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Biochemistry

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Abstract

Detección de interacciones proteína-proteína usando el análisis de 2 híbrido de levadura ha sido una herramienta eficaz, pero su uso en gran parte se ha limitado al descubrimiento de interactianos de alta afinidad que se enriquecen altamente en la biblioteca de los candidatos interactúan. En un formato tradicional, el ensayo de 2-híbrido de la levadura puede producir también muchas colonias a analizar cuando se llevó a cabo en baja estrigencia donde podrían hallarse los interactianos de baja afinidad. Por otra parte, sin un interrogatorio amplio y completo de la misma biblioteca contra cebos diferentes plásmidos, no se puede lograr un análisis comparativo. Aunque algunos de estos problemas pueden abordarse utilizando bibliotecas de vestida de presa, el costo y la infraestructura necesaria para el funcionamiento de estas pantallas pueden ser prohibitivos. Como alternativa, hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de transitorios y las interacciones de proteínas estáticas dentro de una sola pantalla utilizando una estrategia denominada DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), que incorpora la secuencia de la DNA de alto rendimiento y cálculo para seguir la evolución de una población de plásmidos que codifican a socios interactúan. Aquí, describimos modificado para requisitos particulares los reactivos y protocolos que permiten una pantalla DEEPN para ejecutar fácil y rentable.

Introduction

Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros1. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., proteína de la fusión de presas) y un plásmido determinado 'cebo' compuesta por la proteína de interés fusionado a un dominio de unión a ADN (por ejemplo, el dominio de Gal4 DNA-que atan que se une a la secuencia de activación Gal4-upstream). Una de las principales ventajas del enfoque Y2H es que es relativamente fácil y barato para llevar a cabo en un laboratorio típico equipado para trabajo biológico molecular de rutina2. Sin embargo, cuando tradicionalmente se realiza, un usuario muestras de colonias individuales que surgen en la selección para una interacción positiva de Y2H. Seriamente, esto limita el número de clones 'presa' de biblioteca que puede ser examinado. Este problema se agrava cuando la abundancia de una presa particular de interacción es muy alta en relación con los demás, disminuyendo la posibilidad de detectar la interacción de plásmidos de presas de baja abundancia.

Una solución para usar el principio de Y2H en cobertura del proteoma es el uso de un enfoque con formato de matriz en una matriz que contiene plásmidos conocido presa individual puede ser interrogada digitalmente. Sin embargo, este enfoque requiere una infraestructura que no es fácilmente accesible o rentable a investigadores individuales que estén interesados en definir el interactoma de un pequeño número de proteínas o dominios3. Además, bibliotecas de presa muy complejo que pueden codificar múltiples fragmentos de proteínas interactuantes ampliaría el tamaño de tales matrices matriz tamaño práctico. Una alternativa es realizar ensayos con complejo bibliotecas en lotes y evaluar la presencia de clones interactúan mediante secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento4. Esto puede aplicarse para analizar la presencia de plásmidos de presas que se presentan en varias colonias con un típico Y2H formato enfoque en cual levadura las células vivienda un par de interacción de proteínas de fusión pueden crecer en una placa de5,6. Esta idea general se puede acentuarse para aumentar la consulta de ambos múltiples cebo y presa de componentes en el mismo tiempo7,8.

Sin embargo, muchas investigaciones requieren que un más fácil todavía centra más esfuerzo en pocos proteína 'cebos' y pueden beneficiarse más de una consulta exhaustiva y semi-cuantitativa de una sola presa complejo biblioteca. Hemos desarrollado y validado un método para llevar a cabo estudios de interacción de proteínas de gran escala usando un principio Y2H en lote formato4. Esto utiliza la tasa de expansión de un plásmido determinado presa como un proxy para la fuerza relativa de Y2H interacción9. Profundo secuenciación de los plásmidos dentro de una población sometida a un crecimiento normal o las condiciones de crecimiento selectivo produce un mapa completo de clones que producen interacciones de Y2H fuertes y débiles. El repertorio de interactianos puede ser obtenido y comparado directamente a través de múltiples plásmidos de cebo. El flujo resultante denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas) así puede utilizarse para identificar interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas, permitiendo la comparación entre una proteína y otra.

Aquí, demostramos DEEPN e introducir mejoras en los métodos de laboratorio que facilitan su uso, que se detallan en la figura 1. Las mejoras significativas incluyen:

Generación de las poblaciones de levadura presas. Uno de los requisitos clave de DEEPN está generando poblaciones de levaduras con cebo diferentes plásmidos que tienen la misma distribución de las bibliotecas de la presa de plásmido. Poblaciones de referencia equivalente de la biblioteca de plásmido de presa son esenciales para hacer comparaciones exactas entre los interactomes de diferentes cebos. Esto se logra mejor cuando un plásmido de biblioteca ya se encuentra en una población de levadura haploide y mover un plásmido determinado cebo en que la población se consigue por el apareamiento para producir un diploide. Aquí, ofrecemos a una guía clara de cómo hacer estas poblaciones usando librerías comerciales ubicados en levadura haploide. Aunque hemos encontrado métodos que generan un alto número de diploides, la eficiencia global de apareamiento de estas cepas de levadura que contiene la biblioteca comercial fue baja. Por lo tanto, construimos una nueva cepa que puede albergar bibliotecas presa que cede más diploides por reacción de acoplamiento.

Nuevo sistema de plásmidos de cebo. Muchos plásmidos actuales que expresan proteínas de la fusión de la 'carnada' compuestas de la proteína de interés y un dominio DNA-que atan son 2µ, lo que les permite ampliar su número de copia. Este número de la copia puede ser muy variable en la población y conducir a la variabilidad en la respuesta transcripcional de Y2H. Esto a su vez podría sesgar la capacidad para medir la fuerza de una interacción de proteína determinada basada en la respuesta de crecimiento de células en la selección. Esto puede ser en parte dirección mediante el uso de un plásmido de copia baja, algunos de los cuales se han descrito previamente como el pDEST32 disponible en el mercado10. Construimos un nuevo plásmido de cebo (pTEF-GBD) que produce proteínas de fusión Gal4-Unión al ADN dominio dentro de un plásmido de copia baja basada en el centrómero de TRP1 portadores del gen de resistencia Kanr que también facilita la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio de unión al ADN de Gal4.

Biblioteca de fragmento de nueva alta densidad Y2H. Había construido un nuevo plásmido a las bibliotecas de casa Y2H presa y usado para construir una biblioteca de Y2H altamente compleja hecha de esquilado al azar fragmentos de la DNA genomic de Saccharomyces cerevisiae. Análisis de la secuencia demostró que esta biblioteca tenía sobre 1 millón de diferentes elementos, mucho más complejos que descrita levadura genómica Y2H plásmido bibliotecas11. Con esta nueva biblioteca, hemos sido capaces de demostrar que el flujo de trabajo DEEPN es lo suficientemente robusto como para dar cabida a las bibliotecas del complejo con muchos plásmidos diferentes en una manera fiable y reproducible.

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Protocol

1. preparación de medios de comunicación y placas

Nota: Todas las placas deben ser mínimamente 2 días antes de comenzar el protocolo. Los medios de comunicación se pueden hacer en cualquier momento. Sin embargo, la adenina de dextrosa de peptona de extracto de levadura protegido (bYPDA) debe hacerse el día que se utilizará. Algunos medios de comunicación se realiza mediante una combinación de suplemento que contiene un nivel de adenina que es más grande que lo que se suele utilizar. Más suplementos de medios mínimos especifican adenina 10 mg/L. Suplementos con la etiqueta '+ 40Ade' especificar un total de adenina 40 mg/L.

  1. Preparar la solución de glucosa (50% w/v). Para 1 L, disolver 500 g de D-(+)-glucosa en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Ajustar el volumen a 1.000 mL de usando un cilindro graduado y un filtro a través de un filtro estéril de 0.2 μm en una botella de almacenamiento de medios estériles 1.000 mL.
  2. Preparar Extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) platos. Para 1 L, disolver 20 g de peptona y 10 g de extracto de levadura en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan hasta 960 mL de agua destilada. Vierte en un erlenmeyer de 2.000 mL y añadir 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 40 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  3. Preparar media mínima sintética completa (CSM)-placas de Trp. Para 1 L, 6,7 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan hasta 960 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 0,7 g de - Trp-se reunió con mezcla de abandono, 20 mg de metionina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 40 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  4. Preparar platos para CSM-Leu-Met. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Vierte en un cilindro graduado y llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 1,005 g de - Leu-se reunió con mezcla de abandono y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  5. Preparar platos para CSM-Leu-Trp. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 1,005 g de - Trp-Leu + mezcla de abandono 40Ade, 240 mg de adenina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  6. Preparar platos para CSM-Leu-Trp-su. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 0,975 g de - Trp-Leu-su + mezcla de abandono 40Ade, 240 mg de adenina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  7. Preparar platos para CSM-Leu-Trp-su-3AT. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 0,975 g de - Trp-Leu-su + mezcla de abandono 40Ade, 240 mg de adenina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Agitando la mezcla en 100 μl de un caldo estéril de 1 M de 3-amino-1,2,4 triazol (3AT).
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  8. Preparar platos para Kanr LB. Para 1 L, disolver 10 g de triptona, 5 g de levadura extracto y 10 g de NaCl en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, completar hasta 1.000 mL de agua destilada. Vierte en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Añadir 50 mg kanamicina y mezclar agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  9. Preparar medios YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp y CSM-Leu-Trp-su. Utilice el procedimiento arriba para las placas excepto en lugar de verter en un matraz de Erlenmeyer, vierta en una botella de almacenamiento de información de los medios de comunicación y omitir el agar.
  10. Preparar bYPDA (con YPDA). Medios YPD estériles y añadir adenina de 200 mg/L en agua destilada estéril. Ajustar el pH a 3,7 con HCl. filtro a través de un filtro estéril de 0.2 μm en un frasco estéril.
  11. Preparar el tampón de transformación: 2 M sorbitol, dihidrato de acetato de litio de 1 M, 10 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM de EDTA, cloruro de calcio 0.2 mM en agua destilada. Filtrar con un filtro de 0.2 μm estéril en una botella estéril.
  12. Preparar la solución de PEG: 70% p/v polietilenglicol 3350 en agua destilada. Esterilizar por autoclave.
  13. Preparar el molinete: 8 M urea, 4% p/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10% v/v de glicerol, 0.02% w/v bromofenol azul en estéril agua destilada.
  14. Preparar sTE (fuerte TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 en agua destilada. Filtrar con un filtro de 0.2 μm estéril en una botella estéril.
  15. Preparar la solución Zymolase: 10 mg/mL Zymolase 100T en 50 mM potasio Fosfato dibásico, pH 7.5, 50% v/v glicerol memoria estéril destilada agua (almacenado a-20 ° C).

2. clonación y verificación de plásmidos de cebo

Nota: Construcción del dominio de unión a DNA-Gal4 plásmidos. Actualmente, hay una variedad de sistemas de Y2H comercialmente disponibles y académica disponibles. DEEPN puede alojar muchos de éstos siempre que el plásmido de cebo expresando la proteína de interés unida a un dominio de unión al ADN en un TRP1-que contiene el plásmido. Otros requisitos posteriores que son la secuencia inmediatamente aguas arriba de la biblioteca presa insertar es conocido y que una interacción positiva de Y2H puede ser marcada por la producción de His3 para selección en medios que carecen de histidina. Aquí describiremos el uso de un nuevo plásmido de cebo Y2H (pTEF-DGB, figura 2), sin embargo, pueden utilizarse también otros plásmidos de cebo Y2H incluyendo pGBKT7. Para la construcción y evaluación de plásmidos de cebo, describimos el uso de pTEF-GBD. Como Nota general, recomendamos síntesis de genes para producir un marco de lectura abierto que se adhiere a la parcialidad de codón de levadura para ayudar a asegurar la buena expresión y la facilidad con la clonación. Asegúrese de que el esquema de clonación permite el cebo en el marco de la del dominio de unión al ADN de Gal4 y que cuando la clonación en el sitio 3', un codón de parada sigue la región de codificación de cebo.

  1. Preparar el vector plásmido. Plásmido pTEF-GBD permite la clonación de un fragmento de codificación de la proteína de interés 5' o 3' de la región de codificación del dominio Gal4 ADN usando un método de rapidez de montaje. Para insertar en el 5' sitio de digerir 3 μg de pTEF-GBD con NarI y EcoRI o para la inserción en el sitio 3', digestión con BamHI y XhoI para 2-4 h. Electrophorese muestra en agarosa de ADN 1% gel que contiene 0.2 - bromuro de etidio 0.5 μg/mL (EtBr) en 100 V. suprimir la corte 5.630 bp TEF-GBD y purificar mediante un kit de extracción de gel de DNA de acuerdo a las instrucciones del fabricante y cuantificar ADN por absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro12.
    Nota: Generación de insertos de codificación de cebo. Fragmentos de ADN codificación de proteínas o fragmentos de la proteína de interés pueden ser hecho mediante síntesis de genes y disponible como fragmentos uncloned. Es aconsejable que codones están optimizados para su expresión en Saccharomyces cerevisiae y herramientas online para optimización de codón son incluidos en la lista de materiales.
  2. Para inserción de 5', flanquean el fragmento de ADN que codifican un codón de inicio ATG por 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'y 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', respectivamente. 3' inserción en marco con el dominio de unión a DNA de Gal4, flanquean el fragmento codificación por 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'y 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Para la construcción del plásmido, utilice el método de rapidez de montaje según se especifica en las instrucciones del fabricante para la clonación de fragmentos en corte pTEF-GBD.
    1. Placa todo transformada de e. coli en placas de LB Kanr e incube por 16-20 h a 37 ° C. Colonias de vivienda pTEF-GBD con el relleno deseado pueden ser identificadas por amplificación por PCR con los oligonucleótidos: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' y 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' para insertar 5' y 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' y 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' por 3' insertar. Estos oligonucleótidos pueden servir también como iniciadores para la secuenciación del inserto.
    2. Plan en la preparación de > 10 μg de cada derivado de pTEF-GBD y pTEF-GBD para proporcionar material para las transformaciones de la secuencia y la levadura.
    3. Utilice las siguientes condiciones PCR: 3 minutos a 98 º C, seguido de 25 ciclos de 30 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y 2 min a 72 ° C, seguido de 5 min a 72 ° C utilizando un tampón que contiene 2,5 mM MgCl2 , U/100 de 0.5 μl ADN polimerasa y búfer de propiedad.

3. expresión de proteínas de fusión dominio Gal4-DNA-obligatorio

  1. Hacer levadura competente.
    1. Racha PJ69-4A levadura sobre una placa de YPD tomando un aplicador de madera estéril, raspar 1 mm3 de-80 º C congelados stock y frotando suavemente en toda la placa YPD. Mueva el aplicador de madera hacia abajo de la placa para que cada paso va en una parte intacta de la superficie de los medios de comunicación. Incube la placa YPD a 30 ° C durante 2 días o hasta que las colonias solo son visibles. Hacer el caldo congelado de levadura de PJ69-4A por suspensión de levadura en el agua o el crecimiento de los medios de comunicación, que complementa con DMSO al 7% y almacenamiento a-80 ° C.
    2. Inocular una colonia solo en 5 mL de cultivo de YPD en un tubo de cultivo 20 x 150 mm con un aplicador de madera estéril y crecer durante la noche a 30 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
    3. Sembrar 50 mL de YPD de 250 mL del matraz Erlenmeyer estéril con 4 mL de la cultura durante la noche de la cepa de levadura de PJ69-4A. Crecer en un incubador de agitación a 30 ° C, 200 rpm a una densidad óptica (OD600) de aproximadamente 1.2, según lo determinado por espectrofotometría con una trayectoria de la luz estándar de 1 cm. Crecimiento toma generalmente 5-7 h.
    4. Aislar la levadura por sedimentación en 50 mL de tubo cónico a 4.696 x g durante 5 min a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Eliminar el sobrenadante por el dumping en residuos líquidos. Usando una pipeta, Resuspender el precipitado en 5 mL de tampón de transformación y transferencia a 15 mL de tubo cónico. Resediment y descartar el sobrenadante, Resuspender la levadura en 1 mL de volumen final de solución tampón de transformación con una pipeta de 1000 μl.
    5. Incube las células de levadura durante 60 min a 30 ° C y agitación a 200 rpm y coloque en hielo durante 30-90 minutos.
  2. Transformación del plásmido de levadura.
    1. En 1,5 mL de tubo de microcentrífuga estéril, añadir 1 μg de plásmido pTEF basados en GBD y 5 μl de portador de esperma de salmón de 10 mg/mL solución de ADN. También incluyen un tubo que contiene sólo el esperma de salmón portador ADN como control negativo de la transformación. Añada 100 μl de la suspensión de células de levadura helada a cada tubo con una pipeta. Añada 100 μl del 70% de solución de PEG con una pipeta de 1000 μl y mezcla suavemente por sacudiendo el tubo de 5 - 10 veces (no agitar con vortex).
    2. Incubar a 30 ° C, en un incubador de agitación a 200 rpm durante 45 minutos.
    3. Choque térmico a 42 ° C durante 15 minutos.
    4. Sedimento en una microcentrífuga a 845 x g durante 3 min a temperatura ambiente, pipeta de descartar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en 150 μL de agua estéril mediante pipeteo arriba y abajo y extender por la superficie de una placa de CSM-Trp.
    5. Coloque las placas de la derecha arriba en incubadora de 30 ° C e incubar durante 2-3 días hasta que las colonias sean visibles. Las placas pueden ser al revés para evitar la condensación en la superficie de la placa después de incubación a 30 ° C durante 6-12 h.
    6. Tomar 2-3 colonias por transformación y raya como un parche en un plato de CSM-Trp usando un palillo de dientes estéril. Permiten para crecer durante 24 h a 30 ° C.
  3. Asegúrese de lisados de expresión de la proteína.
    1. Inocular 3 mL de medio líquido CSM-Trp con un partido--tamaño de la cabeza de la levadura del parche y crecer durante la noche a 30 ° C en un tubo de cultivo 20 x 150 mm, mientras que la agitación a 200 rpm. Hacer dos culturas durante la noche por vector vacío pTEF-DGB y el cebo.
    2. Añadir 1 mL de YPD a cada 3 mL de cultura noche CSM-Trp. Crecer por 1 h a 30 ° C, agitando a 200 rpm. Compruebe el OD de las células por el espectrofotómetro.
    3. Sedimento un número equivalente de células, normalizar según el OD. Utilizar 1,5 mL estéril de los tubos de microcentrífuga con un giro de 5 min a 2.348 x g a temperatura ambiente en una microcentrífuga. Utilice una pipeta para descartar el sobrenadante. La acción final corresponde a un mínimo de 2,1 OD.
      Nota: Al calcular el número equivalente de células, puede ocurrir que diferentes volúmenes puede requeridos de cada cultura durante la noche para lograr la mínima do 2.1.
    4. Resuspender el precipitado en 450 μl de 0.2 M NaOH por pipeteo arriba y abajo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar las células por 2 min a 2.348 x g a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.
    5. Resuspender el precipitado con 50 μl de tampón de molinete mediante pipeteo arriba y abajo con cuidado para no hacer burbujas. Muestra de calor durante 5 minutos a 70 ° C.
  4. Si hay expresión de proteínas por SDS-PAGE.
    1. Uso un gel del gradiente de 4-20% para una amplia gama de pesos moleculares se puede resolver. Cantidad equivalente de carga (mismo OD) de muestras en un SDS-PAGE gel y asegúrese de incluir por lo menos una muestra que contiene el pTEF-GBD sin modificar vector13,14,15.
    2. Después de la separación electroforética, transferir el gel a nitrocelulosa y immunoblot usando anticuerpos monoclonales o policlonales anti-myc y la solución de detección ECL (figura 3).

4. uno mismo-activación prueba

  1. Raya la levadura de MATalpha de los valores de-80 ° C correspondiente a la tensión de la vivienda la biblioteca presa de interés sobre una placa de YPD tomando un aplicador de madera estéril, raspar una pequeña cantidad de levadura en el frasco y rayones en la placa YPD. Incube la placa YPD a 30 ° C durante 2 días o hasta que las colonias solo son visibles. Parche un par solo colonias en una placa de YPD e incubar durante una noche a 30 ° C.
    Nota: La nueva cepa se convirtió aquí a la biblioteca de casa presa es PLY5725 mientras que algunas bibliotecas compatibles de Y2H comercialmente disponibles se encuentran en Y187.
  2. Siga los procedimientos en 3.3.1 - 3.3.4 PLY5725 con LEU2de transformar-basado en el plásmido utilizado para albergar la biblioteca de la presa deseada. Para las bibliotecas se convirtió aquí, el plásmido correspondiente es pGal4AD (pPL6343). Recuperar levaduras transformantes, placa placas CSM-Leu-Met. Después de las colonias se presentan, racha como parches en un plato CSM-Leu-Met e incubar durante 24 h a 30 ° C.
  3. Seguir el protocolo en 3.4 para confirmar la expresión de pPL6343 vector vacío utilizando-HA anticuerpos monoclonales o policlonales y la solución de detección ECL.
  4. Raya de la levadura de PJ69-4A transformada en un patrón cruzado con PLY5725 construye en una placa YPD que fue confirmada a expresar la proteína en protocolo sección 3.4 y 4.3 e incubar a 30 ° C durante la noche. Tomar 1 mm3 de las células donde las dos cepas han crecido juntos y parche en separar CSM-Leu-Met, CSM-Trp y placas CSM-Trp-Leu y crecer 24 h.
    Nota: Diploides deseadas crecerá en las placas de CSM-Trp-Leu. En CSM-Leu-Met y Trp CSM placas sirven como control positivo para el crecimiento de la levadura.
  5. Crecer diploides en 1 mL de medio de Leu-Trp-CSM durante la noche a 30 ° C. Las células de 500 μl de sedimento de 1,5 mL de microcentrífuga tubo a 2.348 x g, 3 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Resuspender las células en 1 mL de agua estéril y repetir la sedimentación y resuspensión. Compruebe el OD600 de las células.
  6. Realizar una serie de 1:10 diluciones seriadas de cada suspensión celular utilizando agua estéril con la puesta en marcha más concentrada la solución de cada uno a un OD de 0.5. Punto 5 μl de cada dilución en una placa de CSM-Leu-Trp, un CSM-Leu-Trp-su plato y un CSM-Leu-Trp-su + placa 3AT. Incubar a 30 ° C y examinar para el crecimiento diario durante 3 días (figura 4).
    Nota: para la 1:10 dilución seriada, Pipetear 10 μl del tubo que contiene un OD 0.5 en 90 μl de agua y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Continuar haciendo 1:10 diluciones seriadas hasta que hay un total de seis diferentes concentraciones a punto.

5. crear poblaciones de levaduras con cebo y presa biblioteca

Nota: La cepa Y187 que contiene plásmidos de biblioteca comercial de la presa no mate bien. Por lo tanto, las siguientes condiciones optimizadas están obligadas a mantener la complejidad de la biblioteca. La PLY5725 cepa que contiene Y2H presa bibliotecas compañeros mejor y el mismo procedimiento de acoplamiento puede utilizarse con esta cepa (figura 5).

  1. Inocular 3 mL de las culturas de cada uno de los transformantes PJ69-4A llevar los diversos TRP1-que contiene el plásmido de cebo de pTEF-GBD en medios CSM-Trp en un tubo de cultivo. Son dos culturas distintas que contienen el plásmido vector de pTEF-GBD para servir como controles de procedimiento. Incubar los cultivos a 30 º C, 200 rpm por 6 h y luego diluir en 25 mL de cultivo en un matraz de Erlenmeyer estéril para el crecimiento durante la noche.
  2. Descongelar un vial de congelados (-80 ° C) de las células de MATalpha que contiene el LEU2-llevar "presa" biblioteca a temperatura ambiente. Inocular una 125 mL de medio de CSM-Leu-Met en un erlenmeyer estéril con el frasco completamente descongelado. Crecen todas las culturas durante la noche a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
    Nota: OD600 de las culturas durante la noche debe oscilar entre 1.0 a 1.5 antes de proceder a los pasos a seguir.
  3. De centrífuga 21 OD equivalentes a cada una de las culturas de la planta de PJ69-4A con una vuelta de 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente. Por cada 10 reacciones de acoplamiento deseado, pellets 39 OD600 equivalentes de la cepa de MATalpha con la plásmidos de biblioteca en separado 50 mL de tubos cónicos.
    1. Resuspender las células en 10 mL de agua estéril y volver a la pelotilla en nuevo 50 mL de tubo cónico 4.696 x g 5 min a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Usando una pipeta, quite con cuidado el sobrenadante sin alterar las células alimentos peleteadas.
    2. Resuspender el pellet de células PJ69-4A en 4 mL de y PLY5725 células en 10 mL de bYPDA (pH 3,7).
  4. Al ajuste del acoplamiento de reacciones, añadir 1 mL de PJ69-4A transformado células, 1 mL de células que contiene la biblioteca de MATalpha y 1 mL de bYPDA pH 3,7 a nuevo 50 mL de tubo cónico. Incubar a 30 ° C con agitación orbital suave (100-130 rpm) durante 90 minutos.
    1. Centrifugar las células durante 5 min a 4.696 x g, a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Quite el sobrenadante con una pipeta y resuspender el precipitado en 2 mL de 1:1 bYPDA:YPD. Todos a 2 mL de en un plato YPD 100 mm de la placa con una pipeta e incubar a 30 ° C por aproximadamente 20 h.
  5. Cosechar las células de las placas YPD usando un raspador celular para desalojar a las células en 2-3 mL de medio de CSM-Leu-Trp. Pipetear las células desalojadas en 50 mL de tubo cónico. Enjuague las placas de 4 - 5 veces con 2-3 mL de medio de CSM-Leu-Trp por pipeteo hasta los medios de comunicación utilizando un 1000 μl de pipeta y expulsar suavemente los medios de comunicación a través de la superficie de la placa YPD.
    1. Centrifugar las células durante 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Descartar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células en 40 mL de medio de CSM-Leu-Trp mediante pipeteo arriba y abajo (do no agitar con vortex).
  6. Para estimar el número de células diploides formadas, diluir 4 μL de la mezcla diploide en medios de CSM-Trp-Leu de 2000 μl y 200 μl. Placa de 200 μL de cada dilución en una placa de CSM-Leu-Trp.
    Nota: Las dos placas representan un 1: 10,000 y 1: 100.000 veces la dilución de las acciones de diploides cosechadas y rendimiento un esperado ~ 9.000-27.000 colonias en la placa de la dilución de 1: 10,000 después de incubación a 30 ° C para h. 36-40 placas de verificación después de paso 5.7. Un número mínimo de 200 colonias en la placa de la dilución de 1: 10,000 es necesaria para proceder al paso 5.8
  7. Inmediatamente tome el resto de cada 40 mL de resuspensión de células e inocular 1.000 mL del matraz Erlenmeyer de 500 mL de medio de CSM-Leu-Trp. Tomar una de OD inicial600. Incube los frascos a 30 ° C con agitación a 180 rpm hasta llegar a saturación (~2.0 OD/mL). Esto normalmente toma aproximadamente 36-40 h. crecimiento de Monitor en 24 h entonces otra vez en 36 h por OD600.
  8. Mediante una pipeta, retire 20 mL de alícuotas de cada uno de lo 500 mL saturado de culturas y de inocular 2.000 mL de matraces de Erlenmeyer, uno que contiene 750 mL de medio CSM-Leu-Trp y lo 750 mL que contienen segunda de CSM-Leu-Trp-su con el nivel más bajo de 3Por que elimina el fondo (previamente determinada en la sección 4.5). Las nuevas culturas (770 mL) agitando bien la mezcla y tome una de OD inicial600.
  9. Incubar los cultivos a 30 º C agitando a 180 rpm hasta llegar a la saturación, que normalmente ocurre dentro de 24 h para la cultura de CSM-Leu-Trp no seleccionada y puede tomar más de 70 h de las culturas en la selección para las interacciones Y2H.
  10. Una vez que las culturas han llegado a saturación (OD ~ 2.0), quitar 11 mL de la pipeta, sedimento las células con una vuelta de 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente, descartar el sobrenadante con una pipeta y congelar a-20 ° C o continuar por la extracción de ADN. Las muestras seleccionadas y no seleccionadas tanto se utilizará para secuenciación profunda.

6. preparación para secuenciación profunda DEEPN

  1. Extracción de ADN.
    1. Utilice una pipeta para resuspender gránulos celulares de protocolo sección 5.7 en 500 μl de tampón de sTE y de transferencia a 1,5 mL de tubo de microcentrífuga. Agregar 3 μl de betamercaptoethanol y 10 μl del stock de Zymolase. Mezclar bien e incubar en la incubadora de 37 ° C durante 24-36 h.
    2. Extracto de la muestra dos veces con alcohol de fenol/cloroformo/isoamílico 500 μl durante el uso de una campana de humo16.
    3. Añadir 7 μl de 4 M NaCl, 900 μl de helado 100% de etanol (ETOH), mezclar por inversión y o congelación-20 ° C o seguir al sedimento del ADN por giro a 21.130 x g por 10 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga.
    4. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Lavar el precipitado tres veces con 900 μl de 70% ETOH.
    5. Sedimento, pellets 21.130 x g durante 2 min y retire residual lavado ETOH pipeta. Pelotilla seca durante 7 min a 42 ° C.
    6. Resuspender el precipitado en 120 μl de 0,1 x sTE en un baño de agua de 37 ° C durante 90 minutos, los tubos para mezclar cada 30 minutos de la película.
    7. Pipetee 60 μL de ADN extraído en una estéril 1.5 mL de tubo de microcentrífuga. Añadir 120 μl de sTE, 3,5 μl del stock de Rnasa A, flick para mezclar e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    8. Precipitado de etanol, como se ha hecho en la sección 6.1.3 - 6.1.5, pero usar 7 μl de acetato de amonio de 5 M en lugar de 4 M NaCl.
    9. Resuspender Rnasa tratados con A DNA en 55 μl de 0,1 x sTE en un baño de agua de 37 ° C durante 90 minutos, película de los tubos para mezclar cada 30 minutos cuantificar ADN por absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro.
  2. Insertos de cDNA PCR.
    1. Realizar dos reacciones de PCR de 50 μL por cada muestra de ADN. Cada reacción contiene 25 pmol de cada primer avance y retroceso que empareja el plásmido presa-biblioteca (ver materiales). Las reacciones también contienen 25 μl de alta fidelidad 2 x PCR Master Mix, 5 μg de muestra de ADN y agua hasta 50 μl. amplificar las reacciones para 25 ciclos con tiempos de extensión de 3 min a 72 ° C, una temperatura Recueza de 55 ° C por 30 s y desnaturalizar a 98 ° C por 10 Precede s. ciclismo por una desnaturalización s 30 a 98 ° C y seguir con una incubación de 5 min a 72 ° C.
    2. Analizar 4 μL de cada reacción de PCR por electroforesis del gel de la agarosa del ADN del 1% con la agarosa de la DNA del gel que contiene de 0.2 - 0.5 μg/mL de EtBr17. Para ver la muestra de ADN por transiluminación UV. Muestras muestra un frotis de la DNA alrededor de 1-3 kb, donde el patrón de bandas puede encontrarse muestras donde una interacción Y2H fue seleccionado (figura 6).
    3. Combinar las muestras duplicadas de PCR y purificar mediante el kit de purificación PCR de acuerdo a las instrucciones del fabricante y cuantificar ADN por absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro.

7. profunda secuenciación

Nota: Preparación de la muestra y la secuencia en una plataforma de secuenciación profunda está típicamente disponible en comerciales y académicas instalaciones de base de la secuencia de ADN.

  1. Corte 600 ng del producto de PCR utilizando un alto rendimiento ultra-sonicador fragmentos de una longitud media de ~ 300 bp.
  2. Generar bibliotecas de secuenciación indexadas utilizando un kit de preparación para la secuencia profunda que añade a enlazadores codificación de códigos de barras, cebado de sitios, y capturar secuencias de forma asimétrica en los extremos de los fragmentos de ADN.
  3. Realizar la preparación de la biblioteca según las instrucciones del fabricante. Piscina indexadas bibliotecas y secuencia como Lee largo extremo apareado en una plataforma de secuenciación profunda (por ejemplo, 2 x 150 bp PE lecturas). El número de lecturas para cada muestra es entre 10 y 40 millones, con más lecturas para las poblaciones no seleccionadas que son típicamente más complejas. Le recomendamos que lee por lo menos 20 millones o más para las poblaciones no seleccionadas.

8. bioinformática procesamiento y verificación

  1. Secuencia de datos en el formulario de fastq con un conjunto de software independiente programas para (1) mapa de secuencia de leer archivos en un formato universal de SAM (2) cuantificar de la DNA del proceso enriquecimiento del gene entre conjuntos de datos (3) realizar análisis estadístico de datos en orden a clasificar cuál candidato genes son positivas para Y2H interacción (4) proporcionan información en cuanto a qué regiones y qué estructura traslacional cada del cDNA presa por gene fragmentos que rendimiento Y2H positivo están compuesto por las interacciones y (5) proporcionar herramientas para reconstruir no sólo el 5' sino también el extremo 3' de los fragmentos de interacción que permiten su reconstrucción y verificación en un formato tradicional de Y2H. Operación de estos programas se detalla en el estudio de acompañamiento.

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Representative Results

El ensayo de Y2H ha sido ampliamente utilizado para la búsqueda de las interacciones proteína: proteína y se han desarrollado varias adaptaciones y sistemas. En su mayor parte, las mismas consideraciones que ayudan a asegurar el éxito con estos métodos anteriores son importantes para DEEPN. Algunos de los puntos de referencia importantes son: garantizar la expresión de dominio DNA-obligatorio proteínas de fusión, asegurando un bajo fondo de falso crecimiento su + en los diploides que contiene el cebo de interés con un plásmido de presa vacía, una alta eficiencia de acoplamiento del cebo MATalpha que contengan levadura MATA con la biblioteca que contiene la levadura, y finalmente, rigor bajo condiciones que permiten a la población a crecer bajo condiciones que seleccione para muchas reacciones positivas de Y2H, incluso los producen bajos niveles de actividad His3 y un débil Respuesta transcripcional de Y2H.

Uno de los aspectos críticos del DEEPN es la biblioteca de Y2H reproducible introducir cepas que contienen plásmidos diferentes cebos y confiablemente seleccionar las poblaciones de los plásmidos de biblioteca que crean interacciones positivas Y2H. Esto se hace más difícil cuando la complejidad de la biblioteca de Y2H aumenta ya que es más difícil de garantizar la adecuada transferencia de toda la biblioteca a través de diferentes poblaciones iniciales. Además, el tamaño de la población escogido para crecer bajo condiciones de selección y profundidad de la secuencia debe ser lo suficientemente grande como para observar los cambios reproducibles en la composición de plásmido Y2H confiablemente identificar interacciones de Y2H positivo verdadero. En estudios anteriores, hemos utilizado comercialmente disponibles bibliotecas de cDNA de Y2H. Encontramos que la variabilidad en la distribución de la biblioteca de Y2H entre poblaciones separadas con el mismo cebo plásmidos es baja, con una sobredispersión entre las dos poblaciones iniciales antes selección de < 0,01 normalmente y 0.35 - 0.55 por separado poblaciones después de selección4. Sin embargo, la complejidad de algunas de estas bibliotecas Y2H comercialmente disponibles es muy baja (figura 7). Además, muchos de los clones dentro de ella (~ 60%) están hechos enteramente de los fragmentos de ADNc que son 3' de la región de la codificación, que limita aún más su utilidad. Para demostrar que los métodos anteriores fueron capaces de acomodar más complejo Y2H bibliotecas, creamos una nueva biblioteca de Y2H en el vector del plásmido aerodinámico 'presa' (pGal4AD) que contiene fragmentos de la DNA genomic de Saccaromyces cerevisiae (cepa PLY5725). La DNA de Genomic fue fragmentada por corte, tamaño seleccionado para los rangos de 600-1500 bp, modificada con adaptadores e inserta en pGal4AD para crear la biblioteca SacCer_TAB Y2H (figura 8). La biblioteca se transformó en PLY5725, que produjo una población de levadura que luego fue acoplada para separar muestras de PJ69-4A MATA con el plásmido de pTEF-GBD solo. Las poblaciones diploides duplicadas fueron cultivadas bajo condiciones no selectivo y selectivo. Los insertos de biblioteca Y2H plásmido se analizaron por secuenciación profunda. Cuando asigna a la DNA de genomic que abarca 100 bp aguas arriba y aguas abajo de cada región (84% de todo el genoma), la codificación de la proteína se encontraron > 1,1 millones plásmidos diferentes en la biblioteca para un tamaño total estimado de la biblioteca en la levadura de ~1.35 millones de diferentes plásmidos. Como comparación, también transformó una levadura previamente descritos genómica Y2H biblioteca11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H biblioteca) en la levadura de MATalpha y había sometido al análisis del mismo que el anterior. Encontramos que la complejidad de nuestra biblioteca de Y2H fragmento aleatorio levadura era mucho mayor y tenía más plásmidos codifican fragmentos en el marco de cada gen de la biblioteca publicada previamente (figura 9). Lo importante es la generación de biblioteca inicial que contiene las poblaciones diploides era muy reproducible con una sobredispersión de < 0,01 (figura 10). Por otra parte, la reproducibilidad de las dos poblaciones de levadura aparte de tener producen redistribuciones similares de plásmidos después de seleccionar para las interacciones positivas de Y2H fue muy buena, que rinde una sobredispersión de 0,3. Por lo tanto, los métodos aquí acomodan más grandes bibliotecas de Y2H de mayor complejidad que los anteriormente utilizados.

En términos de aumento de la facilidad de DEEPN, preferimos usando la síntesis del gen para hacer inserciones de codificación para la proteína cebo del interés. Esto permite codificación regiones para dominios de la proteína, quimeras y mutantes para fácilmente incorporar Y2H cebo plásmidos, pero también permite que los codones que se optimizará para la expresión en S. cerevisiae. Expresión dos diferentes Gal4-Unión al ADN dominio de proteínas de fusión se demuestra en la figura 3. Dos transformantes de levadura diferente expresión de dos proteínas de fusión de cebo fueron preparadas y sometidas y SDS-PAGE immunoblotting con anticuerpos anti-myc. Tenga en cuenta los niveles de expresión de proteínas cebo en relación con el dominio de Gal4 DNA-que atan solamente del vector vacío. Encontramos que es importante no sólo para comprobar la expresión de la proteína de fusión del cebo, sino también para verificar la expresión en la exacta Colonia de planta de levadura MATA que se utilizarán para ampliar y mate a la levadura que contiene la biblioteca de la presa. Una vez que se ha identificado una planta, es posible congelar abajo y almacenar para uso posterior.

La figura 4 muestra una prueba para uno mismo-activación donde se platean una dilución seriada de las células diploides en CSM-Leu-Trp (+ su), CSM-Trp-Leu-su (-su) y CSM-Trp-Leu-su + 3Por (-su + 3AT) placas y permitió para crecer a 30 ° C durante 3 días. El resultado deseado es observar crecimiento en la presencia pero no ausencia de histidina independientemente de si hay 3AT. Esto permitirá el uso de CSM-Trp-Leu-su para seleccionar para la levadura con una interacción de 2 híbrido de levadura positivos. Si hay crecimiento en las placas de CSM-Leu-Trp-su, entonces una selección de Y2H puede todavía obtenerse usando la menor concentración de 3AT que evita el crecimiento. Nos encontramos con que si el crecimiento se puede bloquear en 3Por CSM-Trp-Leu-su + 0,1 mM, el ensayo DEEPN puede proceder usando esta condición para seleccionar las interacciones Y2H. Si, sin embargo, la inhibición del crecimiento de diploides que contiene pGal4AD u otro plásmido presa vacía y el plásmido de pTEF-GBD-bait fusion requiere concentraciones más altas de 3AT, comprometerá el rendimiento del procedimiento DEEPN y un plásmido de cebo diferente se debe buscar. Tenga en cuenta que su + crecimiento es la única selección para una interacción positiva de Y2H. Hemos encontrado que esto es suficiente para enriquecer las interacciones Y2H en lote.

Uno de los procedimientos más importantes en el flujo de trabajo DEEPN es lograr alta eficiencia de acoplamiento de la levadura MATA con el plásmido de cebo con la levadura de MATalpha llevar la biblioteca presa de Y2H. Encontró que algunas cepas (por ejemplo, Y187)18, bibliotecas de cDNA disponible en el mercado de la vivienda, tienen eficacia de acoplamiento relativamente pobre. Por esa razón, hemos diseñado una cepa para llevar bibliotecas Y2H. Esta variedad se basa en BY4742, un derivado de S288c. Esta cepa carece de GAL4, GAL80, TRP1, LEU2y HIS3. Contiene no hay reporteros que respondan a una proteína de Gal4 híbrido ni un híbrido diferente (por ejemplo, LexA-VP16). En cambio, la fuente de producción inducida de Y2H His3 ocupa dentro de la variedad MATA que llevaría el plásmido determinado cebo. Esto simplifica el sistema y permite una mayor flexibilidad en la que uno puede usar las misma biblioteca-células que contienen MATalpha para aparearse con una cepa expresando una proteína de fusión de cebo LexA y un reportero de LexA(UAS) -HIS3 o una proteína de fusión de Gal4-DBD-cebo y un Gal4 (UAS)-HIS3 reportero.

Una vez que se generan las poblaciones diploides con un plásmido de cebo y la biblioteca, son diluidos y permite crecer en condiciones que sólo tienes que seleccionar para ambos plásmidos (p. ej., Leu-Trp-CSM) o de plásmidos y una interacción positiva de Y2H que unidades de producción de His3 (p. ej., CSM-Leu-Trp-su). Es importante comenzar con una gran cantidad de la población inicial para evitar una evolución 'embotellamiento' puede sesgar la población que resulta después de la selección para una interacción positiva de Y2H. Así, nuestro procedimiento especifica utilizando 20 mL de 500 mL de la cultura de la población diploide para cultivarse en 750 mL de dulce CSM-Leu-Trp-su medio para evitar este problema. Con el pTEF-DGB como el plásmido de cebo, se encontró que una sola ronda de dilución y crecimiento fue suficiente para evolucionar una población informativa. Utilizando plásmidos diferentes cebo previamente, hemos utilizado dos rondas de dilución y crecimiento, 20 mL inicial de en 750 mL, y luego 2 mL de eso saturado cultura diluida en 75 mL. La figura 6 muestra los resultados de la amplificación por PCR a través de las inserciones de la biblioteca para la población diploide cultivado bajo condiciones no-selectivo, así como una primera y segunda ronda sucesiva de dilución y crecimiento en condiciones selectivas para dos diferentes cebo de plásmidos. Tenga en cuenta que no hay selección, es indicativo de una mezcla compleja y relativamente bien normalizada de fragmentos de un borrón de transferencia generalizada de productos de la PCR. En la selección, ese patrón cambia, con algunas especies enriqueciendo grandemente por lo que se observan bandas individuales. Cierto grado de bandas es típica de los experimentos exitosos realizados hasta ahora, sin embargo un patrón de frotis además o en lugar de un patrón de bandas, es indicativo de una mezcla compleja de partes movibles de la presa y es deseable si quiere maximizar el número de candidatos que detecta DEEPN. Patrón de bandas muy fuerte, donde la mayoría de los productos PCR se encuentra en bandas de 1-3, indica que la mayoría de los datos de la secuencia estará dominada por solamente 1-3 inserciones de presa. Uno puede compensar esto en parte dedicándole más lecturas de esta muestra. Uno puede ver que si la población diluida y crecida más (véase 'd2 seleccionado' en la figura 5), el patrón de bandas es más prominente, indicando eso Presa plásmidos confieren débiles pero auténtico Y2H interacciones están siendo disminuidas mientras unos pocos se aprovechan plásmidos están aumentando su abundancia. Sucesiva dilución y crecimiento a este nivel excesivo se considera contraproducente para el objetivo de capturar el mayor número de candidatos potenciales y así con el protocolo aquí, recomendamos utilizar una ronda de dilución y crecimiento.

Figure 1
Figura 1: esquema de flujo de trabajo DEEPN. Generalidades de los procedimientos de laboratorio se muestran a la izquierda junto con el tiempo aproximado necesario para completar la tarea correspondiente. A la derecha es el flujo de trabajo de bioinformática utilizando los paquetes de software DEEPN y Stat_Maker. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de pTEF-GBD. La TRP1-que contiene el plásmido de expresión de copia baja Gal4 ADN dominio fusion proteína se muestra. Cuenta con un promotor constitutivo de TEF1 , etiqueta del epítopo de myc, el dominio de unión a DNA de Gal4 siguió un sitio de unión de T7 ARN polimerasa polylinker y terminator PRM9 dentro de un centrómero (CEN)-basado en el plásmido. Este plásmido también lleva resistencia a la kanamicina y el origen bacteriano de ColE1 de replicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: expresión de proteínas de fusión Gal4-cebo. Fueron objeto de lisados de expresión de proteínas de diferentes cebos fusionadas al dominio Gal4 ADN expresado en pTEF-GBD de levadura y SDS-PAGE immunoblotting con anticuerpos anti-myc. GBD pTEF expresa sólo el dominio de Gal4-ADN-bindng solo; pTEF-GBD-bait1 expresa el dominio de Gal4-ADN-bindng unido a un RhoA carentes de su sitio de Prenilación C-terminal y una mutación de bloqueo en una conformación de GTP-limite; la vivienda pTEF-GBD-bait2 expresa el dominio de Gal4-ADN-bindng unido a un RhoA carentes de su sitio de Prenilación C-terminal y una mutación de bloqueo en una conformación del PIB-limitan la vivienda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: test de la uno mismo-activación Diploides de las células PJ69-4A llevar la carnada indicada plásmidos y PLY5725 las células con el plásmido de la indicada presa en serie diluidos y manchados en las placas, placas CSM-Leu-Trp-su y CSM CSM-Leu-Trp-Leu-Trp-su + 3Por placas y crecido durante 3 días a 30 ° C. Los transformantes PJ69-4A usados para el apareamiento fueron los primeros de cada par que se muestra en la figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: acoplamiento eficiencia de Y187 vs. PLY5725. La reacción de acoplamiento entre PJ69-4A que contiene un TRP1-que contienen cebo vector y Y187 o PLY5725 que lleva presa plásmido fue realizada. diluciones de 1: 10,000 fueron plateadas en CSM-Trp-Leu seleccionar para diploides. La cepa de PLY5725 muestra una mayor eficiencia de acoplamiento que la cepa Y187 con ~ 10 veces más colonias producidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: PCR de presa biblioteca insertos. ADN fue aislado de la levadura diploide que contiene una biblioteca de presa que fue cultivada bajo condiciones no selectivo (CSM-Leu-Trp media) o condiciones de selección para una interacción positiva de Y2H (CSM-Leu-Trp-su media). PCR a través de la biblioteca inserta revela diferencias en el repertorio de insertos seleccionadas. Se utilizaron dos rondas de crecimiento selectivo. Una ronda inicial de crecimiento hecho diluyendo 20 mL de 500 mL de cultivo diploide en 750 mL de medios no selectivos de CSM-Leu-Trp y otros 20 mL de en 750 mL de CSM-Leu-Trp-sus medios de comunicación para una ronda inicial de crecimiento selectivo (d1). Esto fue seguida por una ronda adicional de crecimiento (d2) por tomar 2 mL del cultivo d1 y diluir en 75 mL de medios selectivos CSM-Leu-Trp-su. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: complejidad de la biblioteca del cDNA Y2H. Análisis del contenido de una biblioteca de presa de cDNA Y2H ratón comercialmente disponibles: una biblioteca de cDNA de cerebro de ratón y uno de varios tejidos de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: generación de Y2H biblioteca de fragmento genomic de la levadura. A. Asamblea describiendo esquemática de la biblioteca de fragmento genomic de levadura en pGal4AD. ADN genómico de cepa PLY5725 al azar esquilada, ligada con los adaptadores indicados de Y y ligarse en SfiI-corte pGal4AD. Trompas se transformaron en bacterias a rendimiento 2.2 x 106 colonias independientes que fueron combinadas y crecidas antes del aislamiento de su ADN para formar la biblioteca de SacCer_TAB Y2H plásmido. B. la LEU2-que contiene el plásmido (pGal4AD) vivienda Gal4 se muestra dominio de activación transcripcional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: complejidad de la biblioteca genómica de levaduras Y2H. La biblioteca genómica de SacCer_TAB se transformó en la cepa de PLY5725 MATalpha y PJ_C1, C2, C3 biblioteca genómica de levadura transformada en la cepa de ΜΑΤalpha de Υ187. Diploides de estas poblaciones fueron hechas por el apareamiento a la cepa PJY69-4A. Las poblaciones fueron cultivadas durante 10 generaciones y presa de fragmentos amplificado de PCR fueron sometidos a análisis y secuenciación de alto rendimiento. A. muestra el orden de lecturas por cada gen en las bibliotecas de Y2H divididas por las lecturas por gene encontrado por secuenciar el genoma de la levadura. Dada la abundancia equivalente de cada gen, cada gen tendría un valor de 1. B. histograma que muestra el número de plásmidos únicos por genes que codifican un fragmento en la proteína codificación región (ORF) y en el marco de lectura aplicada adecuada. C. comparación de la cantidad de plásmidos diferentes en cada biblioteca que codifican genes de la levadura y la proporción de éstos que son y no son en el marco de lectura aplicada correcta o se insertó al revés. D. Parcelas mostrando posiciones y abundancia de las ensambladuras que genes de ejemplo (VPS8 y VPS16) encontró para la plásmidos en cada biblioteca. Plásmidos con fusiones de genes que se encuentran en el marco de lectura aplicada correcta se señalan azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: reproducibilidad de DEEPN con biblioteca genómica de complejo Y2H levadura. A. cuatro poblaciones diploides diferentes levaduras fueron creadas por el apareamiento con la biblioteca de Y2H SacCer_TAB ubicado en PLY5725, cultivados bajo condiciones no-selectivo y secuenciado. Las lecturas por gene para cada población individualmente se grafica en función del valor de orden de rango medio en todas las poblaciones. B. muestra las lecturas por gene entre dos muestras después de la selección para las interacciones positivas de Y2H. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí ofrecemos a una guía de cómo llevar a cabo ensayos de Y2H en lote usando métodos optimizados. Hay algunos pasos críticos en el procedimiento para garantizar que la población de levaduras que se colocaba en la selección es representante de la biblioteca de partida y que suficiente de la población a partir de la levadura se utiliza para someterse a la selección para limitar la variabilidad . Lo importante, estos criterios son relativamente fáciles de lograr junto a adaptar los métodos y materiales para un ensayo de Y2H tradicional, por lo que este enfoque accesible a la mayoría de los laboratorios para biología molecular estándar. DEEPN permite la selección de la misma población de biblioteca de presa durante el uso de cebos diferentes plásmidos. Por lo tanto, el conjunto de candidatos interacción que producen una interacción de Y2H con uno cebo contra otro puede compararse directamente. Porque se utiliza la secuencia profunda, uno puede comprobar la composición inicial de biblioteca para cada población de levadura específica de cebo y siga el enriquecimiento de cada gen candidato de presa en la biblioteca de manera independiente. Procesamiento por lotes permite consultar la misma biblioteca contra diferentes cebos en forma semicuantitativa que permite entonces calcular un ranking estadístico4.

Hay varios pasos en este protocolo que son críticos para el éxito. Uno es que debe obtenerse un gran número de diploides para asegurar una representación adecuada de la biblioteca presa de Y2H se mezcla con cada plásmido cebo de interés. El procedimiento de apareamiento descrito aquí ha sido optimizado mediante la variación de varios parámetros. Encontramos que algunas cepas que bibliotecas de Y2H comerciales casa mate mal en general, sin embargo, el procedimiento de apareamiento descrito aquí puede generar 2 x 106- 2 x 107 diploides cuando seguido, permitiendo a transferencia adecuada y reproducible de la Y2H Biblioteca en la población. Otro aspecto fundamental del procedimiento es garantizar que el plásmido de cebo de interés crear una interacción positiva de Y2H ni con el dominio de activación de Gal4 vacíelo presa de plásmido. El método para seleccionar una interacción Y2H exige crecimiento en ausencia de la histidina en el que una interacción positiva de Y2H induce la transcripción de HIS3 para permitir que las células que su +. Mientras que habitualmente los ensayos tradicionales de Y2H pueden agregar la 3AT inhibidor competitivo para disminuir el crecimiento del fondo o usar otros reporteros3 , este procedimiento funciona mejor cuando las células con débiles interacciones Y2H pueden crecer y así aumentar el rigor para el crecimiento y seleccionar sólo de células con interacciones fuertes Y2H limita el repertorio de presa plásmidos que pueden ser identificados. Otro aspecto crítico es asegurarse de que una gran cantidad de la población diploide partida solía crecer en condiciones selectivas y no selectivos para evitar cuellos de botella evolutivos de muestreo error4 . Después de la célula y volúmenes de cultura números especificados aquí ayudará a garantizar la reproducibilidad y disminuir ruido.

Una de las razones que el enfoque DEEPN es potente es que puede seguir exhaustivamente todos la plásmidos en una biblioteca de presa dada por su capacidad para interactuar con el cebo del interés. Así, una de las limitaciones de DEEPN es la complejidad de la biblioteca de usa. Para algunas de las librerías comerciales como las que usamos aquí, encontramos que el número de plásmidos que codifican fragmentos de buena fe del cDNA ORF que se encuentran en el mismo marco de lectura del dominio de activación de Gal4 es entre 3-6 x 104 con representación de ~ 6,000 - 8,00 0 diferentes genes. Encontramos que casi el 75% de estas bibliotecas contenían fragmentos correspondientes únicamente a las regiones de cDNA que fueron 3' de la secuencia de ADN de codificación (CDS/ORF). Por otra parte, casi un tercio de los genes que tenían fragmentos de la biblioteca no tenía ninguno que correspondió a las regiones en el ORF o aguas arriba del ORF.

Hicimos tres otros cambios al método DEEPN. Uno es una nueva cepa de MATalpha que puede llevar bibliotecas ubicadas dentro de un plásmido de TRP1 y que se acopla mucho mejor que algunas cepas que contiene la biblioteca disponibles en el mercado como Y187 de presas. Esto ayuda a asegurar a la transferencia completa de la población de biblioteca para cada cebo del interés. También hicimos un nuevo plásmido de expresión, que difiere del anteriormente descritos plásmidos que utilizan una copia variable columna vertebral basada en 2µ10de cebo. Aquí describimos un plásmido baja-copia CEN (pTEF-GBD) y encontrar que una sola ronda de crecimiento selectivo es suficiente para enriquecer la interacción presa plásmidos. Por último, creamos un vector de biblioteca aerodinámico 'presa' y usado para producir una biblioteca alta densidad aleatoria fragmento genomic Y2H para Saccharomces cerevisiae, que debe ser útil en el futuro para descubrir y caracterizar las interacciones entre proteínas de la levadura. En general, las mejoras en los materiales y herramientas bioinformáticas (descritos en el trabajo que lo acompaña) hacen el DEEPN acercarse de una manera accesible, viable y eficiente de realizar pantallas de Y2H comprensivas y comparativas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Agradecemos al personal en el Instituto de genética humana para secuenciación y NGS biblioteca preparación. Damos las gracias por su experiencia en la preparación de fragmentos de la biblioteca genómica de la biblioteca de plásmido Y2H aquí Einat Snir. Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

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References

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Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína
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Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

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