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Biochemistry

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

효 모 2 잡종 분석 결과 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 심사는 긴 효과적인 도구, 하지만 사용 크게 상호 작용 후보자의 라이브러리에서 풍성 하 게 매우 높은 선호도 인터의 발견에 제한 되었습니다. 전통적인 형식에서 효 모 2 잡종 분석 결과 분석 낮은 엄중에서 실시 하는 경우에 낮은 선호도 인터를 찾을 수 있습니다 너무 많은 식민지를 얻을 수 있습니다. 또한, 다른 미끼 플라스 미드에 대 한 동일한 라이브러리의 포괄적이 고 완전 한 심문 없이 비교 분석 얻을 수 없다. 이러한 문제 중 일부 기준점과 먹이 라이브러리를 사용 하 여 해결할 수 있습니다, 있지만 비용과 같은 화면을 작동 하는 데 필요한 인프라는 금지 될 수 있습니다. 대신, 우리 동시에 과도의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 및 정적 단백질 상호 작용 전략을 활용 한 화면 내에서 불리 DEEPN (평가의 단백질 네트워크를 위한 동적 농축)을 통합 높 처리량 DNA 연속 그리고 상호 작용 파트너 인코딩할 플라스 미드의 인구의 진화에 따라 계산 합니다. 여기, 우리 사용자 지정된 시 약 및 DEEPN 화면 쉽고 비용 효율적으로 실행 될 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

Introduction

세포 생물학 과정의 완전 한 이해를 찾는 그들의 분자 메커니즘의 기반이 되는 단백질 상호 작용 네트워크에 의존 합니다. 단백질 상호 작용을 식별 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 관심의 두 단백질 도메인 바인딩할 다른1일단 작동 공상 전사 요소를 조립 하 여 작동 하는. 전형적인 Y2H 화면 인코딩 상호 작용 단백질에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 플라스 미드의 두 도서관 효의 인구를 생성 하 여 수행 됩니다 (예., '먹이' 퓨전 단백질)와 주어진된 '미끼' 플라스 미드 단백질의 구성 관심사의 DNA 바인딩 도메인 (예를 들면,에 Gal4 상류 활성화 순서 Gal4 DNA 바인딩 도메인)에 융합. Y2H 접근의 주요 장점 중 하나 그것은 상대적으로 쉽게 하 고 일상적인 분자 생물학 작업2에 대 한 일반적인 실험실에서 수행 하는 저렴 한 장비입니다. 그러나 때 전통적으로 수행, 사용자 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 사항에 따라 발생 하는 개별 식민지를 샘플링 합니다. 이 심각 하 게 조사 될 수 있는 라이브러리 '먹이' 클론의 수를 제한 합니다. 이 문제는 때 특정 상호 작용 먹이의 풍부한 매우 낮은 풍부한 먹이 플라스 미드에서 상호 작용 검출의 기회를 감소, 다른 기준으로 복합입니다.

Y2H 원리는 프로테옴의 포괄적인 범위에서 사용 하기 위한 하나의 솔루션 알려진된 개별 먹이 플라스 미드를 포함 하는 배열을 디지털 심문 될 수 있습니다 어떤 점에서 매트릭스 형식의 접근 방법의 사용 이다. 그러나, 이러한 접근 되지 않는 쉽게 액세스할 수 또는 비용 효율적인 단백질 또는 도메인3의 적은 수의 위하여 정의에 관심이 개별 조사 하는 인프라가 필요 합니다. 또한, 상호 작용 단백질의 여러 단편을 인코딩할 수 있습니다 매우 복잡 한 먹이 라이브러리 것 허무 크기 같은 매트릭스 배열의 크기를 확장 합니다. 대안은 배치에서 복잡 한 라이브러리와 분석을 수행 하 고 대규모 병렬 높 처리량 연속4를 사용 하 여 상호 작용 클론의 존재를 평가 하는 것 이다. 이 일반적인 사용 하 여 여러 식민지에서 발생 하는 먹이 플라스 미드의 존재를 시험에 적용할 수 있는 Y2H 형식의 접근을 효 모에 세포 융해 단백질의 상호 작용 쌍 주택 접시5,6에 성장 수 있습니다. 이 일반적인 생각 쿼리 두 여러 미끼의 증가 먹이 같은 시간7,8에서 구성 요소를 강조 될 수 있습니다.

아직도, 많은 조사 쉽게 아직 더에 초점을 맞춘 노력 불과 단백질 '미끼'를 요구 하 고 단일 복잡 한 먹이 라이브러리의 완전 및 반 정량적 쿼리에서 더 혜택을 받을 수 있습니다. 우리가 개발 하 고 배치 형식4의 Y2H 원리를 사용 하 여 대규모 단백질 상호 작용 연구를 수행 하는 방법을 확인 했습니다. 이 Y2H 상호 작용9의 상대 강도 대 한 프록시는 특정 먹이 플라스 미드의 확장 속도 사용합니다. 인구 내의 모든 플라스 미드의 깊은 시퀀싱 대상이 정상적인 성장 또는 선택적 성장 조건 강하고 약한 Y2H 상호 작용을 생성 하는 클론의 완전 한 지도 생성. 인터의 레 퍼 토리 얻을 하 고 직접 여러 미끼 플라스 미드에 걸쳐 비교 수 있습니다. 불리 DEEPN (동적 농축 단백질 네트워크의 평가) 결과 워크플로 따라서 다른에 대 한 단백질 사이 비교를 허용 하는 단백질을 식별 하기 위해 같은 먹이 라이브러리에서 차동 interactomes 식별 하 사용할 수 있습니다.

여기, 우리가 DEEPN 설명 그림 1에 설명 되어 있습니다 실험실 방법의 사용을 촉진 하는 개선 사항 소개. 중요 한 개선 다음과 같습니다.

먹이 효 모 인구의 세대. DEEPN의 주요 요구 사항 중 하나 다른 미끼 플라스 미드 플라스 미드 먹이 라이브러리의 동일한 분포와 누 룩의 생성 합니다. 등가 기준 인구 먹이 플라스 미드 도서관의 다른 미끼의 interactomes 간의 정확한 비교를 만들기 위한 필수적입니다. 이것은 최고의 도서관 플라스 미드는 이미 단일 효 모 인구에 자리 하 고는 2 중 생산 짝짓기에 의해 달성 된다 인구에 주어진된 미끼 플라스 미드 이동 달성. 여기, 우리는 단일 효 모에는 상용 라이브러리를 사용 하 여 이러한 인구를 확인 하는 방법에 명확한 가이드를 제공 합니다. 우리가 diploids의 높은 번호를 생성 하는 방법을 발견, 이러한 상용 라이브러리-포함 된 효 모 종자의 전반적인 짝짓기 효율 낮은 했다. 따라서, 우리는 짝짓기 반응 당 훨씬 더 많은 diploids 수율 먹이 라이브러리를 집을 수 있습니다 새로운 긴장을 건설 한다.

새로운 미끼 플라스 미드의 설정. 익스프레스 '미끼' 퓨전 단백질 구성 관심과 DNA 바인딩 도메인의 단백질의 많은 현재 플라스 미드 2µ-기반으로, 그들의 복사본 수를 증폭 하는. 이 복사 번호 인구에서 매우 변수 하 고 Y2H transcriptional 응답에서 가변성으로 이어질 수 있습니다. 이 차례로 선택 셀의 성장 응답에 따라 주어진된 단백질 상호 작용의 강도 측정 하는 기능을 왜곡 수 있습니다. 이 중 일부는 이전 상용 pDEST3210같은 설명 되었습니다 낮은 사본 플라스 미드를 사용 하 여 주소 분할 수 있습니다. 우리가 건설 한 새로운 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD) 또한 상류의 미끼 조각 모두 복제 수 있습니다 Kanr 저항 유전자를 운반 TRP1 centromere 기반 낮은 사본 플라스 미드 내 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질을 생산 하 고 Gal4 DNA 바인딩 도메인의 다운스트림.

새로운 고밀도 Y2H 조각 도서관. 우리 집 Y2H 먹이 라이브러리에 새로운 플라스 미드를 건설 하 고 게놈 DNA의 임의로 깎인된 파편의 Saccharomyces cerevisiae에서 만든 매우 복잡 한 Y2H 라이브러리를 구축 하는 데 사용. 시퀀스 분석이 라이브러리 1 백만 이상 다른 요소, 앞에서 설명한 효 모 게놈 Y2H 플라스 미드 도서관11보다 훨씬 더 복잡 했다 보여주었다. 이 새로운 라이브러리 DEEPN 워크플로 안정적이 고 재현 가능한 방식으로 많은 다른 플라스 미드와 복잡 한 라이브러리에 맞게 충분히 강력한 보여줄 수 있었습니다.

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Protocol

1입니다. 미디어와 접시의 준비

참고: 모든 접시 프로토콜을 시작 하기 전에 2 일 최소로 만들 필요가 있다. 미디어는 언제 든 지 할 수 있다. 그러나, 버퍼링 된 효 모 추출 물 펩 포도 당 아데닌 (bYPDA) 사용 되는 날을 만들 수 필요가 있다. 일부 미디어 무엇 일반적으로 사용 되는 보다 큰 아데닌의 수준을 포함 하는 보충 믹스를 사용 하 여 이루어집니다. 대부분 최소한의 미디어 보조 10 mg/L 아데닌을 지정합니다. 보조 제 표시 된 '+ 40Ade' 지정 40 mg/L 아데닌의 총.

  1. 포도 당 솔루션 준비 (50 %w / v). 1 L, 해산의 D-(+) 500 g-1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 포도. 1000 ml의 멸 균 1000 mL 미디어 저장 병에 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 졸업된 실린더와 필터를 사용 하는 볼륨을 조정 합니다.
  2. 효 모 추출 물 펩 포도 당 (YPD) 접시를 준비 합니다. 1 L, 펩의 및 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 효 모 추출의 10 g 20g을 분해. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 960 mL 증류수 채우기. 2000 mL 삼각 플라스 크에 부 어와 한 천 15 g을 추가. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 40 mL를 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  3. 완전 한 합성 최소한의 미디어 (CSM) 준비-Trp 접시. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 6.7 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 960 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp의 0.7 g-강하 믹스, 20mg 메티오닌, 한 천 15 g를 만났다. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 40 mL를 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  4. CSM 레이 만난 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 부 어와 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가의-레이 1.005 g-강하 믹스와 한 천 15 g을 만났다. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  5. CSM-레이-Trp 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp의 1.005 g-레이 + 40Ade 강하 믹스, 아데닌, 240 밀리 그램 및 한 천 15 g. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  6. CSM-레이-Trp-그의 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp 0.975 g-레이-그의 + 40Ade 강하 믹스 아데닌, 240 밀리 그램, 한 천 15 g. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 잘 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  7. CSM-레이-Trp-그의-3AT 접시를 준비 합니다. 1 L, 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL에 10.05 g 효 모 질소 기지의 아미노산 없이 해산. 졸업된 실린더에 따르십시오, 최대 940 mL의 증류수 채우기. 삼각 플라스 크 2000 mL를 붓고 고 추가-Trp 0.975 g-레이-그의 + 40Ade 강하 믹스 아데닌, 240 밀리 그램, 한 천 15 g. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50% 포도 당 60 mL을 추가 하는 피 펫을 사용 합니다. 소용돌이 의해 3-아미노-1,2,4 triazole (3AT)의 1 M 살 균 주식의 100 µ L에 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  8. 파운드-Kanr 접시를 준비 합니다. 과 800 mL에 NaCl의 10 g을 1000 mL 비 커에 증류수 1 L, 디졸브 Tryptone, 10 g의 효 모 5 g 추출 합니다. 졸업된 실린더에 따르십시오, 증류수 1000 mL를 채우십시오. 삼각 플라스 크 2000 mL로 부 어와 한 천 15 g을 추가. 오토 클레이 브와 37 ° C 물 목욕 물 목욕 온도 약 42-50 ° c.를 냉각 했다 때까지 멋진 50 mg 대를 추가 하 고 소용돌이 의해 혼합.
    1. 피 펫에 의해 미디어의 20 mL 100 mm 접시의 시리즈를 따르십시오.
  9. YPD, CSM 레이 만난, CSM-Trp, CSM-레이-Trp와 CSM-레이-Trp-그의 미디어를 준비 합니다. 위의 절차를 사용 하 여 격판덮개는 agar를 생략 하 고 삼각 플라스 크에 따르고, 대신 미디어 저장 병에 부 어 제외 하 고.
  10. BYPDA (버퍼 YPDA)을 준비 합니다. 살 균 YPD 미디어 고 멸 균 증류수에 200 mg/L 아데닌을 추가. 무 균 병으로 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 HCl. 여과기와 3.7 pH 조정 합니다.
  11. 변환 버퍼 준비: 2 M sorbitol, 1 M 리튬 아세테이트가 수화물, 10 mM Tris pH 7.6, 0.5 m EDTA, 0.2 m m 증류수에 염화 칼슘. 무 균 병으로 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 필터링.
  12. 준비 못 솔루션: 증류수에 70 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 3350. 압력솥에 의해 소독.
  13. 돌리기 준비: 8 M 요소, 4 %w / v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10 %v / v 글리세롤, 0.02 %w / v bromophenol 블루에 살 균 증류수.
  14. STE (강한 테) 준비: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 증류수. 무 균 병으로 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 필터링.
  15. Zymolase 재고 솔루션을 준비: 10 mg/mL Zymolase 100T 50 mM 칼륨 인산 염기 pH 7.5에에서, 50 %v / v 글리세롤 버퍼 멸 균 증류수 (-20 ° C에 저장).

2. 복제 및 미끼 플라스 미드의 확인

참고: 건설 Gal4 DNA 바인딩 도메인 플라스 미드. 현재, 상용 하 고 학문적으로 사용 가능한 Y2H 시스템의 다양 한이 있다. 미끼 플라스 미드 DNA 바인딩 도메인에 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 된 TRP1DEEPN이 수용할 수 있는-포함 하는 플라스 미드. 다른 다운스트림 요구 순서는 즉시 상류 먹이 라이브러리의 삽입 알려져 있다 고 긍정적인 Y2H 상호 작용 미디어 히스티딘 부족에서 선택할 수 있도록 His3의 생산에 의해 득점 될 수 있습니다. 그러나 여기 우리는 새로운 Y2H 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD, 그림 2)의 사용을 설명 합니다, 그리고, pGBKT7를 포함 하는 다른 플라스 미드 Y2H 미끼 뿐만 사용할 수 있습니다. 건설 및 미끼 플라스 미드의 평가, pTEF GBD의 사용을 설명 합니다. 일반 노트로 서 유전자 합성을 좋은 표현과 복제와 용이성을 보장 하기 위해 효 모 codon 바이어스를 준수 하는 오픈-독서 프레임을 생산 하는 것이 좋습니다. 복제 스키마 Gal4 DNA 바인딩 도메인 프레임 및 3' 사이트에 복제 하는 경우 정지 codon 다음과 미끼 코딩 지역 미끼에 대 한 수 수 있는지 확인 합니다.

  1. 플라스 미드 벡터를 준비 합니다. 플라스 미드 pTEF GBD 관심사의 단백질을 인코딩 조각 복제 허용 5' 또는 3' 지역의 Gal4 DNA 바인딩 도메인 빠른 어셈블리 메서드를 사용 하 여 인코딩. 5' 사이트에 삽입 소화의 나리와 EcoRI pTEF GBD 3 µ g 또는 3' 사이트에 삽입, BamHI로 소화 하 고 2-4 헤 1% DNA agarose에서 Electrophorese 샘플에 대 한 XhoI 젤 포함 0.2-0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람 (EtBr) 100 대에서 삭제할 컷 5,630 혈압 TEF GBD DNA 젤 추출 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라에서 정화 하 고 260에서 흡 광도 의해 DNA를 계량 분 광 광도 계12nm.
    참고: 미끼 인코딩 삽입의 세대입니다. DNA 파편 인코딩 단백질 또는 단백질 파편의 복제 되지 않은 조각을 사용할 수 있도록 하 고 유전자 합성을 사용 하 여 만든 수 있습니다. Codons Saccharomyces cerevisiae 에 식에 대 한 최적화와 코 돈 최적화를 위한 온라인 도구 재료의 목록에 포함 하는 것이 좋습니다.
  2. 5' 삽입, 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3는 ATG 시작 codon 인코딩 DNA 조각 측면 '및 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', 각각. 3' Gal4 DNA 바인딩 도메인 프레임에 삽입, ctgcatatggccatggaggccgaa-3-5'로 인코딩 조각 측면 '및 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. 플라스 미드 건설에 대 한 빠른 어셈블리 메서드 사용 제조자의 방향에 지정 된 대로 복제 조각 컷된 pTEF GBD에.
    1. 모든 파운드 Kanr 접시에 대장균 을 변형 16-20 h 37 ° c.에 대 한 품 어 접시 원하는 삽입을 가진 pTEF GBD 주거 식민지는 oligonucleotides를 사용 하 여 PCR 증폭에 의해 확인 될 수 있다: CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3-5' ', 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' 삽입 및 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3'와 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' 3' 삽입에 대 한. 이러한 oligonucleotides 뇌관 삽입 시퀀싱도 될 수 있습니다.
    2. 준비 계획 > 각 pTEF GBD 파생 및 시퀀싱 및 누 룩 변환에 대 한 자료를 제공 하는 혼자 pTEF GBD 10 µ g.
    3. 다음 PCR 조건 사용: 98 ° c, 3 분 뒤에 30의 25 주기 s 98 ° C, 30에서 55 ° c, s 및 72 ° C에서 2 분 뒤에 2.5 m m MgCl2 를 포함 하는 버퍼를 사용 하 여 72 ° C에서 5 분 0.5 U/100 µ L DNA 중 합 효소, 및 독점 버퍼.

3. 표현의 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질

  1. 유능한 누 룩을 확인 합니다.
    1. -80 ° C의 1 m m3 를 근 근이 살 균 나무 주걱을 취 함으로써 YPD 접시에 효 모 PJ69-4A에 밖으로 행진 동결 주식과 YPD 접시에 걸쳐 부드럽게 문 지르고. 각 패스 미디어 표면의 손길이 닿지 않은 부분에 걸쳐가 되도록 접시 아래 나무 주걱을 이동 합니다. 2 일 동안 또는 단일 식민지 표시 될 때까지 30 ° C에서 YPD 플레이트를 품 어. 물 또는 성장 매체에서 누 룩을 중단, 7 %DMSO 보충 하 여 저장 하면-80 ° c.에 PJ69-4A 효 언된 재고 확인
    2. 단일 식민지 문화 YPD의 메 마른 나무 주걱을 사용 하 여 20 mm x 150 mm 문화 관에서의 5 mL에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 성장 한다.
    3. PJ69-4A 효 모 스트레인의 숙박 문화 4 mL를 무 균 삼각 플라스 크의 250 ml에서 YPD의 50 mL 접종 표준 1 cm 빛 경로와 분 광 광도 법에 따라 약 1.2의 30 ° C, 광학 밀도 (OD600) 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 성장 한다. 성장에는 일반적으로 5-7 h 걸립니다.
    4. 벤치탑 원심 분리기에 실 온에서 5 분 동안 4,696 x g에서 원뿔 튜브의 50 mL에 침전 하 여 효를 격리 합니다. 액체 폐기물에 덤핑으로 상쾌한을 삭제 합니다. 변환 버퍼와 15 mL 원뿔 튜브의 전송의 5 mL에 펠 릿을 resuspend를 피 펫을 사용 하 여. 상쾌한, 삭제 하 고 변환 버퍼 1000 µ L 피 펫의 최종 볼륨의 1 mL에 누 룩을 resuspend Resediment.
    5. 30 ° C에서 60 분에 대 한 효 모 세포 200 rpm에서 동요 하는 동안 알을 품고 고 30 ~ 90 분 동안 얼음에 놓습니다.
  2. 효 모 플라스 미드 전이입니다.
    1. 살 균 microcentrifuge 튜브 1.5 ml, pTEF GBD-기반 플라스 미드의 1 µ g 및 5 µ L의 10 mg/mL 연어 정자 DNA 솔루션을 추가 합니다. 또한 부정적인 변환 제어로만 연어 정자 캐리어 DNA를 포함 하는 튜브를 포함 합니다. 피 펫에 의해 각 튜브를 얼음 처럼 차가운 효 모 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다. 70%의 100 µ L을 추가 못 1000 µ L 피 펫 및 부드럽게 터치 튜브 5-10 배 (소용돌이 하지 않습니다) 하 여 혼합 솔루션.
    2. 45 분 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 품 어.
    3. 15 분 동안 42 ° C에서 열 충격.
    4. 845 x g, 실내 온도에 3 분에 microcentrifuge에 앙금에서 플라스틱 그리고 상쾌한 삭제, 아래로, pipetting으로 살 균 물 150 µ L에서 펠 릿 resuspend CSM Trp 격판덮개의 표면에 걸쳐.
    5. 30 ° C 인큐베이터에 접시 오른쪽 장소 하 고 식민지가 표시 될 때까지 2-3 일 동안 품 어. 플레이트 6-12 h 30 ° C에서 배양 후 플레이트 표면에 응축을 피하기 위해 거꾸로 설정 될 수 있습니다.
    6. 메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 CSM Trp 접시에 패치로 변환 및 행진 당 2-3 식민지를 가져가 라. 30 ° c.에 24 h에 대 한 성장을 허용합니다
  3. 단백질 식 lysates를 확인 합니다.
    1. 일치 머리 크기 패치에서 효와 CSM Trp 액체 미디어의 3 mL 접종 하룻밤 20 mm x 150 mm 문화 관에서 30 ° C에서 200 rpm에서 떨고 있는 동안 성장 하 고. 미끼와 빈 pTEF GBD 벡터 당 2 개의 숙박 문화를 확인 합니다.
    2. CSM Trp 하룻밤 문화의 각 3 ml YPD의 1 mL를 추가 합니다. 200 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 1 시간에 대 한 성장. 분 광 광도 계에 의해 셀의 OD를 확인 합니다.
    3. 셀, 마약에 따라 정상화의 동등한 수 앙금. Microcentrifuge 튜브의 살 균 1.5 mL를 사용 하 여 실내 온도 microcentrifuge에 2,348 x g에 5 분 회전 급강하. 한 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 삭제. 마지막 재고 최소 2.1 OD에 해당합니다.
      참고: 셀의 동등한 수를 계산, 그것은 발생할 수 있습니다 다른 볼륨 최소 2.1 OD를 달성 하기 위해 각 숙박 문화에서 필요할 수 있습니다.
    4. 0.2 M NaOH의 450 µ L를 위아래로 pipetting으로 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 품 어. 실 온에서 2,348 x g 2 분에 대 한 셀을 recentrifuge 하 고 피펫으로 여는 상쾌한 삭제.
    5. 거품을 만들지으로 신중 하 게 여기저기 pipetting으로 돌리기 버퍼의 50 µ L와 펠 릿을 resuspend. 70 ° c.에서 5 분 동안 열 샘플
  4. 단백질 발현 SDS 페이지를 확인 합니다.
    1. 분자 무게의 큰 범위를 위해 4-20%의 그라데이션 젤 해결할 수를 사용 합니다. 부하 상응 하는 금액 (동일한 OD) SDS 페이지에 샘플의 젤 되며 수정 되지 않은 pTEF GBD 벡터13,,1415를 포함 하는 적어도 하나의 샘플을 포함 해야 합니다.
    2. 전기 이동 별거 후 젤 니트로와 immunoblot 안티 myc 단일 클로 널 또는 polyclonal 항 체 및 ECL 탐지 솔루션 (그림 3)를 사용 하 여 전송 합니다.

4. 자기 인증 테스트

  1. 조에 해당 하 여 메 마른 나무 주걱, 유리병에서 효 모의 작은 금액을 긁 YPD 격판덮개의 맞은편에 질주 먹이 도서관 YPD 플레이트에 대 한 관심의 주택 스트레인-80 ° C 주식에서 흔 MATalpha 효 모 개 2 일 동안 또는 단일 식민지 표시 될 때까지 30 ° C에서 YPD 플레이트를 품 어. 패치는 YPD 접시에 몇 가지 단일 식민지와 30 ° c.에서 밤새 품 어
    참고: 여기 집 먹이 라이브러리 개발 새로운 변형 PLY5725는 반면 일부 호환 상용 Y2H 라이브러리 Y187에 보관 되어있습니다.
  2. 3.3.1-의 절차에 따라 LEU2와 PLY5725를 변환할 3.3.4-플라스 미드를 집 원하는 먹이 라이브러리 사용을 기반으로. 여기서 개발 된 라이브러리, 해당 플라스 미드는 pGal4AD (pPL6343). 효 모 transformants를 복구 하려면 CSM 레이 만난 접시에 접시. 식민지 후 발생, CSM 레이 만난 접시에 패치로 행진 하 고 30 ° c.에 24 h에 대 한 품 어
  3. 3.4 pPL6343 빈 벡터를 사용 하 여 안티의 식을 확인 하는 프로토콜에 따라-하 단일 클로 널 또는 polyclonal 항 체 및 ECL 탐지 솔루션.
  4. 프로토콜 섹션 3.4와 4.3에에서 단백질을 표현 하 고 하룻밤 30 ° C에서 품 어 확인 되었다 YPD 접시에 각각 PLY5725와 크로스 패턴에서 변형된 PJ69-4A 효 모 생성 행진. 받아 1 m m3 두 변종에 함께 성장 하 고에 패치 셀의 CSM 레이 만난, 별도 CSM-Trp, 및 CSM-Trp-레이 접시 24 h를 성장.
    참고: 원하는 diploids CSM-Trp-레이 판에 성장할 것입니다. CSM 레이 만난에 성장 및 CSM Trp 접시 효 모 성장에 대 한 긍정적인 컨트롤 역할을 합니다.
  5. 30 ° c.에 하룻밤 CSM-Trp-레이 미디어의 1 mL에 diploids 성장 Microcentrifuge의 1.5 ml에서 앙금 500 µ L 셀 2,348 x g, 실내 온도 microcentrifuge에 3 분에 관. 상쾌한 피 펫에 의해 삭제 합니다. Resuspend 살 균 물의 1 mL에서 셀과 침전 및 물의 resuspension 반복 합니다. 셀의 OD600 을 확인 하십시오.
  6. 만들기 시리즈 1시 10분의 각 세포 현 탁 액 살 균 수를 사용 하 여 시작 하는 대부분의 직렬 희석 0.5 세에서 각각의 솔루션을 집중. CSM-레이-Trp 접시, CSM-레이-Trp-그의 플레이트, 그리고는 CSM에 각 희석의 5 µ L 자리-레이-Trp-그의 + 3AT 플레이트. 30 ° C에서 품 어와 성장을 위한 검사 일일 3 일 동안 (그림 4).
    참고: 1시 10분에 대 한 직렬 희석, 10 µ L 90 µ L의 물에는 OD 0.5 포함 된 튜브의 플라스틱 및 아래로 pipetting으로 혼합. 1시 10분 직렬 희석 자리에 6 개의 다른 농도의 총 때까지 계속 합니다.

5. 미끼와 먹이 도서관 효 모 인구 만들기

참고: 상업 먹이 라이브러리 플라스 미드 하우스 Y187 스트레인 잘 친구 하지 않습니다. 따라서, 다음과 같은 최적화 된 조건은 라이브러리의 복잡성을 유지 하기 위해 필요 합니다. PLY5725 포함 Y2H 먹이 라이브러리 동료를 더 변형 및이 긴장 (그림 5)와 같은 짝짓기 프로시저를 사용할 수 있습니다.

  1. 다양 한 TRP1를 들고 PJ69-4A transformants의 각각의 문화의 3 mL 접종-문화 관에 CSM Trp 미디어에서 pTEF GBD 미끼 플라스 미드를 포함 하. 절차적 컨트롤 역할을 혼자 pTEF GBD 벡터 플라스 미드를 포함 하는 2 개의 별도 문화를 포함 합니다. 30 ° C를 6 h 200 rpm에서 문화를 품 어 그리고 하룻밤 성장 위한 무 균 삼각 플라스 크에 문화의 25 mL로 희석.
  2. LEU2를 포함 하는 MATalpha 세포의 냉동된 (-80 ° C) 유리병을 녹여-실 온에서 도서관 "먹이"를 들고. 완전히 해 동된 유리병으로 무 균 삼각 플라스 크에 CSM 레이 만난 미디어의 125 mL 접종 200 rpm에서 떨고 하룻밤 30 ° C에서 모든 문화를 성장.
    참고: OD600 하룻밤 문화의 다음 단계로 진행 하기 전에 1.0 ~ 1.5 사이 범위 필요가 있다.
  3. PJ69-4A transformant 문화 실 온에서 4,696 x g에 5 분 회전 급강하의 각각의 21 세 해당 원심 모든 10 짝짓기 반응, 별도 50 mL 원뿔 튜브에에서 라이브러리 플라스 미드를 운반 하는 MATalpha 긴장의 펠 릿 39 세600 등가물 원하는.
    1. Resuspend 살 균 물 10 mL에 셀과 다시 새로운 50 ml에서 원뿔 튜브 4,696 x g 5 분의 작은 벤치탑 원심 분리기에서 실내 온도에. 부드럽게 한 피 펫을 사용 하 여, 수송과 세포를 중단 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
    2. 4 mL에 PJ69-4A 셀과 bYPDA (pH 3.7) 10 mL에 PLY5725 셀의 펠 릿 resuspend
  4. 설정 하려면 짝짓기 반응, PJ69-4A의 1 mL 변형 셀, MATalpha 라이브러리 포함 된 셀의 1 mL 및 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 bYPDA pH 3.7의 1 mL 추가 합니다. 90 분에 대 한 부드러운 궤도 동요 (100-130 rpm)와 30 ° C에서 품 어.
    1. 실내 온도 벤치탑 원심 분리기에 4,696 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 상쾌한 피 펫에 의해 제거 하 고 1:1 bYPDA:YPD 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 피 펫에 의해 모든 2 mL 100 mm YPD 접시에 접시와 약 20 h 30 ° C에서 품 어.
  5. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 CSM-레이-Trp 미디어의 2-3 mL로 세포를 꺼내 려 하는 YPD 격판덮개에서 베스트 셀. 원뿔 튜브의 50 mL에 dislodged 피 펫 셀. 최대 1000 µ L를 사용 하 여 미디어 플라스틱 pipetting와 부드럽게 YPD 플레이트 표면에 걸쳐 미디어 꺼내기 CSM-레이-Trp 미디어의 2-3 mL와 4-5 회 접시를 헹 구 십시오.
    1. 실내 온도 벤치탑 원심 분리기에 4,696 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 상쾌한 피 펫에 의해 무시 하 고 (마 하지 소용돌이) 위아래로 pipetting으로 CSM-레이-Trp 미디어의 40 mL에 셀을 resuspend.
  6. 형성 하는 2 중 세포의 수를 예상 하려면 200 µ L 2000 µ L CSM-Trp-레이 미디어에 2 중 혼합물의 4 µ L를 희석. CSM-레이-Trp 접시에 각 희석의 200 µ L 플레이트.
    참고: 두 접시 diploids 수확 하 고 저조한 1:10,000 희석 접시에 예상된 ~ 9000-27000 식민지 36-40 헤 30 ° C에서 부 화 후 체크 플레이트 단계 5.7 후 재고의 1:10,000 및 1:100,000 배 희석을 나타냅니다. 최소한 1:10,000 희석 접시에 200 식민지의 5.8 단계로 진행 하는 데 필요한
  7. 바로 셀 물의 resuspension의 각 40 mL의 나머지 고 CSM-레이-Trp 미디어의 500 mL를 포함 하는 삼각 플라스 크 1000 mL를 접종 합니다. 초기 세600을 가져가 라. 채도 (~2.0 OD/mL)를 도달할 때까지 180 rpm에서 떨고와 30 ° C에서이 플라스 크를 품 어. 이 일반적으로 걸립니다 약 36-40 헤 24 h에 모니터 성장을 다시 36 h에 OD600여.
  8. 문화와 innoculate 2000 mL 삼각 플라스 크, 포함 한 750 mL CSM-레이-Trp 미디어의과 두 번째 포함 750 mL의 CSM-레이-Trp-그의 3AT의 낮은 수준으로의 포화 500 mL의 각에서 aliquots의 20 mL를 제거를 피 펫을 사용 하 여 그 배경 (이전 섹션 4.5에서 결정)을 제거 합니다. 소용돌이 의해 잘 새로운 문화 (770 mL)를 혼합 하 고 초기 세600걸릴.
  9. 채도 일반적으로 선택 되지 않은 CSM-레이-Trp 문화에 대 한 24 시간 이내 발생 하 고 Y2H 상호 작용에 대 한 선택에서 문화에 대 한 70 h 이상 걸릴 수 있습니다 도달까지 180 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 문화를 품 어.
  10. 문화에는 채도 (OD ~ 2.0)에 도달 했습니다, 일단 제거의 11 mL 피 펫, 앙금 4,696 x g 상 온에서 5 분 스핀으로 셀, 피 펫,으로 상쾌한 삭제-20 ° C에서 동결 또는 DNA 추출에 계속. 선택한 및 선택 되지 않은 샘플 모두 사용 됩니다 깊은 시퀀싱에 대 한.

6. 샘플 준비 DEEPN 깊은 시퀀싱

  1. DNA 추출입니다.
    1. 한 피 펫을 사용 하 여 resuspend microcentrifuge 튜브 1.5 ml sTE 버퍼와 전송 프로토콜 섹션 5.7에 500 µ L에서 셀 펠 릿. 3 µ L의 betamercaptoethanol 및 Zymolase 주식의 10 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 24-36 h에 대 한 37 ° C 배양 기에서 품 어.
    2. 연기 후드16을 사용 하는 동안 500 µ L 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜으로 두 번 샘플을 추출 합니다.
    3. 4 M NaCl의 7 µ L, 얼음 감기 100% 에탄올 (ETOH), 전도 의해 혼합 및 어느 동결-20 ° C의 900 µ L를 추가 하거나 토사 DNA microcentrifuge에 실 온에서 10 분 동안 21,130 x g에서 회전 하 여 계속 합니다.
    4. 상쾌한 피 펫에 의해 삭제 합니다. 70%의 900 µ L로 몇 번이 고 펠 릿을 세척 ETOH.
    5. 침전 물 21,130 x g 2 분에 대 한 작은 고 피 펫에 의해 잔여 ETOH 세척을 제거 합니다. 7 분 42 ° c.에 건조 펠 렛
    6. 90 분 동안 37 ° C 물 욕조에 0.1 x sTE의 120 µ L에서 펠 릿 resuspend, 매 30 분을 혼합 튜브 영화.
    7. Microcentrifuge 튜브의 살 균 1.5 mL로 추출 된 DNA의 60 µ L 플라스틱. 인 트, RNase A 주식, 혼합 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어 영화 3.5 µ L의 120 µ L를 추가 합니다.
    8. 이전 단원의 6.1.3-6.1.5, 수행 하는 에탄올 침전 하지만 4 M NaCl 대신 5 M 염화 아세테이트의 7 µ L을 사용 합니다.
    9. 90 분 동안 37 ° C 물 욕조에 0.1 x sTE의 55 µ L에 RNase A 치료 DNA resuspend, 260에서 흡 광도 의해 30 분 마다 계량 DNA를 혼합 튜브 영화는 분 광 광도 계에 nm.
  2. PCR cDNA를 삽입합니다.
    1. 2 DNA 샘플 당 50 µ L PCR 반응을 수행 합니다. 각 반응 포함 각 정방향 및 역방향 뇌관 먹이 도서관 플라스 미드를 일치의 25 pmol (자료 참조). 반응 또한 하이파이 2 x PCR 마스터 믹스, 5 µ g의 DNA 샘플의 25 µ L를 포함 하 고 최대 50 µ L. 증폭 반응 확장 시간 72 ° C, 55 ° C 30의 단련 온도에서 3 분의 25 주기 위한 물 들, 그리고 10 s. 선행 98 ° C에서 변성 시키기 사이클링 72 ° c.에서 5 분 부 화와 98 ° C에 따라 30 s 변성에 의해
    2. 4 분석 DNA agarose와 1% DNA agarose 젤 전기 이동 법에 의해 각 PCR 반응의 µ L 젤 포함 0.2-0.5 µ g/mL EtBr17. UV transillumination에 의해 DNA 샘플을 시각화. 샘플은 DNA 약 1-3 kb, 어디 밴딩 패턴 있습니다 샘플에 대 한 Y2H 상호 작용은의 얼룩 선정 (그림 6) 표시 됩니다.
    3. 중복 PCR 견본을 결합 하 고 제조업체의 지침에 따라에서 PCR 정화 키트를 사용 하 여 정화 하 고 260에서 흡 광도 의해 DNA를 계량 한 분 광 광도 계에 nm.

7. 깊은 시퀀싱

참고: 샘플 준비 및 시퀀싱 깊은 시퀀싱 플랫폼에는 상업 및 학문적 인 DNA 시퀀싱 핵심 시설에서 일반적으로 사용할 수입니다.

  1. ~ 300의 평균 길이의 조각에 게 고성능 울트라 sonicator를 사용 하 여 PCR 제품의 전단 600 ng 혈압.
  2. 링커 못쓰게 사이트, 바코드, 인코딩 추가 깊은 시퀀싱에 대 한 준비 키트를 사용 하 여 인덱싱된 시퀀싱 라이브러리를 생성 하 고 DNA 파편의 끝에 비대칭으로 시퀀스를 캡처하십시오.
  3. 제조업체의 지침에 따라 라이브러리 준비를 수행 합니다. 풀 색인 라이브러리와 깊은 시퀀싱 플랫폼 (예를 들어, 2 x 150 bp PE 읽기)에 긴 쌍 간 읽기 시퀀스. 각 샘플에 대 한 대상으로 읽기 원하는 수 10와 일반적으로 더 복잡 한 선택 되지 않은 인구에 대 한 원하는 더 많은 읽기로 40 백만 사이입니다. 선택 되지 않은 인구를 위해 적어도 20 백만 이상의 읽기를 좋습니다.

8. Bioinformatic 처리 및 확인

  1. 독립형 소프트웨어 (1) 시퀀스를 지도 하는 프로그램 파일 범용 샘 형식 (2) 계량 읽기의 세트와 함께 fastq의 형태로 데이터를 시퀀싱 프로세스 DNA 데이터 (집합 사이의 유전자 농축 3) 수행에 데이터의 통계 분석 순위는 후보자 유전자 순서는 긍정적인 상호 작용 Y2H (4) (5) 및 무슨 지구 및 무엇 변환 프레임 각 유전자 마다 먹이 cDNA의 파편을 긍정적인 Y2H 상호 작용 구성 되어 항복 정보 제공 제공 5' 뿐만 아니라 전통적인 Y2H 형식에 그들의 재건 및 확인을 수 있도록 상호 작용 조각의 3' 끝을 재구성 하는 도구. 이러한 프로그램의 운영은 함께 연구에 상세 하다.

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Representative Results

Y2H 분석 결과 단백질: 단백질 상호 작용을 찾기위한 널리 사용 되었습니다 그리고 몇 가지 적응 및 시스템 개발 되었습니다. 대부분의 경우, 이러한 이전 접근의 성공을 보장 하는 데 도움이 같은 고려 DEEPN에 대 한 중요 하다. 중요 한 벤치 마크의 일부를 포함: 보장 표현의 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질, 보장의 스 퓨 리 어스 낮은 배경을 포함 하는 빈 먹이 플라스 미드, 미끼의 높은 결합 효율에 대 한 관심의 미끼 diploids에서 그의 + 성장 포함 하는 라이브러리 포함 된와 타 누 룩 효 모 MATalpha, 그리고 마지막으로, 많은 긍정적인 Y2H 반응에 대 한 선택 하는 조건 하에서 성장 하는 인구를 허용 하는 낮은 엄중 조건 사람 그 생산의 저급 His3 활동과 약한 Y2H transcriptional 응답입니다.

DEEPN의 중요 한 측면 중 하나입니다 reproducibly 다른 미끼 플라스 미드를 포함 하는 긴장으로 Y2H 라이브러리를 소개 하 고 안정적으로 긍정적인 Y2H 상호 작용을 만드는 그 라이브러리 플라스 미드에 대 한 그 인구를 선택 합니다. Y2H 라이브러리의 복잡성 증가 이후 다른 초기 인구에서 전체 라이브러리의 적절 한 전송 되도록 열심히 하면 더 어려워집니다. 또한, 선택 선택 조건과 시퀀싱의 깊이에서 성장 하는 인구의 크기는 안정적으로 진정한 긍정적인 Y2H 상호 작용을 식별 하는 Y2H 플라스 미드 구성에서 재현할 수 변화를 관찰 하기에 충분 해야 합니다. 이전 학문에서는, 우리는 상업적으로 사용 가능한 Y2H cDNA 라이브러리를 사용합니다. 우리 같은 미끼 플라스 미드를 운반 하는 별도 인구 사이 Y2H 라이브러리 배포에 있는 가변성의 선택 하기 전에 두 개의 초기 인구 사이 overdispersion와 낮은 발견 < 0.01 일반적으로, 및 0.35-0.55 분리에 대 한 선택4후의 인구 그러나, 이러한 상용 Y2H 라이브러리의 일부의 복잡성은 매우 낮은 (그림 7). 또한, 그것 (~ 60%) 내에서 클론의 많은 3 ' 더 제한 하는 그들의 유틸리티를 코딩 영역의 cDNA 파편의 전적으로 만들어집니다. Saccaromyces cerevisiae (스트레인에서에서 게놈 DNA의 조각 (pGal4AD)를 포함 하는 위의 방법 보다 복잡 한 Y2H 라이브러리를 수용할 수 있는, 유선형된 '먹이' 플라스 미드 벡터에 새로운 Y2H 라이브러리를 만들었습니다 입증 하 PLY5725)입니다. 게놈 DNA 기울이기, 크기 SacCer_TAB Y2H 라이브러리 (그림 8)를 만드는 600-1500 bp, 어댑터, 수정 하 고 pGal4AD에 삽입의 범위에 대 한 선택에 의해 조각 되었다. 라이브러리는 PLY5725, PJ69-4A 타 들고 혼자 pTEF GBD 플라스 미드의 샘플을 다음 성관계 했다 효 모 인구 생산으로 변모 했다. 중복 2 중 인구 비 선택적이 고 선택적 조건 하에서 성장 했다. Y2H 플라스 미드 도서관 삽입 깊은 시퀀싱에 의해 분석 되었다. 100을 포괄 하는 genomic DNA에 매핑될 때 혈압 상류와 하류 지역 (전체 게놈의 84%), 코딩 각 단백질의 발견 > 라이브러리의 ~1.35 백만 다른 효 모에의 예상된 총 크기에 대 한 라이브러리에서 1.1 백만 다른 플라스 미드 플라스 미드입니다. 비교, 우리는 앞에서 설명한 효 모 게놈 Y2H 라이브러리11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H 라이브러리) MATalpha 효 모, 변형 그리고 위와 같은 분석을 복종. 우리 우리의 임의 조각 효 모 Y2H 라이브러리의 복잡성 훨씬 높은 되었고 훨씬 더 많은 플라스 미드 인코딩 이전 게시 된 라이브러리 (그림 9) 보다 각 유전자의 프레임에 조각 했다 발견. 중요 한 것은, 2 중 인구를 포함 하는 초기 라이브러리의 생성 했다의 overdispersion으로 재현성 < 0.01 (그림 10). 또한, 두 개의 별도 효 모 인구의 재현성 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택은, 0.3 overdispersion를 생성 후 플라스 미드 비슷한 재배포 하려면 생산. 따라서, 여기에 방법을 큰 Y2H 라이브러리 사용 이전 보다 높은 복잡성의 수용.

DEEPN의 용이성 증가 측면에서 우리는 관심의 미끼 단백질에 대 한 코딩 삽입 유전자 합성을 사용 하 여 선호 합니다. 이 코딩 영역 단백질 도메인, 키메라, 및 돌연변이 Y2H 미끼 플라스 미드에 쉽게 통합 될 수 있지만 또한 S. cerevisiae에 식에 대 한 최적화가 그들의 codons를 허용 한다. 두 개의 다른 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질의 표정은 그림 3에서 설명 했다. 두 개의 서로 다른 효 모 transformants 중 한 두 가지 미끼 융합 단백질을 표현 하는 것은 준비 되었고 SDS 페이지 고 immunoblotting 안티 myc 항 체와 함께. 빈 벡터에서 혼자 Gal4 DNA 바인딩 도메인 기준으로 미끼 단백질의 참고 식 수준. 우리는 그것은 중요 한 미끼 융해 단백질의 표정 확인 뿐만 아니라 정확한 타 효 모 transformant 식민지를 확장 하 여 먹이 라이브러리-포함 된 효 모에 친구 사용 될 식 확인을 발견. transformant 식별 되 면 아래로 고정 하 여 나중에 사용할 저장 가능 하다.

그림 4 는 자체 정품 인증을 위한 테스트 2 중 세포의 직렬 희석 CSM-레이-Trp (+ 그의)에 도금은 CSM-Trp-레이-그의 (-그의), 그리고 CSM-Trp-레이-그의 + 3AT (-그의 + 3AT) 플레이트와 3 일 동안 30 ° C에서 성장할 수. 원하는 결과 성장 관찰 하는 존재 하지만 하지 여부에 히스티딘의 부재에 있다 3AT. 이 CSM-Trp-레이-그의 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용을 가진 효 모에 대 한 선택의 사용을 허용할 것 이다. CSM-레이-Trp-그의 접시에 성장 하는 경우 다음 Y2H 선택 여전히 얻을 수 있습니다 성장을 방지 하는 3AT의 낮은 농도 사용 하 여. 우리는 성장 CSM-Trp-레이-그의 + 0.1 m m 3AT에서 차단 될 수 있습니다, 경우 다음 DEEPN 분석 결과 진행 Y2H 상호 작용에 대 한 선택이 조건을 사용 하 여 찾을. 그러나 경우,, diploids pGal4AD 또는 다른 빈 먹이 플라스 미드 및 pTEF GBD 미끼 퓨전 플라스 미드의 성장의 저해 3AT의 높은 농도, 그것 DEEPN 절차 및 다른 미끼 플라스 미드의 성능이 저하 됩니다. 발견 되어야 한다. 참고 그의 + 성장 긍정적인 Y2H 상호 작용을 위한 유일한 선택 이다. 우리는 이것은 일괄 처리에서 Y2H 상호 작용에 대 한 풍부 하 게 충분 한 발견 했다.

DEEPN 워크플로에서 가장 중요 한 절차 중 하나 높은 효율 MATalpha 효 모 Y2H 먹이 라이브러리를 들고 미끼 플라스 미드를 들고 타 효 짝짓기 달성입니다. 우리는 일부 변종 (예를 들어, Y187)18, 상용 cDNA 라이브러리 주택, 상대적으로 가난한 짝짓기 효율성이 있다. 그 이유로, 우리는 Y2H 라이브러리를 수행 하는 변형 설계. 이 긴장은 BY4742, S288c의 파생을 기반으로 합니다. 이 긴장에 GAL4, GAL80, TRP1, LEU2및 HIS3부족 하다. 하이브리드 Gal4 단백질도 다른 하이브리드 (예를 들어, LexA VP16) 반응 없는 기자 들을 포함 합니다. 대신, Y2H 유도 His3 생산의 원천 특정 미끼 플라스 미드를 수행할 것 이라고 타 변형 내에서 지 내게 됩니다. 이 시스템을 간소화 하 고 그 하나에 유연성 수 LexA 미끼 융합 단백질 및 LexA(UAS)-HIS3 기자 또는 Gal4 DBD 미끼 융해 단백질와는 Gal4 스트레인 친구를 동일한 라이브러리에 포함 된 MATalpha 셀을 사용할 수 있습니다. (UAS)-HIS3 기자.

2 중 인구를 들고 미끼 플라스 미드와 라이브러리 생성 됩니다, 일단 그들은 희석 하 고 조건 하에서 단지 선택 하는 (예를 들어, CSM-Trp-레이)는 모두 플라스 미드 또는 플라스 미드 및 긍정적인 Y2H 상호 작용을 모두 성장할 수 있는 His3의 생산 드라이브 (예: CSM-레이-Trp-그의). 로 시작 하는 진화 '좁은 통로'를 피하기 위해 시작 인구의 다량 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 후 결과 인구 기울일 수 중요 하다. 따라서, 우리의 절차 2 중 인구 문화의 500 mL에서의 20 mL 750 ml이 문제를 방지 하려면 신선한 CSM-레이-Trp-그의 미디어의 성장 수를 사용 하 여 지정 합니다. 미끼 플라스 미드로 pTEF GBD, 우리 발견 희석 및 성장 단일 라운드 유익한 인구 진화 하기에 충분 했다. 이전 다른 미끼 플라스 미드를 사용 하 여, 우리 희석과 성장는 초기 20 mL 750 mL로 2 라운드를 사용 하 고 그의 2 개 mL 75 mL에 희석 하는 문화를 포화 하는 다음. 그림 6 다른 두에 대 한 선택적 상태에서 선택적 비 조건 뿐만 아니라 성장과 희석의 첫 번째 및 두 번째 연속 라운드에서 성장 하는 2 중 인구에 대 한 라이브러리 삽입에서 PCR 증폭에서 결과 보여 줍니다. 플라스 미드를 미끼. 아니 선택 유의 복잡 하 고 상대적으로 잘 정규화 된 파편의 혼합물을 나타내는 PCR 제품의 일반적인된 얼룩. 선택, 그 패턴 변경, 일부 수 종은 크게 개별 밴드를 분별 수 있도록 풍부. 밴딩의 어느 정도 지금까지 실시 하는 성공적인 실험의 전형적인 아직 얼룩 패턴 이외에, 또는 밴딩 패턴 대신 먹이 삽입의 복잡 한 혼합물의 지표 이며 바람직한 후보자의 수를 최대화 하 고 싶어 하는 경우 그 DEEPN 감지합니다. 어디 PCR 제품의 대부분은 1 3 밴드에서 발견 된다, 매우 강한 밴딩 패턴 시퀀싱 데이터의 대부분만 1-3 먹이 삽입에 의해 지배 될 것 이다 나타냅니다. 하나이 부분적으로이 샘플에서 더 많은 읽기를 사용 하 여 보정할 수 있습니다. 하나는 볼 수 있습니다 인구 희석 ('선택한 d2' 그림5에서 참조) 더 성장 경우 밴딩 패턴 두드러지게 나타내는 그 먹이 포식 하는 몇 가지 선택 하는 동안 약한 하지만 정통 Y2H 상호 작용을 부여 하는 플라스 미드 감소 되는 플라스 미드는 그들의 풍부 하 게를 증가 하 고 있다. 연속 희석과이 과도 한 수준으로 성장 가장 큰 수의 잠재적인 후보자와 따라서 여기 프로토콜을 붙 잡기의 목표에 역효과 간주, 좋습니다 희석 및 성장에의 한 라운드 사용할 수.

Figure 1
그림 1: DEEPN 워크플로의 도식. 실험실 절차의 일반적인 개요는 해당 작업을 완료 하는 데 필요한 대략적인 시간 함께 왼쪽에 표시 됩니다. 오른쪽에는 DEEPN 및 Stat_Maker 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 생물 정보학 워크플로입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: pTEF GBD의 도식. TRP1-낮은 복사 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질 식 플라스 미드를 포함 하는 표시. 제정 TEF1 발기인, myc 피토 프 태그 기능, Gal4 DNA 바인딩 도메인 T7 RNA 중 합 효소 바인딩 사이트, polylinker, 및 PRM9 터미네이터 centromere (CEN) 내에서-기반 플라스 미드. 이 플라스 미드는 또한 대 저항 및 복제 ColE1 세균성 근원 운반합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Gal4 미끼 융해 단백질의 표정. 다른 미끼 단백질 pTEF GBD 표현 Gal4 DNA 바인딩 도메인에 융합을 표현 하는 효 모에서 Lysates SDS 페이지 immunoblotting 안티 myc 항 체를 받게 되었다. 혼자; 그냥 Gal4-DNA-bindng 도메인을 표현 하는 pTEF GBD RhoA의 C-터미널 prenylation 사이트를 부족 하 고 GTP 바인딩된 구조;으로 잠금 돌연변이 주택에 융합 Gal4-DNA-bindng 도메인을 표현 하는 pTEF-GBD-bait1 pTEF GBD bait2 RhoA의 C-터미널 prenylation 사이트를 부족 하 고 GDP 바인딩된 구조에 그것을 잠금 하는 돌연변이 주택에 융합 Gal4-DNA-bindng 도메인을 표현 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 자기 인증 테스트 PJ69-4A 셀 표시 미끼 플라스 미드를 들고 나타난된 먹이 플라스 미드를 운반 하는 PLY5725 세포에서 만들어진 diploids 직렬 희석 고 CSM-레이-Trp 접시, CSM-레이-Trp-그의 격판덮개, 및 CSM에 발견-레이-Trp-그의 + 3AT 플레이트에 3 일 동안 성장 30 ° C. 짝짓기에 사용 되는 PJ69-4A transformants 그림 3에 표시 된 각 쌍의 첫번째 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: Y187 PLY5725 대의 효율을 짝짓기. PJ69-4A 포함 하는 TRP1사이 짝짓기 반응-미끼 벡터 및 Y187 또는 PLY5725 운반 먹이 플라스 미드를 포함 하는 수행. 1:10,000 희석 CSM-Trp-레이 diploids에 대 한 선택에 도금 했다. PLY5725 변형 ~ 10 배 더 많은 식민지 생산로 Y187 스트레인 보다 높은 짝짓기 효율을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 먹이 라이브러리 삽입의 PCR. DNA가 격리 비 선택적 조건 (CSM-레이-Trp 미디어)에서 성장 했다 먹이 라이브러리를 포함 하는 2 중 효 모 또는 긍정적인 Y2H 상호 작용 (CSM-레이-Trp-그의 미디어)에 대 한 선택 조건을. 도서관에 걸쳐 PCR 삽입 선택의 레 퍼 토리에서 밝혀 차이 삽입 합니다. 2 라운드의 선택적 성장 사용 되었다. 비 선택적 CSM-레이-Trp 미디어의 750 mL 및 선택적 성장 (d1)의 초기 라운드 CSM-레이-Trp-그의 미디어의 750 mL로의 또 다른 20 mL로 2 중 문화의 500 mL의 20 mL를 diluting 하 여 만든 성장의 초기 라운드. 이것은의 성장 (d2) d1 문화 2 mL 및 선택적 미디어의 75 mL로 희석에 의해 추가 라운드 뒤 CSM-레이-Trp-그의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: Y2H cDNA 라이브러리의 복잡성. 상업적으로 사용 가능한 마우스 cDNA Y2H 먹이 라이브러리의 내용 분석: 쥐의 뇌와 여러 마우스 조직에서의 cDNA에서 라이브러리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: Y2H 효 모 게놈 조각 라이브러리의 세대. A. pGal4AD로 효 모 게놈 조각 라이브러리의 구조도 설명 어셈블리. 게놈 DNA 변형 PLY5725에서에서 임의로 전단, 표시 된 Y-어댑터와 함께 출혈 이었고 SfiI 컷 pGal4AD에 출혈. Ligations는 수익률 2.2 x 106 독립적인 식민지를 결합 하 고 그들의 플라스 미드 DNA 구성 하는 SacCer_TAB Y2H 라이브러리의 격리 전에 성장 했다 박테리아도 변모 했다. B. LEU2-포함 하는 플라스 미드 (pGal4AD) 주택 Gal4 transcriptional 활성화 도메인 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: Y2H 효 모 게놈 라이브러리의 복잡성. SacCer_TAB 게놈 라이브러리 PLY5725 MATalpha 긴장 및 PJ_C1, C2, C3 효 모 게놈 라이브러리 Υ187 ΜΑΤalpha 변형으로 변형 되었다으로 변모 했다. 이러한 인구의 diploids PJY69-4A 스트레인에 짝짓기에 의해 만들어졌다. 인구 10 세대를 위한 재배 되었고 먹이 조각을 PCR 증폭 높은 처리량 시퀀싱 및 분석 대상이 됐다. 1. 효 모 게놈 시퀀싱에 의해 발견 하는 유전자 당 읽기로 나눈 Y2H 라이브러리에 각 유전자 당 읽기의 등급 순서를 보여줍니다. 각 유전자의 동등한 풍부를 감안할 때, 각 유전자 1의 값을 할 것 이다. B. 히스토그램은 단백질 코딩 영역 (ORF)와 적절 한 변환 독서 프레임에 조각 인코딩할 유전자 당 고유 플라스 미드의 수를 보여주는. C. 비교 효 모 유전자를 인코딩 하는 각 라이브러리에 다른 플라스 미드의 수와 비율이 고 올바른 변환 독서 프레임에 또는 뒤에 삽입 됩니다. 디 구획 위치 및 각 라이브러리에는 플라스 미드에 대 한 발견 예 유전자 (VPS8 및 VPS16)에 매핑되는 접합의 풍부. 올바른 변환 독서 프레임에 있는 유전자 융해와 플라스 미드 블루를 지정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10: DEEPN 복잡 한 Y2H 효 모 게놈 라이브러리의 재현성. A. 4 개의 다른 효 모 2 중 인구 PLY5725에 선택적 비 조건에서 성장 하 고 시퀀싱 SacCer_TAB Y2H 라이브러리와 짝짓기에 의해 만들어졌습니다. 각 인구에 대 한 유전자 당 읽기 개별적으로 모든 인구에 걸쳐 평균 등급 순서 값의 기능으로 플롯 됩니다. B. 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 후 두 샘플 사이 유전자 당 읽기 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기 우리는 최적화 된 방법을 사용 하 여 일괄 처리에서 Y2H 분석 실험을 수행 하는 방법에 대 한 가이드를 제공 합니다. 선택 아래에 배치 될 것 이다 효 모의 인구 시작 라이브러리의 대표는 하 고 충분히 시작 효 모 인구 다양성을 제한 하는 선택을 사용 하는 절차에 있는 몇 가지 중요 한 단계 . 중요 한 것은, 이러한 벤치 마크는 적응 방법 및 전통적인 Y2H 분석 결과, 따라서이 방법은 대부분 실험실 표준 분자 생물학 장비에 액세스할 수 만들기에 대 한 자료와 함께 달성 하기 상대적으로 쉽다. DEEPN 다른 미끼 플라스 미드를 사용 하는 동안 같은 먹이 라이브러리 인구에서 선택 영역을 수 있습니다. 따라서, 다른에 대 한 미끼와 Y2H 상호 작용을 생성 하는 상호 작용의 세트는 직접 비교할 수 있습니다. 깊은 시퀀싱을 사용 하기 때문에 각 미끼 별 효 모 인구에 대 한 시작 라이브러리 구성을 확인 하 고 라이브러리에서 각 후보 먹이 유전자의 농축을 독립적으로 수행 수 하나. 일괄 처리는 다음 계산 통계 순위4수 세미 양적 방식에서 다른 미끼에 대 한 동일한 라이브러리를 쿼리 수 있습니다.

이 프로토콜에 성공을 위한 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 하나는 Y2H 먹이 라이브러리의 적절 한 표현을 관심의 각 미끼 플라스 미드와 혼합 되도록 diploids의 많은 수를 얻을 수 있어야 합니다. 여기에 설명 된 짝짓기 절차는 몇 가지 매개 변수를 변화 하 여 최적화 되었습니다. 그러나 우리 발견 집 상용 Y2H 라이브러리 친구 제대로 일반적으로, 약간 긴장, 여기에 설명 된 짝짓기 절차 2 x 106-2 x 107 diploids 때 생성할 수 있도록 적절 하 고 재현할 수는 Y2H의 전송 인구로 도서관입니다. 프로시저의 또 다른 중요 한 측면은 관심의 미끼 플라스 미드 자체에 긍정적인 Y2H 상호 작용을 만들 또는 플라스 미드를 먹이 빈 Gal4 활성화 도메인 하지 않습니다. Y2H 상호 작용을 선택 하는 방법은 긍정적인 Y2H 상호 작용의 수를 셀 수 있도록 HIS3 전사를 유도 하는 점에서 히스티딘의 부재에 성장을 요구 하는 그의 +. 동안 정기적으로 전통적인 Y2H 분석 실험 배경 성장 감소 하거나 다른 기자3 , 약한 Y2H 상호 작용으로 세포를 성장 하는 때 가장 두 일 및 성장에 대 한 엄중 증가 사용 하 여 경쟁 억제 물 3AT를 추가할 수 있습니다 그리고 강한 Y2H 상호 작용도 포함 된 셀에 대해서만 식별 될 수 있는 먹이 플라스 미드의 레 퍼 토리를 선택. 또 다른 중요 한 점은 시작 2 중 인구 많은 양의 오류4 샘플링에서 진화 병목 현상을 피하기 위해 선택적이 고 선택적 비 조건에서 성장 하는 데 사용 되도록. 문화 볼륨 및 셀 다음 여기에 지정한 숫자 재현성을 보장 하 고 소음을 감소 도움이 됩니다.

DEEPN 방식은 강력한 이유 중 하나입니다 그것은 포괄적으로 관심의 미끼와 상호 작용 하는 그들의 능력에 대 한 주어진된 먹이 라이브러리에서 모든 플라스 미드를 따를 수 있다. 따라서, DEEPN의 한계 중 하나는 사용 하는 라이브러리의 복잡성입니다. 우리가 여기에서 사용 하는 것과 같은 상용 라이브러리의 일부, 우리는 ORF Gal4 활성화 도메인의 동일한 독서 프레임에 있는 10 x 3-6 사이 cDNA의 타고 난 파편을 인코딩할 플라스 미드의 수 발견4 ~ 6000-표현의 8,00 0 다른 유전자입니다. 우리는 거의 이러한 라이브러리의 75%는 3' 코딩 DNA 순서 (CD/ORF)의 cDNA 영역에만 해당 하는 조각을 포함 발견. 또한, 라이브러리에 파편 했다 유전자의 거의 3 분 아무도 ORF에 또는 ORF의 업스트림 영역에 대응 했다.

DEEPN 방법에 게 다른 3 개의 변경 하 고. 하나는 '먹이' 라이브러리 TRP1 플라스 미드와 그 동료 Y187 등 일부 상용 라이브러리-포함 된 종자 보다 훨씬 더 나은 내에서 지 내게 하는 것을 수행할 수 있는 새로운 MATalpha 변형입니다. 이 라이브러리의 인구에 각 미끼에 대 한 관심의의 완전 한 전송 보장 수 있습니다. 우리 또한 했다 새로운 '미끼'에 가변 복사 2µ 기반 백본10을 사용 하는 앞에서 설명한 플라스 미드 식 플라스 미드. 여기 우리가 낮은 복사 CEN 플라스 미드 (pTEF GBD) 설명 하 고 단일 라운드의 선택적 성장 하는 플라스 미드 먹이 상호 작용에 대 한 풍부 하 게 충분 한. 마지막으로, 우리 유선형된 '먹이' 라이브러리 벡터를 구축 하 고는 발견 및 상호 작용 amonst에 대 한 미래에 도움이 되어야 Saccharomces cerevisiae에 대 한 고밀도 임의 조각 게놈 Y2H 라이브러리를 생성 하기 위해 사용 효 모 단백질입니다. 전반적으로, 재료 및 생물 정보학 도구 (동반 작품에서 설명)에 개선 DEEPN 포괄적이 고 비교 Y2H 화면 수행의 접근 가능 하 고, 하 고 효율적인 방식으로 접근을 확인 합니다.

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Disclosures

저자 공개할 게 없다

Acknowledgments

우리 직원을 내에서 연구소의 인간 유전학 NGS 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 감사합니다. 여기 Y2H 플라스 미드 도서관에 대 한 게놈 라이브러리 조각 준비에 그녀의 전문성에 감사 Einat Snir 하 고. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다: NIH R21 EB021870-01A1 NSF 연구 프로젝트 그랜트에 의해: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

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References

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생화학 문제 136 단백질 상호 작용 차세대 시퀀싱 DNA 순서 분석 효 모 2 잡종
단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린
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Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

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