Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Traitement par lots des écrans 2-hybride de levure permet une comparaison directe des profils interaction de plusieurs protéines d’appât avec un ensemble très complexe de protéines de fusion de proies. Nous décrivons ici des méthodes raffinées, nouveaux réactifs et comment mettre en œuvre leur utilisation pour ces écrans.

Abstract

Dépistage des interactions protéine-protéine à l’aide de l’essai 2-hybride de levure a longtemps été un outil efficace, mais son utilisation a été largement limitée à la découverte des Interactiens de haute affinité qui sont hautement enrichi dans la bibliothèque des candidats qui interagissent. Dans un format traditionnel, le dosage de 2-hybride de levure peut produire trop de colonies à analyser lorsque menée à la raideur bas où se trouvent les Interactiens faible affinité. Par ailleurs, sans un interrogatoire exhaustif et complet de la bibliothèque même contre des plasmides différents appâts, une analyse comparative ne peut être atteint. Bien que certains de ces problèmes peuvent être traités à l’aide de bibliothèques en proie, le coût et l’infrastructure nécessaire pour faire fonctionner ces écrans peuvent être prohibitifs. Comme alternative, nous avons adapté le test 2-hybride de levure pour découvrir en même temps des dizaines de transitoire et interactions de protéine statique au sein d’un seul écran utilisant une stratégie appelée DEEPN (enrichissement dynamique pour réseaux d’évaluation des protéines), qui incorpore le séquençage à haut débit et calcul de suivre l’évolution d’une population de plasmides codant les partenaires qui interagissent. Nous décrivons ici personnalisées réactifs et protocoles qui permettent un écran DEEPN à exécuter facilement et à moindre coût.

Introduction

Une compréhension complète des processus biologiques de cellule s’appuie sur la recherche des réseaux d’interactions protéiques qui sous-tendent leurs mécanismes moléculaires. Une approche pour identifier les interactions entre protéines est la levure 2-hybride (Y2H), qui fonctionne en assemblant un facteur de transcription chimérique fonctionnement une fois que les deux domaines de la protéine d’intérêt lient à un autre1. Un écran Y2H typique est effectué en créant une population de levures qui abrite les deux une bibliothèque des plasmides codant des protéines qui interagissent, fusionnés à un activateur de la transcription (e.g., « la proie » protéine de fusion) et un plasmide de donnée « appât » composé de la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison de l’ADN (par exemple, le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 qui se lie à la séquence activatrice Gal4-amont). L’un des principaux avantages de l’approche Y2H est qu’il est relativement facile et peu coûteux à réaliser dans un laboratoire typique équipé pour les travaux courants de biologique moléculaire2. Toutefois, lorsque traditionnellement effectué, un utilisateur échantillonne des colonies individuelles qui surviennent après la sélection d’une interaction positive de Y2H. Cela limite fortement le nombre de clones de « proies » de bibliothèque qui peuvent être interrogés. Ce problème est aggravé lorsque l’abondance d’une proie interaction particulière est très élevé par rapport aux autres, ce qui diminue les chances d’apercevoir l’interaction de plasmides de proies de faible abondance.

Une solution pour utiliser le principe Y2H dans une couverture complète du protéome est l’utilisation d’une matrice au format dans lequel un tableau contenant des plasmides de proies individuels connus peut être interrogé numériquement. Toutefois, une telle approche exige une infrastructure qui n’est pas facilement accessible et le plus rentable pour les chercheurs qui s’intéressent à la définition de l’interactome d’un petit nombre de protéines ou domaines3. En outre, bibliothèques de proies très complexe qui peuvent coder plusieurs fragments de protéines qui interagissent augmenterait la taille de tels tableaux matrice aux tailles impraticables. Une alternative consiste à effectuer des essais avec des bibliothèques complexes en lots et d’évaluer la présence de clones interagissants avec le séquençage haut débit parallèle massive4. Ceci peut être appliqué pour doser la présence de plasmides de proies qui se posent dans plusieurs colonies au moyen d’un typique Y2H formaté approche dans laquelle la levure cellules abritant une paire d’interaction des protéines de fusion sont autorisés à cultiver sur un plaque5,6. Cette idée générale peut être accentuée pour augmenter la requête de deux appâts multiples et la proie de composants dans le même temps7,8.

Pourtant, nombreuses enquêtes exigent qu'une plus facile encore plus concentré efforts sur quelques protéines « appâts » et puissent bénéficier davantage par une requête exhaustive et semi-quantitative d’une bibliothèque de proies complexe unique. Nous avons développé et validé une approche pour effectuer des études d’interaction de protéine à grande échelle en utilisant un principe Y2H lot format4. Celui-ci utilise le taux d’expansion d’un plasmide de proie particulière en tant que proxy pour la force relative de Y2H interaction9. Séquençage en profondeur de tous les plasmides au sein d’une population soumise à une croissance normale ou des conditions de croissance sélective produit une carte complète de clones qui donnent des interactions Y2H fortes et faibles. Le répertoire d’interacteurs pouvant être obtenu et directement comparé à travers plusieurs plasmides d’appât. Le flux de travail qui en résulte, appelé DEEPN (dynamique d’enrichissement pour les réseaux d’évaluation des protéines) permet ainsi d’identifier les interactomes différentiels des bibliothèques proies même d’identifier des protéines, permettant la comparaison entre une protéine contre un autre.

Ici, nous démontrons DEEPN et introduire des améliorations dans les méthodes de laboratoire qui facilitent son utilisation, qui sont décrites dans la Figure 1. Des améliorations notables incluent :

Génération de populations de levures proies. Une des exigences clés de DEEPN génère des populations de levure avec des appâts différents plasmides qui ont la même distribution des bibliothèques de proies du plasmide. Les populations de base équivalent de la bibliothèque de plasmide de proies sont essentielles pour faire des comparaisons précises entre les interactomes des appâts différents. C’est plus facilement atteintes qu’un plasmide de bibliothèque occupe déjà une population de levure haploïde et pénétrant un plasmide d’appât donné de cette population est obtenue par croisement pour produire une plante diploïde. Ici, nous fournissons un guide clair dans Comment faire de ces populations en utilisant les librairies commerciales logés chez la levure haploïde. Bien que nous avons trouvé des méthodes qui génèrent un grand nombre d’espèces diploïdes, l’efficacité globale d’accouplement de ces souches de levures commerciales bibliothèque contenant était faible. Par conséquent, nous avons construit une nouvelle souche qui peut accueillir des bibliothèques de la proie qui donne beaucoup plus de diploïdes par réaction d’accouplement.

New jeu de plasmides d’appât. Plusieurs actuelles plasmides exprimant des protéines de fusion « appât » composés de la protéine d’intérêt et un domaine de liaison à l’ADN sont axés sur les 2µ, leur permettant d’amplifier leur nombre de copies. Ce nombre de copies peut être assez variable dans la population et mener à la variabilité de la réponse transcriptionnelle Y2H. Cela pourrait à son tour incliner la capacité de mesurer la force de l’interaction protéine donnée basée sur la réaction de la croissance des cellules sous sélection. Cela peut être en partie adresse à l’aide d’un plasmide de faibles copies, dont certains ont été décrits précédemment tels que le pDEST32 disponible dans le commerce10. Nous avons construit un nouveau plasmide d’appât (pTEF-GBD) qui produit des protéines de fusion Gal4-DNA-binding domain dans un plasmide d’axée sur les centromères faible copie TRP1 porteuses du gène de résistance Kanr qui permet aussi de clonage de fragments d’appâts les deux en amont et en aval du domaine de liaison à l’ADN de Gal4.

Bibliothèque de fragment nouveau High-Density Y2H. Nous avons construit un nouveau plasmide aux bibliothèques de proies Y2H maison et utilisé pour construire une bibliothèque Y2H hautement complexe, faite de fragments cisaillés au hasard de l’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae. Le séquençage a révélé que cette bibliothèque plus 1 million de différents éléments, beaucoup plus complexes que la levure décrite précédemment Y2H génomique plasmidique de bibliothèques11. Avec cette nouvelle bibliothèque, nous avons pu montrer que le flux de travail DEEPN est assez robuste pour accueillir des bibliothèques complexes avec plusieurs plasmides différents de manière fiable et reproductible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparation des plaques et des médias

Remarque : Toutes les plaques il faut faire au minimum 2 jours avant de commencer le protocole. Les médias peuvent être faites à tout moment. Toutefois, l’adénine de dextrose peptone tamponnée levure extrait (bYPDA) doit être faite le jour dont il sera utilisé. Certains médias s’effectue avec un mélange de supplément contenant une concentration de l’adénine est supérieure à ce qui est généralement utilisé. La plupart des suppléments de milieu minimal spécifient adénine de 10 mg/L. Suppléments étiquetés « + 40Ade » spécifier un total d’adénine 40 mg/L.

  1. Préparer une Solution de Glucose (50 % p/v). Pour 1 L, dissoudre 500 g de D-(+)-Glucose dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Régler le volume à 1 000 mL d’utiliser une éprouvette graduée et un filtre sur un filtre stérile de 0,2 µm dans un flacon stérile de 1 000 mL de médias.
  2. Extrait de levure préparer les plaques de peptone dextrose (DPJ). Pour 1 L, dissoudre 20 g de Peptone et 10 g d’extrait de levure dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 960 mL d’eau distillée. Verser dans un erlenmeyer de 2 000 mL et ajouter 15 g de gélose. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 40 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  3. Préparer le milieu minimal synthétique complet (CSM)-plaques de Trp. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 960 mL d’eau distillée. Versez dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 0,7 g de - Trp-rencontre mélange d’abandon, 20 mg de méthionine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 40 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  4. Préparer les assiettes CSM-Leu-Met. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée et remplissez-le à 940 mL d’eau distillée. Versez dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 1,005 g de - Leu-rencontre mélange d’abandon et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  5. Préparer les assiettes de CSM-Leu-Trp. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 940 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 1,005 g de - Trp-Leu + mélange d’abandon 40Ade, 240 mg de l’adénine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  6. Préparer les assiettes CSM-Leu-Trp-His. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 940 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 0,975 g de - Trp-Leu-ses + mélange d’abandon 40Ade, 240 mg de l’adénine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  7. Préparer les assiettes CSM-Leu-Trp-His-3AT. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 940 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 0,975 g de - Trp-Leu-ses + mélange d’abandon 40Ade, 240 mg de l’adénine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Mélanger dans 100 µL d’un stock stérile 1 M 3-amino-1,2,4 triazoles (3AT) en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  8. Préparer les assiettes LB-Kanr. Pour 1 L, dissoudre 10 g de Tryptone, 5 g de levure extrait et 10 g de NaCl dans 800 mL de l’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 1 000 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 15 g de gélose. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Ajouter 50 mg kanamycine et mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  9. Préparer la DPJ, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp et CSM-Leu-Trp-His médias. Utilisez la procédure ci-dessus pour les plaques sauf au lieu de verser dans un erlenmeyer, versez dans une bouteille de stockage de médias et omettre l’agar.
  10. Préparer bYPDA (YPDA tamponnée). Prendre le milieu YPD stérile et ajouter adénine 200 mg/L dans l’eau distillée stérile. Ajuster le pH à 3,7 avec HCl filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 µm dans un flacon stérile.
  11. Préparer la Transformation tampon : 2 M sorbitol, dihydrate d’acétate de lithium 1 M, 10 mM Tris pH 7.6, 0,5 mM EDTA, le chlorure de calcium dans l’eau distillée de 0,2 mM. Filtrer sur un filtre stérile 0,2 µm dans un flacon stérile.
  12. Préparer la solution de PEG : 70 % w/v polyéthylène glycol 3350 dans l’eau distillée. Stériliser à l’autoclave.
  13. Préparer le tourbillon : 8 M urée, 4 % w/v SDS, 50 mM Tris pH 6,8, 10 % v/v de glycérol, 0,02 % w/v bleu stérile de bromophénol eau distillée.
  14. Préparer les sTE (fort TE) : 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 dans l’eau distillée. Filtrer sur un filtre stérile 0,2 µm dans un flacon stérile.
  15. Préparer la solution mère de Zymolase : Zymolase 100 t 10 mg/mL dans 50 mM potassium phosphate dibasique de pH 7.5, 50 % v/v glycérol tampon stérile distillée (conservé à-20 ° C).

2. le clonage et la vérification des plasmides d’appât

Remarque : La Construction du domaine de Gal4-DNA-binding plasmides. Actuellement, il existe une variété de systèmes Y2H commercialement disponibles et sur le plan académique. DEEPN peut accueillir bon nombre d'entre eux, pourvu que l’appât de plasmide exprimant la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison à l’ADN se trouve dans un TRP1-contenant le plasmide. Autres exigences en aval qui sont de l’ordre immédiatement en amont de la bibliothèque de proies insert est connu et qu’une interaction Y2H positive peut être marquée par la production d’His3 permettant une sélection dans des milieux dépourvus d’histidine. Ici, nous allons décrire l’utilisation d’un nouveau plasmide d’appât Y2H (pTEF-GBD, Figure 2), cependant, autres plasmides d’appât Y2H y compris pGBKT7 peuvent être utilisés aussi bien. Pour la construction et l’évaluation des plasmides d’appât, nous décrirons utilisationdes pTEF-GBD. Nous proposons comme une note générale, synthèse de gène de produire un cadre de lecture ouvert qui adhère à la partialité de codon de levure pour aider à assurer la bonne expression et la facilité avec le clonage. S’assurer que le système de clonage permet à l’hameçon dans le cadre avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 et que lors du clonage dans le site 3', un codon stop suit la région codant pour appât.

  1. Préparer le vecteur plasmidique. Plasmide pTEF-GBD permet pour le clonage d’un fragment codant la protéine d’intérêt 5' ou 3' de la région codant le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 en utilisant une méthode d’assemblage rapide. Pour insertion au site de 5', 3 µg de pTEF-GBD avec NarI et EcoRI de digérer ou d’insertion sur le site de 3', digérer avec BamHI et XhoI pour 2-4 h. échantillon d’électrophorèse en gel d’agarose de l’ADN 1 % gel contenant 0,2 - bromure d’éthidium de 0,5 µg/mL (EtBr) à 100 V. exciser le bp de coupe 5 630 TEF-GBD et purifier à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN gel conformément aux instructions du fabricant et quantifier l’ADN de l’absorbance à 260 nm par spectrophotomètre12.
    NOTE : Génération d’appât-encodage des inserts. Fragments d’ADN codant les protéines ou les fragments de protéine d’intérêt peuvent être faite à l’aide de la synthèse de gènes et disponibles comme des fragments non clonées. Il est recommandé que les codons sont optimisés pour l’expression chez Saccharomyces cerevisiae et outils en ligne pour l’optimisation de codons sont inclus dans la liste des matériaux.
  2. Pour 5' insertion, flanquent le fragment d’ADN codant un codon de début ATG par 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'et 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', respectivement. Pour 3' insertion dans le cadre avec le domaine de liaison de Gal4 ADN, flanquent le fragment de codage de 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'et 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Pour la construction plasmidique, utilisez la méthode assemblage rapide tel que spécifié dans les instructions du fabricant pour le clonage de fragments en coupe pTEF-GBD.
    1. Plaque tous transforment e. coli dans LB-Kanr assiettes et incuber pendant 16 à 20 h à 37 ° C. Colonies pTEF-GBD avec l’insertion désirée de logement peuvent être identifiés par l’amplification par PCR en utilisant des oligonucléotides : 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' et 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' pour insérer 5' et 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' et 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' à 3' insérer. Ces oligonucléotides peuvent aussi servir d’amorces de séquençage de l’insert.
    2. Plan sur la préparation > 10 µg de chaque dérivé pTEF-GBD et pTEF-GBD seul à fournir des éléments pour les transformations de séquençage et de la levure.
    3. Utiliser les conditions PCR suivantes : 3 min à 98 ° C, suivie de 25 cycles de 30 s à 98 ° C, 30 s à 55 ° C et 2 min à 72 ° C, suivie de 5 min à 72 ° C à l’aide d’un tampon contenant 2,5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µL ADN polymérase et tampon de propriété industrielle.

3. l’expression des protéines de Fusion de Gal4-DNA-binding Domain

  1. Faire des levures compétentes.
    1. Strie sur levure PJ69-4 a sur une plaque de la DPJ en prenant un applicateur en bois stérile, grattage 1 mm3 -80 ° c congelés stock et frottant doucement à travers la plaque de la DPJ. Déplacer l’applicateur en bois vers le bas de la plaque pour que chaque passage traverse une partie intacte de la surface de médias. Incuber la plaque de la DPJ à 30 ° C pendant 2 jours ou jusqu'à ce que les colonies individuelles sont visibles. Faire le stock congelé de levure PJ69-4 a en suspendant la levure dans l’eau ou la croissance des médias, en complétant avec le DMSO à 7 % et en stockant à-80 ° C.
    2. Ensemencer une seule colonie dans 5 mL de la culture de la DPJ dans un tube à culture 20 x 150 mm à l’aide d’un applicateur en bois stérile et se développer pendant la nuit à 30 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
    3. Ensemencer à 50 mL de la DPJ dans un 250 mL de la fiole d’Erlenmeyer stérile avec 4 mL de la culture au jour le jour de la souche de levure PJ69-4 a. Grandir dans un incubateur à agitation à 30 ° C, 200 tr/mn à une densité optique (OD600) d’environ 1,2, telle que déterminée par spectrophotométrie avec un chemin de lumière standard de 1 cm. La croissance prend habituellement 5-7 h.
    4. Isoler les levures par sédimentation dans 50 mL de tube conique à 4 696 x g pendant 5 min à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. Jeter le surnageant par déversement dans les eaux usées. À l’aide d’une pipette, resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de transformation et de transfert de 15 mL de tube à fond conique. Resediment à jeter le surnageant et remettre en suspension la levure dans 1 mL de volume final du tampon de transformation avec une pipette de 1000 µL.
    5. Incuber les cellules de levure pendant 60 min à 30 ° C en agitant à 200 tr/min et placez sur la glace pendant 30 à 90 min.
  2. Transformation de levure de plasmide.
    1. En 1,5 mL de tubes de microcentrifuge stérile, ajouter 1 µg de plasmide pTEF-GBD-basé et 5 µL de transporteur de sperme de saumon 10 mg/mL solution d’ADN. Comprennent également un tube contenant seulement saumon sperme transporteur ADN comme un contrôle de la transformation négative. Ajouter 100 µL de la suspension de cellules de levure glacée à chaque tube pipette. Ajouter 100 µL de 70 % solution PEG avec une pipette de 1000 µL et mélangez doucement en effleurant le tube 5 - 10 fois (ne pas de vortex).
    2. Incuber à 30 ° C, dans un incubateur à agitation pendant 45 min à 200 tr/min.
    3. Choc thermique à 42 ° C pendant 15 min.
    4. Sédiments dans une micro-centrifugeuse à 845 x g pendant 3 min à température ambiante, Pipeter hors et jeter le surnageant, resuspendre le culot dans 150 µL d’eau stérile par pipetage de haut en bas et répartis sur la surface d’une plaque de CSM-Trp.
    5. Placer les plaques de droite vers le haut dans incubateur à 30 ° C et incuber pendant 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les colonies sont visibles. Plaques peuvent être tournés à l’envers pour éviter la condensation sur la surface de la plaque après incubation à 30 ° C pendant 6 à 12 h.
    6. Prendre 2-3 colonies par transformation et streak comme un patch sur une plaque de CSM-Trp à l’aide d’un cure-dent stérile. Permettre de croître pendant 24 h à 30 ° C.
  3. Faire des lysats d’expression de la protéine.
    1. Ensemencer de 3 mL de milieu liquide CSM-Trp avec un match de football-tête-taille de levure du patch et croître durant la nuit à 30 ° C dans un tube à culture 20 x 150 mm, en agitant à 200 tr/min. Faire deux cultures au jour le jour par l’appât et vecteur vide pTEF-GBD.
    2. Ajouter 1 mL de la DPJ à chaque 3 mL d’une culture de CSM-Trp. Croître durant 1 h à 30 ° C, et en agitant à 200 tr/min. Vérifier le diamètre extérieur de cellules par le spectrophotomètre.
    3. Il s’agit un nombre équivalent de cellules, normalisant selon la Division d’opposition. Utilisez stérile des microtubes à centrifuger de 1,5 mL avec un spin 5 min à 2 348 x g à la température ambiante dans une micro-centrifugeuse. Utiliser une pipette pour jeter le surnageant. Le stock final correspond à un minimum de 2,1 OD.
      Remarque : Lors du calcul d’un nombre équivalent de cellules, il peut arriver que des volumes différents peuvent être nécessaires de chaque culture une nuit ou plus pour atteindre l’OD 2.1 minime.
    4. Resuspendre le culot dans 450 µL de 0,2 M NaOH par pipetage de haut en bas. Incuber 5 min à température ambiante. Recentrifuge cellules pendant 2 min à 2 348 x g à la température ambiante et éliminer le surnageant de la pipette.
    5. Resuspendre le culot avec 50 µL de tampon de tourbillon de pipetage de haut en bas avec soin quant à ne pas faire des bulles. Échantillon de chaleur pendant 5 min à 70 ° C.
  4. Recherchez l’expression de la protéine par SDS-PAGE.
    1. Utiliser un gel à gradient de 4 à 20 % pour assurer un large éventail de poids moléculaires peut être résolu. Montant équivalent de la charge (même OD) des échantillons dans une SDS-PAGE de gel et prenez soin d’inclure au moins un échantillon contenant la non modifiées pTEF-GBD vector13,14,15.
    2. Après séparation par électrophorèse, transférer le gel de nitrocellulose et immunoblot en utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-myc et solution de détection ECL (Figure 3).

4. activation de l’essai

  1. Strie sur la levure de MATalpha de la crosse de-80 ° C correspondant à la souche logeant la bibliothèque de proies d’intérêt sur une plaque de la DPJ en prenant un applicateur stérile en bois, en grattant une petite quantité de levure dans le flacon et en il fendant la plaque de la DPJ. Incuber la plaque de la DPJ à 30 ° C pendant 2 jours ou jusqu'à ce que les colonies individuelles sont visibles. Patch de quelques colonies individuelles sur une plaque de la DPJ et incuber une nuit à 30 ° C.
    Remarque : La nouvelle souche développée ici, à la bibliothèque de proies de maison est PLY5725 alors que certaines bibliothèques de Y2H commercialement disponibles compatibles sont logés dans des Y187.
  2. Suivez les procédures dans 3.3.1 - 3.3.4 pour transformer PLY5725 avec le LEU2-basé plasmide abritait la bibliothèque proie désirée. Pour les bibliothèques développées ici, le plasmide correspondant est pGal4AD (pPL6343). Pour récupérer les transformants de levure, plaque sur plaques CSM-Leu-Met. Après colonies surviennent, strie sous forme de taches sur une plaque de CSM-Leu-Met et incuber pendant 24 h à 30 ° C.
  3. Suivre le protocole en 3.4 pour confirmer l’expression de pPL6343 vecteur vide utilisant-HA anticorps monoclonaux ou polyclonaux et solution de détection ECL.
  4. Strie que chacun de la levure PJ69-4 a transformé en croix avec PLY5725 construit sur une plaque de la DPJ qui a été confirmée pour exprimer la protéine dans le protocole l’article 3.4 et 4.3 et incuber à 30 ° C durant la nuit. Prenez 1 mm3 des cellules où les deux souches ont grandi ensemble et patch sur séparer CSM-Leu-Met, CSM-Trp et plaques de CSM-Trp-Leu et grandir 24h.
    NOTE : Souhaitées diploïdes seront développera sur les plaques de CSM-Trp-Leu. Croissance sur CSM-Leu-Met et CSM-Trp plaques servent de témoin positif pour la croissance de la levure.
  5. Cultiver des diploïdes dans 1 mL de médias de CSM-Trp-Leu nuit à 30 ° C. Cellules de 500 µL de sédiments dans un 1,5 mL de microcentrifuge tube à 2 348 x g, 3 min à température ambiante dans une micro-centrifugeuse. Jeter le surnageant de la pipette. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’eau stérile et répétez la sédimentation et la remise en suspension. Vérifier l' OD600 des cellules.
  6. Faire une série de 01:10 série de dilutions de chaque suspension de cellules à l’aide de l’eau stérile avec la plupart de départ concentré solution de chacun à une OD de 0,5. Spot 5 µL de chaque dilution dans une assiette de CSM-Leu-Trp, une plaque de CSM-Leu-Trp-His et un CSM-Leu-Trp-3AT plaque son +. Incuber à 30 ° C et inspecter de croissance par jour pendant 3 jours (Figure 4).
    Remarque : pour le 01:10 dilutions, déposer 10µl du tube contenant un OD 0,5 dans 90 µL d’eau et mélanger en pipettant également de haut en bas. Continuer à faire 01:10 des dilutions successives jusqu'à ce qu’il y a un total de six différentes concentrations à repérer.

5. créer des Populations de levure avec appât et de la bibliothèque de proies

Remarque : La souche Y187 qui abrite des plasmides de bibliothèque de proie commerciale mate pas bien. Ainsi, les conditions optimisées suivantes sont nécessaires pour maintenir la complexité de la bibliothèque. Le PLY5725 souche contenant Y2H proies bibliothèques mates mieux et la même procédure d’accouplement peut être utilisée avec cette souche (Figure 5).

  1. Inoculer une 3 mL des cultures de chacun des transformants de PJ69-4 a portant les divers TRP1-contenant le plasmide appât pTEF-GBD CSM-Trp médias dans un tube à culture. Inclure deux cultures distinctes contenant le plasmide vecteur de pTEF-GBD seul pour servir en tant que contrôles procédures. Incuber les cultures à 30 ° C, 200 tr/min pendant 6 h et puis diluer dans un 25 mL de la culture dans un erlenmeyer stérile de croissance durant la nuit.
  2. Décongeler un flacon de congelés (-80 ° C) des MATalpha des cellules contenant le LEU2-transportant des « proies » bibliothèque à température ambiante. Ensemencer une 125 mL de CSM-Leu-Met les médias dans un erlenmeyer stérile avec le flacon entier décongelé. Se développer toutes les cultures du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    Remarque : L' OD600 des cultures doit varier entre 1,0 et 1,5 avant de procéder aux étapes suivantes.
  3. Centrifuger 21 équivalents OD de chacune des cultures PJ69-4 a transformant avec un spin 5 min à 4 696 x g à la température ambiante. Pour chaque 10 réactions d’accouplement désiré, pellet OD 39600 équivalents de la souche MATalpha transportant les plasmides de bibliothèque en séparé 50 mL de tubes coniques.
    1. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL d’eau stérile et re-pellet dans nouveau 50 mL de tube conique 4 696 x g 5 min à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant sans perturber les cellules granulés.
    2. Remettre en suspension les pastilles de PJ69-4 a 4 mL de cellules et les cellules de PLY5725 dans 10 mL de bYPDA (pH 3,7).
  4. De mettre en place des réactions accouplements, ajouter 1 mL de PJ69-4 a transformé des cellules et 1 mL de MATalpha cellules de bibliothèque contenant 1 mL de bYPDA pH 3,7 à nouveau 50 mL de tube à fond conique. Incuber à 30 ° C avec agitation orbitale douce (100-130 tr/min) pendant 90 min.
    1. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 4 696 x g, à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant par pipette et Resuspendre le culot dans 2 mL de bYPDA:YPD 1:1. Tous les 2 mL de sur une plaque de la DPJ de 100 mm sur plaque de pipette et incuber à 30 ° C pendant environ 20 h.
  5. Récolte des cellules sur les plaques de la DPJ à l’aide d’un grattoir de cellules pour déloger les cellules dans 2-3 mL de CSM-Leu-Trp médias. Pipetter délogent les cellules dans 50 mL de tube à fond conique. Rincer les plaques 4 - 5 fois avec 2-3 mL de CSM-Leu-Trp médias en haut les médias avec un 1000 µL Pipeter de pipetage et éjecte délicatement le support sur toute la surface de plaque de la DPJ.
    1. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 4 696 x g à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. Jeter le surnageant par pipette et remettre en suspension les cellules dans 40 mL de CSM-Leu-Trp médias en pipettant également, haut et bas (do pas de vortex).
  6. Pour estimer le nombre de cellules diploïdes formé, diluer 4 µL du mélange diploïde dans 200 µL et médias de CSM-Trp-Leu 2000 µL. Plaque de 200 µL de chaque dilution sur une plaque de CSM-Leu-Trp.
    Remarque : Les deux plaques représentent une dilution de 1/10 000 et 1/100 000 pli du stock des diploïdes récoltés et produisant une colonies attendu ~ 9 000-27 000 sur la plaque de dilution de 1/10 000 après incubation à 30 ° C pendant 36-40 h. plaques de cocher après l’étape 5,7. Il faut un nombre minimum de 200 colonies sur la plaque de dilution de 1/10 000 pour passer à l’étape 5.8
  7. Immédiatement prendre le reste de chaque 40 mL de remise en suspension cellulaire et ensemencer un 1 000 mL d’erlenmeyer contenant 500 mL de Trp-Leu-CSM media. Prendre une initiale de l’OD600. Incuber ces flacons à 30 ° C sous agitation à 180 tr/min, jusqu'à ce qu’ils atteignent la saturation (~2.0 OD/mL). Cela prend généralement environ 36-40 h. surveiller la croissance après 24 h et puis à 36 h par OD600.
  8. À l’aide d’une pipette, retirer 20 mL d’aliquotes de chacune des 500 mL saturé de cultures et inoculer 2 000 mL d’erlenmeyers, un contenant 750 mL de Trp-Leu-CSM media et le second contenant 750 mL de CSM-Leu-Trp-His au niveau le plus bas de 3AT qui élimine le fond (préalablement déterminée à la Section 4.5). Les nouvelles cultures (770 mL) bien mélanger en agitant et prendre une initiale de l’OD600.
  9. Incuber les cultures à 30 ° C en agitant à 180 tr/min jusqu'à arriver à saturation, qui généralement se produit moins de 24 h pour la culture de CSM-Leu-Trp désélectionnée et peut prendre plus de 70 h pour les cultures sous sélection Y2H interactions.
  10. Une fois que les cultures ont atteint saturation (OD ~ 2.0), supprimer 11 mL d’une pipette, sédiments de cellules avec un spin 5 min à 4 696 x g à la température ambiante, jeter le surnageant par pipette et congeler à-20 ° C ou continuer sur l’extraction de l’ADN. Les échantillons sélectionnés et non sélectionnés tous deux serviront pour le séquençage en profondeur.

6. préparation de séquençage profonde DEEPN

  1. Extraction de l’ADN.
    1. Utiliser une pipette pour remettre en suspension les pastilles de cellule de protocole section 5.7 dans 500 µL de tampon de sTE et le transfert à un 1,5 mL de tubes de microcentrifuge. Ajouter 3 µL de betamercaptoethanol et 10 µL de Zymolase stock. Bien mélanger et laisser incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 à 36 h.
    2. Extraire l’échantillon deux fois avec de l’alcool de phénol/chloroforme/isoamylique 500 µL tout en utilisant une fumée capot16.
    3. Ajouter 7 µL de 4 M NaCl, 900 µL de glace froide 100 % d’éthanol (ETOH), mélanger par inversion et soit gel-20 ° C ou continuer d’ADN des sédiments de la filature à 21 130 x g pendant 10 min à température ambiante dans une micro-centrifugeuse.
    4. Jeter le surnageant de la pipette. Laver le granule trois fois avec 900 µL de 70 % ETOH.
    5. Sédiments pellet 21 130 x g pendant 2 min et retirez résiduelle lavage ETOH en pipette. Granulés secs pendant 7 min à 42 ° C.
    6. Resuspendre le culot dans 120 µL de 0,1 x sTE dans un bain-marie à 37 ° C pendant 90 min, feuilleter les tubes pour mélanger toutes les 30 minutes.
    7. Pipetter 60 µL d’extrait d’ADN dans un stérile de 1,5 mL de tubes de microcentrifuge. Ajouter 120 µL de sTE, 3,5 µL du stock de la RNase A, sélecteur pour mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    8. Précipité d’éthanol faite précédemment dans la Section 6.1.3 - 6.1.5, mais l’utilisation de 7 µL d’acétate d’ammonium 5 M au lieu de 4 M de NaCl.
    9. Resuspendre RNase imprégnées d’insecticide A ADN dans 55 µL de 0,1 x sTE dans un bain-marie à 37 ° C pendant 90 min, feuilleter les tubes pour chaque 30 min. de quantifier l’ADN de la composition de l’absorbance à 260 nm sur un spectrophotomètre.
  2. PCR cDNA insère.
    1. Effectuer deux, réactions de PCR 50 µL par échantillon d’ADN. Chaque réaction contient 25 pmol de chaque amorce avant et arrière correspondant le plasmide de proies-bibliothèque (voir documentation). Réactions aussi contenir 25 µL de High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, 5 µg de l’échantillon d’ADN et l’eau jusqu'à 50 µL. amplifier des réactions pour 25 cycles avec des temps d’extension de 3 min à 72 ° C, une température de recuit de 55 ° C pendant 30 s et dénaturation à 98 ° C pendant 10 s. Precede cyclisme par une dénaturation de s de 30 à 98 ° C et suivez avec une incubation de 5 min à 72 ° C.
    2. Analyser les 4 µL de chaque réaction de PCR par électrophorèse de gel d’agarose ADN 1 % avec l’agarose de l’ADN de gel contenant 0,2 - 0,5 µg/mL de bromure d’éthidium17. Visualiser l’échantillon d’ADN par transillumination UV. Échantillons montrera un frottis de l’ADN autour de 1-3 kb, où le marquage chromosomique peut être trouvée pour échantillons où une interaction Y2H a été sélectionné (Figure 6).
    3. Combiner des doubles des échantillons PCR et de purifier à l’aide de la trousse de purification du PCR conformément aux instructions du fabricant et de quantifier l’ADN de l’absorbance à 260 nm sur un spectrophotomètre.

7. deep séquençage

NOTE : Préparation de l’échantillon et le séquençage sur une plate-forme de séquençage en profondeur est généralement disponible dans les installations centrales du séquençage de l’ADN commerciales et universitaires.

  1. Cisaillement 600 ng du produit PCR utilisant un haute performance ultra-sonicateur pour donner des fragments d’une longueur moyenne d’environ 300 bp.
  2. Générer des bibliothèques de séquençage indexée en utilisant un kit de préparation pour le séquençage en profondeur qui ajoute des linkers codant des codes à barres, d’amorçage sites, et de capturer des séquences asymétriquement sur les extrémités des fragments d’ADN.
  3. Effectuer la préparation de la bibliothèque selon les instructions du fabricant. Piscine indexé bibliothèques et séquence que les lectures de long jumelé-fin sur une plate-forme de séquençage en profondeur (par exemple, 2 x 150 bp PE lectures). Le nombre désiré de lectures ciblées pour chaque échantillon est entre 10 et 40 millions, avec des lectures plus désirées pour les populations non sélectionnées qui sont généralement plus complexes. Nous recommandons au moins 20 millions ou plusieurs lectures pour les populations non sélectionnées.

8. bioinformatique traitement et vérification

  1. Analyse statistique des données en enrichissement de gène entre les ensembles de données () 3) effectuer des processus ADN ordonnançant des données sous forme de fastq avec un ensemble de logiciels autonomes programmes construits pour (1) carte séquence lire 2) quantifier les fichiers dans un format universel de SAM () afin de classer quel candidat gènes sont positifs pour l’interaction Y2H () 4) offrent de fournir des informations qu’elles ce qui s et quel cadre translationnelle chaque de l’ADNc de la proie par gène des fragments qui donnent Y2H positive des interactions sont composées et (5) outils pour reconstruire non seulement la 5', mais aussi l’extrémité 3' des fragments interdépendants permettant leur reconstruction et la vérification dans un format traditionnel de Y2H. Fonctionnement de ces programmes est détaillée dans l’étude qui l’accompagne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le dosage Y2H a été largement utilisé pour trouver des interactions de protéine : protéine et plusieurs adaptations et systèmes ont été développés. Pour l’essentiel, les mêmes considérations qui aident à assurer le succès de ces approches précédentes sont importantes pour DEEPN. Parmi les critères importants : assurer l’expression du domaine de liaison à l’ADN des protéines de fusion, un faible bruit de fond des rayonnements non essentiels à assurer son + croissance dans les diploïdes contenant l’appât d’intérêt avec un plasmide vide proie, un rendement élevé d’accouplement de l’appât MATalpha contenant des levures MATA avec la bibliothèque contenant la levure, et enfin, basse-rigueur des conditions qui permettent à la population de croître dans des conditions qui sélectionne pour les nombreuses réactions positives d’Y2H, même celles que produisent de faibles niveaux d’activité His3 et une faible Y2H réponse transcriptionnelle.

Un des aspects critiques de DEEPN est d’introduire de façon reproductible la bibliothèque Y2H dans variétés qui contiennent des appâts différents plasmides et sélectionner avec fiabilité les populations de ces plasmides de bibliothèque qui créent des interactions positives avec Y2H. Cela devient plus difficile lorsque la complexité de la bibliothèque Y2H augmente car il est plus difficile à assurer le transfert adéquat de l’intégralité de votre bibliothèque à travers différentes populations initiales. En outre, la taille des populations, choisi de se développer dans des conditions de sélection et de la profondeur du séquençage doit être suffisante pour observer les changements reproductibles dans la composition de plasmide Y2H pour identifier de façon fiable vraies interactions Y2H positives. Dans des études précédentes, nous avons utilisé des banques d’ADNc Y2H disponibles dans le commerce. Nous avons trouvé que la variabilité dans la distribution de bibliothèque Y2H entre populations distinctes portant les mêmes plasmides d’appât est faible, avec une surdispersion entre les deux populations initiales avant sélection de < 0,01 en général et 0,35 - 0,55 pour séparer populations après sélection4. Cependant, la complexité de certaines de ces bibliothèques Y2H disponibles dans le commerce est assez faible (Figure 7). En outre, bon nombre des clones qu’il contient (~ 60 %) sont fabriqués entièrement de fragments d’ADNc qui sont 3' de la région codante, ce qui limite encore davantage leur utilité. Pour démontrer que les méthodes ci-dessus ont été capables d’accueillir les bibliothèques Y2H plus complexes, nous avons créé une nouvelle bibliothèque Y2H dans le vecteur de plasmide « proie » simplifié (pGal4AD) contenant des fragments d’ADN génomique de Saccaromyces cerevisiae (souche PLY5725). L’ADN génomique a été fragmenté par cisaillement, taille choisie pour les gammes de bp 600-1500, modifié avec adaptateurs et insérée dans pGal4AD pour créer la bibliothèque de SacCer_TAB Y2H (Figure 8). La bibliothèque a été transformée en PLY5725, qui a produit une population de levure qui a été ensuite accouplée pour séparer des échantillons de PJ69-4 a MATA portant le plasmide pTEF-GBD seul. Les populations diploïdes en double ont été cultivées dans des conditions non sélectifs et sélectifs. Les inserts de bibliothèque de plasmide Y2H ont été analysés par séquençage en profondeur. Lorsque mappé sur l’ADN génomique englobant 100 bp en amont et en aval de chaque protéine codage région (84 % de l’ensemble du génome), nous avons trouvé > 1,1 millions de plasmides différents dans la bibliothèque pour une taille totale estimée de la bibliothèque dans la levure de ~1.35 millions de différentes plasmides. En comparaison, nous aussi transformé une levure décrite précédemment génomique Y2H bibliothèque11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H bibliothèque) dans la levure de MATalpha et soumis à la même analyse que ci-dessus. Nous avons constaté que la complexité de notre bibliothèque de Y2H levure fragment aléatoire était beaucoup plus élevée et avait beaucoup plus de plasmides codant des fragments dans le cadre de chaque gène que la bibliothèque déjà publiée (Figure 9). Ce qui est important, la génération de la bibliothèque initiale contenant des populations diploïdes était très reproductible avec une surdispersion de < 0,01 (Figure 10). En outre, la reproductibilité d’avoir les deux populations distinctes de levure produisent des répartitions similaires des plasmides après que sélection pour des interactions positives avec Y2H était très bonne, ce qui donne une surdispersion de 0,3. Ainsi, les méthodes ici accueillent grandes bibliothèques Y2H de complexité plus élevée que ceux précédemment utilisés.

En termes d’augmentation de la facilité de DEEPN, nous préférons utilisant la synthèse de gène s’insère codant pour la protéine appât d’intérêt. Cela permet de codage des régions pour les domaines protéiques, chimères et mutants pour être facilement intégré à Y2H appât plasmides, mais également leurs codons d’être optimisée pour l’expression chez S. cerevisiae. Expression de deux protéines différentes de la fusion du domaine Gal4-DNA-binding est illustrée dans la Figure 3. Deux différentes levures transformants exprimant une des deux protéines de fusion d’appâts ont été préparés et soumis à la SDS-PAGE et immunoblotting avec des anticorps anti-myc. Noter les niveaux d’expression des protéines d’appât par rapport à la domaine de liaison à l’ADN de Gal4 seul du vecteur vide. Nous avons trouvé que c’est important non seulement pour vérifier l’expression de la protéine de fusion d’appât, mais aussi de vérifier l’expression dans la colonie de cellules transformées exacte de levure MATA qui servira à élargir et à s’accoupler à la levure de bibliothèque contenant des proies. Une fois un transformant a été identifié, il est possible de congeler vers le bas et les stocker pour une utilisation ultérieure.

La figure 4 montre un test pour l’activation autonome où une dilution en série de cellules diploïdes sont ensemencés sur CSM-Leu-Trp (+ son), CSM-Trp-Leu-His (-sa) et CSM-Trp-Leu-3AT His + (-His + 3AT) plaques et autorisés à cultiver à 30 ° C pendant 3 jours. Le but recherché est d’observer la croissance dans la présence, mais pas l’absence de l’histidine, indépendamment du fait qu’il n’y a 3AT. Cela permettra l’utilisation de CSM-Trp-Leu-His pour sélectionner pour la levure avec une interaction 2-hybride de levure positive. S’il y a croissance sur plaques CSM-Leu-Trp-His, ensuite une sélection Y2H peut encore être obtenue utilisant la plus faible concentration de 3AT qui empêche la croissance. Nous constatons que si la croissance peut être bloquée en 3AT CSM-Trp-Leu-His + 0,1 mM, puis le dosage DEEPN peut procéder à l’aide de cette condition pour sélectionner Y2H interactions. Si, cependant, l’inhibition de la croissance des diploïdes contenant des pGal4AD ou autre plasmide vide proies et le plasmide pTEF-GBD-bait fusion requiert des concentrations plus élevées de 3AT, elle compromettra l’exécution de la procédure DEEPN et un plasmide différents appâts doit être recherchée. Notez que son + croissance est la seule sélection d’une interaction Y2H positive. Nous avons trouvé que cela suffit enrichir Y2H interactions dans lot.

Une des procédures plus critiques dans le flux de travail DEEPN est d’atteindre le rendement élevé d’accouplement de la levure MATA portant le plasmide d’appâts avec la levure MATalpha proie Y2H transportant. Nous a constaté que certaines souches (p. ex., Y187)18, logement disponible dans le commerce d’ADNc, ont relativement faible efficacité accouplement. C’est pourquoi nous avons conçu une souche pour transporter Y2H bibliothèques. Cette souche est basée sur BY4742, un dérivé de S288c. Cette souche n’a pas de GAL4, GAL80, TRP1, LEU2et HIS3. Il ne contient aucun journalistes qui répondent à une protéine de Gal4 hybride ni un hybride différent (p. ex., LexA-VP16). Au lieu de cela, la source de la production induite par Y2H His3 se trouve dans la souche MATA qui porterait le plasmide appât particulier. Cela simplifie le système et permet une plus grande souplesse que l'on peut utiliser les mêmes cellules de MATalpha bibliothèque contenant à s’accoupler avec une souche exprimant une protéine de fusion LexA-appât et un journaliste LexA(UAS) -HIS3 , une protéine de fusion de Gal4-DBD-appât ou un Gal4 (UAS)-journaliste deHIS3 .

Une fois que les populations diploïdes transporter un plasmide d’appâts et la bibliothèque sont générées, ils sont dilués et permis de se développer dans des conditions il suffit de sélectionner les deux plasmides (p. ex., CSM-Trp-Leu) ou pour les plasmides et une interaction positive de Y2H qui entraîne la production de His3 (p. ex., CSM-Leu-Trp-His). Il est important de commencer par une grande quantité de la population de départ afin d’éviter une évolution « goulot » qui peut fausser la population résultante après sélection d’une interaction positive de Y2H. Ainsi, notre procédure spécifie à l’aide de 20 mL de 500 mL de la culture de la population diploïde à être cultivé dans 750 mL de supports CSM-Leu-Trp-His neufs pour éviter ce problème. Avec le pTEF-CMM comme le plasmide d’appât, nous avons trouvé qu’un seul tour de dilution et de croissance ne suffisait pas à évoluer une population informative. En utilisant des appâts différents plasmides précédemment, nous avons utilisé deux séries de dilution et de croissance, une initiale 20 mL de dans 750 mL, et puis 2 mL de celle saturée diluée dans 75 mL de la culture. La figure 6 montre les résultats de l’amplification par PCR dans les inserts de bibliothèque pour la population diploïde, cultivées dans des conditions non sélectif, mais aussi un premier et le deuxième tour successifs de dilution et de croissance en état sélective pour deux différents appât de plasmides. Notez qu’avec aucune sélection, il existe un frottis généralisé des produits PCR indicative d’un mélange complex et relativement bien normalisé des fragments. Après la sélection, ce modèle change, avec certaines espèces grandement enrichir afin que des bandes individuelles peuvent être discernées. Un certain degré de baguage est typique des expériences réussies menées jusqu'à présent, encore un motif de frottis en sus ou au lieu d’un marquage chromosomique, est révélateur d’un mélange complexe d’inserts de proies et est souhaitable si l'on veut maximiser le nombre de candidats que DEEPN détecte. Profil de bandes très forte, où la plupart du produit PCR se trouve dans les bandes 1-3, indique que la plupart des données de séquençage sera dominée par des inserts de proies seulement 1-3. On peut compenser cela en partie en consacrant plus de lectures de cet échantillon. On peut voir que si la population est diluée et cultivée plus loin (voir « sélectionné » d2"dans la Figure 5), le marquage chromosomique est plus important, ce qui indique que les proies plasmides conférant des interactions Y2H faibles mais authentiques étant diminuent tandis que la proie de quelques privilégiés plasmides augmentent leur abondance. Dilutions successives et la croissance à ce niveau excessif est jugé contre-productif pour le but d’attraper le plus grand nombre de candidats potentiels et donc avec le protocole ici, nous recommandons d’utiliser un seul tour de dilution et de croissance.

Figure 1
Figure 1 : schéma du flux de travail DEEPN. Le schéma général des procédures de laboratoire est indiqué sur la gauche ainsi que le temps approximatif nécessaire pour effectuer la tâche correspondante. La droite se trouve le flux de travail de bio-informatique en utilisant les logiciels DEEPN et Stat_Maker. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : schéma de pTEF-GBD. Le TRP1-contenant le plasmide de faibles copies Gal4 DNA-binding domain fusion protéine expression s’affiche. Il dispose d’un promoteur constitutif de TEF1 , la balise épitope myc, le domaine de liaison ADN Gal4 suivi un site de liaison T7 RNA polymérase et polylinker PRM9 terminator dans un centromère (CEN)-plasmide de base. Ce plasmide porte également la résistance à la kanamycine et l’origine bactérienne ColE1 de réplication. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Expression de protéines de fusion de Gal4-appât. Lysats de levures exprimant des protéines de différents appâts fondus vers le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 exprimé en pTEF-GBD étaient victimes de SDS-PAGE et immunoblotting avec des anticorps anti-myc. pTEF-GBD exprime simplement le domaine Gal4-ADN-bindng seul ; pTEF-GBD-bait1 exprime le domaine Gal4-ADN-bindng fusionné à un RhoA manque son site de prénylation C-terminal et de l’habitation une mutation verrouillant dans une conformation GTP lié ; pTEF-GBD-bait2 exprime le domaine Gal4-ADN-bindng fusionné à un RhoA manque son site de prénylation C-terminal et de l’habitation une mutation verrouillant dans une conformation PIB lié. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Activation self test. Diploïdes issus de cellules PJ69-4 a transportant les plasmides appât indiquée et PLY5725 portant le plasmide de proies indiquées étaient en série dilués et repérées sur des assiettes, plaques CSM-Leu-Trp-His et CSM CSM-Trp-Leu-Leu-Trp-His + 3AT plaques et cultivées pendant 3 jours à 30 ° C. Les transformants de PJ69-4 a utilisé pour l’accouplement ont été les premiers de chaque paire illustré à la Figure 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : accouplement efficacité de Y187 vs PLY5725. La réaction d’accouplement entre PJ69-4 a contenant un TRP1-contenant des appâts vector et Y187 ou PLY5725 comptable proies plasmide a été réalisée. les dilutions de 1/10 000 ont été ensemencées sur CSM-Trp-Leu pour sélectionner des diploïdes. La souche PLY5725 montre une plus grande efficacité de reproduction que la souche Y187 avec environ 10 fois plus colonies produisent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : PCR des proies bibliothèque inserts. L’ADN a été isolé de levure diploïde contenant une bibliothèque de proie qui a été cultivée dans des conditions non sélective (Trp-Leu-CSM media) ou des conditions de sélection pour une interaction positive de Y2H (CSM-Leu-Trp-His media). PCR à travers la bibliothèque insère révèle des différences dans le répertoire d’inserts sélectionnés. Deux séries de croissance sélective ont été utilisés. Une première série de croissance faite par diluer 20 mL de 500 mL de culture diploïde dans 750 mL de non-sélective Trp-Leu-CSM media et un autre 20 mL de dans 750 mL de CSM-Leu-Trp-His médias pour une première série de croissance sélective (d1). Elle a été suivie d’un tour supplémentaire de croissance (d2) faite en prenant 2 mL de la culture de d1 et dilution dans 75 mL de milieux sélectifs CSM-Leu-Trp-His. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : complexité d’ADNc Y2H. Analyse du contenu d’une souris disponibles dans le commerce Y2H proie d’ADNc : une bibliothèque de cDNA de cerveau de souris et l’autre de nombreux tissus de souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : génération de la bibliothèque de fragment génomique de levure Y2H. A. schématique assemblage décrivant de la bibliothèque de fragment génomique de levure dans pGal4AD. L’ADN génomique de la souche PLY5725 a été aléatoirement cisaillé, ligaturé avec les adaptateurs Y indiquées et ligué dans SfiI-coupe pGal4AD. Ligature des trompes ont été transformées en bactéries de rendement 2.2 x 106 colonies indépendantes qui ont été combinées et cultivées avant l’isolement de leur ADN pour former la bibliothèque SacCer_TAB Y2H plasmidique. B. la LEU2-contenant le plasmide (pGal4AD) abritant la Gal4 domaine d’activation transcriptionnelle est montré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : complexité de banque génomique de levure Y2H. La banque génomique SacCer_TAB a été transformée en la souche MATalpha de PLY5725 et le PJ_C1, C2, C3, banque génomique de levure a été transformé en la souche ΜΑΤalpha de Υ187. Diploïdes de ces populations ont été faites par l’accouplement de la souche PJY69-4 a. Les populations ont été cultivées pendant 10 générations et fragments de proies que PCR amplifié ont été soumis à l’analyse et le séquençage haut-débit. A. présente le classement des lectures par chaque gène dans les bibliothèques de Y2H divisés par les lectures par gène, par séquençage du génome de la levure. Compte tenu de l’abondance équivalente de chaque gène, chaque gène aurait une valeur de 1. B. histogramme indiquant le nombre de plasmides uniques par gène codant un fragment qui est la protéine région (ORF) codant tant dans le cadre de lecture translationnelle adéquat. C. comparaison du nombre de plasmides différents dans chaque bibliothèque qui codent pour les gènes de la levure et la proportion d'entre eux qui sont et qui ne sont pas dans le cadre de lecture translationnelle correct ou sont insérées à l’envers. D. Emplacements montrant les positions et l’abondance des jonctions qui mappent aux gènes d’exemple (VPS8 et VPS16) trouvés pour les plasmides dans chaque bibliothèque. Plasmides avec des fusions de gènes qui se trouvent dans le cadre de lecture translationnelle correctes sont désignés bleu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : reproductibilité de DEEPN avec complexe banque génomique de la levure Y2H. A. quatre populations diploïdes de levure différents ont été créées en s’accouplant avec la bibliothèque SacCer_TAB Y2H abrité au sein de PLY5725, cultivées dans des conditions non sélectifs et séquencé. Les lectures par gène pour chaque population individuellement sont tracées en fonction de la valeur de l’ordre de grandeur moyenne dans l’ensemble de toutes les populations. B. affiche les lectures par gène entre deux échantillons après sélection pour des interactions positives avec Y2H. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ici, nous fournissons un guide pour savoir comment effectuer les dosages Y2H en lot à l’aide de méthodes optimisées. Il y a quelques étapes cruciales dans la procédure pour s’assurer que la population de levures qui seraient placés sous la sélection est représentatif de la bibliothèque de départ et que suffisamment de la population de levures départ sert à subir une sélection afin de limiter la variabilité . Ce qui est important, ces repères sont relativement faciles à réaliser aux côtés d’adapter les méthodes et les matériaux pour un dosage Y2H traditionnel, rendant ainsi accessible à la plupart des laboratoires équipés pour la biologie moléculaire standard de cette approche. DEEPN permet la sélection de la même population de bibliothèque de proies tout en utilisant des appâts différents plasmides. Par conséquent, l’ensemble de candidats qui interagissent qui produisent une interaction Y2H avec un appât par rapport à l’autre peut être directement comparé. Parce que le séquençage en profondeur est utilisé, on peut vérifier la composition de départ bibliothèque pour chaque population de levures spécifiques à appât et suivre l’enrichissement de chaque gène candidat de proies dans la bibliothèque de façon indépendante. Le traitement par lots permet d’interroger la même bibliothèque contre différents appâts de manière semi-quantitative permet alors de calculer un classement statistique4.

Il y a plusieurs étapes dans le présent protocole qui sont essentiels pour le succès. L’une est qu’un grand nombre d’espèces diploïdes doit être obtenu afin d’assurer une représentation adéquate de la bibliothèque de proies Y2H est mélangée à chaque appât de plasmide d’intérêt. La procédure correspondante décrite ici a été optimisée en faisant varier plusieurs paramètres. Nous avons constaté que certaines souches qui les bibliothèques Y2H commerciales maison s’accouplent mal en général, toutefois, la procédure correspondante décrite ici peut générer 2 x 106- 2 x 107 diploïdes lorsqu’il est suivi, permettant un transfert adéquat et reproductible de la Y2H bibliothèque dans la population. Un autre aspect essentiel de la procédure est d’assurer que le plasmide d’appât d’intérêt ne créer une interaction Y2H positive en soi ni avec le domaine d’activation vide Gal4 proie plasmide. La méthode de sélection d’une interaction Y2H réclame la croissance en l’absence de l’Histidine dans lequel une interaction positive de Y2H induit la transcription de HIS3 pour permettre aux cellules d’être son +. Alors que régulièrement les dosages Y2H traditionnels peuvent ajouter l’inhibiteur compétitif 3AT pour diminuer la croissance de l’arrière-plan ou utiliser les autres journalistes3 , cette procédure fonctionne mieux quand les cellules avec des interactions faibles Y2H modulable et augmentant ainsi la rigueur pour la croissance et en sélectionnant uniquement pour les cellules avec fortes interactions Y2H limite le répertoire des plasmides de proies qui peuvent être identifiés. Un autre aspect essentiel est de s’assurer qu’une quantité importante de la population diploïde départ utilisé pour croître dans des conditions pour éviter les goulets d’étranglement évolutionnaires d’échantillonnage erreur4 sélectifs et non sélectifs. Suite aux volumes de culture et de la cellule numéros spécifiés ici aidera à garantir la reproductibilité et de diminuer le bruit.

Une des raisons pour lesquelles que l’approche DEEPN est puissant est qu’il peut suivre globalement tous les plasmides dans une bibliothèque de proie donnée pour leur capacité à interagir avec l’appât d’intérêt. Ainsi, une des limites de DEEPN est la complexité de la librairie utilisée. Pour certains des bibliothèques commerciales comme celles que nous avons utilisé ici, nous avons constaté que le nombre de plasmides codant des véritables fragments d’ADNc ORF qui se trouvent dans le même cadre de lecture du domaine d’activation Gal4 est entre 3 et 6 x 104 avec représentation de ~ 6 000 - 8,00 0 différents gènes. Nous avons constaté que près de 75 % de ces bibliothèques contiennent des fragments correspondant uniquement aux régions de cDNA qui étaient 3' de la séquence codante de l’ADN (CDS/ORF). Par ailleurs, près d’un tiers des gènes ayant des fragments dans la bibliothèque n’en avait pas qui correspondent aux régions dans l’ORF ou en amont de l’ORF.

Nous avons fait trois autres changements à la méthode DEEPN. L’un est une nouvelle souche de MATalpha pouvant transporter « proie » bibliothèques logés dans un plasmide TRP1 et que mates beaucoup mieux que certaines souches de bibliothèque contenant disponibles dans le commerce tels que Y187. Cela permet de garantir un transfert complet de la population de la bibliothèque pour chaque appât d’intérêt. Nous avons également fait une nouvelle « appâts » plasmide d’expression, qui se distingue des plasmides décrites précédemment qui utilisent une copie variable basé sur 2µ épine dorsale10. Ici, nous décrivons un plasmide CEN peu de copies (pTEF-GBD) et trouver qu’un seul cycle de croissance sélective est suffisante pour enrichir pour interaction proies plasmides. Enfin, nous créons un vecteur de bibliothèque simplifiée « proies » et utilisé pour produire une bibliothèque de haute densitée aléatoire-fragment génomique Y2H pour Saccharomces cerevisiae, qui devrait être utile dans l’avenir pour la découverte et la caractérisation des interactions proximités protéines de levure. Dans l’ensemble, les améliorations dans les matériaux et outils bioinformatiques (décrites dans l’ouvrage qui l’accompagne) faire la DEEPN approcher de manière accessible, faisable et efficace de l’exécution globale et comparatives Y2H écrans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Nous remercions le personnel au sein de l’Institut de génétique humaine de séquençage et de préparation de bibliothèque NGS. Nous remercions Einat Snir pour son expertise dans la préparation des fragments de banque génomique pour la bibliothèque de plasmide Y2H faite ici. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health : NIH R21 EB021870-01 a 1 et de subvention de projet de recherche FNS : 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

Biochimie numéro 136 Interaction protéine prochaine génération de séquençage analyse des séquences ADN 2-hybride de levure
Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter