Summary
在这里, 我们讨论了一系列的诱导和确认细胞衰老在培养细胞的协议。我们专注于不同的衰老诱发刺激, 并描述了常见的衰老相关标记的量化。我们提供的技术细节, 以成纤维细胞作为模型, 但协议可以适应各种细胞模型。
Abstract
细胞衰老是一种永久性细胞周期停止激活的反应, 以应对不同的破坏性刺激。细胞衰老的活化是各种病理生理条件的标志, 包括肿瘤抑制、组织重塑和衰老。细胞衰老的诱导体在体内仍然缺乏特征。然而, 一些刺激可以用来促进细胞衰老前体。其中, 最常见的衰老诱导因子是复制衰竭, 电离和非电离辐射, 毒性药物, 氧化应激, 去甲基化和乙酰剂。在这里, 我们将提供有关如何使用这些刺激诱导成纤维细胞衰老的详细说明。该协议可以很容易地适应不同类型的主要细胞和细胞系, 包括癌细胞。我们还描述了不同的方法来验证衰老诱导。特别是, 我们专注于测量溶酶体与衰老相关的β-乳糖酶 (SA β-加仑) 的活性, 使用 5-乙炔-2 '-脱氧尿苷 () 的 DNA 合成率, 细胞周期的表达水平抑制剂 p16 和 p21, 以及衰老相关分泌表型 (SASP) 成员的表达和分泌。最后, 给出了实例结果, 并讨论了这些协议的进一步应用。
Introduction
在 1961年, 佛烈克和穆尔黑德报告说, 在连续1段后, 培养的主要成纤维细胞失去了增殖潜能。这一过程是由每细胞分裂后端粒的顺序缩短引起的。当端粒到达临界短的长度时, 它们被 DNA 损伤反应 (DDR) 所识别, 它激活了不可逆转的增殖--也被定义为复制衰老。复制衰老是目前已知的许多刺激之一, 导致一个永久性细胞周期逮捕的状态, 使细胞不敏感的 mitogens 和凋亡信号2,3。衰老程序通常的特点是额外的功能, 包括高溶酶活性, 线粒体功能障碍, 核变化, 染色质重组, 内质网应力, DNA 损伤和衰老相关分泌表型 (SASP)3,4。衰老细胞在体内具有多种功能: 发育、创面愈合和肿瘤抑制2。同样, 众所周知, 它们在衰老和肿瘤进展5中起着重要的作用。衰老的消极和部分矛盾的影响通常归因于 SASP6。
最近, 它表明, 消除衰老细胞的小鼠导致寿命延长和消除许多老化功能7,8,9,10,11,12. 同样, 已经开发了多种药物, 以消除衰老细胞 (senolytics) 或靶向 SASP13,14。抗衰老治疗潜力最近引起了人们的广泛关注。
对细胞衰老相关机制的研究和药理干预的筛选严重依赖于体外模型, 特别是在人原代成纤维细胞中。虽然不同的衰老诱导因子激活了一些共同的特征, 但衰老表型的大变异性被观察到, 并依赖于各种因素, 包括细胞类型, 刺激和时间点3,15, 16,17。研究和定位衰老细胞的异质性是当务之急。因此, 本议定书的目的是提供一系列方法, 以诱发衰老的主要成纤维细胞使用不同的治疗。正如它将解释, 这些方法可以很容易地适应其他细胞类型。
除了复制衰老, 我们还描述了其他五种衰老诱导治疗: 电离辐射, 紫外线 (紫外线) 辐射, 阿霉素, 氧化应激和后生变化 (即促进组蛋白乙酰化或 DNA 去甲基化).电离辐射和紫外线辐射直接导致 DNA 损伤, 并在适当剂量下引发衰老18,19。阿霉素还导致衰老主要是通过锂 dna 损伤的 dna 和干扰拓扑异构酶 II 功能, 从而停止 DNA 修复机制20。衰老的关键基因表达通常由组蛋白乙酰化和 DNA 甲基化控制。因此, 组蛋白乙酰抑制剂 (如丁酸钠和萨哈) 和 DNA 去甲基化 (例如, 5-aza) 剂会导致正常细胞21,22的衰老。
最后, 与衰老细胞相关的四种最常见的标记将被解释为: 衰老相关的乳糖酶 (SA β) 的活性、由免疫组织测定的 DNA 合成率、细胞周期调节器的过度表达和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p16 和 p21, 并表达和分泌的 SASP 成员。
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Protocol
1. 一般准备
- 准备 D10 培养基。补充 DMEM 中 Glutamax 与10% 血清和1% 青霉素/链霉素 (最后浓度: 100 U/毫升)。
- 准备无菌 PBS。根据制造商的指示, 在水中溶解药片。用高压釜消毒。
- 准备1x 胰蛋白酶。稀释5毫升的胰蛋白酶-Versene EDTA/10x 1:10 在45毫升的无菌 PBS。
注意: 在整个协议中, 我们使用的细胞培养条件, 更接近的生理条件, 主要成纤维细胞。这意味着, 我们孵化的细胞在37摄氏度和 5% CO2通常做, 但使用5% O2 而不是 "标准" 20% O2. - 使用层流罩、实验室外套和手套处理所有灭菌条件下的样品。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
2. 衰老的诱导
- 复制衰老
- 在处理细胞或任何与它们接触的材料 (滴管、烧瓶、介质等) 的情况下, 使用层流罩、实验室外套和手套在无菌条件下工作。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
- 种子 7 x 105可行的主要成纤维细胞在低人口加倍 (PD) 在一个 T75 烧瓶 (~ 9.3 x 103细胞/cm2) 包含10毫升的 D10。
