Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Пакетная обработка экранов 2-гибрида дрождей позволяет для прямого сравнения профилей взаимодействия нескольких приманки белков с весьма сложным набором добычу синтеза белков. Здесь мы описываем, изысканные методы, новые реагенты и как осуществлять их использования для таких экранов.

Abstract

Скрининг для взаимодействий протеин протеина используя пробирного 2-гибрида дрождей уже давно эффективным средством, но его использование во многом был ограниченным к открытию высокоспецифичные посредники, которые сильно обогащенный в библиотеке взаимодействующих кандидатов. В традиционном формате пробирного 2-гибрида дрождей может принести слишком много колоний для анализа при проведении в низкой жесткости где низкого сродства посредники могут быть найдены. Кроме того без всеобъемлющей и полной допроса той же библиотеки против различных приманки плазмид, сравнительный анализ невозможно. Хотя некоторые из этих проблем могут быть решены с использованием библиотек выстроились добычу, стоимость и инфраструктуры, необходимых для работы таких экранов может быть непомерно высока. В качестве альтернативы, мы адаптировали дрожжи 2-гибрид assay одновременно раскрыть десятки переходных и статические белковых взаимодействий в одном экране, используя стратегию называют DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей), который включает в себя высокопроизводительного секвенирования ДНК и вычисление проследить эволюцию популяции плазмиды, которые кодируют взаимодействия партнеров. Здесь мы описываем заказной реагентов и протоколы, которые позволяют DEEPN экрана, чтобы быть выполнен легко и экономически эффективно.

Introduction

Полное понимание биологических процессов клетки основывается на поиске сетей взаимодействия белков, которые лежат в основе их молекулярные механизмы. Один из подходов к идентификации взаимодействий протеина является дрожжи assay (Y2H) 2-гибрид, который работает путем сборки функционирования химерных транскрипционный фактор, после двух доменов протеина интереса связывать друг с другом1. Типичный Y2H экран осуществляется путем создания население дрожжей, что дома обе библиотеки плазмид кодирования взаимодействуя белками, сливается с transcriptional активатор (например., «добычу» синтез белка) и плазмида данного «приманки» состоит из белка из интереса сливается с ДНК связывающий домен (например, Gal4 ДНК-связывающих домен, который связывает вверх по течению Gal4 активируя последовательности). Одним из главных преимуществ Y2H подход является, что это сравнительно легко и недорого провести в типичной лаборатории оснащены для рутинной молекулярных биологических работы2. Однако когда традиционно выполняется, пользователь образцы отдельных колоний, которые возникают при выборе для позитивного взаимодействия Y2H. Это серьезно ограничивает количество библиотека «добычу» клоны, которые могут быть обследованы. Эта проблема усугубляется, когда обилие конкретных взаимодействующих добычу очень высока по сравнению с другими, уменьшая вероятность обнаружения взаимодействия с низкой численности хищных плазмид.

Одним из решений для использования Y2H принципа всеобъемлющего охвата протеома является использование матрицы формате подхода, которой массив плазмид известных индивидуальных добычу могут допрашиваться цифровой. Однако такой подход требует инфраструктуры, которая не является легко доступной или экономически отдельных следователей, которые заинтересованы в определении interactome небольшое количество белков или домены3. Кроме того очень сложные добычу библиотек, которые могут кодировать несколько фрагментов взаимодействующих белков будет расширять размер такой матрицы массивов непрактичным размеров. Альтернативой является для выполнения анализов с комплекс библиотек в пакетах и оценить наличие взаимодействующих клонов, используя массивной параллельной последовательности высок объём4. Это может быть применено к assay присутствие плазмид добычу, которые возникают в несколько колоний, с использованием типичного Y2H формате подход, в котором дрожжи клетки жилья взаимодействующие синтеза белков могут расти на пластине5,6. Эта общая идея может акцентировал увеличить запрос оба несколько приманки и добычей компонентов на же время7,8.

Тем не менее многие расследования требуют что проще еще более целенаправленный характер усилий на нескольких белка «приманки» и может принести пользу более запросом исчерпывающим и полуколичественных единый комплекс добычу библиотеки. Мы разработали и проверены подход для выполнения белка широкомасштабного взаимодействия исследования с использованием Y2H принцип в пакетный формат4. Скорость расширения конкретной жертвой плазмида использует в качестве прокси для относительной силы взаимодействия Y2H9. Глубокие секвенирования всех плазмид в рамках населения подвергается нормальному росту или селективный рост условий производит полную карту клонов, которые дают сильные и слабые Y2H взаимодействий. Репертуар посредники могут получить и непосредственно сравнивать по несколько плазмидов приманки. Полученный рабочий процесс, называется DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей) таким образом может использоваться для определения дифференциального interactomes же добычей библиотек для идентификации белков, позволяя сравнение одного белка против другой.

Здесь, мы демонстрируем DEEPN и внесения улучшений в лабораторных методов, которые облегчают его использования, которые приводятся на рисунке 1. Значительные усовершенствования включают в себя:

Поколение популяций хищных дрожжи. Одним из ключевых требований DEEPN порождает населения дрожжей с различные приманки плазмиды, которые имеют такое же распределение библиотек добычу плазмиды. Эквивалентные базовых популяций хищных плазмида библиотеки необходимы для точных сопоставлений между interactomes разных приманки. Это лучше всего достигается, когда библиотека плазмида уже расположен в haploid дрожжей населения и перемещение заданного приманки плазмида в населения достигается путем спаривания производить диплоидные. Здесь мы предоставляем четкое руководство в том, как сделать такое население, с использованием коммерческих библиотек, размещенный в haploid дрожжей. Хотя мы нашли методы, которые генерируют большое количество diploids, общей спаривания эффективности эти коммерческие библиотеки, содержащей штаммов дрожжей был низким. Таким образом мы построили новый штамм, который может дом добычу библиотек, что дает гораздо больше diploids за спаривания реакции.

Новый набор приманки плазмид. Многие текущие плазмиды, которые выражают протеины сплавливания «приманки» входят протеина интереса и ДНК связывающих домена на основе 2μ, позволяя им для того усилить их копии номер. Этот номер копии могут быть вполне переменной в населенности и привести к изменчивости в ответ transcriptional Y2H. Это в свою очередь может исказить возможность оценить силу взаимодействия данного белка, основываясь на ответе роста клеток под выбор. Это может быть частично адрес с помощью низкой копировать плазмиду, некоторые из которых ранее были описаны как коммерчески доступных pDEST3210. Мы построили новые приманки плазмида (pTEF ГПБ), которая производит Gal4-ДНК связывающих белков фьюжн домена внутри центромер низкая копирования плазмида TRP1 , перевозящих ген сопротивления Kanr, также позволяет клонирования приманки фрагментов оба вверх по течению и вниз по течению от Gal4 ДНК-связывающих домена.

Библиотека фрагмент новой высокоплотного Y2H. Мы построен новый плазмида дом Y2H добычу библиотек и использовал его для построения сложных Y2H библиотеки из случайно стриженый фрагментов геномной ДНК из Saccharomyces cerevisiae. Анализ последовательности показали, что эта библиотека более 1 миллиона различных элементов, гораздо более сложным, чем ранее описанные дрожжи геномной Y2H плазмиды библиотек11. С этой новой библиотеки мы смогли показать, что процесс DEEPN достаточно прочным для того, чтобы вместить комплекс библиотек с много различных плазмид в манере, которая является надежным и воспроизводимость.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. подготовка средств массовой информации и плиты

Примечание: Все пластины должны быть сделаны как минимум 2 дня перед началом протокол. Средства массовой информации могут быть сделаны в любой точке. Однако буферизации дрожжевой экстракт Пептон Декстроза аденин (bYPDA) необходимо предусмотреть в день, из которых он будет использоваться. Некоторые средства массовой информации производится с использованием дополнения смеси, содержащей уровень аденин, что больше, чем обычно используется. Большинство дополнений минимальные средства массовой информации укажите аденин 10 мг/Л. Добавки с надписью «+ 40Ade» укажите в общей сложности 40 мг/Л аденин.

  1. Подготовка раствора глюкозы (50% w/v). Для 1 Л, растворить в 500 g D-(+)-глюкозы в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Отрегулируйте громкость до 1000 мл с помощью мерного цилиндра и фильтр через 0,2 мкм стерильным фильтром в бутылку хранения СМИ стерильные 1000 мл.
  2. Подготовьте дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) пластины. Для 1 Л, растворяют 20 g Пептон и 10 г дрожжей экстракт в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 960 мл дистиллированной водой. Налить в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 40 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  3. Подготовить полный синтетических минимальный СМИ (CSM)-Trp пластины. Для 1 Л, растворяются 6,7 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 960 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0,7 г - Trp-встретился отсева микс, 20 мг метионин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 40 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  4. Подготовьте CSM-леи-Met пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налить в мензурку и заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 1,005 г - леи-встретил отсева смеси и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  5. Подготовьте CSM-леи-Trp пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 1,005 г - Trp-лей + 40Ade отсева микс, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  6. Подготовьте CSM-леи-Trp-его тарелки. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0.975 g - Trp-леи-его + 40Ade смесь отсева, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте хорошо крутятся.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  7. Подготовьте CSM-леи-Trp-его 3AT пластины. Для 1 Л, растворяются 10.05 г дрожжей азота базы без аминокислот в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 940 мл дистиллированной водой. Налейте в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавьте 0.975 g - Trp-леи-его + 40Ade смесь отсева, 240 мг аденин и 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Использование пипетки для добавления 60 мл 50% глюкозы. Смешайте в 100 мкл стерильные запас 1 M 3-амино-1,2,4 триазола (3AT), закрученной.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  8. Подготовьте LB-Kanr пластины. Для 1 Л, Растворите 10 g Триптон, 5 г дрожжей экстракт и 10 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл. Налейте в мерный цилиндр, заполнить до 1000 мл дистиллированной водой. Налить в 2000 мл колбу Эрленмейера и добавить 15 г агара. Автоклавы и прохладный 37 ° C водяной бане до тех пор, пока температура ванны вода остынет до приблизительно 42-50 ° C. Добавьте 50 мг канамицин и смешать с закрученной.
    1. Залейте серии 100 мм пластин с 20 мл СМИ с пипеткой.
  9. Подготовьте YPD, CSM-леи-Met, CSM-ГТО, CSM-леи-ГТО и CSM-леи-Trp-его средств массовой информации. Описанные выше для пластин за исключением вместо вливаются в колбу Эрленмейера, налить в бутылку для хранения средств массовой информации и опустить агар.
  10. Подготовка bYPDA (буферизованное YPDA). Возьмите стерильные YPD СМИ и добавить 200 мг/Л аденин в стерильной дистиллированной воде. Скорректировать рН 3,7 с HCl. фильтра через 0,2 мкм стерильным фильтром в стерильных бутылку.
  11. Подготовить преобразования буфера: 2 M сорбитол, дигидрат ацетат лития 1 М, 10 мм трис рН 7,6, 0.5 мм ЭДТА, кальция хлорид 0,2 мм в дистиллированной воде. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм стерильным в стерильных бутылку.
  12. Подготовить PEG решение: 70% w/v полиэтиленгликоля 3350 в дистиллированной воде. Стерилизуйте в автоклаве.
  13. Подготовить вертеть: 8 M мочевины, SDS 4% w/v, 50 мм трис рН 6,8, 10% v/v глицерина, 0,02% w/v бромфеноловый синий в стерильной дистиллированной воды.
  14. Подготовить sTE (сильный TE): 50 мм трис, 20 ЭДТА, рН 8,0 в дистиллированной воде. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм стерильным в стерильных бутылку.
  15. Подготовить раствор Zymolase: 10 мг/мл Zymolase 100т в 50 мм калия фосфат двухосновной pH 7.5, 50% v/v глицерин буфер в стерильной дистиллированной воды (хранятся при температуре-20 ° C).

2. клонирование и проверка приманки плазмиды

Примечание: Строительство Gal4-ДНК связывающих домена плазмид. В настоящее время существует целый ряд коммерчески доступных и академически доступны Y2H систем. DEEPN может вместить многие из них, условии, что приманка плазмида выражения протеина интереса, сливается в ДНК связывающих домен находится в TRP1-содержащих плазмиды. Другие требования, ниже по течению, что последовательность сразу вверх по течению добычу библиотеки известен вставки и позитивного взаимодействия Y2H может быть забит с производством His3 позволяет для выбора в средствах массовой информации не хватает гистидина. Здесь мы будем описывать использование новой плазмида Y2H приманку (pTEF ГПБ, рис. 2), однако, могут также использоваться другие приманки плазмид Y2H, включая pGBKT7. Для строительства и оценки приманки плазмид мы будем описывать использование pTEF ГПБ. Общее замечание мы рекомендуем гена синтеза производить открытое чтение кадр, который придерживается предвзятости кодон дрожжей чтобы обеспечить хорошее выражение и легкость с клонирования. Убедитесь, что клонирования схема позволяет приманку, чтобы быть в рамка с Gal4 ДНК-связывающий домен и что при клонировании в 3' сайт, стоп-кодон следующим регионе приманки кодирования.

  1. Подготовьте вектор плазмиды. Плазмида pTEF ГПБ позволяет для клонирования шифруя протеин интереса либо 5' и 3' региона кодирования Gal4 ДНК-связывающий домен, с помощью метода быстрой сборки. Для вставки на 5' сайте, дайджест 3 мкг pTEF ГПБ Нари и EcoRI или для вставки на сайт 3', дайджест с BamHI и XhoI для 2-4 ч. Electrophorese образца ДНК агарозы 1% гель содержащие 0,2 - 0,5 мкг/мл ethidium бромид (бромистый этидий) на 100 г. акцизный вырезать 5,630 bp КТЭ-ГПБ и очистить с помощью комплекта извлечения геля ДНК в соответствии с инструкциями производителя и количественного определения ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре12.
    Примечание: Поколение приманки кодирования вставок. Фрагменты ДНК кодирования белков или фрагменты белка интерес может быть изготовлен с использованием гена синтеза и доступны как uncloned фрагменты. Рекомендуется, что кодоны оптимизированы для выражения в Saccharomyces cerevisiae и онлайн инструменты для оптимизации кодон, включены в список материалов.
  2. Для 5' вставки, обрамляют фрагмента ДНК кодирования кодон начала ГПТ, 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'и 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, соответственно. 3' вставки в рамке с связывающий домен Gal4 ДНК, обрамляют фрагмента кодирования, 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 "и 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3».
  3. Для строительства плазмида используйте метод быстрой сборки согласно инструкциям производителя для клонирования фрагментов в резки pTEF ГПБ.
    1. Плита все превращается E. coli на LB-Kanr пластины и проинкубируйте 16-20 ч при 37 ° C. Колонии жилья pTEF ГПБ с требуемой вставки могут быть идентифицированы по амплификации PCR используя олигонуклеотиды: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' и 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Вставка и 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' и 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' по 3' вставить. Эти олигонуклеотиды может также служить грунты для секвенирования insert.
    2. План по подготовке > 10 мкг каждого pTEF ГПБ производной и pTEF ГПБ самостоятельно предоставлять материалы для преобразования последовательности и дрожжи.
    3. Используйте следующие условия PCR: 3 мин при 98 ° C, а затем 25 циклов 30 s на 98 ° C, 30 s при 55 ° C и 2 мин при 72 ° C, а затем 5 мин при 72 ° C, используя буфер, содержащий 2,5 мм2 MgCl , 0.5 U/100 мкл ДНК-полимеразы и проприетарные буфера.

3. выражение домена Gal4-ДНК связывающих белков Fusion

  1. Сделайте компетентным дрожжей.
    1. Полоса из PJ69-4A дрожжей на YPD пластину, принимая стерильные деревянные аппликатор, соскоб 1 мм3 -80 ° c замороженных фондовых и растирая его мягко через пластину YPD. Переместите деревянным аппликатором вниз пластину, так что каждый проход идет через нетронутые частью поверхности СМИ. Инкубируйте YPD пластины при 30 ° C в течение 2 дней или до тех пор, пока один колоний видны. Сделать замороженные запасы PJ69-4A дрожжей, приостановив дрожжи в воде или роста СМИ, дополняющего с ДМСО до 7% и хранения при температуре-80 ° C.
    2. Прививок одной колонии в 5 мл культуры YPD в трубу культуры 20 мм x 150 мм, с помощью стерильных аппликатор деревянные и расти на ночь при 30 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
    3. Прививать 50 мл YPD в 250 мл стерильную колбу Эрленмейера с 4 мл ночь культуры PJ69-4A штамм дрожжей. Растут в пожимая инкубатора при 30 ° C, 200 rpm оптической плотности (600OD) приблизительно 1.2, как определено методом спектрофотометрии с пути света стандартного 1 см. Рост обычно занимает 5-7 ч.
    4. Изолируйте дрожжей, седиментации в 50 мл конические пробки на 4,696 g x 5 мин при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Выбросите супернатант сбросами в жидких отходов. С помощью пипетки, Ресуспензируйте гранулы в 5 мл буфера для преобразования и передачи 15 мл Конические трубки. Resediment чтобы отменить супернатанта и Ресуспензируйте дрожжи в 1 мл окончательный объем преобразования буфера с 1000 мкл пипетки.
    5. Инкубировать дрожжевых клеток для 60 мин при 30 ° C при встряхивании в 200 об/мин, а затем поместить на льду за 30-90 мин.
  2. Дрожжи плазмида преобразование.
    1. 1,5 мл стерильного microcentrifuge трубки добавьте 1 мкг на основе pTEF ГПБ плазмиды и 5 мкл 10 мг/мл спермы лосося перевозчика ДНК решения. Также включать трубка, содержащая только лосося спермы перевозчик ДНК как элемент негативные трансформации. Добавьте 100 мкл суспензии клеток ледяной дрожжей в каждую пробирку, пипетки. 100 мкл 70% PEG решение с 1000 мкл пипетки и смешайте нежно, стряхивая трубки 5 - 10 раз (делать не вихрь).
    2. Инкубируйте на 30 ° C, в дрожь инкубатор на 200 об/мин за 45 мин.
    3. Теплового шока при 42 ° C 15 мин.
    4. Осадков в microcentrifuge в 845 g x 3 мин при комнатной температуре, Пипетка с удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле в 150 мкл стерильной воды, закупорить вверх и вниз и распределяют по поверхности плиты CSM-ГТО.
    5. Разместите таблички справа вверх в инкубаторе 30 ° C и проинкубируйте 2-3 дня до тех пор, пока колоний видны. Плиты могут быть перевернуто во избежание образования конденсата на поверхности пластины после инкубации при 30 ° C для 6-12 ч.
    6. Взять 2-3 колоний за преобразования и полоска как патч на CSM-Trp пластину с помощью стерильных зубочисткой. Позволяют расти в течение 24 ч при температуре 30 ° C.
  3. Сделайте лизатов для выражения протеина.
    1. Прививок 3 мл жидких сред CSM-ГТО с размером матч руководитель дрожжей из патча и расти на ночь при 30 ° C в трубке культура 20 мм x 150 мм, при встряхивании в 200 об/мин. Сделайте два ночи культур на приманку и пустой pTEF ГПБ вектора.
    2. Добавьте 1 mL YPD для каждого 3 мл CSM-Trp ночь культуры. Расти в течение 1 ч при 30 ° C, при встряхивании в 200 об/мин. Проверьте на од клеток, спектрофотометр.
    3. Отложения эквивалентное количество клеток, нормализующее согласно ОД. Используйте стерильные 1,5 мл microcentrifuge трубок с 5 мин спина на 2348 x g при комнатной температуре в microcentrifuge. Использование пипетки отказаться супернатант. Окончательный акций соответствует как минимум 2.1 ОД.
      Примечание: При расчете эквивалентное количество клеток, это может произойти, что разные тома может потребоваться от каждой ночи культуры для достижения минимальной 2.1 ОД.
    4. Ресуспензируйте гранулы в 450 мкл 0,2 М NaOH, закупорить вверх и вниз. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Recentrifuge клетки на 2 мин на 2348 x g при комнатной температуре и отбросить супернатант в пипетку.
    5. Ресуспензируйте лепешка с 50 мкл буфера ВЕРТЕТЬ, закупорить вверх и вниз тщательно, чтобы не сделать пузыри. Пример тепла для 5 мин при 70 ° C.
  4. Проверка выражения протеина SDS-PAGE.
    1. Использование градиента гель 4-20%, обеспечить широкий спектр молекулярным весом могут быть решены. Эквивалент нагрузки (же OD) образцов в SDS-PAGE гель и не забудьте включить по крайней мере один образец, содержащий в неизмененном pTEF ГПБ вектор13,14,15.
    2. После электрофоретического разделения передачи гель нитроцеллюлозы и immunoblot с помощью моноклональных и поликлональных антител анти myc и ECL обнаружения раствора (рис. 3).

