Summary
Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) son una clase de pequeños RNAs noncoding que regulan la expresión génica celular post-transcriptionally. MiRNAs atar a la región 3' no traducida (UTR) de blanco mRNA para inhibir la traducción de la proteína o en algunos casos causar degradación del mRNA. La Unión de lo miRNA a los 3' UTR del mRNA es mediada por una secuencia de semilla de 2 – 8 nucleótidos en el extremo 5' de miRNA blanco. Mientras que el papel de miRNAs como moléculas reguladoras celulares está bien establecido, la identificación de los mRNAs de destino con relevancia funcional sigue siendo un desafío. Herramientas bioinformáticas han sido empleados para predecir las secuencias dentro de los 3' UTR de los mRNAs como blancos potenciales para el atascamiento de miRNA. Estas herramientas también se han utilizado para determinar la conservación evolutiva de estas secuencias entre especies relacionadas en un intento de predecir el papel funcional. Sin embargo, estos métodos a menudo generan resultados falsos positivos y se limitan a predecir la interacción canónica entre miRNA y mRNA. Por lo tanto, los procedimientos experimentales que miden la Unión directa de miRNA a su objetivo de mRNA son necesarios establecer interacción funcional. En este informe, describimos un método sensible para la validación de interacción directa entre el celular miRNA miR-125b y 3' UTR de PARP-1 mRNA. Elaboramos un protocolo en el que fueron transfectados imitadores sintéticos biotinilado-miRNA en células de mamíferos y el complejo de miRNA-mRNA en el lisado celular fue derribado con bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Por último, el objetivo de que mRNA en el ácido nucleico de tiró-abajo complejo se cuantificó usando una estrategia basada en qPCR.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) son pequeños no-codificación RNAs que regulan negativamente la expresión de proteína1. Precursores de miRNA residen en racimos a través de muchas regiones del genoma, más frecuentemente en las regiones intergénicas e intrones de genes proteína-codificación2,3. Biogénesis de miRNAs implican la transcripción de los pri-miRNAs de codificación miRNA genes4. Los pri-miRNAs son sometidos a procesamiento secuencial, primero en el núcleo y luego en el citoplasma para generar miRNAs maduros trenzado solo4,5. Posteriormente, los miRNAs maduros se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC): un complejo de ARN-proteína multimérica que incluye un miembro de la familia de Argonaute proteínas objetivo reconocimiento4,5, 6,7. MiRNAs maduros en el complejo RISC predominante se unen a los 3' UTR de destino mRNAs8,9,10 pero de vez en cuando también puede enlazar en la codificación y la región 5' UTR del mRNA10,11 . La Unión de miRNA en el mRNA secuencias resultados en traslacional silenciamiento12,13,14 y en algunos casos mRNA desestabilización15. Puesto que un único miRNA puede apuntar muchos mRNAs, estas moléculas reguladoras están involucradas en casi todos los procesos celulares y han sido implicadas en varias enfermedades condiciones16,17,18.
Comprensión detallada de cómo miRNAs regulan vías celulares requiere la identificación de los mRNAs de destino. Múltiples plataformas de Bioinformática están disponibles para predecir miRNA:mRNA supuesta interacciones19,20. Estas predicciones se basan en Watson-Crick base maridaje perfecto entre la secuencia de semilla de 2 – 8 nucleótidos de la miRNA y una secuencia complementaria dentro de la meta ARNm4,21. Además, estas herramientas generan estructura secundaria del miRNA:mRNA duplex, calcular parámetros termodinámicos de esta interacción molecular y mostrar la conservación de los sitios de unión a través de especies para mejorar la relevancia funcional de la meta predicción. Lamentablemente, estas herramientas también tienen la limitación de la predicción de falsos objetivos positivos a una tasa muy alta (~ 27 – 70%)15,22. Lo más importante, estas plataformas en silico incapaces de reconocer las interacciones no-canónico de miRNAs con sus objetivos23. Por lo tanto, tales análisis predictivos son a menudo combinados con métodos experimentales para validar objetivos funcionalmente relevantes.
Varios enfoques se han desarrollado para validar experimentalmente la interacción miRNA:mRNA. Experimentos genéticos con miRNA imitadores, esponjas e inhibidores que alteren los niveles de miRNAs en la célula proporcionan pistas por su efecto regulador sobre el objetivo gene expresión24,25,26. Además, reportero basado en análisis mediante la transfección de un clon que contiene la región 3' UTR de los imitadores de mRNA y miRNA blanco o inhibidores en las células proporcionan pruebas de la función reguladora de miRNAs26. Mientras que estos métodos son cruciales para el estudio de la regulación postranscripcional de la expresión génica por miRNAs, transfección eficiencia y pleotropic efectos de las alteraciones en los niveles de miRNA de celular son principales limitaciones de estos enfoques genéticos23, 26. Por lo tanto, se emplean métodos bioquímicos complementarios que probe una interacción directa entre miRNA y su objetivo para entender mejor la función celular de miRNAs.
Un método ampliamente utilizado para el estudio de la interacción directa entre miRNA y su objetivo es la inmunoprecipitación de lo complejo RISC seguido por la detección de objetivo de mRNA en el complejo27,28,29,30 . Recientemente, un método mejorado de la trampa RISC también fue utilizado para identificar objetivos de miRNA; parejas estabilización de objetivos dentro de los intermedios de RISC-miRNA-mRNA con la purificación de las blancos del mRNA. Sin embargo, estos methodsface los desafíos inherentes de interacciones no específicas entre proteínas RNA y RNA-que ata que generalmente están separadas en compartimentos celulares31,32. Además, estos ensayos son dependientes en la presencia de antes2 proteínas por inmunoprecipitación de los complejos RISC33. Dado que antes2 no es el único argonaute para mediar las interacciones miRNA:mRNA eficiente, exclusión de otras argonautes podría conducir a resultados sesgados34. Por lo tanto, se necesitan estrategias alternativos para estudiar la Unión directa de miRNA al mRNA.
En este informe, elaboramos un enfoque de un solo paso para sondear la interacción directa entre un miRNA y su objetivo de mRNA. En primer lugar, 3' ácidos nucleicos (LNA) biotinilado bloqueado miRNA imitadores son transfectados en células de mamíferos. Entonces, el miRNA:mRNA en el lisado celular es capturado mediante bolas magnéticas recubierta de estreptavidina. El objetivo de ARNm a su complementaria miRNA se cuantifica mediante qPCR.
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Protocol
1. transfección de 3'-biotinilado miRNA
Nota: Realice los siguientes pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril.
- Semilla 4 x 105-5 x 105 HEK-293T células por pocillo en 2 mL de completan modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) [DMEM suplementado con 10% de suero Fetal bovino (FBS) y 1 x antibiótico Pen-strep]. Las células en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 durante la noche de la cultura.
- Al día siguiente, Compruebe la salud y la adherencia de las células plateadas bajo un microscopio de luz.
Nota: Asegúrese de que las células tienen adheridos y logró morfología apropiada antes de proceder al siguiente paso. Las células HEK-293T están normalmente preparadas para transfección 18 – 24 h post chapado. - En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mL, diluir 75 picomoles de miRNA biotinilado en 200 μL de medio esencial mínimo. Transferir esta mezcla a otro 1,7 mL microcentrífuga tubo que contiene liposomas basado en la transfección reactivo (8 μL/pocillo) diluido en 200 μL de medio esencial mínimo. Mezclar muy bien, pero suavemente, transfiriendo e incubar durante 20-25 min a temperatura ambiente para permitir la formación de los complejos de transfección.
- Quitar los viejos medios de comunicación de la placa de cultivo bien 6 mediante pipeteo suave y llenar cada pozo con 1.6 mL de DMEM completo recién preparado (sin 1 x antibióticos Pen-strep).
- Añadir los complejos de transfección (de 1,3) mediante goteo a las células en la placa de 6 pozos con una pipeta bien calibrada. Agitar la placa suavemente añadiendo los complejos para asegurar su distribución uniforme en toda la placa.
