Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

Abstract

הקרנה עבור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות שמרים 2-היברידית וזמינותו כבר זמן רב כלי יעיל, אך השימוש בה במידה רבה הוגבלה לגילוי של interactors גבוהה-זיקה כי הם מאוד מועשרים בספריה של מועמדים אינטראקציה. בתבנית מסורתית, שמרים 2-היברידית וזמינותו יכולות להניב מושבות רבות מדי לנתח כאשר ניצח ב לכתחילה נמוך שבו זיקה נמוכה interactors שעשויים להימצא. יתר על כן, ללא חקירה מקיפה ושלמה של הספרייה אותו נגד פלסמידים שונים פיתיון, ניתוח השוואתי אינה יכולה להיות מושגת. למרות חלק מבעיות אלו ניתן לטפל באמצעות ספריות טרף ערוכים, עלות והתשתיות הדרושים להפעלת מסכי כזה יכול להיות אסורה. כחלופה, אנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות ארעי, אינטראקציות חלבון סטטי בתוך מסך אחד ניצול אסטרטגיה כינה DEEPN (העשרה דינמי עבור הערכה של חלבונים רשתות), אשר משלבת רצפי DNA תפוקה גבוהה וחישוביות לעקוב אחר ההתפתחות של אוכלוסיה של פלסמידים אשר קידוד שותפים אינטראקציה. כאן, אנו מתארים ריאגנטים מותאם אישית ופרוטוקולים לאפשר מסך DEEPN להורג בקלות וביעילות.

Introduction

הבנה מלאה של התהליכים הביולוגיים תא מסתמך על מציאת הרשתות אינטראקציית חלבון העומדים בבסיס המנגנונים המולקולריים שלהם. גישה אחת כדי לזהות אינטראקציות חלבון הוא וזמינותו (Y2H) 2-היברידית שמרים, אשר עובד על ידי הרכבת פקטור שעתוק chimeric מתפקדת ברגע חלבון שני, תחומי עניין לאגד בזו1. מסך Y2H טיפוסי מבוצע על-ידי יצירת אוכלוסייה של שמרים כי בתים בשני ספריה של פלסמידים קידוד חלבונים שמעצבת דבוקה מפעיל גנים ברמת השעתוק (למשל., "טרף" חלבון כימרי) ולא על פלסמיד נתון "פיתיון" המורכבת של החלבון עניין התמזגו לתחום איגוד ה-DNA (למשל, התחום Gal4 DNA-איגוד המאגד רצף הפעלת נגד הזרם-Gal4). אחד היתרונות העיקריים של הגישה Y2H היא כי קל יחסית זול לבצע במעבדה טיפוסי מצויד עבור עבודה שוטפת ביולוגית מולקולרית2. עם זאת, כאשר מבוצעת באופן מסורתי, משתמש דוגמאות בודדות מושבות שעולות בעת הבחירה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. זה קשות מגביל את המספר של ספריית "טרף" שיבוטים זה יבדקו. בעיה זו היא הופכת למורכבת יותר כאשר השפע של טרף אינטראקציה מסוימת היא גבוהה מאוד ביחס לאחרים, צמצום הסיכוי של גילוי האינטראקציה של פלסמידים לטרף השפע נמוכה.

פתרון אחד לשימוש העיקרון Y2H ב כיסוי מקיף של פרוטאום הוא השימוש בגישה בתבנית מטריצה שבה מערך המכיל טרף בודדים הידועים פלסמידים יכולים דיגיטלית להיחקר. עם זאת, גישה כזו דורשת תשתית אינו נגיש בקלות או חסכונית לחוקרים בודדים אשר מעוניינים מגדיר את interactome של מספר קטן של חלבונים או תחומים3. בנוסף, ספריות טרף מאוד מורכב יכול לקודד שברים מרובים של חלבונים שמעצבת להרחיב גודל כזה מערכים מטריקס גדלים מעשית. חלופה אחת היא לבצע מבחני עם ספריות מורכבים בקבוצות להעריך את הנוכחות של אינטראקציה שיבוטים שימוש מסיבי מקביל בתפוקה גבוהה רצף4. זה ניתן ליישם assay הנוכחות של פלסמידים טרף העולות מושבות מרובות באמצעות טיפוסי Y2H מעוצב הגישה שמרים אילו תאים דיור בזוג אינטראקציה של חלבונים פיוז'ן רשאים לגדול על צלחת5,6. זה הרעיון הכללי יכול להיות הדגישה להגדיל השאילתה של שני פיתיון מרובים, טרף רכיבים באותו זמן7,8.

עדיין, חקירות רבות דורשות שקל יותר עדיין מתרכז יותר מאמץ רק כמה חלבון "פיתיונות', יכולים ליהנות יותר על-ידי שאילתת ממצה, חצי כמותית של ספריה טרף מורכבת אחת. יש שפותחה ואנו לאימות גישה לביצוע מחקרים אינטראקציה חלבון בהיקף נרחב באמצעות עיקרון Y2H אצווה תבנית4. זה משתמש קצב התרחבות פלסמיד מסוים טרף כמייצג העוצמה היחסית של האינטראקציה Y2H9. רצף עמוק של פלסמידים כל בתוך אוכלוסיה נתון הצמיחה רגילה או תנאי הגידול סלקטיבי מייצר מפה מלאה של שיבוטים המניבים אינטראקציות Y2H חזקות או חלשות. הרפרטואר של interactors יכול להיות שהושג, בהשוואה ישירות על פני פלסמידים מרובים פיתיון. זרימת העבודה וכתוצאה מכך כינה DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות) וכך ניתן לזהות interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים, המאפשר השוואה בין חלבון אחד לעומת אחר.

. הנה, נדגים DEEPN להציג שיפור שיטות מעבדה זה להקל על השימוש בו, אשר מתוארים באיור1. שיפורים משמעותיים כוללים:

דור של אוכלוסיות השמרים טרף. אחת מהדרישות מפתח של DEEPN מייצר אוכלוסיות של שמרים עם פלסמידים שונים פיתיון שיש מאותה התפלגות של ספריות טרף פלסמיד. אוכלוסיות בסיסית המקבילה של הספרייה פלסמיד טרף חיוניים לייצור מדויק השוואות בין interactomes של פיתיונות שונים. זו מושגת בצורה הטובה ביותר כאשר פלסמיד ספריית שוכן כבר בקרב אוכלוסיה שמרים הפלואידי, לגור פלסמיד הפיתיון נתון של האוכלוסייה הזאת מושגת על ידי הזדווגות לייצר דיפלואידי. כאן, אנו מספקים מדריך ברור באיך להכין כזה אוכלוסיות באמצעות ספריות מסחריים בבניין שמרים הפלואידי. אמנם מצאנו שיטות לייצר מספר רב של diploids, היעילות הכוללת ההזדווגות של מסחרי ספריית המכילים שמרים זנים אלו היה נמוך. לכן, אנחנו נבנה זן חדש אשר יכול בית ספריות טרף המניבה diploids הרבה יותר לכל ההזדווגות התגובה.

ניו סט פתיונות פלסמידים. פלסמידים הנוכחי רבים המבטאים "פיתיון" פיוז'ן חלבונים מורכבת של החלבון של עניין לתחום ה-DNA מחייב הם מבוססי 2µ, ומאפשר להם להגביר את מספר העותק שלהם. מספר עותק זה יכול להיות משתנה מאוד באוכלוסייה, להוביל השתנות בתגובה תעתיק Y2H. זה בתורו יכול להטות את היכולת לאמוד את עוצמת האינטראקציה חלבון נתון בהתבסס על התגובה צמיחה של תאים תחת בחירת. זו יכולה להיות חלקית כתובת על-ידי שימוש של פלסמיד עותק נמוכה, אשר חלקם תוארו קודם לכן כגון זמינים מסחרית pDEST3210. ואנחנו נבנה על חדש פיתיון פלסמיד (pTEF-GBD) מייצרת Gal4 DNA-מחייב תחום היתוך חלבונים בתוך פלסמיד מבוססי צנטרומר עותק נמוך TRP1 נושא את הגן ההתנגדות Kanr המאפשר גם שיבוט של פיתיון קטעים שני במעלה הזרם, במורד הזרם של התחום מחייב Gal4 DNA.

ספריית קטע חדש בצפיפות גבוהה Y2H. אנו נבנה על פלסמיד חדש לספריות טרף Y2H הבית, השתמשו בו כדי לבנות ספרייה Y2H מורכב מסיבים של אקראי הוטו שברי DNA גנומי האפייה. ניתוח רצף הראו כי בספריה זו היה מעל 1 מיליון רכיבים שונים, הרבה יותר מורכב מאשר שמרים שתואר לעיל גנומית Y2H פלסמיד ספריות11. עם הספרייה החדשה, הצלחנו להראות זרימת העבודה DEEPN יציבה מספיק כדי להכיל את ספריות מורכב עם הרבה פלסמידים שונים באופן אמין, לשחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת לוחות ומדיה

הערה: כל לוחות צריך להתבצע מינימלית 2 ימים לפני תחילת בפרוטוקול. התקשורת יכול להתבצע בכל עת. עם זאת, אדנין דקסטרוז (bYPDA) peptone תמצית שמרים במאגר צריך להתבצע ביום שבו ייעשה שימוש. כמה כלי תקשורת נעשית באמצעות שילוב תוסף המכיל רמה של אדנין שגדול מ מה זה משמש בדרך כלל. רוב התוספים תקשורתי מזערי ציין אדנין 10 mg/L. תוספי מזון הנקרא '+ 40Ade' ציין סכום כולל של אדנין 40 מ ג/ליטר.

  1. להכין תמיסת גלוקוז (50% w/v). עבור 1 L, להמיס 500 גרם של D-(+)-גלוקוז ב- 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. לכוון את עוצמת הקול עד 1000 מ"ל של באמצעות משורה מסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק אחסון מדיה mL 1,000 סטרילי.
  2. להכין תמצית שמרים צלחות דקסטרוז (YPD) peptone. עבור 1 L, לפזר 20 גרם של Peptone ו- 10 גרם של שמרים לחלץ ב- 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 960 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק, להוסיף 15 גרם של אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 40 מ"ל של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  3. להכין תקשורתי מזערי סינתטי מלא (CSM)-Trp צלחות. עבור 1 L, יתמוסס 6.7 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 960 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף גר' 0.7 - Trp-פגשתי הנשירה מיקס 20 מ ג של מתיונין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 40 מ"ל של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  4. להכין CSM-Leu-פגש את הצלחות. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה ולמלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 1.005 גר' - Leu-פגשתי הנשירה מיקס ו- 15 גרם של אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  5. להכין CSM-Leu-Trp צלחות. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 1.005 גר' - Trp-Leu + לערבב נושרת מבית 40Ade, 240 מ"ג של אדנין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  6. הכינו צלחות CSM Leu-Trp-שלו. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 0.975 גר' - Trp-Leu-שלו + לערבב הנשירה 40Ade 240 מ"ג של אדנין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים היטב בעזרת לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  7. הכינו צלחות CSM-Leu-Trp-שלו-3AT. עבור 1 L, יתמוסס 10.05 גר' שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל. שופכים לתוך משורה, למלא עד 940 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך 2,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף 0.975 גר' - Trp-Leu-שלו + לערבב הנשירה 40Ade 240 מ"ג של אדנין, 15 גר' אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה כדי להוסיף 60 מ של 50% גלוקוז. מערבבים את µL 100 של 1 מ' מלאי סטרילי של 3-אמינו-1,2,4 triazole (3AT) על ידי לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  8. להכין LB-Kanr לוחיות. עבור 1 L, התמוססות 10 גר' טריפטון, 5 גר' שמרים לחלץ, 10 גרם של NaCl ב- 800 מ של מים בתוך 1000 מ"ל מזוקקים. שופכים לתוך משורה, למלא עד 1,000 מ ל מים מזוקקים. שופכים לתוך מ 2,000 ל Erlenmeyer את הבקבוק, להוסיף 15 גרם של אגר. אוטוקלב וקריר באמבט מים 37 ° C עד טמפרטורת אמבט המים יש מקורר כ 42-50 מעלות צלזיוס. מוסיפים 50 מ"ג Kanamycin ומערבבים על ידי לטמיון.
    1. יוצקים סדרה של הצלחות 100 מ מ עם 20 מ של המדיה באמצעות פיפטה.
  9. להכין YPD, CSM-Leu-נפגשו, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp CSM Leu-Trp-לו ומדיה. השתמש בהליך לעיל עבור לוחות אלא במקום לשפוך לתוך הבקבוק Erlenmeyer, שופכים לתוך בקבוק אחסון מדיה ולהשמיט את אגר.
  10. הכנת bYPDA (YPDA במאגר). קח סטרילי YPD מדיה ולהוסיף 200 mg/L אדנין במים מזוקקים סטריליים. להתאים את ה-pH ל 3.7 עם HCl. מסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק סטרילי.
  11. הכנת מאגר טרנספורמציה: בסורביטול 2 מ', 1 מ' ליתיום אצטט וגופרית והרכבו, 10 מ מ טריס pH 7.6, 0.5 מ מ EDTA, 0.2 מ מ סידן כלורי במים מזוקקים. לסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק סטרילי.
  12. להכין פתרון פג: 70% w/v פוליאתילן גליקול 3350 במים מזוקקים. לחטא על ידי תא לחץ.
  13. הכן עיוות סיבוב: 8 מ' אוריאה, 4% w/v מרחביות, 50 מ מ pH טריס 6.8, 10% v/v גליצרול, 0.02% w/v bromophenol כחול סטרילי מים מזוקקים.
  14. להכין סטי (TE חזקה): 50 מ מ. טריס, 20 מ מ EDTA, pH 8.0 במים מזוקקים. לסנן דרך מסנן סטרילי 0.2 µm לתוך בקבוק סטרילי.
  15. להכין פתרון מניות Zymolase: 10 מ"ג/מ"ל Zymolase 100T ב 50 מ מ אשלגן פוספט dibasic pH 7.5, 50% v/v גליצרול מאגר סטרילי לגלידה (מאוחסן ב-20 ° C).

2. שיבוט ואימות של פלסמידים פיתיון

הערה: בניית Gal4-הדי-איגוד תחום פלסמידים. כיום, ישנן מגוון רחב של מערכות Y2H זמינים מסחרית וזמין מבחינה אקדמית. DEEPN יכול להכיל רבים מהם ובלבד פלסמיד פיתיון לבטא את החלבון עניין התמזגו לתחום ה-DNA-איגוד נמצא TRP1-המכילים פלסמיד. שאר הדרישות במורד הזרם הם זה הרצף מיד במעלה הזרם של הספרייה טרף הוספה ידוע והוא זה השפעה חיובית הדדית Y2H יכול להיות שבוים על ידי הייצור של His3 המאפשר בחירה בתקשורת חסר היסטידין. כאן נתאר את השימוש פלסמיד פיתיון החדש Y2H (pTEF-GBD, איור 2), עם זאת, אחרים פלסמידים פיתיון Y2H כולל pGBKT7 יכול לשמש גם כן. עבור בנייה והערכה של פלסמידים פיתיון, נתאר את השימוש pTEF-GBD. בתור הערה כללית, אנו ממליצים על גן סינתזה כדי לייצר מסגרת פתוחה-קריאה על פי הטיה codon שמרים כדי להבטיח נוחות עם שיבוט וביטוי טוב. ודא כי שיטת השיבוט מאפשר הפיתיון במסגרת עם התחום Gal4 DNA מחייב, כי כאשר שיבוט לאתר 3', stop codon עוקב אחר האזור פיתיון-קידוד.

  1. הכינו את הווקטור פלסמיד. פלסמיד pTEF-GBD מאפשר שיבוט שבר קידוד החלבון עניין 5' או 3' של האזור קידוד התחום מחייב Gal4 DNA באמצעות שיטת הרכבה מהירה. עבור הכניסה באתר 5', לעכל 3 µg של pTEF-GBD עם נארי, EcoRI או להכנסה באתר 3', לעכל עם BamHI ו XhoI עבור 2-4 ה Electrophorese מדגם agarose DNA 1% ג'ל המכיל 0.2 - 0.5 µg/mL אתידיום ברומיד (EtBr) ב-100 נ' לסלק את bp גזור 5,630 TEF-GBD, לטהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA בהתאם להוראות היצרן, לכמת את ה-DNA על ידי ספיגת ב-260 nm-ספקטרופוטומטרים12.
    הערה: דור מוסיף קידוד פיתיון. DNA קטעים קידוד חלבונים או שברי חלבון עניין יכול להיות עשוי באמצעות סינתזה של ג'ין וזמין כקטעים מפוצלים uncloned. מומלץ כי codons ממוטבים עבור ביטוי האפייה , כלים מקוונים עבור מיטוב codon כלולים ברשימה של חומרים.
  2. 5' להכנסה, לאגף את מקטע ה-DNA קידוד codon התחלה של ATG מאת 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'ו 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', בהתאמה. עבור 3' ההכנסה במסגרת עם התחום מחייב Gal4 DNA, לאגף השבר קידוד על ידי 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'ו 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. לבנייה פלסמיד, השתמש בשיטה הרכבה מהירה כפי שצוין ביישום הוראות יצרן על שברי שיבוט לתוך לחתוך pTEF-GBD.
    1. צלחת כל טרנספורמציה e. coli אל LB-Kanr לוחיות, תקופת דגירה של 16-20 h ב- 37 מעלות צלזיוס. מושבות דיור pTEF-GBD עם הוספת הרצוי ניתן לזהות באמצעות PCR הגברה באמצעות oligonucleotides של: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3' ו 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' עבור 5' insert ו- 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' ו 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' עבור 3' הכנס. אלה oligonucleotides יכול לשמש גם צבעי יסוד קביעת רצף של תותב.
    2. תוכנית על הכנת > 10 µg של כל נגזרת pTEF-GBD, pTEF-GBD לבד כדי לספק חומר להמרות רצף ושמרים.
    3. השתמש התנאים PCR הבאים: 3 דקות ב 98 ° C, ואחריו 25 מחזורים של 30 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C, ו- 2 דקות ב-72 מעלות, ואחריו 5 דקות ב-72 מעלות באמצעות מאגר המכיל 2.5 מ"מ MgCl2 , 0.5 U/100 µL DNA פולימראז, ומאגר קניינית.

3. ביטוי של חלבונים פיוז'ן Gal4-הדי-איגוד תחום

  1. להפוך שמרים המוסמכת.
    1. פס החוצה PJ69-4A שמרים לצלחת YPD על ידי לקיחת המוליך עץ סטרילי, גירוד 1 מ3 של-80 ° C קפוא מניות, לשפשף את זה בעדינות על פני הלוח YPD. להזיז את המוליך עץ למטה הצלחת כך כל מעבר עובר על פני חלק ללא שינוי פני המדיה. דגירה את הצלחת YPD ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים או עד יחיד מושבות גלויים. להפוך את המניה קפוא של PJ69-4A שמרים על ידי השעיית שמרים בתקשורת מים או צמיחה, שכשהם עם דימתיל סולפוקסיד ל 7% אחסון ב- 80 ° c
    2. לחסן מושבה בודדת ב 5 מ של תרבות YPD תרבות 20 מ מ x 150 מ מ צינור באמצעות של המוליך עץ עקר ולגדול ללון ב- 30 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 200 סל ד.
    3. לחסן 50 מ של YPD ב 250 מ של הבקבוק Erlenmeyer סטרילי עם 4 מ"ל של התרבות לילה של זן שמרים PJ69-4A. גדלים חממה חזק ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל ד צפיפות אופטית (OD600) של 1.2, כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר עם נתיב אור רגיל 1 ס מ. הצמיחה בדרך כלל לוקח h 5-7.
    4. לבודד שמרים על-ידי שיקוע ב 50 מ ל צינור חרוטי ב g x 4,696 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי זריקת לתוך. פסולת נוזלית. באמצעות פיפטה של, resuspend בגדר ב 5 מ של טרנספורמציה מאגר והעברתן ל-15 מיליליטר צינור חרוטי. Resediment למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את השמרים ב- 1 מ"ל נפח סופי של טרנספורמציה מאגר עם פיפטה 1000 µL.
    5. דגירה תאי שמרים למשך 60 דקות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול-200 סל ד ולאחר מכן מקם על קרח למשך 30-90 דקות.
  2. שמרים פלסמיד טרנספורמציה.
    1. ב- mL 1.5 צינור microcentrifuge סטרילי, להוסיף 1 µg של פלסמיד המבוססות על pTEF-GBD ו- µL 5 של 10 מ"ג/מ"ל זרע סלמון הספק פתרון ה-DNA. כוללים גם שפופרת המכילה רק זרע סלמון DNA המוביל כפקד שינוי שלילי. להוסיף 100 µL של התליה תא קר כקרח שמרים כל שפופרת באמצעות פיפטה. להוסיף 100 µL של 70% פתרון פג עם 1000 µL פיפטה, לערבב בעדינות על ידי מצליף הצינור 5 - 10 פעמים (לעשות לא מערבולת).
    2. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס, בחממה חזק ב 200 סל"ד למשך 45 דקות.
    3. מחממים את ההלם 42 º C למשך 15 דקות.
    4. משקעים ב microcentrifuge ב g x 845 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, פיפטה למחוק את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 150 µL של מים סטריליים על-ידי pipetting למעלה ולמטה ו התפשטה על פני השטח של צלחת CSM-Trp.
    5. המקום בצד ימין הצלחות ב- 30 מעלות צלזיוס חממה, תקופת דגירה של 2-3 ימים עד מושבות גלויים. לוחות עשויים להיות מתהפך כדי למנוע עיבוי על פני צלחת לאחר דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 6-12 שעות.
    6. לקחת 2-3 מושבות לכל שינוי, פס כטלאי על צלחת CSM-Trp באמצעות קיסם סטרילי. אפשר לגדול במשך 24 שעות ביממה ב- 30 ° C.
  3. להפוך lysates ביטוי חלבון.
    1. לחסן 3 מ"ל של מדיה נוזלי CSM-Trp עם התאמה-הראש-גודל של שמרים מהמדבקה ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס בשפופרת תרבות 20 מ"מ x 150 מ"מ, תוך כדי טלטול-200 סל ד. להפוך את שתי התרבויות לילה לכל פיתיון וקטור pTEF ריק-GBD.
    2. להוסיף 1 מ"ל של YPD כל 3 מ"ל של תרבות לילה CSM-Trp. לגדול עבור 1 h ב- 30 מעלות צלזיוס, תוך כדי טלטול-200 סל ד. בדוק את יתר של תאים על ידי ספקטרופוטומטרים.
    3. משקעים מספר שווה של תאים, על-פי OD נירמול. השתמש mL 1.5 סטרילי של צינורות microcentrifuge עם ספין 5 דקות ב g x 2,348 בטמפרטורת החדר microcentrifuge. השתמש פיפטה כדי למחוק את תגובת שיקוע. המניה הסופי מקביל מינימום של 2.1 OD.
      הערה: בעת חישוב שווי ערך מספר התאים, זה יכול להתרחש אמצעי אחסון שונים העשויים להידרש מתרבות כל לילה כדי להשיג OD 2.1 מינימלי.
    4. Resuspend בגדר ב 450 µL של 0.2 M NaOH מאת pipetting למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. Recentrifuge תאים למשך 2 דקות ב g x 2,348 בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה.
    5. Resuspend בגדר עם 50 µL מאגר עיוות סיבוב על-ידי pipetting למעלה ולמטה בזהירות לא לעשות בועות. דוגמת חום עבור 5 דקות ב- 70 מעלות צלזיוס.
  4. בדוק אם יש ביטוי חלבונים על ידי עמודים מרחביות.
    1. שימוש ג'ל הדרגתי של 4-20% כדי להבטיח מגוון רחב של משקולות מולקולרית ניתן לפתור. כמות שוות ערך עומס (OD אותו) דוגמאות לתוך מרחביות-דף של ג'ל, הקפד לכלול מדגם אחד לפחות המכיל את pTEF שלא שונתה-GBD וקטור13,14,15.
    2. לאחר הפרידה electrophoretic, העברה ג'ל ניטרוצלולוזה, immunoblot באמצעות נוגדנים אנטי-myc monoclonal או polyclonal ו- ECL זיהוי פתרון (איור 3).

4. הפעלה עצמית מבחן

  1. פס החוצה השמרים MATalpha מן המלאי-80 ° C המתאים המתח דיור הספרייה הטרף של ריבית על צלחת YPD על-ידי לקיחת של המוליך עץ סטרילי, גירוד כמות קטנה של שמרים מחוץ המבחנה שיורד זה הלוח YPD. דגירה את הצלחת YPD ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים או עד יחיד מושבות גלויים. תיקון כמה מושבות יחיד על צלחת YPD, דגירה בין לילה ב- 30 ° C.
    הערה: הזן החדש פותח כאן לספריית הבית טרפו היא PLY5725 בעוד כמה ספריות Y2H זמינים מסחרית תואם שוכנות Y187.
  2. בצע את ההליכים בסעיף 3.3.1 - 3.3.4 להפוך PLY5725 עם LEU2-המבוסס על פלסמיד רגילה להאוס הספרייה הרצויה טרף. עבור ספריות פותח כאן, פלסמיד המתאים הוא pGal4AD (pPL6343). כדי לשחזר שמרים transformants, צלחת על גבי לוחות CSM-Leu-נפגשו. לאחר מושבות עולות, פס כמו כתמים על גבי צלחת CSM-Leu-פגש את תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב- 30 ° C.
  3. לפי התקנון ב- 3.4 כדי לאשר את הביטוי של pPL6343 וקטור ריקה באמצעות אנטי-HA נוגדנים monoclonal או polyclonal ופתרון זיהוי ECL.
  4. פס שאחד של שמרים PJ69-4A טרנספורמציה בתבנית צלב עם PLY5725 בונה על צלחת YPD זה אושר אקספרס חלבון בפרוטוקול סעיף 3.4 ו- 4.3, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קח 1 מ3 התאים גדלו ביחד ואיפה טלאי על גבי שני זנים להפריד CSM-Leu-נפגשו, CSM-Trp, וצלחות CSM-Trp-Leu ולגדול 24 שעות ביממה.
    הערה: diploids הרצויה תגדל על לוחות CSM-Trp-Leu. גידול על CSM-Leu-פגשתי וצלחות CSM-Trp לשמש פקד חיובי עבור צמיחת שמרים.
  5. לגדול diploids ב 1 מ"ל של מדיה CSM-Trp-Leu ללון ב- 30 ° C. משקעים 500 µL תאים 1.5 מ של microcentrifuge צינור ב 2,348 x g, 3 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge. למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה. Resuspend תאי 1 מ"ל של מים סטריליים וחזור שקיעת ו- resuspension. בדוק את יתר600 של תאים.
  6. לעשות סידרה של 1:10 דילולים טורי של כל השעיה תא שימוש במים סטריליים עם ההתחלה הכי מרוכז פתרון של כל אחד ב- OD של 0.5. במקום 5 µL של כל דילול על גבי צלחת CSM-Leu-Trp צלחת CSM Leu-Trp-שלו, של CSM-Leu-Trp-שלו + צלחת 3AT. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ולבדוק לצמיחה מדי יום במשך 3 ימים (איור 4).
    הערה: עבור ה-1:10 דילול טורי, פיפטה 10 µL של הצינור המכיל OD 0.5 לתוך µL 90 מים ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. המשך לבצע 1:10 דילולים טורי עד יש בסך הכל 6 ריכוזים שונים לאתר.

5. ליצור את אוכלוסיות השמרים עם פיתיון וספריית טרף

הערה: בעקבות המתח Y187 שבו בתים טרף מסחרי ספריית פלסמידים לא חבר טוב. לפיכך, בתנאים אופטימליים הבאים נדרשים לשמור על המורכבות של הספרייה. PLY5725 זן המכיל Y2H טרף ספריות חברים כדאי, לאותו תהליך ההזדווגות יכולה לשמש עם זן זה (איור 5).

  1. לחסן mL 3 של תרבויות של כל אחד transformants PJ69-4A נושאת את שונים TRP1-המכילים pTEF-GBD פלסמיד פיתיון בתקשורת CSM-Trp בשפופרת תרבות. כוללים שתי תרבויות נפרד המכיל את פלסמיד וקטור pTEF-GBD לבד כדי לשמש כפקדי פרוצדורלי. דגירה תרבויות ב 30 מעלות צלזיוס, סל ד 200 עבור 6-אייץ ', ואז לדלל לתוך 25 מ של תרבות בבקבוקון Erlenmeyer סטרילי לצמיחה לילה.
  2. הפשרת בקבוקון קפואים (-80 מעלות צלזיוס) של התאים MATalpha המכילים את LEU2-נושא "טרף" ספריית בטמפרטורת החדר. לחסן 125 מ של התקשורת CSM-Leu-פגש את בקבוקון Erlenmeyer סטרילי עם המבחנה המופשרים לגמרי. לגדול בכל התרבויות בין לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
    הערה: ה OD600 של התרבויות לילה צריך לנוע בין 1.0 ל 1.5 לפני שתמשיך את הצעדים הבאים.
  3. צנטריפוגה 21 מקבילות OD של כל התרבויות transformant PJ69-4A עם ספין 5 דקות ב g x 4,696 בטמפרטורת החדר. כל 10 תגובות ההזדווגות הרצוי, גלולה OD 39600 במקבילות של המתח MATalpha סוחבת על פלסמידים ספריה נפרדת 50 מ של צינורות חרוט.
    1. Resuspend תאים ב- 10 מ"ל מים סטריליים, גלולה מחדש ב- 50 מ ל החדש של צינור חרוטי 4,696 g x 5 דקות בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. בעדינות באמצעות פיפטה של, להסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת התאים pelleted.
    2. Resuspend כדורי של תאים PJ69-4A 4 מיליליטר ותאים PLY5725 ב- 10 מ"ל של bYPDA (pH 3.7).
  4. שיבנו תגובות ההזדווגות, להוסיף 1 מ"ל של PJ69-4A טרנספורמציה תאים 1 מ"ל של תאים המכיל ספריית MATalpha, 1 מ"ל של pH bYPDA 3.7 עד חדש 50 מ"ל צינור חרוטי. דגירה ב 30 ° C עם עצבנות מסלולית עדין (100-130 rpm) במשך 90 דקות.
    1. צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב g x 4,696, בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. להסיר את תגובת שיקוע על ידי פיפטה, resuspend בגדר ב 2 מ של 1:1 bYPDA:YPD. צלחת כל 2 מיליליטר לצלחת YPD 100 מ מ באמצעות פיפטה, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך כ- 20 h.
  5. קציר תאים מן הלוחות YPD באמצעות מגרד תא מכך התאים אל תוך 2-3 מ"ל של CSM-Leu-Trp מדיה. פיפטה יצא ממקומו התאים 50 מ של צינור חרוטי. לשטוף צלחות 4 - 5 פעמים עם 2-3 מ"ל של CSM-Leu-Trp מדיה על-ידי pipetting למעלה התקשורת באמצעות µL של 1000 פיפטה ולהוציא בעדינות את המדיה פני צלחת YPD.
    1. צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב g x 4,696 בטמפרטורת החדר ומפרידה benchtop. למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה, resuspend התאים 40 מיליליטר CSM-Leu-Trp מדיה על-ידי pipetting למעלה ולמטה (do לא מערבולת).
  6. כדי להעריך את מספר התאים דיפלואידי נוצר, לדלל µL 4 של תערובת דיפלואידי לתוך 200 µL ומדיה CSM-Trp-Leu 2000 µL. צלחת µL 200 של כל דילול לצלחת CSM-Leu-Trp.
    הערה: שתי צלחות מייצגים לדילול קיפול 1:10,000, כוללות על מלאי diploids שנקטפו, מניב מושבות ~ 9,000 צפויים-27,000 בצלחת דילול 1:10,000 לאחר דגירה ב 30 ° C עבור ה 36-40 לוחות הסימון לאחר שלב 5.7. מספר מינימלי של 200 מושבות בצלחת דילול 1:10,000 נדרשת כדי להמשיך לשלב 5.8
  7. מיד לקחת את השארית לכל 40 מ של תא resuspension, לחסן של 1,000 מ של הבקבוק Erlenmeyer המכיל 500 מ"ל של CSM-Leu-Trp מדיה. קח יתר ראשונית של600. דגירה המבחנות הללו ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-סל ד 180 עד שהם מגיעים לרוויה (~2.0 OD/mL). זה בדרך כלל לוקח כ 36-40 ה צג הצמיחה ב 24 שעות ואז שוב ב- 36 h מאת OD600.
  8. באמצעות פיפטה של, להסיר 20 מ של aliquots מכל mL 500 רוויה של תרבויות, innoculate מ 2,000 ל Erlenmeyer, צלוחיות, בושם אחד המכיל 750 מ של מדיה CSM-Leu-Trp, את השני המכיל 750 מ של CSM Leu-Trp-לו עם הרמה הנמוכה ביותר של 3AT את זה מבטל רקע (בעבר נקבע סעיף 4.5). מערבבים את תרבויות חדשות (770 מ"ל) היטב בעזרת מתערבל ולקחת יתר ראשונית של600.
  9. דגירה תרבויות ב 30 מעלות צלזיוס תוך טלטול-180 סל ד עד שהגיע רוויה, אשר בדרך כלל מתרחשת בתוך 24 שעות ביממה עבור התרבות CSM-Leu-Trp שלא נבחרו, יכול לקחת מעל 70 h עבור תרבויות תחת בחירת עבור אינטראקציות Y2H.
  10. פעם אחת התרבויות הגיעו רוויה (OD ~ 2.0), הסר מ 11 ל באמצעות פיפטה, משקעים התאים עם ספין 5 דקות ב g 4,696 x בטמפרטורת החדר, למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה, להקפיא ב-20 ° C או המשך על מיצוי הדנ א. הדגימות שנבחרו, שלא נבחרו שניהם ישמש עבור רצף עמוק.

