En gær 2-Hybrid skærm i Batch for at sammenligne Protein interaktioner

Summary

Batchafvikling af gær 2-hybrid skærme giver mulighed for direkte sammenligning af interaktion profiler af flere agn proteiner med et meget komplekst sæt af bytte fusion proteiner. Her, beskriver vi raffineret metoder, nye reagenser, og hvordan man gennemfører deres brug for sådanne skærme.

Abstract

Screening for protein-protein interaktioner ved hjælp af gær 2-hybrid assay har længe været et effektivt redskab, men dets anvendelse har stort set været begrænset til opdagelsen af høj-affinitet interactors, der er stærkt beriget i biblioteket af interagerende kandidater. I en traditionel format, kan gær 2-hybrid assay give for mange kolonier til at analysere når udført på lav strenghed hvor lav affinitet interactors kan findes. Desuden, uden en omfattende og komplet forhør i det samme bibliotek mod forskellige agn plasmider, en sammenlignende analyse kan ikke opfyldes. Selv om nogle af disse problemer kan løses ved hjælp af klædt bytte biblioteker, kan omkostninger og infrastruktur forpligtet til at drive sådanne skærme være uoverkommelige. Som et alternativ, har vi tilpasset gær 2-hybrid assay for at samtidig afdække snesevis af forbigående og statisk protein interaktioner indenfor en enkelt skærm bruger en strategi kaldet DEEPN (dynamisk berigelse for evaluering af Protein netværk), som indeholder høj overførselshastighed DNA-sekventering og computation at følge udviklingen af en population af plasmider, der indkode interagerende partnere. Her beskriver vi tilpassede reagenser og protokoller, der giver mulighed for en DEEPN skærm skal udføres nemt og omkostningseffektivt.

Introduction

En komplet forståelse af celle biologiske processer er baseret på at finde de protein interaktion netværk, der ligger til grund for de molekylære mekanismer. En metode til at identificere protein interaktioner er gær 2-hybrid (Y2H) analyse, som virker ved at samle en fungerende kimære transkriptionsfaktor, når to protein domæner af interesse binde til hinanden¹. En typisk Y2H skærmen er udført ved at skabe en befolkning af gær, der huser både et bibliotek af plasmider kodning interagerende proteiner smeltet til en transcriptional aktivator (fx., 'bytte' fusion protein) og en given 'agn' plasmid består af protein af interesse er sammenvoksede til en DNA bindende domæne (f.eks., Gal4 DNA-bindende domæne, der binder til den Gal4-upstream aktiverende sekvens). En af de største fordele ved Y2H tilgangen er at det er relativt nemt og billigt at foretage i en typisk laboratorium udstyret for Molekylær biologiske rutinearbejde². Men når traditionelt udført, en bruger prøver enkelte kolonier, der opstår efter valget for en positiv Y2H interaktion. Dette begrænser i høj grad antallet af bibliotek 'bytte' kloner, der kan blive undersøgt. Dette problem forværres, når overfloden af en bestemt interagerende bytte er meget høj i forhold til de andre, mindre chance for at opdage interaktion fra lav overflod bytte plasmider.

En løsning for at bruge Y2H princippet i omfattende dækning af proteomet er brugen af en matrix-formateret tilgang, hvori et array som indeholder kendte individuelle bytte plasmider kan være digitalt afhørt. Men en sådan tilgang kræver en infrastruktur, der ikke er umiddelbart tilgængelig eller omkostningseffektivt at enkelte undersøgelsesmedarbejdere, der er interesseret i at definere interactome af et lille antal proteiner eller domæner³. Derudover vil meget komplekse bytte biblioteker, der kan indkode flere fragmenter af interagerende proteiner udvide størrelsen af sådanne matrix arrays til upraktisk størrelser. Et alternativ er at udføre assays med komplekse biblioteker i partier og vurdere tilstedeværelsen af interagerende kloner ved hjælp af massive parallelle høj overførselshastighed sekventering⁴. Dette kan anvendes til at assay tilstedeværelsen af bytte plasmider, der opstår i flere kolonier ved hjælp af en typisk Y2H formateret tilgang i hvilken gær celler boliger en interagerende par fusion proteiner får lov til at vokse på en plade^5,6. Denne generelle idé kan blive forstærket for at øge forespørgsel af begge flere agn og bytte komponenter på samme tid^7,8.

Stadig, mange undersøgelser kræver en lettere endnu mere fokuseret indsats på blot et par protein "lokkemad" og kan drage større fordel af en udtømmende og semi-kvantitative forespørgsel om en enkelt kompleks bytte bibliotek. Vi har udviklet og valideret en metode for at udføre omfattende protein interaktion undersøgelser ved hjælp af et Y2H princip i batch format⁴. Dette bruger satsen for udvidelse af en bestemt bytte plasmid som en proxy for den relative styrke af Y2H interaktion⁹. Dyb sekventering af alle plasmider inden for en befolkning udsættes for normal vækst eller selektiv vækstbetingelser producerer et komplet kort over kloner, der giver stærke og svage Y2H interaktioner. Repertoire af interactors kan opnås og direkte sammenlignes på tværs af flere agn plasmider. Den resulterende arbejdsproces kaldes DEEPN (dynamisk berigelse for evaluering af Protein netværk) kan således bruges til at identificere differentieret interactomes fra de samme byttedyr biblioteker til at identificere proteiner, tillader sammenligning mellem et protein vs en anden.

Her, vi demonstrere DEEPN og indføre forbedringer i de laboratoriemetoder, der letter brugen, som er skitseret i figur 1. Betydelige forbedringer omfatter:

Generation af bytte gær populationer. En af de vigtigste krav til DEEPN genererer populationer af gær med forskellige agn plasmider, der har den samme fordeling af plasmid bytte biblioteker. Tilsvarende oprindelige befolkninger af bytte plasmid bibliotek er afgørende for at gøre nøjagtig sammenligninger mellem interactomes af forskellige lokkemad. Dette opnås bedst, når en bibliotek plasmid allerede har til huse i en haploid gær befolkning og flytter en given agn plasmid i befolkningen er opnået ved parring for at producere en diploid. Her give vi en klar vejledning i hvordan man laver disse befolkninger ved hjælp af kommercielle biblioteker har til huse i haploide gær. Selv om vi fundet metoder, der genererer et stort antal diploids, var den samlede parring effektivitet af disse kommercielle bibliotek, der indeholder gærstammer lav. Derfor, vi konstrueret en ny stamme, der kan huse bytte biblioteker, der giver langt flere diploids per parring reaktion.

Nye sæt af agn plasmider. Mange nuværende plasmider, der udtrykker 'agn' fusion proteiner består af protein af interesse og en DNA-bindende domæne er baseret på 2µ, får mulighed at forstærke deres kopi nummer. Denne kopi antallet kan være meget varierende i befolkningen og føre til variabilitet i Y2H transcriptional svar. Dette kunne til gengæld skew evnen til at måle styrken af et bestemt protein interaktion baseret på vækst svar af celler under udvælgelse. Dette kan være delvis adresse ved hjælp af en lav kopi plasmid, hvoraf nogle har været tidligere beskrevet som kommercielt tilgængelig pDEST32¹⁰. Vi konstrueret en ny agn plasmid (pTEF-GBD), der producerer Gal4-DNA-bindende domæne fusion proteiner inden for en TRP1 centromer-baserede lav kopi plasmid bærer Kanr resistens gen, der også tillader kloning af agn fragmenter, både opstrøms og neden for Gal4 DNA-bindende domæne.

Nye High-Density Y2H fragment bibliotek. Vi konstrueret en ny plasmid til huset Y2H bytte biblioteker og brugte det til at bygge en yderst komplekse Y2H bibliotek lavet af tilfældigt afrevne fragmenter af genomisk DNA fra Saccharomyces cerevisiae. Sekvensanalyse viste, at biblioteket havde over 1 million forskellige elementer, langt mere kompleks end tidligere beskrevet gær genomisk Y2H plasmid biblioteker¹¹. Med denne nye bibliotek har vi kunnet vise, at DEEPN arbejdsproces er robuste nok til at rumme komplekse biblioteker med mange forskellige plasmider på en måde, der er pålidelig og reproducerbar.

Protocol

1. forberedelse af medier og plader

Bemærk: Alle plader skal foretages minimalt 2 dage før begyndelsen af protokollen. Medierne kan foretages på ethvert tidspunkt. Bufferet gær extract pepton dextrose adenin (bYPDA) skal dog ske den dag, hvor det vil blive brugt. Nogle medier er lavet ved hjælp af et supplement mix som indeholder et niveau af adenin, der er større end hvad der typisk bruges. De fleste minimal media kosttilskud angive 10 mg/L adenin. Kosttilskud mærket '+ 40Ade' Angiv ialt 40 mg/L adenin.

1. Forberede Glucose opløsning (50% w/v). For 1 L, opløse 500 g af D-(+)-Glucose i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Justere lydstyrken til 1.000 mL ved anvendelse af et måleglas og filter gennem en 0,2 µm sterile filter i en steril 1.000 mL medier opbevaring flaske.
2. Forberede gærekstrakt pepton dextrose (YPD) plader. For 1 L, opløse 20 g af pepton og 10 g gær Extract i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas, fylde op til 960 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyerkolbe og der tilsættes 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Bruge en pipette til tilsættes 40 mL 50% glukose. Bland godt af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
3. Udarbejde komplette syntetiske minimal medier (CSM)-Trp plader. For 1 L, opløses 6,7 g Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas, fylde op til 960 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyer-kolbe og tilsættes 0,7 g - Trp-mødte frafald mix, 20 mg methionin og 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Bruge en pipette til tilsættes 40 mL 50% glukose. Bland godt af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
4. Forberede CSM-Leu-Met plader. For 1 L, opløses 10.05 g Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas og fylde op til 940 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyer-kolbe og tilsættes 1,005 g - Leu-mødte frafald mix og 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Bruge en pipette tilføjes 60 mL 50% glukose. Bland godt af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
5. Forberede CSM-Leu-Trp plader. For 1 L, opløses 10.05 g Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas, fylde op til 940 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyer-kolbe og tilsættes 1,005 g - Trp-Leu + 40Ade dropout mix, 240 mg af adenin og 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Bruge en pipette tilføjes 60 mL 50% glukose. Bland godt af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
6. Forberede CSM-Leu-Trp-hans plader. For 1 L, opløses 10.05 g Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas, fylde op til 940 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyer-kolbe og tilsættes 0.975 g - Trp-Leu-hans + 40Ade dropout mix, 240 mg af adenin og 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Bruge en pipette tilføjes 60 mL 50% glukose. Bland godt af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
7. Forberede CSM-Leu-Trp-hans-3AT plader. For 1 L, opløses 10.05 g Yeast Nitrogen Base uden aminosyrer i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas, fylde op til 940 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyer-kolbe og tilsættes 0.975 g - Trp-Leu-hans + 40Ade dropout mix, 240 mg af adenin og 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Bruge en pipette tilføjes 60 mL 50% glukose. Mix i 100 µL af en 1 M sterile bestand af 3-amino-1,2,4 triazoler (3AT) af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
8. Forberede LB-Kanr plader. For 1 L, opløses 10 g trypton, 5 g gær extract og 10 g NaCl i 800 mL destilleret vand i en 1000 mL bægerglas. Hældes i et måleglas, fylde op til 1000 mL med destilleret vand. Hæld i en 2.000 mL Erlenmeyerkolbe og der tilsættes 15 g agar. Autoklave og cool i 37 ° C vandbad indtil vand bad temperatur er afkølet til ca. 42-50 ° C. Tilsæt 50 mg Kanamycin og bland af hvirvlende.
   1. Hæld en række 100 mm plader med 20 mL af medier med pipette.
9. Forberede YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp og CSM-Leu-Trp-hans medier. Bruge ovenstående fremgangsmåde til plader undtagen i stedet for at hælde i en Erlenmeyerkolbe hældes en medier opbevaring flaske og udelade agaren.
10. Forberede bYPDA ("buffered" YPDA). Tag sterile YPD medier og tilføje 200 mg/L adenin i sterilt destilleret vand. Justere pH til 3,7 med HCl. Filter igennem en 0,2 µm sterile filter i en steril flaske.
11. Forberede Transformation Buffer: 2 M sorbitol, 1 M lithium acetat dihydrat, 10 mM Tris pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM calciumchlorid i destilleret vand. Filtreres gennem et 0,2 µm sterile filter i en steril flaske.
12. Forberede PIND løsning: 70% w/v polyethylenglycol 3350 i destilleret vand. Steriliseres ved autoklavering.
13. Forberede snurre rundt: 8 M urinstof, 4% w/v SDS, 50 mM Tris pH 6,8, 10% v/v glycerol, 0,02% w/v bromophenol blå i sterilt destilleret vand.
14. Forberede sTE (stærk TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 i destilleret vand. Filtreres gennem et 0,2 µm sterile filter i en steril flaske.
15. Forberede Zymolase stamopløsning: 10 mg/mL Zymolase 100T i 50 mM kalium fosfat dibasiske pH 7,5, 50% v/v glycerol buffer i sterilt destilleret vand (opbevares ved-20 ° C).

2. kloning og verifikation af agn plasmider

Bemærk: Konstruktion af Gal4-DNA-bindende domæne plasmider. I øjeblikket, er der en bred vifte af kommercielt tilgængelige og fagligt tilgængelige Y2H systemer. DEEPN kan rumme mange af disse, forudsat at den agn plasmid udtrykker protein af interesse smeltet til en DNA-bindende domæne er i en TRP1-der indeholder plasmid. Andre downstream krav er at sekvensen umiddelbart opstrøms af biblioteket bytte Indsæt er kendt, og at en positiv Y2H interaktion kan blive scoret af produktionen af His3 giver mulighed for valg i medier mangler histidin. Her vil vi beskrive anvendelsen af en ny Y2H agn plasmid (pTEF-GBD, figur 2), men andre Y2H agn plasmider herunder pGBKT7 kan bruges som godt. For konstruktion og evaluering af agn plasmider, vil vi beskrive brugen af pTEF-GBD. Som en generel bemærkning anbefaler vi gen syntese til at producere en open-læsning ramme, der overholder gær codon bias for at sikre godt udtryk og lethed med kloning. Sikre, at ordningen med kloning giver mulighed for lokkemad til at være i-frame med Gal4 DNA-bindende domæne og at når kloning til webstedet 3', en stop codon følger regionen agn-kodning.

1. Forberede plasmid vektor. Plasmidet pTEF-GBD giver mulighed for kloning et fragment kodning proteiner af interesse enten 5' eller 3' i regionen kodning Gal4 DNA-bindende domæne ved hjælp af en hurtig montage metode. For indsættelse på 5' websted, fordøje 3 µg for pTEF-GBD med Jesper og EcoRI eller til indsættelse på webstedet 3', fordøje med BamHI og XhoI for 2-4 h. Electrophorese prøve i 1% DNA Agarosen gel indeholdende 0,2 - 0,5 µg/mL ethidiumbromid (EtBr) på 100 V. punktafgifter cut 5,630 bp TEF-GBD og rense, ved hjælp af en DNA gel udvinding kit i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger og kvantificere DNA af absorbans på 260 nm ved Spektrofotometer¹².
   Bemærk: Generation af agn-kodning skær. DNA fragmenter kodning proteiner eller protein fragmenter af interesse kan være fremstillet ved hjælp af genet syntese og tilgængelig som uncloned fragmenter. Det anbefales at kodon er optimeret til udtryk i Saccharomyces cerevisiae og online værktøjer til codon optimering er inkluderet i listen over materialer.
2. For 5' indsættelse, flanke DNA-fragment kodning en ATG start codon af 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'og 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, hhv. Til 3' indsættelse i ramme med Gal4 DNA bindende domæne, flankerer den kodning fragment af 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'og 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
3. For plasmid byggeri, skal du bruge metoden hurtig montage som angivet i producentens anvisninger for kloning fragmenter i snit pTEF-GBD.
   1. Plade alle omdannet E. coli på LB-Kanr plader og inkuberes i 16-20 timer ved 37 ° C. Kolonier boliger pTEF-GBD med den ønskede indsætte kan identificeres ved hjælp af PCR-amplifikation ved hjælp af oligonukleotider: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' og 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Indsæt og 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' og 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' til 3' Indsæt. Disse oligonukleotider kan også tjene som primere til sekvensering skæret.
   2. Planlægger at forberede > 10 µg for hver pTEF-GBD afledning og pTEF-GBD alene til at levere materiale til sekvensering og gær transformationer.
   3. Brug følgende PCR betingelser: 3 min på 98 ° C, efterfulgt af 25 cykler 30 s på 98 ° C, 30 s på 55 ° C, og 2 min på mindst 72 ° C, efterfulgt af 5 min ved 72 ° C ved hjælp af en buffer, som indeholder 2,5 mM MgCl₂ , 0,5 U/100 µL DNA polymerase og proprietære buffer.

3. angivelse af Gal4-DNA-bindende domæne Fusion proteiner

1. Foretage kompetente gær.
   1. Streak ud PJ69-4A gær på en YPD tallerken ved at tage en steril træ applikator, skrabning 1 mm³ i et-80 ° C frosne lager og gnide det forsigtigt på tværs af YPD plade. Flytte træ applikator ned på pladen, så hvert pass går på tværs af en uberørt del af media overflade. Inkuber YPD pladen ved 30 ° C i 2 dage eller indtil enkelt kolonier er synlige. Gøre den frosne bestand af PJ69-4A gær ved at suspendere gær i vandet eller vækst medier, supplere med DMSO til 7% og lagring ved-80 ° C.
   2. Podes en enkelt koloni i 5 mL af kultur af YPD i 20 mm x 150 mm kultur rør ved hjælp af en steril træ applikator og vokse natten over ved 30 ° C i en rystende inkubator ved 200 rpm.
   3. Podes 50 mL af YPD i en 250 mL sterilt Erlenmeyerkolbe med 4 mL af PJ69-4A gærstamme overnight kultur. Vokse i en rystende inkubator ved 30 ° C, 200 rpm til en optisk densitet (OD₆₀₀) af cirka 1,2, som bestemmes af spektrofotometri med en standard 1 cm lys sti. Vækst tager normalt 5-7 h.
   4. Isolere gær ved bundfældning i en 50 mL af koniske rør på 4,696 x g i 5 min ved stuetemperatur i en benchtop centrifuge. Fjern supernatanten ved dumpning i flydende affald. Ved hjælp af en pipette, resuspenderes i 5 mL af transformation bufferen og overføre til 15 mL af koniske rør. Resediment til at kassere supernatanten, og pelleten gæren i 1 mL af endelige mængden af transformation buffer med 1000 µL pipette.
   5. Inkuber gærceller for 60 min. ved 30 ° C under omrystning på 200 rpm og Anbring på is til 30-90 min.
2. Gær plasmid transformation.
   1. I 1,5 mL sterilt microcentrifuge tube, tilføje 1 µg for pTEF-GBD-baserede plasmid og 5 µL af 10 mg/mL laks sperm carrier DNA løsning. Også omfatte et rør, der indeholder kun laks sperm carrier DNA som en negativ transformation kontrol. Tilføje 100 µL af iskold gær cellesuspension til hver rør med pipette. Tilsæt 100 µL af 70% PIND løsning med en 1000 µL pipette og bland forsigtigt ved at bladre i røret 5 - 10 gange (gør ikke vortex).
   2. Der inkuberes ved 30 ° C, i en rystende inkubator ved 200 rpm i 45 min.
   3. Heat shock på 42 ° C i 15 min.
   4. Sediment i en microcentrifuge på 845 x g i 3 min. ved stuetemperatur, afpipetteres ud og kassere supernatanten, resuspend pellet i 150 µL sterilt vand af pipettering op og ned, og spredt over overfladen af en CSM-Trp plade.
   5. Placer plader højre side op i 30 ° C inkubator og inkuberes i 2-3 dage indtil kolonier er synlige. Plader kan være vendt op og ned for at undgå kondens på plade overflade efter inkubation ved 30 ° C i 6-12 h.
   6. Tage 2-3 kolonier pr. transformation og streak som et plaster på et CSM-Trp tallerken ved hjælp af en steril tandstikker. Giver mulighed for at vokse i 24 timer ved 30 ° C.
3. Gøre lysates for protein udtryk.
   1. Podes 3 mL af CSM-Trp flydende medier med en match-hoved-størrelse af gær fra patchen og vokse natten over ved 30 ° C i 20 mm x 150 mm kultur rør, mens ryste på 200 rpm. Gøre to overnight kulturer pr. agn og Tom pTEF-GBD vektor.
   2. Der tilsættes 1 mL af YPD til hver 3 mL af CSM-Trp overnight kultur. Vokse i 1 time ved 30 ° C, mens ryste på 200 rpm. Kontrollere OD af celler ved Spektrofotometer.
   3. Sediment et tilsvarende antal celler, normalisere ifølge OD. Bruge sterile 1,5 mL af microcentrifuge rør med en 5 min spin på 2.348 x g ved stuetemperatur i en microcentrifuge. Bruge en pipette til at kassere supernatanten. Den endelige lager svarer til mindst 2,1 OD.
      Bemærk: Ved beregning af tilsvarende antal celler, kan det forekomme, at forskellige diskenheder kan være påkrævet fra hver overnight kultur til at opnå den minimale 2.1 OD.
   4. Knyt resuspenderes i 450 µL af 0,2 M NaOH af pipettering op og ned. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Recentrifuge celler i 2 min på 2.348 x g ved stuetemperatur, og supernatanten med pipette.
   5. Resuspenderes med 50 µL af snurre rundt buffer af pipettering op og ned omhyggeligt, ikke at det bobler. Varme prøve i 5 min. ved 70 ° C.
4. Check for protein udtryk af SDS-PAGE.
   1. Brug en gradient gel på 4-20% for en lang række molekylvægte, inden kan løses. Belastning svarende beløb (samme OD) af prøver i en SDS-PAGE gel og sørg for at medtage mindst én prøve, der indeholder ikke-modificerede pTEF-GBD vektor^13,14,15.
   2. Efter elektroforetisk separation, skal du overføre gel til nitrocellulose og immunblot ved hjælp af anti-myc monoklonale eller polyklonale antistoffer og ECL påvisning løsning (figur 3).

4. selvstændig aktivering Test

1. Streak ud MATalpha gær fra-80 ° C lager svarende til stammen bolig bytte bibliotek af interesse på en YPD tallerken ved at tage en steril træ applikator, skrabe en små beløb af gær ud af hætteglasset og striber på tværs af YPD plade. Inkuber YPD pladen ved 30 ° C i 2 dage eller indtil enkelt kolonier er synlige. Lappe et par enkelt kolonier på en YPD tallerken og inkuberes natten over ved 30 ° C.
   Bemærk: Den nye stamme udviklet her til huset bytte bibliotek er PLY5725, mens nogle kompatibel kommercielt tilgængelig Y2H biblioteker er opstaldet i Y187.
2. Fremgangsmà ¥ den i 3.3.1 - 3.3.4 at omdanne PLY5725 med LEU2-baseret plasmid brugt til at huse de ønskede bytte bibliotek. For biblioteker udvikles her, den tilsvarende plasmid er pGal4AD (pPL6343). At inddrive gær transformants, plade på CSM-Leu-Met plader. Efter kolonier opstår, streak som pletter på en CSM-Leu-Met tallerken og inkuberes i 24 timer ved 30 ° C.
3. Følg den protokol i 3.4 at bekræfte udtryk af pPL6343 Tom vektor ved hjælp af-HA monoklonale eller polyklonale antistoffer og ECL påvisning løsning.
4. Stribe hver af de transformerede PJ69-4A gær i en cross mønster med PLY5725 konstruktioner på en YPD plade, der blev bekræftet at udtrykke protein i protokollen afsnit 3.4 og 4.3 og inkuberes ved 30 ° C natten over. Tag 1 mm³ af de celler, hvor de to stammer er vokset sammen og lappe på separate CSM-Leu-Met, CSM-Trp og CSM-Trp-Leu plader og vokse 24 h.
   Bemærk: Ønskede diploids vil vokse på CSM-Trp-Leu plader. Vækst på CSM-Leu-Met og CSM-Trp plader tjene som positiv kontrol for gær vækst.
5. Vokse diploids i 1 mL af CSM-Trp-Leu media natten over ved 30 ° C. Sediment 500 µL celler i en 1,5 mL af microcentrifuge rør på 2.348 x g, 3 min. ved stuetemperatur i en microcentrifuge. Kassér supernatanten med pipette. Resuspend celler i 1 mL sterilt vand og Gentag bundfældning og resuspension. Kontrollere OD₆₀₀ af celler.
6. Foretage en række 1:10 serielle fortyndinger af hver cellesuspension med sterilt vand med det starter de fleste koncentreret opløsning af hver i en OD på 0,5. Spot 5 µL af hver fortynding på et CSM-Leu-Trp plade, en CSM-Leu-Trp-hans plade og en CSM-Leu-Trp-hans + 3AT plade. Der inkuberes ved 30 ° C og inspicere for vækst dagligt over 3 dage (figur 4).
   Bemærk: For 1:10 seriel fortynding afpipetteres 10 µL af de rør, der indeholder en OD 0,5 til 90 µL vand og blandes ved pipettering op og ned. Fortsætte med at gøre 1:10 serielle fortyndinger, indtil der er i alt seks forskellige koncentrationer til spot.

5. Opret gær populationer med agn og bytte bibliotek

Bemærk: Den Y187 stamme, der huser kommercielle bytte bibliotek plasmider ikke parre godt. Således er følgende optimeret betingelser forpligtet til at opretholde kompleksiteten af biblioteket. PLY5725 stamme indeholdende Y2H bytte biblioteker kammerater bedre og det samme parring procedure kan bruges med denne stamme (figur 5).

1. Podes en 3 mL af kulturer af hver af de PJ69-4A transformants transporterer de forskellige TRP1-indeholdende pTEF-GBD agn plasmid i CSM-Trp medier i en kultur tube. Omfatte to særskilte kulturer indeholdende pTEF-GBD vektor plasmid alene til at tjene som proceduremæssige kontrolelementer. Inkuber kulturer ved 30 ° C, 200 rpm for 6 h og derefter fortyndes i et 25 mL af kultur i en steril Erlenmeyerkolben for natten vækst.
2. Tø frosne (-80 ° C) hætteglas af MATalpha celler, der indeholder LEU2-bærer "bytte" bibliotek ved stuetemperatur. Podes en 125 mL af CSM-Leu-Met medier i en steril Erlenmeyerkolbe med de helt optøede hætteglas. Vokse alle kulturer natten over ved 30 ° C under omrystning på 200 rpm.
   Bemærk: OD₆₀₀ overnight kulturer skal variere mellem 1,0 til 1,5, før du fortsætter til næste trin.
3. Der centrifugeres 21 OD ækvivalenter af hver af PJ69-4A transformant kulturerne med en 5 min spin på 4,696 x g ved stuetemperatur. For hver 10 parring reaktioner ønskes, pellet 39 OD₆₀₀ ækvivalenter af den MATalpha stamme bærer bibliotek plasmider i separate 50 mL af koniske rør.
   1. Resuspend celler i 10 mL sterilt vand og re pellet i nye 50 mL konisk tube 4,696 x g 5 min ved stuetemperatur i en benchtop centrifuge. Ved hjælp af en pipette, forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre de pelleted celler.
   2. Resuspend pellets af PJ69-4A celler i 4 mL og PLY5725 celler i 10 mL af bYPDA (pH 3.7).
4. Set-up tilføje parring reaktioner, 1 mL PJ69-4a forvandlet celler, 1 mL af MATalpha bibliotek, der indeholder celler og 1 mL af bYPDA pH 3.7 til nye 50 mL af koniske rør. Der inkuberes ved 30 ° C med blid orbital agitation (100-130 rpm) for 90 min.
   1. Der centrifugeres celler i 5 min på 4,696 x g, ved stuetemperatur i en benchtop centrifuge. Fjern supernatanten ved pipette og resuspenderes i 2 mL af 1:1 bYPDA:YPD. Plade alle 2 mL på en 100 mm YPD tallerken med pipette og inkuberes ved 30 ° C i ca. 20 h.
5. Høst celler fra YPD plader ved hjælp af en celle skraber til at løsne cellerne i 2-3 mL af CSM-Leu-Trp medier. Der afpipetteres forrykke celler i en 50 mL af koniske rør. Skyl plader 4 - 5 gange med 2-3 mL af CSM-Leu-Trp medier af pipettering up medierne ved hjælp af en 1000 µL afpipetteres og forsigtigt skubbe medier på tværs af YPD plade overflade.
   1. Der centrifugeres celler i 5 min på 4,696 x g ved stuetemperatur i en benchtop centrifuge. Kassér supernatanten med pipette og resuspend celler i 40 mL af CSM-Leu-Trp medier af pipettering op og ned (ikke vortex).
6. For at anslå antallet af diploide celler dannet, fortyndes 4 µL af den diploide blandingen ind i 200 µL og 2000 µL CSM-Trp-Leu medier. Plade 200 µL af hver fortynding på et CSM-Leu-Trp tallerken.
   Bemærk: De to plader repræsenterer et 1:10,000 og 1:100,000 fold fortynding af bestanden af diploids høstet og giver en forventet ~ 9.000-27.000 kolonier på 1:10,000 fortynding plade efter inkubation ved 30 ° C i 36-40 h. Check plader efter trin 5.7. Et minimum af 200 kolonier på 1:10,000 fortynding plade er forpligtet til at gå videre til trin 5.8
7. Straks tage resten af hver 40 mL af celle ophvirvling og podes en 1.000 mL Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 500 mL af CSM-Leu-Trp medier. Tage en indledende OD₆₀₀. Ruger disse kolber på 30 ° C under omrystning på 180 rpm, indtil de når mætning (~2.0 OD/mL). Det tager typisk omkring 36-40 h. skærm vækst på 24 h så igen på 36 h af OD₆₀₀.
8. Ved hjælp af en pipette, fjerne 20 mL af delprøver fra hver af de mættede 500 mL af kulturer og innoculate 2.000 mL Erlenmeyerkolbe kolber, én der indeholder 750 mL af CSM-Leu-Trp medier og den anden som indeholder 750 mL af CSM-Leu-Trp-hans med det laveste niveau af 3AT, eliminerer baggrund (tidligere bestemt i afsnit 4.5). Bland de nye kulturer (770 mL) godt af hvirvlende og tage en indledende OD₆₀₀.
9. Inkuber kulturer ved 30 ° C under omrystning på 180 rpm indtil nå mætning, som typisk opstår inden for 24 timer for den umarkerede CSM-Leu-Trp kultur og kan tage over 70 h for kulturer under markering for Y2H vekselvirkninger.
10. Når kulturer har nået mætning (OD ~ 2.0), fjerne 11 mL med pipette, sediment celler med en 5 min spin på 4,696 x g ved stuetemperatur, kassere supernatanten med pipette, og fryse ved-20 ° C eller Fortsæt på DNA-ekstraktion. De markerede og umarkerede prøver skal begge bruges til dyb sekvensering.

6. Prøvetilberedning for DEEPN dyb sekventering

1. DNA-ekstraktion.
   1. Bruge en pipette til resuspend celle pellets fra protokollen afsnit 5.7 i 500 µL af sTE buffer og overførsel til en 1,5 mL af microcentrifuge rør. Tilføje 3 µL af betamercaptoethanol og 10 µL af Zymolase materiel. Bland godt og Inkuber i 37 ° C inkubator i 24-36 timer.
   2. Uddrag prøven to gange med 500 µL chloroform-phenol-isoamyl alkohol mens du bruger et aftræk hood¹⁶.
   3. Tilføj 7 µL af 4 M NaCl, 900 µL af iskolde 100% ethanol (ETOH), mix af inversion og enten fryse-20 ° C eller fortsætte til sediment DNA af spinning på 21,130 x g i 10 min. ved stuetemperatur i en microcentrifuge.
   4. Kassér supernatanten med pipette. Vaske pellet tre gange med 900 µL af 70% ETOH.
   5. Sediment pellet 21,130 x g for 2 min og fjern resterende ETOH vask med pipette. Tør pellet i 7 min. på 42 ° C.
   6. Resuspend pellet i 120 µL af 0,1 x sTE i et 37 ° C vandbad i 90 min., svirp rør for at blande hvert 30 min.
   7. Der afpipetteres 60 µL af ekstraherede DNA i en sterile 1,5 mL af microcentrifuge rør. Tilføje 120 µL af sTE, 3,5 µL af RNase A materiel, flick blandes og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
   8. Ethanol bundfaldet som tidligere gjort i afsnit 6.1.3 - 6.1.5, men bruger 7 µL af 5 M ammoniumacetat i stedet for 4 M NaCl.
   9. Resuspend RNase A-behandlede DNA i 55 µL af 0,1 x sTE i et 37 ° C vandbad i 90 min., svirp rør for at blande hver 30 min. tal DNA af absorbans på 260 nm på et spektrofotometer.
2. PCR cDNA indsætter.
   1. Udfør to, 50 µL PCR reaktioner pr. DNA-prøve. Hver reaktion indeholder 25 pmol hver frem og bak primer matchende bytte-bibliotek plasmid (Se materialer). Reaktioner også indeholde 25 µL af High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, 5 µg af DNA-prøve, og vand op til 50 µL. uddyber reaktioner til 25 cykler med udvidelse gange på 3 min. ved 72 ° C, en anneal temperatur på 55 ° C i 30 s, og denaturering på 98 ° C i 10 s. Precede cykling ved en 30 s denaturering på 98 ° C og følg med en 5 min inkubation ved 72 ° C.
   2. Analysere 4 µL af hver PCR reaktion ved 1% DNA Agarosen gelelektroforese med DNA Agarosen gel indeholdende 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr¹⁷. Visualisere DNA-prøve af UV ved gennemlysning. Prøver vil vise et udstrygningspræparat af DNA omkring 1-3 kb, hvor den banding mønster kan findes for prøver, hvor en Y2H interaktion var valgt (figur 6).
   3. Kombinere dublerede PCR prøver og rense, ved hjælp af PCR rensning kit i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger og kvantificere DNA af absorbans på 260 nm på et spektrofotometer.

7. dyb sekventering

Bemærk: Forberedelse af prøver og sekventering på en dyb sekventering platform er typisk tilgængelige i kommercielle og akademiske DNA-sekventering core faciliteter.

1. Shear 600 ng af PCR produkt ved hjælp af en højtydende ultra-sonikator give fragmenter af en gennemsnitlig længde på ~ 300 bp.
2. Generere indekserede sekventering biblioteker ved hjælp af en forberedelse kit til dyb sekvensering, der tilføjer linkers kodning stregkoder, priming sites, og capture sekvenser asymmetrisk på enderne af DNA-fragmenter.
3. Udføre bibliotek forberedelse ifølge producentens anvisninger. Pool indekseret biblioteker og sekvens som længe parret-ende læser på en dyb sekventering platform (f.eks. 2 x 150 bp PE læsninger). Det ønskede antal læser indskyde nemlig hver prøve er mellem 10 og 40 millioner, med flere læser ønskes for de umarkerede populationer, der er typisk mere komplekse. Vi anbefaler mindst 20 millioner eller mere læser for de ikke-markerede befolkninger.

8. Bioinformatic behandling og kontrol

1. Processen DNA sequencing data i form af fastq med et sæt af stand-alone-software programmer er bygget til (1) kort sekvens læse filer i en universel SAM format (2) kvantificere gen berigelse mellem datasæt (3) foretage statistisk analyse af data i for at rang som kandidat gener er positive for Y2H interaktion () 4) fremlægge oplysninger om hvad region(er) og hvad translationel ramme hver af bytte cDNA pr. gen fragmenter der giver positive Y2H interaktioner består, og (5) være værktøjer til at genopbygge ikke blot 5', men også 3' slutningen af interagerende fragmenter at tillade deres genopbygning og verifikation i en traditionel Y2H format. Drift af disse programmer er beskrevet i den ledsagende undersøgelse.

Representative Results

Y2H analysen har været almindeligt brugt til at finde protein: protein interaktioner og flere tilpasninger og systemer er blevet udviklet. For det meste er de samme overvejelser, der hjælpe med at sikre succes med disse tidligere tilgange vigtige for DEEPN. Nogle af de vigtige referencepunkter omfatter: at sikre udtryk for DNA-bindende domæne fusion proteiner, sikre en lav baggrund af spurious hans + vækst i diploids som indeholder agn af interesse med en tom bytte plasmid, en parring højeffektiv af agn indeholdende MATA gær med bibliotek-holdige MATalpha gær, og endelig, lav-strenghed betingelser, der tillader befolkningen til at vokse under betingelser, som vælger for mange positive reaktioner, Y2H, selv ones at producere lave niveauer af His3 aktivitet og en svag Y2H transcriptional svar.

Et af de kritiske aspekter af DEEPN er reproducerbar indføre Y2H bibliotek i stammer, der indeholder forskellige agn plasmider og pålideligt vælge disse populationer for disse bibliotek plasmider at skaber positive Y2H interaktioner. Det bliver sværere, når kompleksiteten i biblioteket Y2H stiger da det er sværere at sikre passende overførsel af hele biblioteket på tværs af forskellige oprindelige befolkninger. Derudover til størrelsen af valgt at vokse under udvalg betingelser og dybde af sekventering skal være stor nok til at observere reproducere ændringer i Y2H plasmid sammensætning til pålideligt identificere sandt positive Y2H interaktioner. I tidligere undersøgelser brugt vi kommercielt tilgængelig Y2H cDNA-biblioteker. Vi fandt variabilitet i Y2H bibliotek distribution mellem adskilte populationer med de samme agn plasmider er lav, med en overdispersion mellem de to oprindelige befolkninger før udvalg af < 0,01 typisk og 0,35 - 0,55 for særskilt befolkningen efter udvalg⁴. Men, kompleksiteten af nogle af disse er kommercielt tilgængelige Y2H biblioteker er forholdsvis lav (figur 7). Derudover er mange af kloner i det (~ 60%) lavet udelukkende af cDNA fragmenter, der er 3' i regionen kodning, som yderligere begrænser deres nytte. For at påvise, at de ovenfor metoder var i stand til at rumme mere komplekse Y2H biblioteker, vi lavet en ny Y2H bibliotek i den strømlinede 'bytte' plasmid vektor (pGal4AD) der indeholder fragmenter af genomisk DNA fra Saccaromyces cerevisiae (stamme PLY5725). Genomisk DNA blev opsplittet af klipning, størrelse for intervaller af 600-1500 bp, modificeret med adaptere, og indsat i pGal4AD har valgt at oprette biblioteket SacCer_TAB Y2H (figur 8). Biblioteket blev omdannet til PLY5725, som producerede en gær befolkning, der blev så parret for at adskille prøver af PJ69-4A MATA transporterer pTEF-GBD plasmid alene. Dublerede diploide befolkninger blev dyrket på non-selektive og selektive betingelser. Y2H plasmid bibliotek skær blev analyseret af dyb sekventering. Når knyttes til genomisk DNA omfatter 100 bp opstrøms og nedstrøms for hvert protein kodende region (84% af den samlede genom), vi fandt > 1,1 millioner forskellige plasmider i biblioteket for en anslået total størrelse af biblioteket i gær af ~1.35 millioner forskellige plasmider. Som en sammenligning, vi også forvandlet en tidligere beskrevet gær genomisk Y2H bibliotek¹¹ (PJ_C1, C2, C3 Y2H bibliotek) i MATalpha gær, og underkastes den samme analyse som ovenfor. Vi fandt, at kompleksiteten af vores tilfældige fragment gær Y2H bibliotek var langt højere og havde langt flere plasmider kodning i-frame fragmenter af hvert gen end den tidligere udgivne bibliotek (figur 9). Vigtigere, generation af oprindelige bibliotek indeholdende diploide populationer var meget reproducerbare med en overdispersion af < 0,01 (figur 10). Derudover reproducerbarhed ved at have to separate gær befolkningerne producerer lignende videredistribution af plasmider efter valg til positive Y2H interaktioner var meget godt, giver en overdispersion af 0,3. Således rumme metoder her større Y2H biblioteker af højere kompleksitet end de tidligere har brugt.

For at øge brugervenligheden af DEEPN, foretrækker vi, ved hjælp af genet syntese for at gøre indsætter koder for agn protein af interesse. Dette giver mulighed for kodning regioner for protein domæner, kimærer og mutanter skal integreres nemt i Y2H agn plasmider, men også tillader deres kodon skal optimeres til udtryk i S. cerevisiae. Udtryk for to forskellige Gal4-DNA-bindende domæne fusion proteiner er vist i figur 3. To forskellige gær transformants udtrykker enten af to agn fusion proteiner var forberedt og udsat for SDS-PAGE og immunoblotting med anti-myc antistoffer. Bemærk udtryk niveauer af agn proteiner i forhold til Gal4 DNA-bindende domæne alene fra den tomme vektor. Vi fandt, at det er vigtigt ikke kun at kontrollere udtryk af agn fusion protein, men også at kontrollere udtryk i den nøjagtige MATA gær transformant koloni, der skal bruges til at udvide og parre at bytte bibliotek, der indeholder gær. Når en transformant er blevet identificeret, er det muligt at fryse den ned og gemme til senere brug.

Figur 4 viser en test for selv aktivisering hvor en seriel fortynding af diploide celler er belagt på CSM-Leu-Trp (+ hans), CSM-Trp-Leu-hans (-hans), og CSM-Trp-Leu-hans + 3AT (-hans + 3AT) plader og lov til at vokse ved 30 ° C i 3 dage. Det ønskede resultat er at observere vækst i tilstedeværelse, men ikke fravær af histidin uanset om der er 3AT. Dette vil tillade brugen af CSM-Trp-Leu-hans vælge for gær med en positiv gær 2-hybrid interaktion. Hvis der er vækst på CSM-Leu-Trp-hans plader, kan derefter et Y2H udvalg stadig fås ved hjælp af den laveste koncentration af 3AT, der forhindrer vækst. Vi finder, at hvis vækst kan blive blokeret i CSM-Trp-Leu-hans + 0,1 mM 3AT, derefter DEEPN analysen kan fortsætte med denne betingelse for at vælge for Y2H vekselvirkninger. Hvis hæmning af væksten i diploids der indeholder pGal4AD eller andre tomme bytte plasmid og pTEF-GBD-agn fusion plasmid kræver imidlertid højere koncentrationer af 3AT, det vil gå på kompromis ydeevne af DEEPN proceduren og en forskellige agn plasmid skal søges. Bemærk, at hans + vækst er det eneste valg for en positiv Y2H interaktion. Vi har fundet dette er tilstrækkeligt til at berige for Y2H interaktioner i batch.

En af de mest kritiske procedurer i DEEPN arbejdsproces er at opnå en høj effektivitet parring af MATA gæren transporterer agn plasmid med MATalpha gær transporterer Y2H bytte bibliotek. Vi fandt, at nogle stammer (f.eks. Y187)¹⁸, boliger kommercielt tilgængelige cDNA-biblioteker, har relativt fattige parring effektivitet. Derfor udviklet vi et pres for at bære Y2H biblioteker. Denne stamme er baseret på BY4742, et derivat af S288c. Denne stamme mangler GAL4, GAL80, TRP1, LEU2og HIS3. Det indeholder ingen journalister, der er lydhøre over for en hybrid Gal4 protein eller en anden hybrid (fx LexA-VP16). I stedet, kilden til Y2H-induceret His3 produktion ligger i MATA-stammen, der ville bære særlige agn plasmid. Dette forenkler systemet og giver mulighed for større fleksibilitet i at man kan bruge de samme bibliotek, der indeholder MATalpha celler til at parre sig med en stamme at udtrykke en LexA-agn fusion protein og en LexA(UAS) -HIS3 reporter eller en Gal4 Bel agn fusion protein og en Gal4 (UAS)-HIS3 reporter.

Når de diploide populationer bærer både en agn plasmid og biblioteket er genereret, de er fortyndet og lov til at vokse under betingelser, der skal bare vælge for begge plasmider (fx CSM-Trp-Leu) eller for både plasmider og en positiv Y2H interaktion, drev produktion af His3 (fx CSM-Leu-Trp-hans). Det er vigtigt at starte med en stor mængde af begynder befolkningen til at undgå en evolutionær 'flaskehals' der kan forvrænge den befolkning, at resultaterne efter valget for en positiv Y2H interaktion. Således, vores fremgangsmåde angiver ved hjælp af 20 mL af 500 mL af diploide befolkning kultur skal dyrkes i 750 mL frisk CSM-Leu-Trp-hans medier til at undgå dette problem. Med pTEF-GBD som agn plasmid fandt vi, at en enkelt runde af fortynding og vækst var tilstrækkelig til at udvikle sig en informativ befolkning. Bruger forskellige agn plasmider tidligere, vi brugte to runder af fortynding og vækst, en indledende 20 mL til 750 mL, og derefter 2 mL fra der mættede kultur fortyndet i 75 mL. Figur 6 viser resultaterne af PCR-amplifikation på tværs af biblioteket skær til den diploide befolkning dyrkes under ikke-selektiv betingelser, samt en første og anden successive runde fortynding og vækst i selektiv betingelse for to forskellige agn plasmider. Bemærk at med ingen valg, der er en generaliseret udstrygningspræparat af PCR produkter vejledende af en kompleks og relativt godt normaliseret blanding af fragmenter. Ved markering ændres dette mønster med nogle arter meget berigende at enkelte bands kan være skimtes. En vis grad af banding er typisk for de vellykkede eksperimenter udført hidtil, endnu en smear mønster som supplement til eller i stedet for en banding mønster, er betegnende for en kompleks blanding af bytte skær og ønskeligt, hvis man ønsker at maksimere antallet af kandidater at registrerer DEEPN. Meget stærk banding mønster, hvor de fleste af PCR-produktet er fundet i 1-3 bands, angiver, at de fleste af sequencing data vil være domineret af kun 1-3 bytte skær. Man kan kompensere for dette dels ved at afsætte flere læser fra denne prøve. Man kan se, at hvis befolkningen er fortyndet og vokset yderligere (Se 'valgte d2' i figur 5), den banding mønster er mere fremtrædende, der angiver, at bytte plasmider giver svag men autentisk Y2H interaktioner er at blive formindsket, mens nogle få udvalgte bytte plasmider er stigende deres overflod. Successive fortynding og vækst til denne overdrevne niveau anses for kontraproduktivt at mål for at fange den største antallet af potentielle kandidater og dermed med protokol her, vi anbefaler en runde af fortynding og vækst anvendes.

Figur 1: skematisk arbejdsproces, DEEPN. Den generelle beskrivelse af laboratorieprocedurer er vist til venstre sammen med den omtrentlige tid kræves for at fuldføre den tilsvarende opgave. Til højre er Bioinformatik arbejdsgang ved hjælp af DEEPN og Stat_Maker software pakkerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: skematisk af pTEF-GBD. TRP1-der indeholder lav kopi Gal4 DNA-bindende domæne fusion protein udtryk plasmid er vist. Det er udstyret med en konstitutiv TEF1 promotor, myc epitop tag, Gal4 DNA bindende domæne fulgt en T7-RNA polymerase bindingssted, polylinker og PRM9 terminator inden for en centromer (CEN)-baseret plasmid. Denne plasmid også bærer Kanamycin modstand og ColE1 bakteriel oprindelsen af replikering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: udtryk for Gal4-agn fusion proteiner. Lysates fra gær udtrykker forskellige agn proteiner sammenvokset til Gal4 DNA-bindende domæne udtrykt i pTEF-GBD blev udsat for SDS-PAGE og immunoblotting med anti-myc antistoffer. pTEF-GBD udtrykker kun Gal4-DNA-bindng domænet alene; pTEF-GBD-bait1 udtrykker den Gal4-DNA-bindng domæne smeltet til en RhoA mangler sit C-terminal prenylation site og boliger en mutation, låse den til et GTP-bundet kropsbygning; pTEF-GBD-bait2 udtrykker den Gal4-DNA-bindng domæne smeltet til en RhoA mangler sit C-terminal prenylation site og boliger en mutation, låse den til et BNP-bundet kropsbygning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: selvstændige aktivering Test. Diploids fremstillet af PJ69-4A celler transporterer angivne agn plasmider og PLY5725 celler transporterer angivne bytte plasmid var seriefremstillede fortyndet og spottet på CSM-Leu-Trp plader, CSM-Leu-Trp-hans plader og CSM-Leu-Trp-hans + 3AT plader og dyrket i 3 dage på 30 ° C. PJ69-4A transformants bruges til parring var først af hvert par, vist i figur 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: parring effektivitet af Y187 vs. PLY5725. Den parring reaktion mellem PJ69-4A indeholdende en TRP1-der indeholder agn vektor og Y187 eller PLY5725 regnskabsmæssige bytte plasmid blev udført. 1:10,000 fortyndinger var belagt på CSM-Trp-Leu vælge for diploids. PLY5725 stammen viser en højere parring energieffektivitet end Y187 stammen med ~ 10 fold mere kolonier produceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: PCR bytte bibliotek skær. DNA blev isoleret fra diploide gær indeholdende et bytte bibliotek, der blev dyrket på non-selektive betingelser (CSM-Leu-Trp media) eller betingelser at vælge for en positiv Y2H interaktion (CSM-Leu-Trp-hans medier). PCR på tværs af biblioteket indsætter afslører forskelle i repertoiret af indsætter valgt. To runder af selektiv vækst blev brugt. En indledende runde af vækst fremstillet ved fortynding af 20 mL af 500 mL af diploide kultur i 750 mL af non-selektive CSM-Leu-Trp medier, og en anden 20 mL til 750 mL CSM-Leu-Trp-hans medier for en indledende runde af selektiv vækst (d1). Dette blev efterfulgt af en ekstra runde i vækst (d2) lavet ved at tage 2 mL af d1 kultur og fortynding til 75 mL af selektivt medie CSM-Leu-Trp-hans. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: kompleksiteten af Y2H cDNA bibliotek. Analyse af indholdet af et kommercielt tilgængelige mus cDNA Y2H bytte biblioteker: et bibliotek fra cDNA mus hjerne og en fra flere mus væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: Generation af Y2H gær genomisk fragment bibliotek. A. skematisk beskrive forsamling af gær genomisk fragment bibliotek i pGal4AD. Genomisk DNA fra stamme PLY5725 var tilfældigt forskydes, forbundet med de angivne Y-adaptere og forbundet til SfiI-cut pGal4AD. Ligations blev omdannet til bakterier til udbytte 2.2 x 10⁶ uafhængige kolonier, der var kombineret og dyrket før isolation af deres plasmid DNA til at omfatte SacCer_TAB Y2H bibliotek. B. LEU2-indeholdende plasmid (pGal4AD) boliger Gal4 transcriptional aktivering domæne er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9: kompleksiteten af Y2H gær genomiske biblioteket. SacCer_TAB genomiske biblioteket blev omdannet til PLY5725 MATalpha stamme og PJ_C1, C2, C3 gær genomiske biblioteket blev omdannet til Υ187 ΜΑΤalpha stamme. Diploids af disse befolkninger blev foretaget af parring PJY69-4A belastning. Populationer var vokset til 10 generationer og bytte fragmenter PCR forstærket blev udsat for høj overførselshastighed sekvensering og analyse. A. viser rangorden af læser per hvert gen i Y2H biblioteker divideret med læser per genet fundet af sekventering gær genom. Givet tilsvarende overflod af hvert gen, ville hvert gen har en værdi på 1. B. histogrammet viser antallet af unikke plasmider pr. gen, der koder et fragment, der er både i det protein kodende region (ORF) og i rammen ordentlig translationel læsning. C. sammenligning af antallet af forskellige plasmider i hver bibliotek, der indkode gær gener og andelen af disse, der er og ikke er i den korrekte translationel læsning ramme eller indsættes baglæns. D. Parceller viser holdninger og overflod af de knudepunkter, der knyttes til eksempel gener (VPS8 og VPS16) findes for plasmider i hvert bibliotek. Plasmider med gen fusioner, der er i den korrekte translationel læsning ramme er udpeget blå. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10: reproducerbarhed af DEEPN med komplekse Y2H gær genomiske biblioteket. A. fire forskellige gær diploide populationer var lavet af parring med SacCer_TAB Y2H biblioteket har til huse i PLY5725, dyrket non-selektive betingelser og sekventeret. Læser per genet for hver befolkning individuelt er afbildet som en funktion af den gennemsnitlige rang ordreværdi på tværs af alle befolkninger. B. viser læser per gen mellem to prøver efter udvalg for positive Y2H interaktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her giver vi en guide til hvordan man udfører Y2H assays i batch optimerede metoder. Der er et par kritiske trin i proceduren for at sikre, at befolkningen af gær, der ville være placeret under valg er repræsentant for biblioteket start og, nok af befolkningens start gær bruges til at gennemgå udvalg for at begrænse variabilitet . Vigtigere, er disse benchmarks relativt let at opnå sammen med tilpasning af metoder og materialer til en traditionel Y2H, analyse, således at denne tilgang gøres tilgængelige for de fleste laboratorier udstyret til standard Molekylærbiologi. DEEPN tillader udvalg fra den samme bytte bibliotek befolkning mens du bruger forskellige agn plasmider. Derfor, sæt af interagerende kandidater, der producerer et Y2H interaktion med en agn vs en anden kan sammenlignes direkte. Dyb sekventering bruges, kan man kontrollere start bibliotek sammensætning for hver agn-specifikke gær befolkning og følg berigelse af hver kandidat bytte gen i biblioteket uafhængigt. Batchafvikling giver forespørge den samme bibliotek mod forskellige lokkemad i en semi-kvantitative måde, som derefter gør det muligt at beregne en statistisk placering⁴.

Der er flere trin i denne protokol, der er kritiske for succes. Et er, at et stort antal diploids skal indhentes for at sikre passende repræsentation af Y2H bytte bibliotek er blandet med hver agn plasmid af interesse. Parring proceduren beskrevet her er optimeret ved at variere flere parametre. Vi fandt, at nogle stammer, som huset kommercielle Y2H biblioteker mate dårligt i almindelighed, men, parring proceduren beskrevet her kan generere 2 x 10⁶- 2 x 10⁷ diploids når fulgt, giver tilstrækkelig og reproducerbare overførsel af Y2H biblioteket i befolkningen. Et andet afgørende aspekt af proceduren er at sikre, at agn plasmid interesse ikke skabe en positiv Y2H interaktion på egen hånd eller med tomme Gal4 aktivering domænet bytte plasmid. Metoden til at vælge en Y2H interaktion er krævende vækst i mangel af histidin hvori en positiv Y2H interaktion inducerer transskription af HIS3 tillade celler til at være hans +. Mens rutinemæssigt de traditionelle Y2H assays kan tilføje kompetitiv inhibitor 3AT for at mindske baggrund vækst eller bruge andre journalister³ , denne procedure fungerer bedst, når celler med svage Y2H interaktioner kan vokse og dermed øge strenghed for vækst og vælge kun for celler med stærk Y2H interaktioner grænser repertoire af bytte plasmider, som kan identificeres. Et andet afgørende aspekt er at sørge for, at en stor del af befolkningens start diploide bruges til at vokse på selektiv og ikke-selektive betingelser at undgå evolutionære flaskehalse fra prøvetagning fejl⁴ . Efter kultur diskenheder og celle numre angivet her vil hjælpe sikre reproducerbarhed og mindske støj.

En af grundene til DEEPN tilgangen er kraftfulde er, at det omfattende kan følge alle plasmider i en given bytte bibliotek for deres evne til at interagere med agn af interesse. En af begrænsningerne af DEEPN er således kompleksiteten i biblioteket anvendte. For nogle af de kommercielle biblioteker som dem, vi brugte her, fandt vi, at antallet af plasmider, der indkode bona fide fragmenter af cDNA ORF, der er i den samme læsning ramme af Gal4 aktivering domæne er mellem 3-6 x 10⁴ med repræsentation af ~ 6.000 - 8,00 0 forskellige gener. Vi fandt, at næsten 75% af disse biblioteker indeholdt fragmenter svarer alene til cDNA regioner, der var 3' af den kodende DNA-sekvens (cd'er/ORF). Desuden, næsten en tredjedel af de gener, der havde fragmenter i biblioteket havde ingen, der svarede til regioner i ORF eller opstrøms af ORF.

Vi lavede tre andre ændringer til metoden DEEPN. En er en ny MATalpha stamme, der kan bære 'bytte' biblioteker har til huse i en TRP1 plasmid og at kammeraterne langt bedre end noget kommercielt tilgængelige bibliotek, der indeholder stammer som Y187. Dette hjælper med at sikre fuldstændig overførsel af befolkningens bibliotek for hver agn af interesse. Vi har også lavet en ny agn udtryk plasmidet, som adskiller sig fra tidligere beskrevet plasmider, der bruger en variabel kopi 2µ-baseret backbone¹⁰. Her beskriver vi en lav-kopi CEN plasmid (pTEF-GBD) og opdager, at en enkelt runde af selektiv vækst er tilstrækkelig til at berige for interagerende bytte plasmider. Endelig, vi bygge en strømlinet 'bytte' bibliotek vektor og bruges til at producere en high-density random-fragment genomisk Y2H bibliotek for Saccharomces cerevisiae, som bør være nyttige for at opdage og kendetegner interaktioner ind i fremtiden gær proteiner. Samlet set gør forbedringer i materialer og bioinformatik værktøjer (beskrevet i den ledsagende arbejde) DEEPN tilgang en tilgængelig, realistisk og effektiv måde at udføre omfattende og sammenlignende Y2H skærme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100