- 在细胞孵化器中生长37摄氏度的细胞, 5% CO2和 5% O2直到它们达到70–80% 汇合 (在低 PD 中增殖培养的3–4天)。
- 使用3毫升1x 胰蛋白酶和孵化的细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O25–7分钟。用细胞培养显微镜定期监测细胞, 检查分离过程。
- 当细胞为球形时, 通过加入9毫升的 D10 来阻止胰蛋白酶的反应。不要孵化超过10分钟。
- 旋转细胞在 300 x g 5 分钟的细胞将形成一个颗粒在底部的管, 而碎片和较小的颗粒将留在上清。
- 移除上清液并将细胞颗粒溶解在1毫升的 D10 中, 并根据制造商的指示或 Neubauer 室进行手动计数, 并使用自动单元计数器进行细胞计数。在计数时, 包括检测细胞的生存能力 (例如, 台盼蓝排除23)。
- 使用此公式计算累计 PD:
PD新= 3.32 * (日志 (细胞数总计)-(日志 (细胞数种子) + PDold
细胞总数 = 所有细胞计数: 死和活。
细胞数种子 = 可存活细胞的数量 (8x105细胞)。
PD老= 在播种的那一刻人口加倍。
PD新= 人口加倍在计数的时刻 (在孵化以后)。
注: 如果 7 x 105原发性成纤维细胞 (PD 35.2) 在 T-75 瓶上播种, 并且, 在4天他们到达80% 汇合并且再被分裂, 现在计数 1.3 x 106总细胞 (死 + 活)。
PD新= 3.32 * (日志 (130万个单元格)-日志 (70万)) + 35。2
PD新= 36。1 - 补种 8 x 105细胞在一个新的 T75, 重复步骤 2.1. 2–2.1. 8。
注意: 经过多次连续的通道, 在细胞停止分裂之前, 这种文化需要更长的时间才能汇合。一旦细胞停止分裂, 测试衰老标记和/或收获的下游应用。 - 考虑到衰老细胞的大小可能会使这种文化显得丰满, 但细胞数量却很低。因此, 当 PD 稳定和其他衰老标记出现在文化中时, 可以假设衰老 (参见协议 3.1–3.5)。
注: 使用增殖的主成纤维细胞作为控制。
- 电离辐射引起的衰老
- 在处理细胞或任何与它们接触的材料 (滴管、烧瓶、介质等) 的同时, 使用层流罩、实验室外套和手套在无菌条件下工作。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
- 种子 7 x 105可行的主要成纤维细胞在一个低 PD 在一个 T75 瓶 (~ 9.3 x 103细胞/cm2) 包含10毫升的 D10。
- 一夜之间孵化细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 根据使用中机器的说明, 将细胞暴露在伽玛照射下10 灰。
- 从细胞中吸取培养基, 并用10毫升的 D10。
- 在10毫升的细胞培养孵化器中孵育细胞在37°c 与 5% CO2和 5% O2为另外10天通常, 大约每3天替换媒介 D10。
- 10天后, 测试衰老标记和/或使用细胞的下游应用。
注: 使用同一 PD (辐照前) 增殖的原发成纤维细胞作为控制。
- 紫外线 (紫外线) 辐射引起的衰老
- 在处理细胞或任何与它们接触的材料 (滴管、烧瓶、介质等) 的同时, 使用层流罩、实验室外套和手套在无菌条件下工作。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
- 种子 1.5–2 x 105可行的初级成纤维细胞在一个低 PD 在一个6井板 (1.5–2.0 x 104细胞/cm2), 增加2毫升的 D10 培养基。
- 放置细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2和允许他们坚持到塑料至少 5 h。
- 从细胞中脱下培养基。把6井板放在紫外线辐射室中间, 然后把塑料盖子摘下来。照射与 UVB, 20–30 mJ/cm2。
- 每井加2毫升培养基。
- 在2毫升的细胞培养孵化器中孵育细胞在37°c 与 5% CO2和 5% O2为另外7天通常, 大约每3天替换媒介 D10。
注: 7 天后, 细胞可以测试衰老标志物, 用于下游应用。使用相同 PD (辐照前) 的增殖原发成纤维细胞作为控制。
- 阿霉素致衰老
- 准备1,000x 阿霉素库存解决方案: 在 1x PBS 制造250µM 的阿霉素, 过滤-消毒溶液和整除500µL 每不育管。将阿霉素储存在-80 摄氏度。
- 在处理细胞或任何与它们接触的材料 (滴管、烧瓶、介质等) 的同时, 使用层流罩、实验室外套和手套在无菌条件下工作。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
- 种子 7 x 105可行的主要成纤维细胞在一个低 PD 在一个 T75 瓶 (~ 9.3 x 103细胞/cm2) 包含10毫升的 D10。
- 一夜之间孵化细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 稀释11µL 的1,000x 阿霉素股票溶液在11毫升的 D10 到最后浓度250 nM.
- 从细胞中吸取培养基, 用10毫升的 D10 + 阿霉素代替。
- 培养细胞为确切地 24 h 在细胞文化孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 从细胞中吸取培养基, 用10毫升的 D10 仔细冲洗一次。
- 在10毫升的 D10 中孵化细胞6天, 定期更换培养基, 大约每3天进行一次。
- 在7天, 测试衰老标记和/或用于下游应用。
注: 作为控制, 使用相同 PD 的增殖原发成纤维细胞治疗24小时与车辆 (PBS) 1:1, 000 在 D10。
- 氧化应激引起的衰老
- 在处理细胞或任何与它们接触的材料 (滴管、烧瓶、介质等) 时, 使用层流罩、实验室外套和手套在无菌条件下工作。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
- 种子 7 x 105可行的主要成纤维细胞在一个低 PD 在一个 T75 瓶 (~ 9.3 x 103细胞/cm2) 包含10毫升的 D10。
- 一夜之间孵化细胞孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 在11毫升的 D10 中加入 22.6 ul 30% 过氧化氢, 在 D10 介质中制备200微米的过氧化氢溶液。
注: 通过作出曲线剂量-反应来评估毒性, 优化细胞类型的治疗。 - 从细胞中吸取培养基, 加入10毫升的新制备的 D10 培养基 + 过氧化氢。孵育2小时在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 从细胞中吸取培养基, 用新鲜的 D10 清洗一次,不含过氧化氢。
- 添加10毫升的 D10没有过氧化氢。
- 孵育48小时在细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 重复步骤 2.5. 4–2.5 8 次, 共三项治疗。
- 检查下游应用的衰老标志或收获。
注: 作为对照, 使用 D10 中22.6 µL 的无菌水在2小时内治疗同一 PD 的增殖细胞。
- Epigenetically 引起的衰老
- 根据表 1准备用于小分子的库存和工作解决方案。过滤-消毒解决方案。整除在无菌管中。存储在-20 摄氏度。
- 在处理细胞或任何与它们接触的材料 (滴管、烧瓶、介质等) 的情况下, 在无菌条件下工作, 例如使用层流罩、实验室外套和手套。仅在处理时将单元格保持在 20% O2 (房间条件)。
- 种子 7 x 105可行的主要成纤维细胞在一个低 PD 在一个 T75 瓶 (~ 9.3 x 103细胞/cm2) 包含10毫升的 D10。
- 一夜之间孵化细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 准备11毫升的 D10 中等 + 工作解决方案, 为理想的治疗。每治疗的确切稀释可以在表 1中看到。
- 在11毫升的 D10 中准备11µL 1 毫米的萨哈工作溶液。
- 在11毫升的 D10 中制备44µL 1 米丁酸钠工作溶液。
- 在11毫升的 D10 中准备11µL 10 毫米 5 aza 工作溶液。
注意: 例如, 对细胞类型的兴趣进行优化处理, 比如对毒性进行曲线剂量反应。
- 添加 D10 中 + 工作解决方案, 为所需的文化治疗。
- 孵育24小时在细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 重复步骤 2.6. 4–2.6 6 倍, 总共三种治疗方法。
- 改变培养基为简单的 D10 没有药物。
- 3天后, 细胞变得衰老, 并准备测试衰老标志物和下游应用。
注: 作为对照, 使用 D10 中 + 车治疗三天的同一 PD 的增殖性原发成纤维细胞。在这三天内, D10 中 + 车需要每24小时刷新一次。该车取决于所使用的治疗方法: 1:1, 000 亚砜为萨哈和 5-aza 和1:250 无菌水的丁酸钠。
3. 衰老的标志物
- 制备
- 准备20毫克/毫升 x-加仑: 溶解20毫克的 x 加仑在1毫升的甲基酰胺或亚砜。贮存在-20 摄氏度, 免受光照。
- 准备 0.1 M 柠檬酸溶液: 在100毫升的水中溶解2.1 克柠檬酸一水合物。在室温下贮存。
- 制备0.2 米磷酸钠溶液: 溶解2.84 克磷酸二钠或3.56 克磷酸二钠, 在100毫升水中脱水。在室温下贮存。
- 准备0.2 米柠檬酸/磷酸磷酸钠 pH 值 6.0: 溶解36.85 毫升 0.1 M 柠檬酸溶液和63.15 毫升的0.2 米磷酸钠。完全调整到 pH 值 6.0。在室温下贮存。
- 准备100毫米盐钾: 盐50毫升水中溶解2.1 克钾。贮存在4摄氏度, 免受光照。
- 准备100毫米氰化钾钾: 氰化钾50毫升水中溶解1.7 克钾。贮存在4摄氏度, 免受光照。
- 准备5米氯化钠: 在50毫升水中溶解14.6 克氯化钠。在室温下贮存。
- 准备1米氯化镁: 在50毫升的水中溶解4.8 克氯化镁。在室温下贮存。
- 在 pbs 中制备2% 甲醛 + 0.2% 戊二醛: 在 pbs 的 12.5 ul 中溶解800µL 25% 戊二醛和16% µL 100 甲醛。在室温下贮存, 免受光线的侵害。
- 根据 表 2准备新的染色液。
- 衰老相关β-乳糖酶染色
- 对于每个样本, 种子 1 x 104细胞在24井板 (5.2 x 103细胞/cm2) 的至少一个井中包含500µL 的 D10, 使细胞稀疏。治疗 (如果适用的话) 可以直接在这个盘子上进行, 或者, 已经被治疗的细胞可以被重新播种到24井板中。
- 一夜之间孵化细胞在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 用 500 ul 的 PBS 冲洗细胞两次。
- 在室温下使用 500 ul/井2% 甲醛 + 0.2% 戊二醛在 PBS 中固定3–5分钟。
- 用 500 ul 的 PBS 冲洗细胞两次。
- 准备新的染色液, 根据样品的数量进行染色。
- 添加染色液 (500 µL/井), 用 parafilm 密封板, 避免蒸发。
注: 蒸发可能导致晶体形成和阻碍观察在显微镜下。 - 在黑暗中孵化细胞 (例如用铝箔覆盖) 在干燥的孵化器 (没有 CO2) 为 12–16 h 的37摄氏度。
注: CO2可能影响 pH 值, 因此修改结果。某些细胞类型可能需要更短的孵化时间。 - 洗两次与 500 ul 的 PBS。
- 评估结果。阳性细胞在正常的光显微镜下呈现蓝色 (主要是) 核周染色 (图 1A)。
- 为定量, 观察每个样本至少100个细胞和计数阳性细胞的数量。由于衰老细胞改变形状, 通常很难定义细胞边界和计数细胞。Counterstain 与 DAPI, 以促进个别细胞的可视化和量化 (图 1B)。使用荧光显微镜 (图 1C) 量化样本 (阳性细胞与总数量的百分比)。拍摄同一样本的多个图片, 以便在最后你可以数至少100单细胞和评估 SA β-gal 阳性细胞的百分比。
- 比较衰老细胞的结果与相应的治疗方法的对照。
注: 在同一个样本上与教育局的共同染色是可能的。认为细胞应该在盖玻片上播种。
- 留学合并化验
- 根据样品数量, 将盖玻片/井放在24井板上进行评估。
- 种子 1 x 104细胞在一个24井板 (5.2 x 103细胞/cm2) 的至少一个井中, 每个条件包含500µL 的 D10, 使细胞稀疏。治疗 (如果适用的话) 可以直接在这个盘子上进行, 或者, 已经处理过的细胞可以被重新播种到24井板中。
- 一夜之间孵化细胞在37°c 与 5% CO2和 5% O2。
- 根据要处理的样品数量 (每样品250个 ul), 在 D10 (1:250) 中制作20µM 解决方案。
- 从每个井中取出一半的介质 (250 ul), 用刚刚准备好的 D10 解决方案来处理并替换它。最终的µM 浓度是10。
- 孵化 18–24 h 在细胞培养孵化器在37°c 与 5% CO2和 5% O2。在控制和衰老细胞中使用相同的孵化时间。
- 用 500 ul 的 PBS 洗涤2x。
- 固定细胞为10分钟与 500 ul 4% 甲醛在 PBS。
- 孵育5分钟在 500 ul 100 毫米 (pH 7.6)。
- Permeabilize 10 分钟的细胞在 500 ul 0.1% 海卫 X-100 在 PBS。
- 用 PBS 洗3x。
- 为每个盖玻片准备 50 ul 标签组合, 按以下顺序添加组件: 44.45 µL 的 PBS, 0.5 µL 铜 (II),4, 0.05 µL sulfo-Cy3-azide, 5 µL 钠抗坏血酸。
- 把 50 ul 的标签组合在一块 parafilm。用一双镊子和一根针举起盖玻片, 让它在标签混合的顶部休息, 表面上含有向下的细胞。确保没有气泡, 盖玻片的整个表面都在接触标签组合。在黑暗中孵化30分钟。
- 把这些细胞放回24井板井中, 用 PBS 冲洗三次。
- 安装与安装介质 (包括 DAPI, 以可视化原子核) 到玻璃幻灯片, 让他们干一夜。
- 使用荧光显微镜可视化了该公司的注册。使用适合 Cy3 的过滤器 (激发/发射: 552/570 nm)。
- 拍摄细胞的多张图片, 以便在每个条件下至少有100个细胞 (Cy3 和 DAPI) 进行量化。
- 使用以下公式量化纳入教育局的单元格百分比:
教育局阳性细胞 (%) = (教育局阳性细胞计数 (Cy3)/总细胞计数 (DAPI)) * 100 - 比较衰老细胞的结果与相应的治疗方法的对照。
注: 在同一样品上与 SA β-gal 进行共染色是可能的。认为细胞仍应在盖玻片上播种。
- p16、p21 和 SASP 的基因表达
- 准备一组感兴趣的基因 (50 µM 每个底漆)。
注: p16、p21 及相关 SASP 因素的 qPCR 是衰老状态的信息。本文所描述的协议使用通用探针库 (价目表) 系统进行相对量化, 使用实时 PCR。表 3显示了用于检测 CDK 抑制剂 p16 和 p21 以及最相关 SASP 成员的底漆的概述, 以及蛋白和肌动蛋白, 作为该化验的参考基因。表 3的最后一列登记用于每种化验的特定价目表探针。 - 为所需的化验准备单独的 qPCR 反应组合。总是包括参考基因以及根据表 4。
- 以重复或三份运行所有示例。
- 负载7.5 µL/井的 qPCR 反应混合在一个384井板上。
- 添加〜5的 cDNA 溶解在2.5 µL 的无 RNase 水。
注意: 最好有类似数量的 cDNA 的所有样本进行比较。这可以通过使用相同数量的 RNA 来实现反向转录。 - 用密封盖住盘子, 确保它正确地覆盖在盘子上的所有油井。
- 旋转板在 2000 x g 1 分钟。
- 使用以下协议在 Lightcycler 中运行40个周期的板块:
95°c 为7分钟
40周期95°c 为 5 s 和60°c 为三十年代
37°c 为1分钟 - 为了对结果进行分析, 使用建议的方法对 Livak 和同事分析 qPCR 数据24。使用蛋白或肌动蛋白作为参考基因计算ΔCt 值, 并使用适当的控制来计算ΔΔCt 价值的特定的衰老诱导治疗。
- 准备一组感兴趣的基因 (50 µM 每个底漆)。
- IL6 蛋白的表达与分泌
- 种子 5–10 x 104细胞在6井板 (5.2–10.5 x 103细胞/cm2) 的至少一个井中, 每个条件包含2毫升的 D10。治疗 (如果适用的话) 可以直接在这个盘子上进行, 或者, 已经被治疗的细胞可以被重新播种到24井板中。让它在播种后一夜之间站立。
- 取出培养基并更换2毫升的 DMEM 培养基,不加血清。正常条件下孵育24小时。
- 在15毫升管中收集培养基。
- 离心机样品在 300 x g 为5分钟培养基可以保存在-80 °c, 直到处理。
- 按照制造商的指示执行 ELISA。
- 衰老细胞相对于特定衰老诱导治疗的适当控制结果比较
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Representative Results
衰老成纤维细胞中 SA β-gal 染色的富集
β-乳糖酶 (β-加仑) 是一种酶, 表达在所有细胞和具有最佳 pH 值为 4.025,26。然而, 在衰老过程中, 溶酶体体积增大, 衰老细胞积累β-加仑。这种酶的增加使它有可能检测到它的活性, 即使在次优 pH 值 6.025,27。图 1A显示了增殖与衰老原代成纤维细胞中 SA β-gal 染色的代表性图像。细胞也看起来扩大, 并与不规则的细胞体。如前所述, 很难区分单个细胞, 因此与 DAPI 的共同染色有助于可视化和细胞计数 (图 1B)。必须在荧光显微镜下拍照, 才能观察 DAPI 染色。这意味着, 在明亮的田野通道上的图片将采取黑色/白色, 使 "蓝色" 的 SA β-gal 的染色将出现黑色的图片。值得注意的是, 并非样本中的所有细胞都是β-gal 的阳性。衰老诱导的效率是高度依赖于刺激-和细胞类型/应变使用。这里描述的协议产生 > 50% β-gal 阳性细胞在原发纤维细胞 (BJ 和 WI-38) 在我们的手。
衰老诱导后细胞吸收更少
在活性 dna 合成过程中, 对核苷类胸苷的模拟, 将被纳入 dna28。在对炔烃 cycloaddition 进行铜催化的叠氮化物 (CuAAC) 后, 在常规的胸苷中, 由于缺乏炔烃组28的反应, 可以直观地将其纳入 DNA。在这个特定的协议中, 正在使用一个 Sulfo-Cy3-azide。如果叠氮化物与炔烃的耦合发生, 细胞将在 Cy3 过滤器下显示荧光 (图 2A)。重要的是要考虑到, 通过执行的教育局的检测, 增殖细胞可以区别于非增殖细胞。非增殖性细胞可以是静止的或衰老的, 这意味着, 在这两种类型的细胞周期逮捕中, 该项研究无法区分。
衰老成纤维细胞 upregulate CDK 抑制剂 p16 和 p21
衰老细胞利用激酶抑制剂阻止细胞周期29。特别是 p16 和 p21 经常被测量作为衰老细胞的标记3。任何一个或两个标记通常上调衰老细胞, 上调是经常测量的转录水平。鼓励同时使用两个标记, 因为有些细胞在转录水平上不 upregulate p16, p21 是衰老15、17、30的普遍但不是特异的标记。图 3显示了 p16 和 p21 mRNA 在成纤维细胞衰老过程中的代表性相对 quantifications。其他技术, 如染色和/或西方印迹, 以检测蛋白质水平也是可能的。
衰老成纤维细胞显示 SASP
大多数衰老细胞转录 upregulate 几个基因编码的分泌蛋白, 这一现象被称为 SASP6。SASP 包括炎症的因素,如interleukins 和趋化因子, 或细胞外基质 (ECM) 降解,如基质金属蛋白酶, 但它是高度异构的。通过酶联免疫吸附剂 (ELISA) 测定 qPCR 或分泌蛋白水平, 可以评估 SASP 因子的诱导。图 4显示了一个代表性的图像, 显示 IL6 的上调在转录和分泌水平。我们只用 IL6 作为代表;但是, 鼓励从3.4 号议定书建议的清单中衡量 SASP 的多个成员。
图 1: 在衰老的原代成纤维细胞中富集 SA β-gal 染色.BJ 原发性包皮成纤维细胞 (PD 34.1) 通过暴露于电离辐射 (10) 而导致衰老。照射后十天, 细胞被染色βgal。(A) βgal 染色在 BJ 主要成纤维细胞中的代表结果, 无论是未经治疗 (上升) 或暴露于电离辐射 (下)。最终放大倍数: 100X。(B) 以 DAPI 为主要成纤维细胞的 SA β-加仑的代表性数字, 不论是否未经处理 (三个左面板) 或暴露于电离辐射 (三右面板)。DAPI 染色 (蓝色) 有助于可视化单个细胞促进量化。在明亮领域拍摄的图片显示为黑色/白色。因此, 在这些特殊的图片中, SA β-gal 染色将看起来像黑色核周斑点。最终放大倍数: 100X。(C) 在增殖 (Prol、白色) BJ 成纤维细胞与电离辐照处理的对应物 (森、蓝) 中, 对 SA β-gal 阳性细胞进行量化。量化是使用三生物复制与误差条显示标准误差的平均值。统计学意义是由两尾学生对三角洲 CT 值的 t 检验确定的。(n = 3, 电子扫描电镜, ** = p值 < 0.01)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在诱导衰老后, 细胞中吸收更多的干细胞.(A) 在增殖的 WI-38 成纤维细胞 PD 43.86 (左) 及其电离辐照的对应物 (右) 中, 有代表性的研究方法。最终放大倍数: 100X。(B) 在增殖 (Prol、白) BJ 成纤维细胞 (PD 38.7) 与辐照的对应物 (森、蓝) 的细胞中进行量化。量化是使用三生物复制与误差条显示标准误差的平均值。统计意义是由一个不成对的两尾学生 t 检验的增量-CT 值 (n = 3, 电子扫描电镜, ** = p值 < 0.01)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 衰老成纤维细胞 upregulate CDK 抑制剂 p16 和 p21.(A) 量化 p16 mRNA 表达的增殖 (Prol, 白色, PD 35.3) 或 5-aza 治疗的 BJ 细胞 (森, 蓝)。(B) 量化 p21 mRNA 表达的增殖 (Prol, 白色, PD 35.3) 或 5-aza 治疗的 BJ 细胞 (森, 蓝)。量化是通过使用三生物复制 (每两个技术复制) 与误差条显示平均值的标准误差进行的。统计意义是由一个不成对的两尾学生 t 检验的增量-CT 值 (n = 3, 电子扫描电镜, ** = p 值 < 0.01)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 衰老成纤维细胞显示分泌表型 (SASP).(A) 在 BJ 成纤维细胞中 IL6 mRNA 表达的量化 (Prol, 白色, PD 38.7) 或通过电离辐射诱导衰老 (森, 蓝)。(B) 在增殖 PD 38.6 (Prol、白色) 或电离辐射处理的 WI38 成纤维细胞中 IL6 蛋白表达的量化 (森, 蓝)。量化是使用三生物复制与误差条显示标准误差的平均值。在 qPCR 数据的情况下, 每个生物复制都有两个技术重复项。统计意义是由一个不成对的两尾学生 t 检验的增量-CT 值 (n = 3, 电子扫描电镜, ** =p值 < 0.01)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 稀释 剂 | 库存解决方案 | 工作解决方案 | 稀释治疗 | 最终浓度 | |
| 萨哈 | Dmso | 100毫米 | 1毫米 | 1:1, 000 | 1µM |
| 丁酸钠 | 无菌水 | --- | 1米 | 1:250 | 4毫米 |
| 5-aza-2 '-脱氧胞苷 (5-aza) | Dmso | 100毫米 | 10毫米 | 1:1, 000 | 10µM |
表 1: 用于 Epigenetically 导致衰老的不同治疗方法的库存和工作解决方案。
| 组件 | 体积 | 最终浓度 |
| 20毫克/毫升 X 加仑 | 1毫升 | 1毫克/毫升 |
| 0.2 米柠檬酸/磷酸钠缓冲液 ph 值6。0 | 4毫升 | 40毫米 |
| 100毫米盐钾 | 1毫升 | 5毫米 |
| 100毫米氰化钾钾 | 1毫升 | 5毫米 |
| 5米氯化钠 | 0.6 毫升 | 150毫米 |
| 1米氯化镁 | 0.04 毫升 | 2毫米 |
| 水 | 12.4 毫升 | - |
| 总 | 20毫升 |
表 2: 用于衰老相关的染色溶液的组成 (SA)-β-加仑染色。
| 目标 | 前进底漆 (5 ' > 3 ') | 反向底漆 (5 '-> 3 ') | 价目表探头 | ||
| 蛋白 | CTTCGTCTCCGCCATCAG | CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC | #40 | ||
| 肌动蛋白 B | ccaaccgcgagaagatga | ccagaggcgtacagggatag | #64 | ||
| P16 | GAGCAGCATGGAGCCTTC | CGTAACTATTCGGTGCGTTG | #67 | ||
| P21 | tcactgtcttgtacccttgtgc | ggcgtttggagtggtagaaa | #32 | ||
| IL6 | CAGGAGCCCAGCTATGAACT | GAAGGCAGCAGGCAACAC | #45 | ||
| IL8 | GAGCACTCCATAAGGCACAAA | ATGGTTCCTTCCGGTGGT | #72 | ||
| IL1a | GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA | TGCTGACCTAGGCTTGATGA | #6 | ||
| CXCL1 | CATCGAAAAGATGCTGAACAGT | ATAAGGGCAGGGCCTCCT | #83 | ||
| CXCL10 | GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT | GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA | #34 | ||
| CCL2 | AGTCTCTGCCGCCCTTCT | GTGACTGGGGCATTGATTG | #40 | ||
| CCL20 | GCTGCTTTGATGTCAGTGCT | GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG | #39 | ||
| PAI1 | AAGGCACCTCTGAGAACTTCA | CCCAGGACTAGGCAGGTG | #19 | ||
| MMP1 | GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA | TTTGTGCGCATGTAGAATCTG | #7 | ||
| MMP3 | CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT | CATCTTTTGGCAAATCTGGTG | #72 | ||
| MMP9 | GAACCAATCTCACCGACAGG | GCCACCCGAGTGTAACCATA | #53 | ||
表 3: 引物序列及其相应的价目表探针检测人源样品中衰老标记的 mRNA。
| 组件 | 容积/样品 |
| Sensifast 探头罗火箭混合体 | 5µL |
| 底漆套 (50 µM) | 0.1 µL |
| 价目表探头 | 0.1 µL |
| 核酸酶水 | 2.3 µL |
| cDNA (4 ng) | 2.5 µL |
| 总 | 7.5 µL |
表 4: 价目表系统的 qPCR 反应组合的组成。
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Discussion
这里解释的协议被优化了为人的主要成纤维细胞, 特别是 BJ 和 WI-38 细胞。复制衰老, 电离辐射和阿霉素的协议已成功地应用于其他类型的成纤维细胞 (HCA2 和 IMR90) 和其他细胞类型 (即新生儿黑色素细胞和角质形成素或 iPSC 衍生心肌细胞)在我们的实验室里。然而, 可以通过调整一些细节, 如种子细胞数量, 方法和化学物质来帮助细胞附着/分离到塑料支架上, 以及治疗的剂量以避免毒性, 来优化其他细胞类型的适应性。
甚至对原发纤维细胞的使用也带来了一些挑战。衰老细胞通常比它们的增殖对应物更难分离, 而且它们通常对 trypsinization 或任何其他类型的分离方法更敏感, 这意味着分离后的生存能力略低于增殖细胞。不同的衰老诱导方法的适当控制选择是困难的。例如, 对于以药物为基础的治疗, 如阿霉素, 我们建议对该车进行短时间的治疗:24 小时的 PBS, 在阿凡霉治疗细胞的控制样本, 然后立即收割/处理的情况下。可以说, 被诱导衰老的细胞在治疗后经过延长的培养时间 (阿霉素治疗细胞的六多天的培养), 在清除 PBS 后, 控制细胞应该培养相等的时间。然而, 这样长的文化将允许细胞进一步分裂, 变得过度汇合或需要进一步传代和增加 PD. 过度汇流可能导致衰老标记, 如 SA β-gal 出现, 尽管细胞保持其增殖潜能31。增加的 PD 将使他们更接近他们的复制限制 (和复制衰老), 使他们不比他们的阿霉素治疗的对应。同样的情况也适用于其他治疗方法。我们已建议我们认为对每个案件更适用的管制措施。
大多数用于诱导细胞衰老的技术似乎相对简单和直接, 但许多因素会影响实验结果。例如, 成纤维细胞常规细胞培养培养基的正常葡萄糖浓度为4.5 克/升。然而, 对于某些细胞类型, 如干细胞, 较低浓度的葡萄糖延长其增殖潜能32, 而对其他人更高的浓度可能导致过早衰老33。此外, 由于衰老细胞是高度代谢和花费大量的能量来产生分泌因子34, 其他衰老相关的表型可能会受到葡萄糖浓度振荡的影响。
细胞培养基中另一个潜在的变量是血清。血清的组成通常没有定义, 并根据动物来源和批次变化。特别是, 生长因子和促炎蛋白的数量会影响衰老35。我们建议将同一批次的血清用于整个实验, 以避免不必要和混杂的变异。然而, 一些不可避免的技术条件, 如使用无血清培养基用于某些 ELISA 的协议, 可以减少 SASP 表达。
氧张力对完全的衰老诱导是重要的。缺氧可抑制 geroconversion, 使细胞不增殖, 但不能不可逆转地被逮捕36。然而, 实验装置中最常见的问题不是缺氧而是高氧。事实上, 标准的养殖条件通常使用20% 氧作为 "normoxia", 但大多数细胞类型的生理条件较低。老鼠囊胚呈现衰老的标记 (SA-βgal 和 DNA 损伤), 当培养在20% 氧, 不同于他们在体内衍生的对应或相同的细胞培养在5% 氧37。此外, 小鼠成纤维细胞培养在更多的生理条件 (3% 氧气), 而不是在常规的 (20% 氧气) 显示 SASP38。在这里, 我们为所有的文化和实验使用了5% 氧气, 我们敦促研究人员重新考虑用于特定细胞类型的氧气浓度。
最后, 另一个需要考虑的因素是衰老细胞的内在异质性。一方面, 不同的细胞类型, 甚至细胞株显示衰老相关表型的差异。例如, 一些成纤维细胞不 upregulate p16 的转录水平后, 衰老感应15,16,17, 因为它也显示在图 3A, 其中尽管看到了上调的p16, 这是没有统计学意义的。P16 也控制在平移和后平移水平, 因此, 测量蛋白质水平可能在某些情况下表明, 这种 CDK 抑制剂的活动增加。然而, 可能有些细胞只是依赖其他 CDK 抑制剂如 p21。我们建议测量两者的转录水平。SASP 的确切组成也取决于产生它的细胞3。此外, 一些细胞组成性表达高水平的β-乳糖酶, 给出了一个积极的结果, SA β-gal 染色, 这不一定表明衰老3。在某些情况下, 通过在 SA β gal 染色协议中减少染色液的孵化时间, 可以克服这个问题。如前所述, 过度汇合的细胞也可能与 SA β-gal 染色, 而不会衰老31, 因此我们敦促研究人员培养细胞稀少, 以执行这种染色。另一方面, 衰老表型本身不稳定39。SASP 的组成和其他衰老标记的出现是时间依赖性的17,40。在这里, 我们建议在每次治疗后, 细胞被认为完全衰老, 并在我们的实验室经常使用的时间点。重要的是, 在较短的时间点测量标记可能导致阴性结果由于不完全衰老40。而且, 由于在大多数的治疗中, 细胞的百分比不会变衰老, 使用较长的时间点可能给少数非衰老细胞提供足够的时间来扩张和超越文化, 减少衰老标志物的表达。对于衰老细胞的异质性和不同标记的多重警示, 我们高度鼓励研究人员在同一样本中使用多个衰老标记。
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Disclosures
N/A
Acknowledgments
我们感谢 Demaria 实验室的成员进行了卓有成效的讨论, 并 Thijmen van 弗利特共享关于紫外线诱发衰老的数据和协议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
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