Nota: Este paso es muy importante para lograr alta eficiencia transfección y debe realizarse con cuidado y paciencia. - Las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 36 h de cultivo.
2. preparación de Streptavidin recubierto de granos magnéticos —
- Resuspender las bolas magnéticas de estreptavidina completamente por Vortex. Transferencia 30 μl de la suspensión de grano (por ejemplo) a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa de 2 mL.
- Coloque el tubo que contiene la suspensión de grano en el stand de separador magnético del grano ("imán" de ahora en adelante) por 2 min. Después de asegurarse que los granos son atraídos hacia el lado del tubo en contacto con el imán, retire con cuidado el sobrenadante usando una micropipeta.
- Añadir 100 μl de tampón de lavado del grano (10 mM Tris-Cl de pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) a los granos. Retire el tubo del imán. Vortex por 15 s a temperatura ambiente para lavar los granos.
- Coloque el tubo que contiene granos en el imán por 2 min y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
- Repita los pasos 2.3 y 2.4 para un total de tres lavados. Después del paso del último lavado, retire el tubo del imán.
- Añada 100 μl de Rnasa liberación de solución (0,1 M NaOH, 0.05 M NaCl) a los granos, mezclar bien todo con un vórtex durante 15 s, incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Coloque el tubo que contiene granos en el imán por 2 min y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
- Repita el paso 2.6 para un total de tres veces.
- Añadir solución de resuspensión de grano (0.5 M NaCl) a los granos, agitarlos durante 15 s e incubar a temperatura ambiente 5 minutos colocar los granos resuspendidos en el imán por 2 min y retire con cuidado el sobrenadante.
- Añadir 200 μL de bolas bloqueando (1 μg/μl de BSA, tRNA de la levadura de 2 μg/μl) de solución para los granos. Mezclar con un vórtex suave de 15 s a temperatura ambiente. Incubar a 4 ° C durante 16 h (noche) en un agitador de tubo múltiples.
3. preparación de Lysates de la célula
- Cosechar las células HEK-293T transfected raspando suavemente con un raspador celular estéril dentro de la campana laminar, luego transferir cada muestra en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL.
- Sedimenten las células raspadas por centrifugación a 1.500 x g por 5 min Resuspender el precipitado en 1 x estéril PBS (tampón fosfato salino), pH 7.2. Centrifugar nuevamente a 1.500 x g durante 5 min obtener un pellet de restos de medios. Inmediatamente le hunda el tubo que contiene pellets en hielo.
- Preparar el tampón de lisis celular completo fresco (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 5mM DTT, 0.5% IGEPAL, 60 Superase U/mL, 1 x inhibidor de la proteasa).
Nota: Un stock de tampón de lisis de la célula falta IGEPAL, Superase y proteasa inhibidor cóctel se puede preparar con antelación y conservado a temperatura ambiente. Prepara un nuevo lote de tampón de lisis celular completa añadiendo los suplementos arriba en las concentraciones finales recomendadas para el tampón de lisis celular de stock y almacenamiento en hielo. - Añadir 260 μl de tampón de lisis celular completa helada a cada muestra en el tubo de microcentrífuga (es decir, cada tubo de microcentrífuga contiene células extraídas de un pozo de la placa de 6 pozos) y resuspender el precipitado de células en una suspensión homogénea mediante pipeteo.
- Lyse las células utilizando el método de congelación y descongelación: incubar los tubos a-80 ° C por 10 – 15 minutos. Entonces, permita que las células se descongele el hielo.
- Centrifugue la célula resultante lisada a 16.000 x g por 5 min en una centrífuga de mesa refrigerada a 4 ° C.
- Transferencia de la célula despejada lisada a un tubo de microcentrífuga estéril 1,7 mL en hielo. Deseche los pellets.
Nota: El volumen final de despejó lisado debe ser ~ 240 – 250 μl. - Añadir 5 M NaCl a la despejada lisado a una concentración final de 1M y mantener las muestras en hielo.
4. elaboración de bolas magnéticas de estreptavidina-II
- Preparar fresco lavado abatible completo buffer (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase y 1 x inhibidor de la proteasa cóctel)
Nota: Una culata desplegable de tampón de lavado falta IGEPAL, Superase y proteasa inhibidor cóctel se puede preparar con antelación y conservado a temperatura ambiente. Prepara un nuevo lote de tampón de lisis celular completa añadiendo los suplementos arriba en las concentraciones finales recomendadas para el tampón de lisis celular de stock y almacenamiento en hielo. - Coloque el tubo que contiene los granos preparados (en el paso 2.9) en el imán para 2 minutos cuidadosamente retiren y descarte el sobrenadante.
- Añadir 150 μL de tampón de lavado completo helada del desplegable a los granos. Vortex por 15 s e incubar a temperatura ambiente durante 30-60 s. lugar los tubos en el imán durante 2 min con cuidado retiren y descarte el sobrenadante.
- Repita el paso 4.3 para un total de 3 veces.
- Resuspender los granos en 300 μL de tampón de lavado completo desplegable.
5. pull-down de complejos de mRNA-miRNA blanco
- Transferir 300 μL de la célula lisada (de paso 3.8) para el tubo de microcentrífuga con 300 μL de granos (desde el paso 4.5).
- Incubar la mezcla en un mezclador oscilante por 1 h a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo en el imán de 5 minutos Retire con cuidado y deseche el sobrenadante.
- Añadir 300 μL de tampón de lavado completo helada del desplegable a los granos. Vortex por 15 s a temperatura ambiente y lugar el tubo sobre el imán por 5 min con cuidado retire y descarte el sobrenadante.
- Repita el paso 5.4 dos veces más.
- Resuspender los granos en 100 μl de agua libre de nucleasas e incubar en hielo.
6. total extracción de ARN, síntesis de cDNA y qPCR
- Extraiga el ARN total de las cuentas resuspendidas (del paso 5.6) usando un método apropiado (véase Tabla de materiales). Resuspender el RNA total extraído en 25 μl de agua libre de nucleasa. Determinar la concentración de RNA y calidad utilizando un espectrofotómetro (absorbancia a 260/280). Preparar una bolsa de trabajo de ARN a 50 ng/μl.
- Realizar síntesis de cDNA, en triplicado, usando 50 ng de RNA total (en el paso 6.1) mediante una síntesis de cDNA correspondiente kit (véase Tabla de materiales) usando las cartillas de oligo dT en un volumen final de 20 μl (tabla 1). A continuación, carga los tubos de PCR en el instrumento de qPCR para realizar ciclos térmicos según las condiciones descritas en la tabla 2.
-
Realizar la qPCR en el CDNA (desde el paso 6.2) usando química SYBR Green (véase tabla de materiales):
- Llevar a cabo todas las reacciones de la qPCR en triplicado en una placa de 96 inferior bien claro en condiciones estériles.
- Alícuota 9 μl de la mezcla de reacción de la qPCR master mix (ver tabla 3) en cada pocillo de la placa. Luego, añadir 1 μl de cDNA en cada pocillo para alcanzar un volumen final de 10 μl. sellar la placa PCR utilizando sellador de placas PCR resistente al calor y la carga en el instrumento de qPCR
- Realizar ciclos térmicos según las condiciones descritas en la tabla 4.
- Normalizar los niveles de expresión (valores de Ct) de cada muestra que los niveles de expresión del control revuelto. Use estos valores para calcular el doble de cambios en la expresión.
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Representative Results
MiRNAs regulan procesos celulares atando a mRNAs de destino. Por lo tanto, identificar objetivos de mRNA son una clave para entender la función de miRNA. Aquí elaboramos un método para identificar el destino de mRNA de miRNA celular. Este protocolo es una adaptación de Wani et al. 35 con la modificación de utilizar biotinilado miRNA basada en LNA imita a telecine blanco mRNA. El uso de oligonucleótidos basadas en LNA imitadores mejora la especificidad del atascamiento de destino debido a la mayor estabilidad del anillo de ribosa modificada sin efectos tóxicos36,37,38. Se empleó este método para bajar de PARP-1 mRNA como destino de celular miRNA miR-125b. El nivel más alto de la expresión de miR-125b se detecta en el tejido cerebral que regula la función neuronal39,40. En un intento por identificar los objetivos de la miR-125b en células neuronales, nos informó recientemente que miR-125b regula negativamente la expresión de PARP-1 por Unión a los 3' UTR de PARP-1 mRNA41.
Desplegable de miRNA:mRNA complejo
Utilizamos las células HEK-293T para estudiar la interacción entre el miR-125b y PARP-1 mRNA, puesto que estas células son ampliamente utilizadas en estudios de biología molecular y celular, bioquímica. Un esquema del protocolo usado para el destino de mRNA se representa en la figura 1. En primer lugar, las células HEK-293T (4 x 105-5 x 105 células por pocillo) fueron sembradas durante la noche en una placa de cultivo de tejidos bien 6 y se incubó a 37 ° C con 5% CO2 para 18 – 24 h. Después de eso, 75 picomoles de imitadores de miR-125b biotinilado 3' y 3'-biotinilado revuelto controles fueron transfected en las células usando liposomas basado en método de transfección. Transfected las células se incubaron a 37 ° C y 5% CO2 para un adicional 36 h y cosecha. Después de eso celulares lisados de células transfected se prepararon por el método de lisis de congelación y descongelación. Los lisados celulares recién preparados se incubaron con las bolas magnéticas bloqueado streptavidin recubierto en un mezclador oscilante superior de banco por 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, los granos fueron procesados y lavado uso recién preparado el tampón de lavado hacia abajo de helada en el separador magnético. Por último, los granos se resuspendió en 100 μl de agua libre de nucleasa para su posterior análisis.
Detección de mRNA de destino en el desplegable miRNA:mRNA complejo
El objetivo de detectar mRNA de miR-125b de la mezcla hacia abajo, se empleó un análisis de qPCR (figura 1). Diseño de cartillas de avance y retroceso (FP y RP) dentro del ORF para amplificar mRNA de PARP-1 (figura 2tabla 5b). También diseñamos juegos de cebadores para la detección de ARNm de p53, un conocido destino del miR-125b42, como control positivo e incluye primers para amplificar actina ARNm como control negativo inespecífico. Además, para confirmar aún más la especificidad de la amplificación, diseñamos cebadores para la detección de las regiones 3' UTR de PARP-1, p53 y actina. Realizamos la qPCR utilizando los métodos descritos en el protocolo (sección 6).
La figura 3 muestra la amplificación de qPCR base de blanco del mRNA en relación con controles codificados de los granos purificados. El nivel de PARP-1 mRNA fue notablemente mayor en las muestras de tiró-abajo con imitadores de miR-125b biotinilado en comparación con los controles codificados. Como se esperaba, mayores niveles de mRNA del positivo controlan de ARNm de p53 y mínima de la actina de control negativo que se observó mRNA en estas muestras. Similares niveles de amplificación fueron obtenidos usando los cebadores dirigidos a los 3' UTR de PARP-1 y p53 en comparación con la actina de control negativo (figura 3B). La qPCR resultados de las regiones ORF (Figura 3A) y 3' UTR regiones (figura 3B) de PARP-1 mRNA y mRNA p53 demostró algunos niveles de variabilidad. Varios factores como la afinidad de Unión, número de sitios de unión de miRNA y diferencias en la secuencia de primer amplificación dependiente puede contribuir a los niveles variables de amplificación en la figura 3. Sin embargo, estos datos apoyan fuertemente la viabilidad y la especificidad del método para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular.
Figura 1: representación esquemática del protocolo para el ensayo de captura de destino usando biotinilado miRNA imitadores de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: diseño de la cartilla para la amplificación de las blancos del mRNA. Representación esquemática de los iniciadores utilizados para detectar el blanco mRNA de miR-125b. Un juego de primers (Figura I) fue diseñada dentro de la región ORF de las transcripciones y el otro set de primers (sistema II) fue diseñado en la región 3' UTR de los genes diana. FP y RP representan cartillas de avance y retroceso para cada conjunto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: identificación de objetivos de la miR-125b por qPCR. (A) niveles del mRNA usando la cartilla I, que amplifica la región ORF de blanco mRNA. Niveles más altos de expresión de PARP-1 y p53 mRNA (control positivo) se observaron en comparación con actina ARNm (control negativo). (B) amplificación de la región 3' UTR de blanco mRNA usando la cartilla ajuste II. No hay amplificación se observó en los controles sin plantilla (NTC). Todas las reacciones fueron realizadas en triplicado y los datos se analizaron utilizando el software de análisis de datos apropiado basado en el método 2-ΔCt . Barras de error representan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Stock | Volumen final de reacción μL 20 |
| Plantilla (RNA) | 50 ng/μl | 1,0 ΜL |
| Tampón de reacción | 5 x | 4,0 ΜL |
| Cartilla de OLIGO dT | Acción principal | 2 ΜL |
| De la transcriptasa reversa | Acción principal | 1 ΜL |
| Agua destilada libre de nucleasas | - | 12 ΜL |
| Volumen de reacción total | 20 ΜL |
Tabla 1: mezcla de la reacción de síntesis de cDNA.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 min |
| 95 ° C = 5 min |
| 10 ° C = Hold |
Tabla 2: cDNA síntesis ciclismo condiciones térmicas.
| Componente | Stock | Volumen final de reacción en 10 μL |
| producto cDNA | - | 1,0 ΜL |
| iTaq mezcla Universal SYBR | 2 x | 5.0 ΜL |
| Destino (ORF/3 ' UTR) F.P. | 10 ΜM | 0.5 ΜL |
| Destino (ORF/3 ' UTR) R.P. | 10 ΜM | 0.5 ΜL |
| Agua destilada libre de nucleasas | - | 3 ΜL |
| Volumen de reacción total | 10 ΜL |
Tabla 3: mezcla de reacción de qPCR.
| 95 ° C = 10 min |
| 30 ciclos de: |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Análisis de la curva del derretimiento |
| S 65 ° C = 31 |
| Tasa de rampa lineal = 0,5 ° C/s |
| Adquisición = intervalos de 0,5 ° C |
Tabla 4: qPCR ciclismo las condiciones térmicas.
| (A): Oligos biotinilado | ||
| Biotinlyated Oligos | Stock | Secuencia (5' a 3') |
| ha-miR-125b | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-biotina |
| Control de revuelto | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-biotina |
| (B) cartillas | ||
| Primer objetivo (ORF) | Stock | Secuencia (5' a 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| ACTINA (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| ACTINA (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) cartillas | ||
| Primer objetivo (3' UTR) | Stock | Secuencia (5' a 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Tabla 5: Nombres de oligonucleótidos y secuencias.
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Discussion
Identificación de dianas de mRNA de miRNAs celular es importante para la comprensión de su función reguladora. Se emplean varias herramientas computacionales para predecir objetivos basados en la complementariedad de secuencia de semillas y la conservación del destino secuencias19,20. Aunque estas herramientas son valiosas, pueden generar altos niveles de falsos positivos y falsos negativos. Por lo tanto, estas predicciones están acompañadas con métodos experimentales como la inmunoprecipitación de RISC complejo y desplegable de miRNA:mRNA complejo para confirmar la Unión directa de miRNAs a sus objetivos respectivos27,31. Este informe detalla una estrategia experimental que utiliza biotinilado miRNA imita a telecine blanco mRNA. Desplegable de biotina puede utilizarse para la identificación de objetivos de miRNA con alta sensibilidad y bajo índice de falsos positivos35,43. Por lo tanto, este método también puede ser explotado para la identificación de objetivos de miRNA por acoplamiento proyección basada en la secuencia de la piscina de RNA capturada. Sin embargo, hay varias limitaciones a este método44. Sobreexpresión de un miRNA exógeno podría modificar la red transcripcional de las células, provocando cambios consiguientes en el mRNA que no son debido a la regulación de miRNA. Éstos podrían superarse mediante el uso de cantidades muy bajas de mímica para no perturbar la regulación de los miRNA endógenos. Además, controles adecuados son necesarios cuando miRNAs exógeno se expresan para evitar atascamiento no específico. Cuidadoso lavado y bloqueo de pasos efectivamente puede minimizar el ruido de fondo y aumentar la especificidad de la miRNA dirigida. Pocos estudios han demostrado que las modificaciones de extremos 3' o 5' miRNA no son bien tolerados45, sin embargo, varios estudios han utilizado eficientemente biotina tagged miR-imitadores como una herramienta eficaz para explorar metas de mRNA.
La otra ventaja de este método es la utilización de base de LNA (bloqueo ácido nucleico) miRNA imitadores. La modificación de ácidos nucleicos LNA permite formación de duplexes estable oligonucleótidos con afinidad alta46,47. Además, el encargo hecho biotinilado LNA miRNA imitadores consisten en tres hebras de RNA. Un filamento de miRNA biotinilado 3' secuencia según la anotación miRBase y un filamento del pasajero complementario a la miRNA que se divide en dos hebras de RNA LNA modificado47. RISC incorpora sólo la hebra de miRNA mientras el pasajero dos filamentos son rápidamente degradados mejorando así la especificidad de la blanco. Para aumentar la confianza de nuestros resultados, hemos incluido también un p53 objetivos validados de miR-125b como β-actina, que no tiene un sitio de unión de miR-125b en su mRNA como control negativo y control positivo. Los resultados obtenidos usando este método con estos controles (figura 3) muestran especificidad de identificación de ARNm objetivo. Aunque LNA miRNA imitadores estabilizaran y mucho favorecen de Watson-Crick base que se aparea, se debe señalar que el uso de LNA miRNA imita con etiqueta de biotina eliminará ni falsos positivos ni negativos. Por otra parte, es probable que puede resultar en confirmación de predicciones computacionales que no pueden ser biológicamente relevantes. Por otro lado, si este método es junto con la secuencia para identificar objetivos de mRNA, falsos negativos pueden generar, porque imita a LNA favor base canónico maridaje podrá excluir de la base no-canónico maridaje de las interacciones que se producen con miRNAs nativo.
El protocolo presentado aquí está adaptado de Wani et al., con varias modificaciones35. Para reducir aún más el ruido de fondo, hemos incorporado pasos de lavado amplia, modifica los parámetros de eficiencia de transfección, preparación de buffer e incubación, las condiciones de telecine y PCR adquisición de datos y análisis. Además, usamos dos conjuntos de primer para amplificar el blanco mRNA después el pull-down, sistema diseñado para amplificar una región de la ORF de blanco mRNA y el segundo conjunto de cebadores para amplificar una región dentro de los 3' UTR del blanco mRNA. Utilización de dos sistemas de cartillas mejora la especificidad para el enriquecimiento de mRNA de la blanco.
Cabe señalar que una limitación de este método es un nivel basal de ruido que surge de objetivos específicos no. Otras modificaciones tales como mejoras en el bloqueo, las condiciones de incubación y lavado pueden proporcionar sensibilidad y mayor especificidad del objetivo. En Resumen, el ensayo que se describe en este informe es estrategia basada en un método rápido y confiable que puede ser adoptado para validar las blancos del mRNA de miRNAs mediante una PCR.
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Disclosures
Los autores no declaran a no financieros y los intereses en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 y MD007586 (en C.D.). El trabajo fue apoyado también por el RCMI Grant G12MD007586, el Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, el centro de investigación traslacional de Meharry (MeTRC) CTSA conceder (U54 RR026140 de NCRR/NIH, el U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH y del centro de Tennessee para el SIDA Investigación (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
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