4. самостоятельной активации теста

  1. Полоса из дрожжей MATalpha от соответствующего жилья добычу библиотека интерес на пластину YPD, принимая стерильных аппликатор деревянные, соскоб небольшое количество дрожжей из флакона и мелирование через пластину YPD штамм акций-80 ° C. Инкубируйте YPD пластины при 30 ° C в течение 2 дней или до тех пор, пока один колоний видны. Патч пару один колоний на YPD пластину и Инкубируйте на ночь на 30 ° C.
    Примечание: Новый штамм, разработанных здесь дом добычу библиотеки является PLY5725, тогда как некоторые совместимый коммерчески доступных библиотек Y2H размещены в Y187.
  2. Выполните процедуры, описанные в 3.3.1 - 3.3.4 для преобразования PLY5725 с LEU2-на основе плазмид, используются для размещения библиотеки желаемого добычу. Для библиотек, разработанных здесь, соответствующий плазмида является pGal4AD (pPL6343). Чтобы восстановить трансформантов дрожжи, пластину на CSM-леи-Met пластины. После колонии возникают, полоска как патчи на CSM-леи-Met пластину и инкубировать в течение 24 ч при температуре 30 ° C.
  3. Следуйте протокола в 3.4 для подтверждения выражение pPL6343 пустой вектор с использованием анти-Ха моноклональных и поликлональных антител и решения обнаружения ECL.
  4. Streak которую каждый преобразованный PJ69-4A дрожжей в крест узор с PLY5725 строит на YPD пластина, которая была подтверждена выразить белка в протоколе раздел 3.4 и 4.3 и Инкубируйте на 30 ° C на ночь. Возьмите 1 мм3 клеток, где два штаммов выросли вместе и патч на отдельные CSM-леи-Met, CSM-ТРП и CSM-Trp-леи пластин и расти 24 h.
    Примечание: Желаемый diploids будет расти на тарелках CSM-Trp-лей. Рост на CSM-леи-мет и CSM-Trp плиты служат положительный контроль для роста дрожжей.
  5. Расти diploids в 1 мл CSM-Trp-леи СМИ на ночь на 30 ° C. Осадков 500 мкл клетки в 1,5 мл microcentrifuge трубки на 2348 x g, 3 мин при комнатной температуре в microcentrifuge. Отказаться от супернатанта, пипетки. Ресуспензируйте клеток в 1 мл стерильной воды и повторите седиментации и ресуспендирования. Проверка ОД600 клеток.
  6. Сделать серию 1:10 серийных разведений каждого суспензии клеток, используя стерильную воду с начиная с наиболее концентрированный раствор каждого в ОД 0.5. SPOT 5 мкл каждого разведения на тарелку CSM-леи-ГТО, CSM-леи-Trp-его тарелку и CSM-леи-Trp-его + 3AT пластины. Инкубируйте на 30 ° C и проверить для роста ежедневно в течение 3 дней (рис. 4).
    Примечание: для 1:10 серийный разрежения, Пипетка 10 мкл трубка, содержащая ОД 0,5 в 90 мкл воды и перемешать, закупорить вверх и вниз. Продолжать делать 1:10 серийных разведений, пока есть в общей сложности шесть различных концентраций в месте.

5. Создайте дрожжей населения с приманкой и добычей Библиотека

Примечание: Y187 штамм, который дома коммерческой добычи библиотека плазмиды также не мат. Таким образом следующие оптимизированные условия требуются для поддержания сложности библиотеки. PLY5725 штамм содержащие Y2H добычу библиотек товарищей лучше и же спаривания процедура может использоваться с этот штамм (рис. 5).

  1. Прививать 3 мл культур каждого из трансформантов PJ69-4A, перевозящих различные TRP1-содержащих pTEF ГПБ приманки плазмида в CSM-ГТО СМИ в трубке культуры. Включает два отдельных культур, содержащих pTEF ГПБ вектор плазмиды самостоятельно выступать в качестве процедурного контроля. Инкубировать культур при 30 ° C, 200 rpm для 6 h и затем разбавляют в 25 мл в стерильную колбу Эрленмейера ночь роста культуры.
  2. Разморозить замороженные (-80 ° C) флакон MATalpha клетки, содержащие LEU2-проведение «добычей» библиотека при комнатной температуре. Прививать 125 мл CSM-леи-Met СМИ в стерильную колбу Эрленмейера с целом талой флакона. Растут всех культур на ночь на 30 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
    Примечание: OD600 ночи культур необходимо диапазоне от 1,0 до 1,5 перед переходом к следующим шагам.
  3. Центрифуга 21 ОД эквиваленты каждого из культур transformant PJ69-4A с 5 мин спина на 4,696 x g при комнатной температуре. За каждые 10 спаривания реакции желаемого, Пелле 39600 эквиваленты ОД MATalpha штамма, перевозящих библиотека плазмид в отдельных 50 мл конические трубы.
    1. Ресуспензируйте клетки в 10 мл стерильной воды и повторно Пелле в новой 50 мл Конические трубки 4,696 x г 5 мин при комнатной температуре в центрифуге benchtop. С помощью пипетки, аккуратно удалите супернатант без нарушения гранулированных клетки.
    2. Ресуспензируйте гранулы PLY5725 клеток в 10 мл bYPDA (рН 3,7) и PJ69-4A клеток в 4 мл.
  4. Для настройки спаривания реакций, добавить 1 мл PJ69-4A преобразовали клетки, 1 мл MATalpha библиотека содержащих клеток и 1 мл bYPDA рН 3,7 до новой 50 мл Конические трубки. Инкубируйте на 30 ° C с нежным орбитальных агитации (100-130/мин) 90 мин.
    1. Центрифуга клетки для 5 мин при 4,696 x g, при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Удалить супернатант пипетки и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл bYPDA:YPD 1:1. Пластина все 2 мл на 100 мм YPD пластину на пипетку и Инкубируйте на 30 ° C около 20 мин.
  5. Урожай клетки от YPD плит с помощью скребка ячейки выбить клетки в 2-3 мл CSM-леи-ГТО СМИ. Пипетка выбили клетки в 50 мл Конические трубки. Промойте пластины 4 - 5 раз с 2-3 мл CSM-леи-ГТО СМИ, закупорить вверх, что средства массовой информации, используя 1000 мкл Пипетка и осторожно извлечь средства массовой информации по всей поверхности пластины YPD.
    1. Центрифуга клетки для 5 мин при 4,696 x g при комнатной температуре в центрифуге benchtop. Отказаться от супернатанта, дозаторов и Ресуспензируйте клетки в 40 мл CSM-леи-ГТО СМИ, закупорить вверх и вниз (ДУ не вихрь).
  6. Чтобы оценить количество формируется диплоидный клеток, разбавляют 4 мкл диплоидных смеси в 200 мкл и 2000 мкл CSM-Trp-леи СМИ. Плита 200 мкл каждого разведения на тарелку CSM-леи-ГТО.
    Примечание: Две пластины представляют мэм и картирование раз разведение акций diploids собирают и приносит ожидаемый ~ 9000-27000 колоний на пластину разрежения мэм после инкубации при 30 ° C для 36-40 ч. Проверка пластин после шага 5.7. Минимальное количество 200 колоний на пластину разрежения мэм необходим для перехода к шагу 5.8
  7. Немедленно занять оставшуюся часть каждого 40 мл клеток ресуспендирования и прививать 1000 мл колбу Эрленмейера, содержащий 500 мл CSM-леи-ГТО СМИ. Возьмите первоначальный ОД600. Инкубируйте эти фляги при 30 ° C с встряхивания на 180 об/мин, до тех пор, пока они достигают насыщения (~2.0 ОД/мл). Это обычно занимает около 36-40 ч. рост монитор на 24 ч потом снова на 36 h ОД600.
  8. С помощью пипетки, удалите 20 мл аликвоты каждого из насыщенных 500 мл культур и innoculate 2000 мл Эрленмейер колбы, один содержащие 750 мл CSM-леи-ГТО СМИ и второй содержащие 750 мл CSM-леи-Trp-его с низким уровнем 3AT, устраняет фон (ранее определяется в разделе 4.5). Mix новых культур (770 мл) хорошо крутятся и принять первоначальный ОД600.
  9. Инкубируйте культур при 30 ° C во время тряски на 180 об/мин до достижения насыщения, который обычно происходит в течение 24 ч для невыбранных CSM-леи-Trp культуры и может занять более 70 h для культур под выбор для Y2H взаимодействия.
  10. После культуры достигли насыщения (ОД ~ 2.0), удалить 11 мл с пипеткой, отложений клетки с 5 мин спина на 4,696 x g при комнатной температуре, отказаться от супернатанта, пипетки и заморозить при температуре-20 ° C или продолжить на экстракции ДНК. Образцы выбранных и невыбранных будет использоваться для глубокого последовательности.