6. דוגמה לקראת רצף עמוק DEEPN

  1. מיצוי הדנ א.
    1. השתמש פיפטה כדי resuspend תא פתיתי פרוטוקול סעיף 5.7 ב- 500 µL של המאגר sTE והעברה 1.5 מ ל צינור microcentrifuge. מוסיפים 3 µL של betamercaptoethanol µL 10 Zymolase מניות. מערבבים היטב, דגירה בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות.
    2. לחלץ את הדגימה פעמיים עם אלכוהול 500 של פנול/כלורופורם/isoamyl µL תוך שימוש הוד fume16.
    3. הוסף µL 7 של 4 M NaCl, µL 900 של אתנול 100% קר כקרח (ETOH), מיקס על ידי היפוך או להקפיא-20 ° C או להמשיך משקעים DNA על ידי ספינינג ב 21,130 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge.
    4. למחוק את תגובת שיקוע על ידי פיפטה. לשטוף את צניפה שלוש פעמים עם 900 µL של 70% ETOH.
    5. משקעים הצניפה 21,130 g x עבור 2 דקות ולהסיר לשארי שטיפת ETOH על ידי פיפטה. צניפה יבש במשך 7 דקות ב 42 º C.
    6. Resuspend צנפה ב 120 µL של 0.1 x sTE באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, קפיצי הצינורות לערבב כל 30 דקות.
    7. פיפטה 60 µL של ה-DNA שחולץ לתוך mL 1.5 סטרילי צינור microcentrifuge. הוסף µL 120 של סטי, µL 3.5 RNase א מניות, תנועה כדי לערבב דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
    8. התמיסה אתנול נעשה כאמור ב סעיף 6.1.3 - 6.1.5, אבל להשתמש µL 7 של 5 מ' אמוניום אצטט במקום 4 M NaCl.
    9. Resuspend RNase דנ א שטופלו ב- 55 µL של 0.1 x sTE באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, קפיצי הצינורות לערבב כל 30 דקות Quantify DNA על-ידי ספיגת-260 ננומטר על ספקטרופוטומטרים.
  2. PCR cDNA מוסיף.
    1. לבצע שניים, 50 µL תגובות PCR לכל. דנ א. כל התגובה מכילה 25 pmol של כל פריימר ואחורה תואמים את פלסמיד טרף-ספרייה (ראה חומרים). תגובות גם מכילים µL 25 של אמינות גבוהה 2 x PCR מיקס מאסטר, µg 5 של דנ א, ומים עד 50 Amplify תגובות µL. עבור 25 מחזורי עם סיומת פעמים של 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, טמפרטורה anneal של 55 ° C ל 30 s, ו denaturing ב 98 ° C עבור לפני ס' 10 רכיבה על אופניים מאת דנטורציה s 30 ב 98 ° C ופעל עם הדגירה 5 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.
    2. לנתח 4 µL של כל תגובה PCR על-ידי 1% DNA בג'ל agarose עם agarose ה-DNA ג'ל המכיל 0.2 - 0.5 µg/mL EtBr17. המחש. דנ א על-ידי UV transillumination. דוגמאות יציגו כתם של הדנ א בסביבות 1-3 kb, איפה התבנית סימון עלול להימצא לדוגמאות איפה האינטראקציה Y2H היה נבחר (איור 6).
    3. לשלב דוגמאות PCR כפולים, לטהר באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות היצרן, לכמת את ה-DNA על ידי ספיגת ב-260 nm ב ספקטרופוטומטרים.

7. רצף עמוק

הערה: הכנת הדוגמא ורצף בפלטפורמה רצף עמוק זמין בדרך כלל מסחרי והאקדמי של מתקנים הליבה של DNA רצף.

  1. הטיה 600 ng של מוצר ה-PCR באמצעות אולטרה-sonicator של ביצועים גבוהים כדי לתת שברי אורך ממוצע של ~ 300 bp.
  2. ליצור רצף אינדקס ספריות באמצעות ערכת הכנה עבור רצף עמוק המוסיפה הטרמה אתרים, קידוד ברקודים, linkers וללכוד רצפים בצורה א-סימטרית על הקצוות של שברי DNA.
  3. לבצע הכנה הספרייה לפי הנחיות היצרן. בריכת באינדקס ספריות של רצף כמו זמן לזווג-end קריאות על פלטפורמה רצף עמוק (למשל, 2 x 150 קריאות bp PE). מספר קריאות ממוקד עבור כל דגימה הרצוי הוא בין 10 ל- 40 מיליון, עם קריאות יותר הרצויים עבור האוכלוסיות שלא נבחרו כי הם בדרך כלל מורכבים יותר. אנו ממליצים על פחות 20 מיליון או יותר קריאות עבור האוכלוסיות שלא נבחרו.

8. Bioinformatic עיבוד ואימות

  1. תהליך ה-DNA רצף נתונים בצורה של fastq עם קבוצת תוכנה עצמאי תוכניות שנבנו למפות (1) רצף לקרוא קבצים בפורמט סאם אוניברסלי (2) לכמת ג'ין העשרה בין נתונים (datasets) (3) לבצע ניתוח סטטיסטי של נתונים סדר לדרג המועמד אילו גנים הם חיוביים לאינטראקציה Y2H (4) לספק מידע לגבי מה region(s) ועל מה translational במסגרת כל cDNA טרף לכל הגן קטעים זה תשואה חיובית Y2H אינטראקציות מורכבות, ו- (5) כלים לשחזר לא רק את 5' אלא גם את 3' סופו של השברים שמעצבת ומאפשר שחזור ואימות שלהם בתבנית Y2H המסורתי. הפעולה של תוכניות אלה מפורט במחקר הנלווה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

וזמינותו Y2H כבר בשימוש נרחב לאיתור אינטראקציות חלבון: חלבון, פותחו מספר עיבודים ומערכות. ברוב המקרים, שאותם שיקולי המסייעות להבטיח הצלחה עם הגישות הקודמות האלה חשובים עבור DEEPN. חלק חשוב אמות כוללות: הבטחת ביטוי של תחום ה-DNA מחייב חלבונים פיוז'ן, הבטחת רקע נמוך של כדין שלו + צמיחה diploids המכילה הפיתיון של האינטרס פלסמיד טרף ריק, יעילות גבוהה ההזדווגות של הפיתיון המכילים שמרים מאטה עם הספריה המכיל שמרים MATalpha, ואפילו בסופו של דבר, נמוך-לכתחילה תנאים המאפשרים האוכלוסייה לגדול בתנאים בחר עבור Y2H הרבה תגובות חיוביות, אלה כי רמות נמוכות של התוצרת של פעילות His3, חלשה תגובת תעתיק Y2H.

אחד ההיבטים הקריטיים של DEEPN הוא reproducibly להציג את הספריה Y2H לתוך זנים המכילים פלסמידים שונים פיתיון וכדי לבחור בצורה אמינה את האוכלוסיות האלה עבור אלה פלסמידים ספריית יוצר אינטראקציה חיובית Y2H. זה הופך קשה יותר כאשר המורכבות של הספרייה Y2H מגביר מאז קשה יותר להבטיח העברה נאותה של הספריה כולה על פני אוכלוסיות שונים ראשונית. בנוסף, בגודל של אוכלוסיות נבחר לגדול תחת תנאים הבחירה והעומק של רצף צריך להיות גדול מספיק כדי להתבונן לשחזור שינויים בהרכב פלסמיד Y2H אמין לזהות נכון אינטראקציה חיובית Y2H. במחקרים קודמים, השתמשנו ספריות cDNA Y2H זמינים מסחרית. מצאנו ההשתנות בהפצה ספריית Y2H בין אוכלוסיות נפרדות נושאת את פלסמידים פיתיון אותו הוא נמוך, עם overdispersion בין שתי האוכלוסיות הראשוני לפני הבחירה של < 0.01 בדרך כלל, ו- 0.35 - 0.55 עבור נפרדים אוכלוסיות לאחר בחירת4. עם זאת, המורכבות של ספריות אלה-Y2H זמינים מסחרית הוא נמוך למדי (איור 7). בנוסף, רבים של שיבוטים בתוכו (כ 60%) עשויים לחלוטין של קטעי cDNA כי הם 3' של האזור קידוד, אשר בהמשך מגביל את השירות שלהם. כדי להדגים כי השיטות לעיל היו מסוגלים אדיב ספריות Y2H מורכבים יותר, יצרנו ספרייה Y2H חדש בוקטור פלסמיד מפושטת "טרף" (pGal4AD) המכיל קטעים של DNA גנומי Saccaromyces cerevisiae (זן PLY5725). הדנ א היה מפוצל לפי גודל ההטיה, שנבחר עבור טווחים של 600-1500 bp, שונה עם מתאמים, והוא מוכנס לתוך pGal4AD כדי ליצור את הספריה SacCer_TAB Y2H (איור 8). הספרייה הפכה PLY5725, אשר הפיק אוכלוסיית שמרים היה אז הזדווגו כדי להפריד בין דגימות של מאטה PJ69-4A נושאת את פלסמיד pTEF-GBD לבד. אוכלוסיות דיפלואידי כפולים גדלו בתנאים לא בררניים, סלקטיבי. Y2H פלסמיד ספריית התוספות נותחו על ידי רצף עמוק. כאשר ממופה ל- DNA גנומי המקיף 100 bp ויוצאת כל החלבון קידוד אזור (84% של הגנום כולו), מצאנו > 1.1 מיליון פלסמידים שונים בספריה עבור הגודל הכולל המשוער של הספרייה שמרים של ~1.35 מיליון שונים פלסמידים. לשם השוואה, גם טרנספורמציה של שמרים שתואר לעיל גנומית Y2H ספריית11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H הספריה) שמרים MATalpha, ואנו נתון זה הניתוח באותו כמפורט לעיל. מצאנו כי המורכבות של ספריית Y2H שמרים שלנו קטע אקראי היה גבוה והיה הרבה יותר פלסמידים קידוד במסגרת שברי-בכל הגן מהספריה שפורסמו בעבר (איור 9). חשוב, הדור של הספריה הראשונית המכילה אוכלוסיות דיפלואידי היה מאוד לשחזור עם overdispersion של < 0.01 (איור 10). יתר על כן, הפארמצבטית שיש שתי האוכלוסיות שמרים נפרדים לייצר המבוצעת דומה של פלסמידים לאחר בחירת עבור אינטראקציה חיובית Y2H היה טוב מאוד, מניב overdispersion של 0.3. לפיכך, השיטות כאן להכיל ספריות גדולות יותר Y2H של מורכבות גבוהה יותר מאשר בעבר.

מבחינת הגדלת הקלות של DEEPN, אנו מעדיפים באמצעות סינתזה של ג'ין כדי להפוך מוסיף קידוד החלבון פיתיון של עניין. זה מאפשר קידוד אזורי תחומים חלבון, כימרות של מוטציות בקלות משולבים לתוך פלסמידים פיתיון Y2H, אך מאפשרת גם codons שלהם להיות אופטימיזציה עבור ביטוי cerevisiae ס. ביטוי של שני שונה Gal4-DNA-מחייב תחום היתוך חלבונים הוא הפגין באיור3. שני transformants שמרים שונים לבטא גם של שני חלבונים פיוז'ן פיתיון שהוכנו, נתון מרחביות-דף immunoblotting עם נוגדנים אנטי-myc. שימו לב רמות ביטוי של חלבונים פיתיון ביחס לתחום Gal4 DNA-איגוד לבד מן הווקטור ריק. . מצאנו שזה חשוב לא רק כדי לאמת את הביטוי של חלבון כימרי הפיתיון, אלא גם כדי לוודא ביטוי במושבה המדויק מאטה שמרים transformant זה ישמש כדי להרחיב ומט כדי שמרים המכיל ספריית טרף. ברגע transformant זוהתה, זה אפשרי. תקפיא את זה למטה ולאחסן לשימוש מאוחר יותר.

איור 4 מראה מבחן להפעלה עצמית איפה לדילול טורי של תאים דיפלואידי הם מצופה על גבי CSM-Leu-Trp (+ שלו), CSM Trp-Leu-לו (-שלו), ו- CSM-Trp-Leu-שלו + 3AT (-שלו + 3AT) פלטות, מותר לגדל ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. התוצאה הרצויה היא לבחון צמיחה נוכחות, אבל לא היעדר היסטידין בין אם יש 3AT. זה יאפשר את השימוש CSM-Trp-Leu-שלו כדי לבחור עבור שמרים עם אינטראקציה 2-היברידית שמרים חיובי. אם יש גידול על צלחות CSM Leu-Trp-לו, ואז מבחר Y2H עדיין ניתן להשיג באמצעות הריכוז הנמוך ביותר של 3AT המונע צמיחה. אנו מוצאים כי אם ניתן לחסום הצמיחה ב- CSM Trp-Leu-לו + 0.1 מ"מ 3AT, ואז DEEPN וזמינותו בהתקנה באמצעות מצב זה כדי לבחור עבור אינטראקציות Y2H. אם, לעומת זאת, עיכוב של הצמיחה של diploids המכילה pGal4AD או אחרים פלסמיד טרף ריק, את פלסמיד פיוז'ן pTEF-GBD-פיתיון דורש ריכוז גבוה של 3AT, זה תסכן את הביצועים של ההליך DEEPN ולא על פלסמיד פיתיון שונים יש לחפש. שימו לב כי הצמיחה שלו + הבחירה היחידה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. מצאנו שזה מספיק כדי להעשיר עבור אינטראקציות Y2H אצווה.

באחד ההליכים הקריטי ביותר בזרימת העבודה DEEPN היא להשיג יעילות גבוהה ההזדווגות של השמרים מאטה נושאת את פלסמיד הפיתיון עם שמרים MATalpha נושאת הספרייה טרף Y2H. אנחנו נמצא כי כמה זנים (למשל, Y187)18, דיור ספריות cDNA זמינים מסחרית, יש יעילות ההזדווגות הדלה יחסית. מסיבה זו, אנו מתוכנן זן לשאת Y2H ספריות. זן זה מבוסס על BY4742, נגזרת של S288c. זן זה חסרה GAL4', ' GAL80', ' TRP1', LEU2, HIS3. הוא מכיל בלי עיתונאים כי הם מגיבים חלבון Gal4 היברידית ולא הכלאה שונים (למשל, לקסה-VP16). במקום זאת, המקור של His3 Y2H-induced ייצור שוכן בתוך המתח מאטה שנושאים את פלסמיד פתיון מסוים. זה מפשט את המערכת ומאפשר גמישות רבה יותר בעיצוב זה ניתן להשתמש המכיל ספריית לאותם MATalpha תאים להזדווג עם זן לבטא של חלבון כימרי לקסה-פיתיון ואת כתב LexA(UAS) -HIS3 או חלבון פיוז'ן Gal4-DBD-פיתיון של Gal4 (UAS)-כתבHIS3 .

פעם אחת האוכלוסיות דיפלואידי נושאת על פלסמיד פיתיון וגם הספרייה נוצרים, הם מדולל, מותר לגדל בתנאים פשוט בחר בשני פלסמידים (למשל, CSM-Trp-Leu) או פלסמידים וגם השפעה חיובית הדדית Y2H את זה כוננים הייצור של His3 (למשל, CSM Leu-Trp-לו). חשוב להתחיל עם כמות גדולה של האוכלוסייה ההתחלה כדי להימנע אבולוציונית של צוואר־בקבוק' זה יכול להטות את האוכלוסייה כי התוצאות לאחר הבחירה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. לפיכך, את הנהלים שלנו מציין באמצעות 20 מיליליטר מתוך 500 מ"ל של התרבות האוכלוסייה דיפלואידי גדל ב- 750 מ של מדיה CSM Leu-Trp-לו טריים כדי להימנע מבעיה זו. עם pTEF-GBD כמו פלסמיד פיתיון, מצאנו כי סבב אחד של דילול וצמיחה היה מספיק כדי מתפתח אוכלוסיה מקיף. בעזרת פלסמידים שונים פיתיון בעבר, היינו שני סיבובים של דילול וצמיחה, אוטם 20 הראשונית של תוך 750 מ ל, ואז 2 מיליליטר מזה רווי תרבות מעורבבת עם 75 מ. איור 6 מציגה את התוצאות של ה-PCR הגברה על פני ספריית התוספות עבור האוכלוסייה דיפלואידי גדל תחת תנאים לא בררניים, כמו גם סיבוב רצופים הראשון והשני של דילול וצמיחה במצב סלקטיבי לשניים שונים פיתיון פלסמידים. שימו לב כי אין מבחר, יש כתם מוכללת של מוצרי ה-PCR מעידה על תערובת מורכבת יחסית היטב המנורמל של קטעים. בעת הבחירה, הדוגמא הזאת משתנה, עם מינים מסוימים מאוד מעשירה כך מבחינים במספר להקות בודדים. מידה מסוימת של פסים הוא אופייני של הניסויים מוצלח שנערך עד כה, עדיין דפוס השמצות בנוסף או במקום תבנית בעלת רצועות, מעידה על תערובת מורכבת של הטרף מוסיף, רצוי אם אדם רוצה למקסם את מספר המועמדים כי DEEPN מזהה. דפוס סימון חזקה מאוד, שבו רוב המוצר PCR נמצא ב- 1-3 להקות, מציין כי רוב רצף נתונים להישלט על ידי רק מוסיף הטרף 1-3. אחד יכול לפצות על כך חלקית על-ידי הקדשת קריאות יותר מן הדוגמא הזאת. ניתן לראות כי אם האוכלוסייה הוא מדולל, גדל עוד יותר (ראו 'd2 שנבחרו' באיור5), התבנית סימון הוא בולט יותר, המציין את הטרף הם להיות פחתה פלסמידים היוועצות אינטראקציות Y2H חלש אך אותנטי בזמן מובחרים מעטים טרף פלסמידים הן הגברת השפע שלהם. דילול רצופים וצמיחה ברמה מוגזמת זו נחשבת לא מועיל למטרה של לתפוס את המספר הגדול ביותר של מועמדים פוטנציאליים ובכך עם פרוטוקול כאן, אנו ממליצים להשתמש סיבוב אחד של דילול וצמיחה.

Figure 1
איור 1: סכימטי של זרימת עבודה DEEPN. התכנית הכללית של ההליכים מעבדה מוצג בצד השמאל עם הזמן המשוער הדרושה להשלמת המשימה המתאימה. מימין נמצאת שזרימת ביואינפורמטיקה באמצעות חבילות תוכנה DEEPN ו- Stat_Maker. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סכימטי של pTEF-GBD. TRP1-המכיל עותק נמוך Gal4 DNA מחייב תחום היתוך חלבון ביטוי פלסמיד מוצג. זה כולל קונסטיטוטיביות TEF1 יזם, myc epitope תג, התחום מחייב Gal4 DNA בעקבות T7 RNA פולימראז אתר קישור, polylinker, PRM9 המחסל בתוך צנטרומר (CEN)-המבוסס על פלסמיד. פלסמיד זו נושאת גם Kanamycin ההתנגדות ואת המקור חיידקי ColE1 של שכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ביטוי של חלבונים פיוז'ן Gal4-פיתיון. Lysates של שמרים המבטאים חלבונים שונים פיתיון התמזגו לתחום מחייב Gal4 DNA המתבטא pTEF-GBD היו נתון מרחביות-דף immunoblotting עם נוגדנים אנטי-myc. pTEF-GBD מבטאת רק Gal4-אן-bindng התחום לבד; pTEF-GBD-bait1 מבטא את התחום Gal4-אן-bindng דבוקה של RhoA חסר לאתר prenylation C-מסוף והדיור מוטציה נעילתה לתוך קונפורמציה GTP מכורך; pTEF-GBD-bait2 מבטא את התחום Gal4-אן-bindng דבוקה של RhoA חסר לאתר prenylation C-מסוף והדיור נעילתה לתוך קונפורמציה מאוגד-תוצר מוטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: בדיקה עצמית הפעלת Diploids עשויים תאים PJ69-4A נושאת את הפיתיון המצוין פלסמידים ותאים PLY5725 נושאת את פלסמיד טרף המצוין היו באופן סדרתי מדולל, הבחין CSM-Leu-Trp לוחות, לוחות CSM Leu-Trp-לו, ועל CSM-Leu-Trp-שלו + צלחות 3AT גדל במשך 3 ימים- 30 ° C. Transformants PJ69-4A המשמש ההזדווגות היו הראשונים של כל זוג בתרשים 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הזדווגות היעילות של Y187 לעומת PLY5725. תגובת החיזור בין PJ69-4A המכיל של TRP1-המכילה פיתיון וקטור, Y187 או PLY5725 פלסמיד טרף נשיאה בוצעה. 1:10,000 דילולים מצופים אל CSM-Trp-Leu כדי לבחור עבור diploids. המתח PLY5725 מראה של ההזדווגות יעילות גבוהה יותר מאשר המתח Y187 עם קיפול ~ 10 מושבות יותר הפיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ה-PCR של הטרף ספריית מוסיף. די אן איי היה מבודד שמרים דיפלואידי המכיל ספריה טרף גדל בתנאים לא בררניים (CSM-Leu-Trp מדיה) או תנאי בחירה עבור השפעה חיובית Y2H הדדית (מדיה CSM Leu-Trp-לו). PCR ברחבי הספרייה מוסיף מגלה הבדלים לרפרטואר של מוסיף שנבחרו. שני סיבובים של צמיחה סלקטיבית שימשו. התחלתית של צמיחה שנעשו על ידי דילול 20 מיליליטר 500 מ של תרבות דיפלואידי 750 מ של מדיה CSM-Leu-Trp לא בררניים, ולאחר עוד 20 מיליליטר לתוך 750 מ של מדיה CSM Leu-Trp-לו עבור התחלתית של צמיחה סלקטיבית (d1). זאת בעקבות של סיבוב נוסף של צמיחה (d2) שנעשו על-ידי לקיחת 2 מ"ל של התרבות d1 דילול לתוך 75 מ של מדיה סלקטיבי CSM Leu-Trp-שלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: המורכבות של ספריית cDNA Y2H. ניתוח התוכן של ספריות הטרף העכבר זמינים מסחרית cDNA Y2H: ספריה של cDNA של מוח העכבר ואחד רקמות העכבר מרובים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: דור Y2H שמרים מקטע גנומי הספרייה. א סכמטי המתאר הרכבה של הספרייה מקטע גנומי שמרים לתוך pGal4AD. דנ א גנומי מהמאמץ PLY5725 הייתה באופן אקראי לכסנתם, מאתרים עם מתאמי Y המצוין, מאתרים לתוך pGal4AD SfiI-קאט. Ligations הפכו לחיידקים התשואה 2.2 x 106 מושבות עצמאית היו משולבות, גדל לפני ניתוקה של פלסמיד שלהם DNA מעגנת את הספריה SacCer_TAB Y2H. B. LEU2-המכילים פלסמיד (pGal4AD) דיור Gal4 את תחום הפעלת גנים ברמת השעתוק מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: המורכבות של ספרייה גנומית של שמרים Y2H. בספרייה גנומית SacCer_TAB הפכה את המתח PLY5725 MATalpha ואת PJ_C1, C2, C3 ספרייה גנומית שמרים הפכה המתח ΜΑΤalpha Υ187. Diploids של אוכלוסיות אלה נעשו על ידי הזדווגות לאמץ PJY69-4A. אוכלוסיות היו מבוגר 10 דורות, שברי טרף ש-PCR מוגבר היו נתונים רצף תפוקה גבוהה וניתוח. א מציג סדר דרגה של קריאות לפי כל הגן בספריות Y2H לחלק את הקריאות לכל הגן נמצא על ידי רצף הגנום שמרים. לאור שפע המקבילה של כל גן, כל הגן יהיה ערך של 1. היסטוגרמה ב' מציג את המספר של פלסמידים ייחודי לכל הגן אשר קידוד קטע זה החלבון קידוד אזור (ORF) והן במסגרת הקריאה translational נאותה. ג. השוואה של מספר פלסמידים שונים בספריה כל כך לקודד גנים שמרים ושיעור אלה, אינם במסגרת קריאה translational נכונה או מוכנסים לאחור. ד חלקות מציג עמדות ושפע של צמתי הממפות גנים לדוגמה (VPS8 ו- VPS16) נמצאו על פלסמידים כל ספריה. פלסמידים עם fusions גנים הנמצאים במסגרת קריאה נכונה translational מיועדים כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10: הפארמצבטית של DEEPN עם ספרייה גנומית שמרים Y2H מורכבים. א ארבע אוכלוסיות דיפלואידי שמרים שונים נוצרו על ידי הזדווגות עם הספריה SacCer_TAB Y2H בבניין PLY5725, גדלו בתנאים לא בררניים, וסודרו. הקריאות לכל הגנים של כל האוכלוסייה בנפרד מותווים כפונקציה של הערך ההזמנה הדרגה הממוצעת על פני כל האוכלוסיות. B. מראה את הקריאות לכל הגן בין שני מדגמים לאחר הבחירה עבור אינטראקציות Y2H חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מספקים מדריך כיצד לבצע מבחני Y2H אצווה באמצעות שיטות אופטימיזציה. ישנם כמה צעדים קריטיים במסגרת ההליך כדי לסייע להבטיח כי האוכלוסייה של שמרים כי להימצא תחת הבחירה הוא נציג של הספרייה ההתחלה, כי מספיק של האוכלוסייה שמרים המוצא משמש בתהליך הבחירה כדי להגביל את השתנות . חשוב לציין, אמות-מידה אלה הם קל יחסית להשיג לצד התאמת את שיטות וחומרים מסורתיים Y2H assay, ובכך גישה זו נגיש ברוב מעבדות מאובזרים עבור תקן ביולוגיה מולקולרית. DEEPN מאפשר בחירה ספריית טרף מאותה אוכלוסייה תוך שימוש פלסמידים שונים פיתיון. לפיכך, קבוצת מועמדים אינטראקציה לייצר אינטראקציה של Y2H עם פתיון אחד לעומת אחר ניתן ישירות להשוות. בגלל רצף עמוק משמש, אחד יכול לאמת ההרכב ספריית ההתחלה עבור כל אוכלוסייה ספציפית פיתיון שמרים, בצע את העשרת לייעו טרף כל מועמד בספריה באופן עצמאי. עיבוד אצווה מאפשר ביצוע שאילתות באותה הספריה נגד פיתיונות שונים בצורה כמותית למחצה המאפשר אחד כדי לחשב את הדירוג סטטיסטי4אז.

ישנם מספר שלבים של פרוטוקול זה הם קריטיים להצלחה. אחת היא כי עליך להשיג מספר רב של diploids כדי להבטיח ייצוג הולם של הספרייה טרף Y2H מעורבב עם כל פלסמיד פיתיון של עניין. ההליך ההזדווגות המתוארים כאן מוטבה על ידי שינוי מספר פרמטרים. מצאנו כי זנים מסוימים זה הבית ספריות Y2H מסחרי חבר גרוע באופן כללי, עם זאת, ההליך ההזדווגות המתוארים כאן ניתן להפיק עונה 2 פרק 106- 2 x 107 diploids, כאשר ומאפשר העברת לשחזור והנכון Y2H ספריית לתוך האוכלוסייה. היבט קריטי נוסף של ההליך היא להבטיח כי פלסמיד פיתיון עניין לא ליצור השפעה חיובית הדדית Y2H בכוחות עצמו או עם התחום הפעלה Gal4 ריק טרף פלסמיד. השיטה לבחירת של האינטראקציה Y2H דורשת צמיחה בהיעדרו של היסטידין שבו השפעה חיובית הדדית Y2H גורם שעתוק של HIS3 כדי לאפשר התאים להיות שלו +. בעוד באופן שגרתי מבחני Y2H המסורתית ניתן להוסיף את 3AT מעכב תחרותי לצמצם רקע צמיחה או משתמשים אחרים כתבים3 , זה עובד ההליך הטוב ביותר כאשר תאים עם אינטראקציות Y2H חלש יכול לגדול, ובכך מגדילים את לכתחילה לצמיחה בחירת רק עבור תאים עם אינטראקציות Y2H חזקה מגביל את הרפרטואר של פלסמידים טרף שיכול להיות מזוהה. היבט קריטי נוסף הוא לוודא כי כמות גדולה של האוכלוסייה דיפלואידי התחלתי להשתמש לגדול בתנאים סלקטיביים, לא בררניים כדי להימנע מצווארי בקבוק אבולוציונית של דגימה שגיאה4 . בעקבות התרבות כרכים של התא המספרים המצוינים כאן יעזור להבטיח הפארמצבטית להפחית רעש.

אחת הסיבות שהגישה DEEPN היא חזקה היא כי זה יכול לעקוב באופן מקיף את כל פלסמידים בספריה טרף נתון על יכולתם לקיים אינטראקציה עם הפיתיון של ריבית. לפיכך, אחת המגבלות של DEEPN היא המורכבות של הספרייה בשימוש. עבור חלק מהספריות מסחרי כמו אלו השתמשנו כאן, מצאנו כי המספר של פלסמידים אשר קידוד בתום שברי cDNA ORF הנמצאים באותה מסגרת הקריאה של תחום הפעלה Gal4 הוא בין 3-6 x 104 עם ייצוג ~ 6,000 - 8.00 0 גנים שונים. מצאנו כי כמעט-75% של ספריות אלה הכלולים שברי המתאים אך ורק על אזורים cDNA היו 3' של קידוד רצף הדנ א (תקליטורים/ORF). יתר על כן, כמעט שליש של גנים אשר היו שברי בספריה היו לי שהקבילו לאזורים של ORF או הזרם של ORF.

עשינו שלושה שינויים אחרים בשיטה DEEPN. אחד הוא זן MATalpha חדש אשר יכול לשאת "טרף" ספריות שוכן בתוך פלסמיד TRP1 והחברים הזה הרבה יותר טוב מאשר זמינים מסחרית המכיל ספריית זנים מסוימים כגון Y187. פעולה זו מסייעת להבטיח להשלים את ההעברה של האוכלוסייה ספריית כפיתיון. כל עניין. עשינו גם חדש "פיתיון" ביטוי פלסמיד, השונה מן פלסמידים שתואר לעיל המשתמשות מבוססי 2µ עמוד שדרה משתנה העתקה10. כאן נתאר פלסמיד CEN נמוך-העתקה (pTEF-GBD), ולמצוא את אחד עגול של צמיחה סלקטיבית מספיקה להעשיר עבור אינטראקציה פלסמידים טרף. לבסוף, אנו לבנות וקטור ספריה יעילים "טרף", נהגה לייצר אקראיות-פרגמנט בצפיפות גבוהה ספריה גנומית Y2H עבור Saccharomces cerevisiae, אשר אמור לסייע בעתיד עבור גילוי ואפיון אינטראקציות amonst שמרים חלבונים. בסך הכל, השיפורים חומרים וכלים לביואינפורמטיקה (המתוארים בעבודה המלווה) להפוך את DEEPN לגשת דרך נגישה, ריאלי ויעיל של ביצוע מסכי Y2H השוואתי ומקיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

אנו מודים לצוות בתוך המכון לגנטיקה אנושית על הגדרות ספריית הכנה ורצף. אנו מודים עינת שניר על המומחיות שלה בהכנת שברי ספרייה גנומית של הספריה פלסמיד Y2H כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

ביוכימיה גיליון 136 אינטראקציית חלבון הדור הבא רצף ניתוח רצף הדנ א שמרים 2-היברידית
מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter