] ウィンドウを閉じます。
注:すべての 10 の平均 s は通常使用されます。 - コマンドとそれぞれに必要なタイミングのシーケンスを定義するオペレーティング ソフトウェア内のプロトコルを作成します。例は、図 1に表示されます。
- 実験には、エアロゾルによる物質の管理が含まれている場合は、適切なソリューションとテストする濃度によると希釈液を準備します。
- 動物
- 静かなエリアの住宅の部屋からリモートで動作します。環境の変化に順応する動物を許可します。
- 動物の重量を量る、適切なサイズを選択します。
- (重要です)落と、試験開始前に手続きに動物を順応させます。実験的なデザイン、増加する持続期間の複数の馴化セッションによって (例えば5-30 分) 必要があります。
注:順応していない動物は、研究から除外する必要があります。- 各順化セッションで挿入背面開口部; から、落内動物デバイスを保持する垂直方向には、便利です。
- 動物は、位置、背面のプランジャーを挿入し、優しく無理な力を適用せず場所でロックします。
- (重要です)動物が正常に呼吸を視覚的に確認します。必要な場合は、ロック機構を移動することによってその位置を調整します。動物の鼻孔は、落の内壁に休んでその鼻と鼻の円錐形の外突出されていることを確認します。
- 胸部の商工会議所の背面パネルをデタッチし、胸部のチャンバーで開くゴムを通して動物を含む落を挿入、商工会議所を閉じる。
- 頭のチャンバーを添付し、バイアス フローを提供します。マウスの 0.5 L/分の流量を使用します。
- 5 分間リラックスする動物を許可します。
- 動物が穏やかな、鼻や呼吸器のフロー信号の記録を開始します。トレースがスムーズと規則正しい呼吸パターン; 表示されるコンピューターの画面上確認します。図 2の例を参照してください。
注:プロトコルには、物質のエアロゾルの管理が含まれている場合、生理食塩水の挑戦は順化手順に含まれることができます。 - 各セッションの終わりには、呼吸器の商工会議所や、落から動物を削除し、住宅ケージと部屋に戻ります。
- 機器
- 実験の日、実験的セッションを開始し、適切な構成ファイルを読み込みます。
注:実験に必要なプロトコルが含まれていることを確認します。 - ツール バー メニューの実行に移動します。実験動物の情報を入力します。一度完了したら、ウィンドウの下部に [実行] ボタンをクリックします。
- システムのキャリブレーションを続行します。各サイトを調整し、信号を個別に入力します。
- バイアス流発生装置をオンに、チューブの部分を介してヘッドのチャンバーに接続し、流量を調整します。
- キャップの頭の部屋の上部開口を閉じます。
- 胸部室の背面パネルをデタッチ、しっかりと頭と体チャンバー気密のシールを作成するを開くゴム内部キャリブレーション ツールを挿入します。閉じ、胸部の商工会議所の背面パネルを取り付ける。
- 胸部の商工会議所の側ポートを頂いたことを確認します。
- ソフトウェア ツール バー メニューから調整し、調整に行きます。
- 入力 1 (胸部)に移動し、キャリブレーション胸部流量信号の調整] ダイアログ ボックスを起動する] を選択します。
- (重要です)キャリブレーション ダイアログ ウィンドウにリストされたパラメーター表示、すなわち、 物理的なストレスが低値を適用される適切な設定であることを確認: 0;物理的なストレスが高い値を適用:-20 mL/秒;サンプル: 統合します。一度完了したら、低[サンプル] ウィンドウでをクリックします。
- 生成される信号が表示ウィンドウで一定であることを確認し、[閉じる] をクリックします。
- プラスチック製のコネクタとチューブの部分を使用して胸部の商工会議所の側ポートを介して 20 mL 注射器を接続します。
- (重要です)[サンプル] ウィンドウで高選択し、すぐにできるだけ一定流量で 2 s 間商工会議所に 20 mL の空気を注入します。
- 生成される信号が完全に表示ウィンドウ内に表示されることを確認します。矢印アイコンを使用して、信号が中心とゼロの線を中心に対称であるかどうかを確認します。閉じるをクリックします。[サンプル] ウィンドウで削除する AC オフセットをクリックして 0 から任意のオフセットを削除します。
注:必要な場合は、価値の高い校正をやり直すことができます。 - 結果の拡張入力範囲が推奨範囲内にあることを確認 (マウス: ±280 ±420 mL/秒)。(重要です)値が許容範囲外にある場合は、校正手順を繰り返します。
- 胸部の商工会議所 (ステップ 1.3.3.6) として同様の方法で頭の商工会議所を調整します。この時間は、入力 2 (鼻)を選択します。
注:(重要)物理的なストレス適用された高い値の値に設定する必要があります + 20 mL/秒。これは後部チャンバーに関連してフロント室内の流れの極性が変更されます。したがって、動物が呼吸している 2 つの流信号、ほとんどが sRaw を計算するために使用遅延は別の段階で。
- 実験の日、実験的セッションを開始し、適切な構成ファイルを読み込みます。
2. 肺機能測定
- 動物の重さし、自分の体重に注意してください。
- 落内動物を挿入し、胸部脈商工会議所 (ステップ 1.2.3.1 に 1.2.3.5) 内に配置します。
- 少なくとも 5 分間リラックスする動物を許可します。
- 最初のステップを選択することによってコマンドのプロトコルを起動し、実行をクリックします。
- 動物の呼吸信号は通常と滑らかな (図 2) で、コンピューターの画面上を確認します。ソフトウェアは自動的にブレス ・ バイ ・ ブレスごとに計算されたパラメーターを表示します。動物のパラメーターが安定していることを確認します。
- 10 分までの基準条件下での呼吸パターンを記録します。
- プロトコルはエーロゾルによって被験物質の投与を含む、次のように操作を行います。
- 必要に応じてネブライザーとデューティ サイクルを調整します。
注:この資料の例で、ネブライザーは 10 の 5% のデューティ サイクルで稼動していた s。 - 車両の挑戦 (例えば、生理食塩水) を実行し、応答を記録します。
- 必要な場合は、(例えば濃度を 2 倍) の手順をエスカレートのネブライザーで濃度を変更することによって被験物質の濃度の増加には、動物を公開します。各投与後応答を記録します。
- 実験的セッションの終わりに自動的に行われていない場合は録音を停止し、動物を住宅ケージと部屋に戻します。
- 必要に応じてネブライザーとデューティ サイクルを調整します。
- 必要な場合、別の実験的セッションを実行するツール バー メニューから実行を選択します。
- セッションの間脈室をきれいにし水ですすいでください。
注:アルコールの使用、脈に不可逆的な損傷があります。
- セッションの間脈室をきれいにし水ですすいでください。
- 研究には、時間をかけて繰り返し評価が含まれている場合は、各選択した timepoint で全体の測定シーケンスを繰り返します。
注:思慮深く、呼吸の仕組みや肺ボリューム1,15のいくつかの精密な測定と研究を補完することをお勧めします。
3. データ分析
注:ソフトウェアは自動的に実験ファイルを保存され、実験的セッションが閉じられたときに記録されたパラメーターをエクスポートします。
- 各動物および実験グループの目的のパラメーターのベースラインの平均を計算します。
注: 表 1提供する情報の種類に基づいて分類の一般的なパラメーターの番号を示します。 - ときに、関連する特定の時点 (例えば、最大または最小値)、平均、またはフルタイム コースを使用して各濃度で目的のパラメーターを考察の揮発性物質の効果を評価します。ベースラインに正規化も考慮することができます。
- グループ、テーブル、またはグラフィック形式のエラーを使用して結果を報告します。結果を統計的に分析します。
注:本研究では双方向性と繰り返し対策は別の DCP 読み出し (sRaw と EF50) だけでなく別の FOT 読み出し、メサコリン、アレルゲン-室内塵ダニ (HDM)- との相互作用の効果を評価するために使用された (RN, G、H)、マウスの両系統で。Sidak の多重比較法それからメサコリンをアレルギー マウス コントロール マウスと異なる濃度を決定するために使用されました。同じテストは、気道閉塞 (sRaw と EF50) と換気パターン (BF、テレビ、ミュージック ビデオ、EIP) の読み出しで日、HDM とベースライン (すなわちメサコリン前に、) での相互作用の効果を評価するために使用されました。ピアソンの相関は sRaw DCP と RN FOT を用いて得られた相関を評価するために使用されました。すべての統計分析およびグラフを代替標準の統計ソフトウェアの (例えば、グラフパッド プリズム) を使用して行った。p ≦ 0.05 は帰無仮説を拒絶するための十分な考慮されました。
Representative Results
連続 3 日間基準条件の下で実行された DCP によって呼吸機能の繰り返し評価の結果 (12、13、および図 1に示すプロトコルの 14 日間) コントロール、アレルギー BALB/c マウス、図 3 に示すように.周波数 (図 3 a)、一回換気量 (図 3 b)、分時換気量 (図 3)、および終了吸気ポーズ (図 3 D) 呼吸呼吸のパターンを評価するために選択されたパラメーターが含まれています。気道閉塞を評価するために使用されるパラメーターが EF50 (図 3E) と吸入後 (図 3 f)。選択したパラメーターごとの結果はアレルギー性炎症によって引き起こされる明らかな効果がない、両方のグループにこれらの 3 日連続で安定していた。
連続した日のメサコリンに対する反応性の程度を評価した DCP (12、13、および図 1に示すプロトコルの 14 日間) 制御とアレルギー BALB/c マウスの両方で。結果は、図 4に示す (図 4 a、 BおよびC) すなわち吸入後気道閉塞に敏感な 2 つのパラメーターに変更を表示して EF50 (図 4、 EおよびF)。予想通り、メサコリンの増分の濃度は徐々 に sRaw を増加し、EF50 を徐々 に減少します。これらの応答は、特に過敏性の存在を証明するテスト、最終濃度でのアレルギー性炎症によって増強されました。結果はまた 2 つのそれに続く評価 (すなわち13、14 日) 中には認められ、誇張された応答性が初日 (12 日目) に限られていたことを示します。
実験的プロトコル (; 15 日の最終日に実行された、FOT による呼吸力学の評価の結果図 1)制御とアレルギー BALB/c マウスでは、図 5のとおりです。これらの実験は、DCP 評価を補完するために研究に含まれていた。FOT は呼吸機能2を評価するためにより正確な方法として認識されます。1 つの強みは、どの (気道末梢気道と肺組織対) 肺のサイトが (例えばアレルゲン、メサコリン) テストの介入によって影響を受ける地形の洞察力を提供することです。呼吸力学、FOT を評価するために推奨される方法は、前述1だった。ここで、3 つの FOT パラメーターは、アレルギー性炎症とメサコリンによる呼吸の力学における変更について説明に使用されました。これらのパラメーターが含まれている: 1 ニュートン抵抗 (RN;図 5 a) の変化は主に値パラメーターを反映; 導電性や気道の抵抗の変化2 組織の減衰 (G;図 5 b) の変化が主に値をパラメーターに反映バリエーション組織抵抗;3 組織エラスタンス (H;図 5) の変化は主に値パラメーターは組織剛性2の変化を反映しています。予想通り、メサコリンの増分濃度への応答でこれらのパラメーターのそれぞれの増加があった。SRaw と前日 (日 14; から DCP EF50 結果に一致して図 1) RN (図 5 a) メサコリン誘発に変更コントロールとアレルギー マウスと同等であった.実際には、吸入後 14 日目での値は、(図 5) 15 日目で RNの値と相関。H, メサコリン誘発の上昇もアレルギー マウス (図 5 b) コントロールと類似していた。しかし、G のメサコリン誘発増加は大きくアレルギー マウス (図 5)。この結果は、2 つの前の日に、DCP の評価によって検出されなかったが、15 日に保持する hyperresponsive のアレルギー マウス表現型の存在を示しています。
全体の研究では、c57bl/6 マウスと繰り返していた。吸入後、12、13、およびプロトコル (図 1)、そして RNの FOT 評価の 14 日、15 日で連続した DCP 評価の結果を図 6に示します。その特定のマウス株誇張されたメサコリン反応のアレルギー マウスで観察 (図 6 a B、およびC) の連続 3 日間維持されました。この hyperresponsive の表現型もアレルギー マウス (図 6 e) でもっと発音されたメサコリン誘発 RNの上昇で 15 日、FOT で描かれていた。これらは BALB/c マウス、場所 14 (図 4) を 12 日から発生した、過敏性の進歩的な低下と RNのメサコリン誘発上昇の違いの欠如が認められた結果と対照的だった日 15 (図 5 a)。一緒に、これらの結果はマウス 2 系統間メサコリン誘発応答におけるアレルゲンの時間変化の影響を示されます。重要なは、この系統の差は、DCP と、FOT の両方で描かれていた。的外れ、吸入後 14 日で DCP によって測定の値は RN BALB/c マウス (図 5) でみられたように、日 15 (図 6 階)、FOT によって測定値に関連付けられます。
図 1.肺のアレルギー性炎症を誘発する, メサコリンに対する反応性の程度を評価するために使用するプロトコル。女性 BALB/c と 7 に 9 週齢の c57bl/6 マウスについて調査しました。全体の研究に遂行される介入のシーケンスは、(A) パネルに表示されます。マウスの半分は肺のアレルギー性炎症を誘発する 14 の連続した日に鼻腔内の室内塵性ダニ (HDM) 抽出物の 50 μ g にさらされました。残りの半分は生理食塩水にさらされ、コントロールとして使用します。呼吸機能は、3 つの別々 の機会 (12、13、および 14 日; 黒丸) の二重チャンバー容積脈波 (DCP) によって評価された次の馴化セッション (日 11; 灰色の円) 生理食塩水噴霧で課題を含む。各セッション中には、ベースラインの呼吸機能及びメサコリンに対する応答のパネル (B) に示すように自動化されたプロトコルを使用してが評価されました。15 日、前述1と強制振動法 (FOT) 呼吸力学侵襲的評価を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.健康な BALB/c マウスからの代表的なフロー信号します。パネル基準条件下でコントロール マウスのダブル室脈によって得られる典型的なレコーディング トレースを表示します。胸部の流れが上部のパネルに示すように、鼻の流れは、下のパネルに表示されます。負の値は吸気時に、有効期限の間に正の値です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.意識下の BALB/c マウスにおける呼吸機能の評価を繰り返す。ベースライン呼吸機能は、日、12、13、および 14 は図 1に示すプロトコルのコントロール (開いているシンボル) とアレルギー (黒丸) マウスで二重チャンバー容積脈波 (DCP) によって評価されました。一時停止の呼吸 (A) で周波数、一回換気量 (テレビ) (B)、(C) の分時換気量 (MV)、吸気終了含まれて呼吸機能を評価するための DCP パラメーター (EIP) 半ば呼気呼気量 (流 (D)EF50) の (E)、および (F) 特定の気道抵抗 (sRaw)。各マウスの呼吸周波数、テレビ、MV、sRaw、EIP の値は、平均 1.5 分以上記録されていた。EF50 の値はこのレコーディング期間中に得られた最小値です。± 標準偏差を意味するグループと、結果が表示されます (n = 5/グループ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.意識下の BALB/c マウスにおけるメサコリン bronchoprovocation テストします。メサコリン反応は、日、12、13、および 14 は図 1に示すプロトコルの制御 (開いているシンボル) とアレルギー (黒丸) マウスで二重チャンバー容積脈波 (DCP) によって評価されました。(C) (A) で特定の気道抵抗 (sRaw) と半ば潮呼気量 (EF50) (D) (F) までの流れ、DCP パラメーター応答を評価するために使用にはが含まれています。Bronchoprovocation は 10 の DCP 頭商工会議所のメサコリンを aerosolizing によって実行された増分の濃度で s。応答は、後各濃度 1.5 分間モニターしました。各マウスの各濃度での吸入後の値は、平均値が 1.5 分以上を記録しただった。EF50 の値はこのレコーディング期間中に得られた最小値です。± 標準偏差を意味するグループと、結果が表示されます (n = 5/グループ)。記号のアスタリスク * に有意差を示す (p 
図 5.呼吸力学 BALB/c マウスでの侵襲的評価します。ベースライン時とメサコリンに対する呼吸の力学は、図 1に示すプロトコルの日 15 日に強制振動法 (FOT) で評価しました。コントロール (開いているシンボル) とアレルギー (黒丸) マウス 12、13、および 14 日にあった二重チャンバー容積脈波 (DCP) によってテストのものと同じ。呼吸力学を評価するために使用されるパラメーターがニュートンの抵抗 (RN) (A) 組織エラスタンス (H) (B) と (C) の (G) を減衰組織。Bronchoprovocation は、仰臥位で麻酔、tracheotomized、麻痺、および機械的に換気されたマウスの気管内チューブに直接メサコリンの増分の濃度を噴霧によって行われました。応答は、各濃度の後 5 分間モニターしました。各マウスの各濃度での各パラメーターの値は、このレコーディング期間中に得られたピーク値でした。± 標準偏差を意味するグループと、結果が表示されます (n = 5/グループ)。パネル (D) は (sRaw) は、14 日目に DCP で測定し、15 日 FOT を用いて RN特定気道抵抗との相関関係を示しています。開いているシンボルはベースラインの値を表し、固体シンボルはメサコリン コントロール (円) またはアレルギー (正方形) マウスのいずれかのテストの最高濃度で最大値を。はめ込み (r2) の係数を示しています。記号のアスタリスク * 有意差 (p ≤ 0.05) を指定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.呼吸機能と c57bl/6 マウスに侵襲的な呼吸力学。特定の気道抵抗 (sRaw) は 12 (A)、13 (B)、(C) 14 日の二重チャンバー容積脈波 (DCP) ベースライン時およびコントロール (開いているシンボル) とアレルギー (黒丸) マウスのメサコリンに応答によって評価された、図 1に示すプロトコルです。ベースライン時とメサコリンに対するニュートン抵抗 (RN) を (D) 15 日 (FOT) 強制振動法による評価しました。Bronchoprovocations は、DCP の FOT、それぞれ図 4と図 5で説明したように実行されました。± 標準偏差を意味するグループと、結果が表示されます (n = 5/グループ)。(E) パネルは、吸入後 14 日目と 15 日目 FOT を用いて RNの DCP によって測定の相関を示します。開いているシンボルはベースラインの値を表し、固体シンボルはメサコリン コントロール (円) またはアレルギー (正方形) マウスのいずれかのテストの最高濃度で最大値を。はめ込み (r2) の係数を示しています。記号のアスタリスク * 有意差 (p ≤ 0.05) を指定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| パラメーター | ユニット | 説明 | 情報 |
| F | bpm | 呼吸頻度 | 換気のパターン |
| テレビ | mL | 一回換気量 | |
| MV | mL | 分時換気量 | |
| Ti | ms | 吸気時間 | |
| テ | ms | 呼気時間 | |
| PIF | mL/秒 | 最大吸気流速 | |
| PEF | mL/秒 | ピークフロー値 | |
| EV | mL | 呼気量 | |
| 日本テレビ | mL | 鼻の一回換気量 | |
| NEV | mL | 鼻の呼気量 | |
| EIP | ms | 最後の吸気ポーズ | |
| チュー | ms | エンド呼気の一時停止 | |
| dT | ms | 遅延時間 | 気流閉塞 |
| sRaw | cmH2O·s | 特定の気道抵抗 | |
| sGaw | 1/cmH2O·s | 気道コンダクタンス | |
| EF50 | mL/秒 | 半ば呼気呼気量で流れる | |
| Sr | % | 成功率 | 品質コントロール |
| N | 有効な呼吸数 |
テーブル 1。ダブル室容積脈波から典型的なパラメーターの一覧を取得します。パラメーターが呼吸機能の評価中に得られる情報の性質に応じてグループ化されます。
| 利点 | 制限 |
| ·意識した動物 | ·周囲の環境を制御する必要性 |
| ·正確な換気パラメーター | ·動物の事前順化 |
| ·気流閉塞 (sRaw、EF50) の明白なインデックス | ·密閉鼻と呼吸器の流れを分離する必要 |
| ·種や動物の様々 なサイズに適応 | ·いくつかの結果のパラメーター絶対値ばらつき |
| ·多くの研究用途で使用 | ·sRaw 抵抗のない本当の測定 |
| ·簡単な技術 | ·上部の航空路の存在 |
| ·変更に敏感 | ·侵襲的評価と測定を補完します。 |
表 2。利点と二重チャンバー容積脈波に関連付けられている制限のリストです。
| ダブル室容積脈波 | 強制振動法 | |
| 動物の意識の状態 | 不変 | 麻酔 (および通常麻痺) |
| 動物の位置 | アップライト | 仰臥位 |
| 動物のアクセシビリティ | チャンバー内に閉じ込められて | アクセス |
| 測定デバイスに動物の統合 | 鼻や首のシール | 気管切開または経口挿管 |
| 動物の気道 | そのまま | 一部 – 上気セグメント除外 (すなわち鼻の実施、咽頭、喉頭) |
| 肺気量結果パラメーターを取得します。 | 変数 - 動物を採用した自発体積 | 標準化 - 制御採用演習と終末呼気陽圧を使用しています。 |
| 周波数結果パラメーターが評価されます。 | 変数 - 動物を採用した自発呼吸周波数 | 制御 - 指定した周波数で定義済みの波形を用いた |
| 上気セグメントから結果パラメーターへの貢献 | 予想されます。 | 回避 |
| エアロゾル配信のサイト | 頭のチャンバ内 | 気管に直接 |
| 吸入量に及ぼす上気セグメント/エアロゾル沈着パターン | 予想されます。 | 防止 |
| 本研究の結果に基づいて変化を検知する能力 | 観察 | 観察 |
| 本研究の結果に基づいて技術の自然な可変性 | ベースラインに sRaw 変動係数の変動: 7.5 20.6% | ベースラインの RNの変動係数の変動: 3.6 13.4% |
表 3。ダブル室容積脈波と強制振動技術との比較。
Discussion
意識した動物の肺機能を測定する能力は、呼吸の研究で明確に保証されます。一般に、DCP は意識と自発的に呼吸動物26呼吸器の換気機能を評価するための興味深いアプローチです。具体的には、DCP、またはその頭をバリアントしばしば提供情報の質と侵襲性3 (表 2) の必要なレベルとの間の適切なバランスを打ちます。技術の種 (例えばマウス、ラット、モルモット) や動物のサイズに合わせることができるし、多くの研究用途で使用することができます。平行調査設計、繰り返し方法で呼吸機能を監視し、時間をかけて応答の動態をキャプチャで一度に多数の動物を評価するために特に便利です。さらに、技術は簡単で、比較的タイムリーに学ぶことができます。この実践的な側面を記述する例に重要なステップを議論脈、同様の手法を拘束し、関連に使用されたマウスの DCP 測定を用いたプロトコル本稿での結果。
ときに意識した動物での作業、再現可能な結果を生成するために周囲の環境 (例えば、静かな部屋で限られた数の人々 や活動の) の条件を制御するが欠かせません。以来、restrainers は様々 な寸法に来て、適切なサイズと、呼吸運動が摂動を開始することが重要です。それはまた有用、しばしば動物実験の設定と手順を適応する必要それはよく確立されてマウスの拘束が呼吸周波数12に影響を与えることとして。実験的なデザインや条件によって増分期間の複数のセッションが必要かもしれない。最後に、実験の開始時に時間を許可する部屋の変更と必要な処理を調整する動物は立証されて、呼吸パターンが一貫して定期的かつベースラインでリラックスしたように簡単な考察。どこに動物が快適でよく適合し、穏やかな条件下での作業は、結果の変動や品質の面で有益なもなります。また、気道の口径の増加し、誘発気道収縮を弱める可能性のあるカテコールアミン、ストレス リリースを制限します。
できるだけ限り密閉の鼻と呼吸器の流れを分離する必要があることを理解することが重要です。システムや種の検討、効果のように同様の形でシール機構によって異なります。我々 はここに記載されている DCP、動物の鼻と保全機器シールが作成されます。DCP によって呼吸機能を評価する際も十分かつ継続的なバイアス フローを提供する本質的な動物に利用できる酸素のレベルの減少が大きな影響を及ぼすになります。落の動物の幸福を考慮して撹拌によって作成された空気漏出のための傾向を制限し、それによってデータの品質を最大化します。一方、シールの破れが拒否されたデータセットまたはいくつかのパラメーターの過小評価になります。
さらに鼻フロー信号の別の記録を有効にするで、頭の商工会議所は噴霧物質に動物を公開する通常使用されます。この記事で示すように、これは応答性の程度を示すための bronchoprovocation テストを実行する使用できます。そのような実験テストされた濃度の範囲の調整が必要になる種、緊張、または動物の性別に応じて検討します。以前に実証8,9,10,27, として存在に示したように、気道抵抗の侵襲の FOT 計測とよく相関した sRaw のメサコリン誘発性変化、.結果はまた DCP 技法が呼吸障害を検出し、肺 (肺組織や小さな末梢気道) の下のコンパートメント内にあるローカライズされた変更された応答を識別する能力の評価に敏感でないことを示す.エアロゾルの分布と堆積から貢献を湿らせるのまた気流28合計の呼吸抵抗の最も大きい部分を占める上部の航空路の存在できます影響を与える動物の気道はそのままなので測定値に低い航空路です。表 3は、DCP のテクニックと、FOT 間の相違点をまとめたものです。最後に、それは理論的に sRaw の測定から動物の合計気道抵抗 (上部の航空路を含む) を見積もることができるだろうが、一般に勧めなど侵襲的な計測と DCP 評価を補完するために詳細な呼吸力学の直接測定を取得する FOT29 。研究の目的によって上気道抵抗の測定も考えられる30,31,32。
結論
その程度の侵襲により DCP は呼吸の研究の重要なニーズを満たすことができる手法です。気流閉塞のいくつかの明白なインデックスと並行して意識した動物における換気パターンの正確な読み出しを提供することです。得られた情報も本当により侵襲的アプローチから補います。
Disclosures
DB と AR は SCIREQ 科学呼吸器装置株式会社は、この記事の内容に関連するトピックに関連する商業的実体で働いていた。DB も株式を所有しています。SCIREQ 株式会社は、emka 技術会社です。
Acknowledgments
SML は健康の研究のカナダの協会からの就労を支え、MG に支えられて、FRQS の呼吸器の健康ネットワークから奨学金 (フォン ・ ド ・凝ったケベック – 健康)、YB は FRQS から研究員。
著者の貢献
すべての著者は、原稿やビデオの概念に貢献しました。SML と LD は、データを収集しました。SML、LD、YB、DM、DB、AR は、人物や原稿執筆の生成データ解析に貢献しました。YB、AR、KL と MG ビデオ スクリプトの準備に関与していた。YB、KL、MG での公演も実施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
| House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
| DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |
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