6. Пробоподготовка для секвенирования глубоко DEEPN

  1. Экстракции ДНК.
    1. Используйте пипетку для Ресуспензируйте клеток окатышей из протокола раздел 5.7 в 500 мкл буфера sTE и передачи для 1.5 мл пробки microcentrifuge. Добавьте 3 мкл betamercaptoethanol и 10 мкл Zymolase запасов. Хорошо перемешайте и инкубировать в инкубаторе 37 ° C для 24-36 ч.
    2. Извлечь образец два раза с 500 мкл фенол/хлороформ/изоамилового спирта при использовании вытяжки дыма16.
    3. Добавление 7 мкл 4 М NaCl, 900 мкл ледяной 100% этанола (ETOH), микс от инверсии и либо замораживания-20 ° C или продолжать отложений ДНК, спиннинг на 21,130 x g 10 мин при комнатной температуре в microcentrifuge.
    4. Отказаться от супернатанта, пипетки. Помыть лепешка трижды с 900 мкл 70% ETOH.
    5. Отложениях Пелле 21,130 g x 2 мин и удалить остаточные ETOH мыть с пипеткой. Сухие гранулы для 7 мин при 42 ° C.
    6. Ресуспензируйте Пелле в 120 мкл 0.1 x sTE в ванну воды 37 ° C, 90 мин, Флик трубы смешивать каждые 30 мин.
    7. Пипетка 60 мкл ДНК в стерильных 1,5 мл пробки microcentrifuge. 120 мкл sTE, 3.5 мкл РНКазы A акций, Флик смешивать и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
    8. Преципитат этанола, как ранее сделали в раздел 6.1.3 - 6.1.5, но использовать 7 мкл ацетата аммония 5 М вместо 4 М NaCl.
    9. Ресуспензируйте РНКазы A-обработал дна в 55 мкл 0.1 x sTE в ванну воды 37 ° C, 90 мин, Флик трубы смешивать каждые 30 мин Quantify ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре.
  2. ПЦР cDNA вставляет.
    1. Выполняют два, 50 мкл ПЦР-реакции на образец ДНК. Каждый реакции содержит 25 пмоль каждого прямого и обратного грунтовки, соответствия плазмида добычу библиотеки (см. материалы). Реакции также содержат 25 мкл высококачественный 2 x PCR Мастер микс, 5 мкг ДНК образца и воды до 50 мкл. Amplify реакций для 25 циклов с расширение раз 3 мин при 72 ° C, обжигают Температура 55 ° c за 30 сек и денатурировать на 98 ° C для 10 s. предшествует Велоспорт по 30 s денатурации 98 ° C и следовать с 5 минут инкубации при 72 ° C.
    2. Анализ 4 мкл каждого реакции PCR, электрофорез геля агарозы 1% ДНК с дна агарозы гель содержащие 0,2 - 0,5 мкг/мл бромистый этидий17. Визуализации образца ДНК путем просвечивания УФ. Образцы покажет что мазок ДНК около 1-3 КБ, где диапазонов шаблон может быть найдена для образцов, где взаимодействие Y2H был выбран (рис. 6).
    3. Объединить повторяющиеся образцы ПЦР и очистить, используя комплект для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя и количественного определения ДНК путем поглощения на 260 Нм на спектрофотометре.

7. глубокая последовательности

Примечание: Пробоподготовка и последовательности на платформе глубокий последовательности обычно доступен в коммерческих и академических учреждениях ядро секвенирования ДНК.

  1. Сдвига 600 нг ПЦР продукта с помощью высокопроизводительных ультра sonicator дать фрагменты средней длиной ~ 300 bp.
  2. Создания индексированных последовательности библиотек с помощью подготовки комплекта для глубоких последовательности, которая добавляет линкеры кодирования штрих-кодов, грунтовка сайтов, и захват последовательности несимметрично на концах фрагментов ДНК.
  3. Выполните подготовку библиотека согласно инструкциям производителя. Бассейн индексируются библиотек и последовательности, как долго в паре конец читает на платформе глубокую последовательности (например, 2 x 150 bp PE прочтений). Нужное количество операций чтения для каждого образца находится между 10 и 40 миллионов, с более читает, требуемой для невыбранных групп населения, которые являются более сложными, как правило. Мы рекомендуем по крайней мере 20 миллионов или более читает для невыбранных групп населения.

8. Bioinformatic обработка и проверка

  1. Процесс ДНК последовательности данных в виде fastq с набором автономные программного обеспечения, программы построены для (1) карта последовательности чтения файлов в формате универсального Сэм (2) количественно гена обогащения между наборами данных (3) выполнять статистический анализ данных в Чтобы ранжировать какой кандидат гены являются позитивными для взаимодействия Y2H () 4) предоставлять информацию о том, что регион(ы) и какие поступательные кадр каждый cDNA добычу за гена фрагменты, дают позитивные Y2H взаимодействия состоят, и (5) инструменты для восстановления не только 5' но и 3' концу взаимодействующих фрагментов, позволяя их реконструкции и проверки в традиционном формате Y2H. Работы этих программ подробно в исследовании, сопровождающих.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Y2H assay широко используется для поиска: протеин взаимодействия и несколько систем и адаптации были разработаны. По большей части те же соображения, которые помогут обеспечить успех этих предыдущих подходов имеют важное значение для DEEPN. Некоторые из важных контрольных показателей включают: обеспечение выражение ДНК связывающих домена синтез белков, обеспечивая низкий фоне ложных его + рост в diploids, содержащие приманки интерес с пустым добычу плазмида, высокой спаривания эффективности приманки содержащие дрожжи Мата с библиотеки, содержащей MATalpha дрожжи, и наконец, низкой жесткости условий, которые позволяют населению расти в условиях, которые выбрать для многих положительных реакций Y2H, даже те, что производят низкий уровень His3 активности и слабый Y2H transcriptional ответ.

Одним из важнейших аспектов DEEPN является познакомить можно воспроизвести Y2H библиотеки в штаммов, которые содержат различные приманки плазмидов и надежно выбрать населению для тех библиотека плазмиды, которые создают положительный Y2H взаимодействий. Это становится более сложной, когда сложность Y2H библиотеки увеличивается, так как это сложнее для обеспечения адекватной передачи всей библиотеки по различным группам населения первоначальный. Кроме того размер населения решили расти в условиях отбора и глубина последовательности должны быть достаточно большой, чтобы наблюдать воспроизводимые изменения в составе плазмида Y2H надежно определить истинный положительный Y2H взаимодействий. В предыдущих исследованиях мы использовали коммерчески доступных Y2H кДНК библиотек. Мы нашли изменчивость в Y2H библиотека распределения между отдельных популяций, перевозящих же плазмид приманку низким, с overdispersion между двумя первоначального населения перед выбором < 0.01 обычно и 0,35 - 0,55 для отдельных население после выбора4. Однако, сложность некоторых из этих коммерчески доступных библиотек Y2H является довольно низким (рис. 7). Кроме того многие из клонов внутри него (~ 60%) изготовлены полностью из фрагментов кДНК, которые являются 3' кодирования региона, которая еще более ограничивает их полезность. Чтобы продемонстрировать, что выше методов вместимостью более сложные Y2H библиотеки, мы создали новую библиотеку Y2H в обтекаемый вектор плазмиды «добычу» (pGal4AD) содержит фрагменты геномной ДНК от Saccaromyces cerevisiae (штамм PLY5725). Геномной ДНК была раздроблена режа, размер выбранных для диапазонов 600-1500 bp, изменение с переходниками и вставляется в pGal4AD для создания SacCer_TAB Y2H библиотека (рис. 8). Библиотека была преобразована в PLY5725, который произвел дрожжей населения, которая затем была повязана отдельные образцы Мата PJ69-4A, перевозящих только плазмида pTEF ГПБ. Повторяющиеся диплоидных населения были выращены условиях неизбирательной и селективным. Вставок библиотека плазмида Y2H были проанализированы глубокую последовательности. При сопоставлении геномной ДНК, охватывающей 100 bp вверх и вниз по течению от каждого белка кодирования региона (84% от всего генома), мы нашли > 1,1 миллиона различных плазмид в библиотеке для общий размер библиотеки в дрожжи ~1.35 миллионов различных плазмиды. Для сравнения мы также преобразована ранее описанных дрожжи геномной Y2H библиотека11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H библиотеки) в MATalpha дрожжи и подвергается такой же анализ как указано выше. Мы обнаружили, что сложность нашей библиотеки Y2H дрожжи случайный фрагмент был гораздо выше и имел гораздо более плазмид кодирования фрагментов в кадр каждого гена чем ранее опубликованных библиотека (рис. 9). Важно отметить, что поколение первоначальной библиотеки, содержащей диплоидных населения было легко воспроизводимые с overdispersion из < 0.01 (Рисунок 10). Кроме того воспроизводимость иметь две отдельные дрожжевой популяции производят аналогичные распространяемые плазмид после выбора позитивного взаимодействия Y2H был очень хорошим, уступая overdispersion 0,3. Таким образом методы здесь разместить больше библиотек Y2H повышенной сложности, чем те, которые ранее использовались.

С точки зрения увеличения простота DEEPN, мы предпочитаем, что с использованием гена синтеза сделать вставляет кодирования для приманки протеина интереса. Это позволяет программировать регионов для доменов протеина, химер и мутантов, чтобы быть легко включены в Y2H приманку плазмид, но и позволяет их кодонов оптимизирован для выражения в S. cerevisiae. Выражение двух различных Gal4-ДНК связывающих доменов синтез белков показана на рисунке 3. Два различных дрожжей трансформантов, выражая либо две приманки синтез белков были подготовлены и подвергается SDS-PAGE и immunoblotting с антителами против myc. Примечание выражение уровни белков приманку по отношению к Gal4 ДНК-связывающих домена только с пустой вектор. Мы нашли, что это важно не только для проверки выражения приманки синтез белка, но и для проверки выражения в точное Мата дрожжи transformant колонии, которая будет использоваться для расширения и мат для библиотеки, содержащей дрожжей добычу. После того, как была обнаружена transformant, его можно заморозить его вниз и сохранить для последующего использования.

На рисунке 4 показан тест для самостоятельной активации где последовательного растворения диплоидных клетках покрыты на CSM-леи-ГТО (+ его), CSM-Trp-леи-его (-его) и CSM-Trp-леи-его + 3AT (-его + 3AT) плиты и позволено расти при 30 ° C в течение 3 дней. Желаемый результат будет наблюдать рост в присутствие, но не отсутствие гистидина независимо есть 3AT. Это позволит использовать CSM-Trp-леи-его, чтобы выбрать для дрожжей с положительных дрожжи 2-гибрид взаимодействия. Если есть рост на CSM-леи-Trp-его пластины, затем Y2H выбор можно еще получить с помощью низкие концентрации 3AT, который предотвращает рост. Мы считаем, что если рост может быть заблокирован в CSM-Trp-леи-его + 0,1 мм 3AT, DEEPN assay может затем использовать это условие для выбора для Y2H взаимодействия. Если, однако, торможение роста diploids, содержащие pGal4AD или других пустых добычу плазмиды и плазмида pTEF ГПБ приманка фьюжн требует более высоких концентраций 3AT, он поставит под угрозу производительность процедуры DEEPN и различные приманки плазмиды следует искать. Обратите внимание, что его + рост является единственным вариантом выбора для позитивного взаимодействия Y2H. Мы нашли, что это достаточно, чтобы обогатить для Y2H взаимодействия в пакете.

Одна из важнейших процедур в рабочем DEEPN является достижение высокой эффективности спаривания Мата дрожжей, неся приманки плазмида с MATalpha дрожжи, перевозящих библиотека Y2H добычу. Мы обнаружили, что некоторые штаммы (например, Y187)18, корпус коммерчески доступных кДНК библиотек, имеют сравнительно бедных спаривания эффективности. По этой причине мы инженерии штамм снести Y2H библиотек. Этот штамм основан на BY4742, производное S288c. Этот штамм не хватает GAL4, GAL80, TRP1, LEU2и HIS3. Он содержит не репортеров, которые учитывали бы гибридный белок Gal4, ни различные гибридные (например, LexA-VP16). Вместо этого источник Y2H-индуцированной His3 производство размещается в Мата штамм, который будет нести плазмида конкретной приманки. Это упрощает систему и позволяет большую гибкость в том одно может использовать те же библиотеки, содержащей MATalpha клетки к спариванию с штамм, выражая LexA приманка синтез белка и репортер LexA(UAS) -HIS3 или Gal4-DBD-приманка синтез белка и Gal4 (УАС)-HIS3 репортер.

После того, как создаются диплоидных населения, перевозящих плазмида приманки и библиотека, они разводят и позволено расти в условиях, которые просто выбрать для обоих плазмид (например, CSM-Trp-Leu) или плазмиды и позитивного взаимодействия Y2H, диски производства His3 (например, CSM-леи-Trp-его). Важно начать с большое количество начального населения избежать эволюционным «узким» что может исказить результаты после выбора для позитивного взаимодействия Y2H населения. Таким образом наша процедура определяет, с помощью 20 мл из 500 мл диплоидных населения культуры вырастись в 750 мл свежего CSM-леи-Trp-его средств массовой информации, чтобы избежать этой проблемы. С pTEF ГПБ как приманка плазмида мы обнаружили, что один раунд разрежения и роста достаточно, чтобы развиваться информативный населения. Используя различные приманки плазмид ранее, мы использовали два раунда разрежения и роста, первоначальный 20 мл 750 мл, и затем 2 мл, насыщенных культуры, разбавленных в 75 мл. Рисунок 6 показывает результаты от амплификации PCR через библиотеку вставки для диплоидных населения, выращенных под неизбирательной условий, а также первый и второй раунды последовательных разрежения и роста в селективный условие для двух различных Приманка плазмид. Обратите внимание, что без выделения, обобщенные мазок ПЦР продукции свидетельствует о сложных и относительно хорошо нормированной смесь фрагментов. После выбора что картина меняется, с некоторых видов значительно обогащая так, что можно различить отдельные полосы. Некоторой степени диапазонов типичный успешных экспериментов, проведенных до настоящего времени, однако шаблон мазка в дополнение или вместо шаблон диапазонов, свидетельствует о сложной смеси добычу вставок и является желательным, если одно хочет увеличить число кандидатов что определяет DEEPN. Очень сильный диапазонов шаблон, где большую часть продукта PCR находится в 1-3 полосы, показывает, что большинство данных последовательности будут доминировать только 1-3 добычу вставок. Один можно компенсировать это частично посвятить больше чтения из этого примера. Можно увидеть, что если население разведен и вырос далее (см. «выбранных d2» на рис. 5), чередования шаблон является более заметным, указывающее, что добычу, которую плазмид, присвоении слаб, но подлинный Y2H взаимодействия уменьшаются хотя выбрать несколько добычу плазмиды растут их изобилия. Последовательных разрежения и роста этого чрезмерного уровня считается контрпродуктивно Цель ловить наибольшее число потенциальных кандидатов и таким образом с протоколом здесь, мы рекомендуем использовать один раунд разрежения и роста.

Figure 1
Рисунок 1: схема рабочего процесса, DEEPN. В общих чертах лабораторных процедур показано на левой стороне вместе с приблизительное время, необходимое для выполнения соответствующей задачи. Справа — процесс биоинформатики с помощью пакетов программного обеспечения DEEPN и Stat_Maker. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема pTEF ГПБ. TRP1-содержащие низкая копирования Gal4 ДНК-связывающих домена синтеза белка выражение плазмида показано. К услугам гостей учредительного TEF1 промоутер, myc epitope тег, связывающий домен Gal4 ДНК последовали за сайт связывания полимеразы T7 RNA, polylinker и PRM9 Терминатор в пределах центромер (ЕКС)-на основе плазмид. Эта плазмида также несет канамицин сопротивления и бактериального происхождения ColE1 репликации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: выражение Gal4-приманка синтез белков. SDS-PAGE и immunoblotting с антителами против myc были подвергнуты лизатов из дрожжей, выражая различные приманки белки, сливается в Gal4 ДНК-связывающих домен, выраженная в pTEF ГПБ. pTEF ГПБ выражает только Gal4-ДНК bindng домен только; pTEF ГПБ bait1 выражает Gal4-ДНК bindng домена, сливается с RhoA, не имея своего сайта prenylation C-терминала и жилищного мутация блокировки в GTP-прыгните конформации; pTEF ГПБ bait2 выражает Gal4-ДНК bindng домена, сливается с RhoA, не имея своего сайта prenylation C-терминала и жилищного мутация блокировки в ВВП прыгните конформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Test. самостоятельной активации Diploids из PJ69-4A клетки, несущие указанных приманки плазмидов и PLY5725 клетки, несущие указанной хищные плазмида были поочередно разбавляется и на тарелки, CSM-леи-Trp-его тарелки и CSM CSM-леи-ГТО-леи-Trp-его + 3AT пластины и вырос на 3 дней 30 ° C. Трансформантов PJ69-4A, используемые для спаривания были первыми из каждой пары, показанный на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: спаривания эффективности Y187 против PLY5725. Спаривания реакции между PJ69-4A, содержащий TRP1-содержащие приманки вектор и Y187 или PLY5725 нося добычу плазмида была выполнена. мэм разведений были позолоченными на CSM-Trp-леи выбрать для diploids. Штамм PLY5725 показывает выше спаривания эффективности чем Y187 штамма с ~ 10 раз больше колоний производства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: ПЦР добычу библиотека вставок. ДНК был изолирован от диплоидных дрожжей, содержащий библиотеку добычу, которая была выращена неизбирательной условиях (CSM-леи-ГТО СМИ) или условия отбора для позитивного взаимодействия Y2H (CSM-леи-Trp-его СМИ). ПЦР по всей библиотеке вставляет показывает различия в репертуаре вставок выбран. Два раунда селективного роста были использованы. Первоначальный раунд рост составил путем разбавления 20 мл, 500 мл диплоидных культуры в 750 мл неизбирательной CSM-леи-ГТО СМИ и еще 20 мл 750 мл CSM-леи-Trp-его средств массовой информации для проведения первоначального раунда выработки селективного роста (d1). Это последовало дополнительный раунд роста (d2) сделал, принимая 2 мл культуры d1 и разбавления в 75 мл селективного СМИ CSM-леи-Trp-его. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: сложность кДНК библиотеки Y2H. Анализ содержания библиотек добычу cDNA Y2H коммерчески доступных мыши: Библиотека от cDNA мозга мыши, и один из нескольких тканей мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: Генерация Y2H дрожжи геномной фрагмент библиотеки. A. схема описания Ассамблея библиотеки геномной фрагмент дрожжей в pGal4AD. Геномная ДНК от штамма PLY5725 случайно стриженый, лигируют с указанной Y-адаптер и лигируют в ГИФКУ cut pGal4AD. Перешнуровок были преобразованы в бактерии доходность 2.2 x 106 независимых колоний, которые были объединены и вырос до изоляции их плазмидной ДНК составляют SacCer_TAB Y2H библиотеки. Б. LEU2-содержащих плазмида (pGal4AD) жилья transcriptional активации домена отображается Gal4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: сложность Y2H дрожжи геномные библиотеки. Геномная библиотека SacCer_TAB была преобразована в штамм PLY5725 MATalpha и PJ_C1, C2, C3, дрожжи геномная библиотека была преобразована в Υ187 ΜΑΤalpha штамма. Diploids этих групп населения были сделаны спаривания штамм PJY69-4A. Население были выращены для 10 поколений и фрагменты добычу, которую усиленный PCR были подвергнуты высокопроизводительного секвенирования и анализа. А. показывает ранга порядок чтения за каждого гена в Y2H библиотек, разделенных читает за генофонд, Секвенирование генома дрожжей. Учитывая эквивалент обилие каждого гена, каждый ген будет иметь значение 1. Б. Гистограмма указанием числа уникальных плазмид в гена, которые кодируют фрагмент, который находится как в протеине кодирования региона (ORF), так и в рамках надлежащего поступательного чтения. C. сравнение числа различных плазмид в каждой библиотеке, которые кодируют дрожжи генов и доля из них, которые являются и не являются в рамках правильное поступательное чтение или вставляются в обратном направлении. D. Участки показаны позиции и обилие перекрестков, которые сопоставляются пример генов (VPS8 и VPS16), нашел для плазмид в каждой библиотеке. Плазмид с Джин слияний, которые находятся в кадре правильное поступательное чтение обозначены синим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10: воспроизводимость DEEPN с сложными Y2H дрожжи геномные библиотеки. A. четыре различных дрожжей диплоидных населения были созданы путем спаривания с библиотекой SacCer_TAB Y2H расположен в PLY5725, выращенной в условиях, неизбирательной и виртуализации. Читает на ген для каждой популяции индивидуально строится как функция среднего ранга значения во всех групп населения. B. показывает читает за генов между двумя образцами после выбора позитивного взаимодействия Y2H. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы предоставляем руководство по как для выполнения анализов Y2H в пакете с помощью оптимизированные методы. Есть несколько критических шаги процедуры, чтобы помочь обеспечить население дрожжей, который будет находиться в разделе выбор представителя начала библиотеки и что достаточно начиная дрожжей населения используется для прохождения отбора для ограничения изменчивость . Важно отметить, что эти критерии являются относительно легко достичь вместе с адаптации методов и материалов для традиционных Y2H assay, таким образом делая этот подход доступным для большинства лабораторий, оснащенных для стандартных молекулярной биологии. DEEPN позволяет выбрать из же библиотека населения добычу при использовании различных приманки плазмид. Следовательно можно непосредственно сравнить набор взаимодействующих кандидатов, которые производят Y2H взаимодействия с одной приманкой против другой. Потому, что глубоко последовательности используется, можно проверить начальный состав библиотеки для каждого приманки конкретных дрожжей населения и самостоятельно следовать обогащения каждого кандидата добычу гена в библиотеке. Пакетная обработка позволяет запрос к библиотеке же против различных приманок полуколичественного способом, который затем позволяет вычислить статистический рейтинг4.

Существует несколько этапов в настоящем Протоколе, которые являются критическими для успеха. То, что большое количество diploids должны быть получены для обеспечения адекватного представительства библиотеки добычу Y2H смешивается с каждым приманки плазмиду интереса. Спаривания процедуру, описанную здесь была оптимизирована путем изменения нескольких параметров. Мы обнаружили, что некоторые штаммы, которые коммерческих библиотек Y2H дом Мате плохо в целом, однако, спаривания процедуру, описанную здесь может генерировать 2 х 106-7 diploids 2 x 10 при, позволяя адекватные и воспроизводимые передачи Y2H Библиотека в состав населения. Другим важным аспектом процедуры заключается в обеспечении что наживки плазмиду интереса не создание позитивного взаимодействия Y2H на свой собственный или с пустым Gal4 активации домена добычу плазмиды. Метод для выбора Y2H взаимодействие требует роста в отсутствие гистидина, которой позитивного взаимодействия Y2H индуцирует транскрипции HIS3 , чтобы клетки, чтобы быть его +. Хотя обычно традиционной Y2H анализов можно добавить конкурентный ингибитор 3AT уменьшить фоне роста или использовать другие репортеры3 , эта процедура работает лучше, когда клетки с слабой Y2H взаимодействия может расти и таким образом увеличения жесткости для роста и выбор только для ячеек с сильным Y2H взаимодействий ограничивает репертуар добычу плазмиды, которые могут быть идентифицированы. Другой важный аспект заключается в том, чтобы убедиться, что большое количество начиная диплоидных населения используется для расти в условиях избирательного и неселективной избежать эволюционной узких мест из выборки ошибка4 . После культуры томов и клеток чисел, указанные здесь поможет обеспечить воспроизводимость и уменьшить шум.

Одна из причин, по которой DEEPN подход является мощным является, что она может всесторонне следовать все плазмид в библиотеке заданного добычей для их способности взаимодействовать с приманкой интерес. Таким образом одним из ограничений DEEPN является сложность использования библиотеки. Для некоторых из коммерческих библиотек как те, которые мы использовали здесь, мы обнаружили, что количество плазмиды, которые кодируют bona fide фрагментов кДНК ORF, находятся в том же кадре чтение Gal4 активации домена находится между 3-6 x 104 с представлением ~ 6000 - 8,00 0 различных генов. Мы обнаружили, что почти 75% этих библиотек содержит фрагменты, соответствующие исключительно cDNA регионов, которые были 3' кодирования последовательности ДНК (компакт-диски/ORF). Кроме того почти треть из генов, которые имели фрагментов в библиотеке был никто, что соответствует регионов на ORF или выше по течению от ORF.

Мы сделали три другие изменения в метод DEEPN. Один является новой MATalpha штамм, который может нести «добычу» библиотеки размещаются внутри плазмида TRP1 и что товарищей, гораздо лучше, чем некоторые коммерчески доступные библиотеки, содержащей штаммов, например Y187. Это помогает обеспечить полной передачи библиотеки населения для каждого приманки интерес. Мы также сделали новый «наживки» выражение плазмида, которая отличается от ранее описанных плазмиды, которые используют копии переменной на основе 2μ позвоночника10. Здесь мы описываем низкий копия ЕКС плазмида (pTEF ГПБ) и обнаружите, что один раунд селективного роста достаточно для обогащения для взаимодействующих добычу плазмид. И наконец мы строим вектор обтекаемый «добычу» библиотека и используется для получения высокой плотности случайных фрагмент геномной Y2H библиотеки для Saccharomces cerevisiae, которые должны быть полезны в будущем для обнаружения и описания взаимодействия среди дрожжи белков. В целом улучшения материалов и инструментов биоинформатики (описанные в работе сопровождающих) делают DEEPN подход доступной, осуществимым и эффективным способом проведения всеобъемлющей и сравнительное Y2H экранов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Мы благодарим сотрудников в рамках Института генетики человека для подготовки NGS библиотеки и последовательности. Мы благодарим Эйнат Снир за ее опыт в подготовке геномная библиотека фрагментов для библиотеки плазмида Y2H здесь. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения: низ R21 EB021870-01A1 и NSF исследовательский проект Грант: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

Биохимия выпуск 136 взаимодействия протеина следующее поколение виртуализации анализа последовательностей ДНК дрожжи 2-гибрид
Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter