Här beskriver vi ett protokoll för den ytlig ven decellularization med tvättmedel och recellularization av perfusion av perifert blod och det endothelial mediet.
Vaskulär kraftledare används under de flesta vaskulär operationer är allogen eller syntetiska ympkvistar som ofta leder till komplikationer orsakade av immunsuppression och dålig patency. Vävnadsteknik erbjuder en ny lösning för att generera anpassade grafter med en naturlig extracellulär matrix som innehåller mottagarens celler med metoden decellularization och recellularization. Vi visar en detaljerad metod för att utföra decellularization av mänskliga ytlig ven och recellularization av perfusionen i perifert blod. Venen var cell-lösa startas 1% Triton x-100, 1% tri-n-butyl-fosfat (TnBP) och 2 000 Kunitz enheter av deoxyribonuclease (DNase). Triton x-100 och ensamt var perfusion vid 35 mL/min för 4 h medan DNAS var perfusion på 10 mL/min vid 37 ° C i 4 h. Venen tvättades i ultrarent vatten och PBS och sedan steriliseras i 0,1% Perättiksyra. Det var tvättas igen i PBS och konditioneras i endotel medium. Venen var ansluten till en bioreaktor och perfusion med endothelial medium innehållande 50 IE/mL heparin för 1 h. Recellularization utfördes genom att fylla den bioreaktor med färskt blod, utspädd 1:1 i Steen lösning och lägga till endokrin körtel-derived vaskulär endotel tillväxtfaktor (80 ng/mL), basic fibroblast tillväxtfaktor (4 µL/mL) och acetyl salicylsyra (5 µg/mL). Bioreaktor sedan flyttades till en inkubator och perfusion för 48 h på 2 mL/min samtidigt som glukos mellan 3-9 mmol/L. Senare, venen tvättas med PBS, fylldes med endothelial medium och perfusion för 96 h i inkubatorn. Behandling med Triton x-100, ensamt och DNAS decellularized den ytlig ven i 5 cykler. Cell-lösa venen såg vita i motsats till normala och recellularized vener (ljusröd). Den hematoxylin och eosin (H & E) färgning visade förekomst av atomkärnor endast i normal men inte i cell-lösa vener. I recellularized anda visade H & E-färgning närvaron av celler på luminala ytan av venen.
Vaskulär conduits krävs för flera kliniska tillstånd som aneurysm, halspulsådern stenos och åderförkalkning som leder till allvarliga vaskulära problem. Kirurger använder autologa, allogena eller syntetiska vaskulär conduits för att återställa funktionella blodtillförseln. Även om användningen av autologt blod fartyg anses fortfarande vara den idealiska strategin, begränsas majorly tillgängligheten hos patienter. Alternativen som allogen eller syntetiska transplantat har djupgående problem med immunsuppressiva behandlingar och dålig patency leder till omoperation1,2, vilket resulterar i stora ekonomiska bördor till länder. Vävnadsteknik av blodkärl syftar till att ge grafter med en naturlig homologi och autologa celler. Således, mottagarens immunsystemet erkänner transplanterade transplantat som jaget och eftersom sådana ett transplantat innehåller naturliga proteiner och celler i den ursprungliga konfigurationen, det kanske fungerar bättre i jämförelse med de aktuella alternativen. Vävnadstekniska organ, såsom urinblåsan3, urinröret4, luftstrupen5och vener6,7, har använts framgångsrikt i kliniken.
Tissue engineering för att producera personlig transplantat kräver ett transplantat från en donator som följt av decellularization och recellularization. Decellularization är en lovande teknik för att ta bort celler från vävnader och organ8,9,10. Decellularization kan utföras genom särskilda fysiska, kemiska och enzymatiska metoder11 eller kombinera dem. På optimal användning av dessa metoder, kan cell-lösa vävnader ha liknande strukturella och funktionella proteiner i en extracellulär matrix som liknar infödda vävnader. Sådana organ besitter inneboende kapacitet att förbättra fastsättning, migration, proliferation och differentiering av inkommande stamceller.
Recellularization är en dynamisk process av sådd celler i transplantatet och mottagarens stamceller kan användas för kliniska transplantationer. Stamceller som för närvarande används för sådana ändamål inkluderar benmärg, mesenkymala och orgel invånare3,5,6. Djur och forskningsinriktade studier har använt stamceller från mesenkymala ursprung som är fostrets och inducerade pluripotenta12,13,14. Denna process kräver en bioreaktor (en kammare som rymmer venen och ger nödvändiga förutsättningar som temperatur, gaser, pH och tryck), celler och kultur media. Utmaningen i recellularization är att uppnå erforderligt antal celler av en viss typ och en sådd strategi genom vilken celler kan nå hela vävnad eller organ. Även om ingen komplett vävnad eller organ strukturellt och funktionellt har genererats och utvärderats hittills, visar flera framsteg på området och de första resultaten de framtida möjlighet15. Den viktigaste funktionen av ven ligger i luminala endotel som styr infiltration av inflammatoriska celler i vävnader och det mellersta muskulatur skikt som hjälper i sammandragning och ger också styrka att hålla blodtrycket16. Studier har visat att under skada, endothelialization sker antingen från anastomos eller från cirkulerande endotelceller stamceller (EPC) i blod17,18,19. Vår strategi för recellularization av vener är beroende av EPCs närvarande i cirkulerande blod.
Vävnadsteknik vener och artärer framfördes av flera grupper efter olika decellularization och recellularization strategier20,21. Vår grupp har också utfört och utvecklat decellularization och recellularization strategier för iliaca och mjölkkörtlar vener6,7. Decellularization utfördes av agitation av venen i Triton X-100, tri-n-butyl fosfat (TnBP) och enzymet deoxyribonuclease (DNase). Recellularization utfördes med hjälp av antingen benmärgen härrör endothelial och smidig muskel celler6 eller perifert blod7. Venerna recellularized av antingen protokollet visade kliniska löfte att tillhandahålla funktionell blodtillförsel i transplantation av pediatriska patienter med extra nedsatt portvenen obstruktion6,7.
För närvarande har vi utvecklat en modifierad version av samma protokoll för den förbättrade och lätt decellularization, recellularization och bioreaktor hantering av liten diameter vener. Det nuvarande decellularization-protokollet krävs perfusion av rengöringsmedel genom venen med trycket istället för agitation med rengöringsmedel. Recellularization protokollet innebär ytterligare ett steg av prekonditionering för att förbättra celladhesion och tillägg av tillväxtfaktorer i cirkulerande blod för att förbättra celladhesion, överlevnad och spridning. Vi har också förbättrat utformningen av den bioreaktor som använder kommersiellt tillgängliga produkter. I detta papper presentera vi en detaljerad beskrivning av det modifierade protokollet för att utföra decellularization och recellularization av mänskliga ytlig venerna.
Tekniken presenteras här för decellularization av ytlig venerna är en lätt, enkel och kostnadseffektiv metod som också kan tillämpas på alla liten diameter vener som navelsträngen och mjölkkörtlar vener. De decellularization lösningarna och deras koncentrationer som används i denna metod är från våra tidigare resultat6,7. Även om vi rekommenderar 5 cykler av decellularization, i vissa vener märkte också vi kompletta decellularization i 3 cykler. Reproducerbara resultat erhölls dock med hjälp av 5 cykler. Tillämpningen av detta protokoll skall vi cell-lösa venerna i varierande längder upp till 30 cm framgångsrikt (opublicerade resultat). Lyft decellularization lösningens utlopp genom 45 cm kommer att skapa ett tryck på 33 mmHg inuti venen. Vår erfarenhet märkte vi detta som ett viktigt steg i decellularizing hela venen jämnt och reproducibly 5 cykler. Valda trycket är 3 gånger högre än normala ytlig ven trycket (5-10 mmHg) men är samma som inkompetent vener (åderbråck)23. Dessutom kan spekulera vi att det höga trycket kommer att skapa en betydande kraft på ven väggar och får därför stöd i effektivare och snabbare cell borttagning.
Eftersom TnBP är ett organiskt lösningsmedel och olöslig i vatten, omrörning tvättmedlet tills det blir molnigt är viktigt; annars flyter tvättmedel. Av samma anledning, för att hålla TnBP blandas i lösning, placerades tvättmedels outlet tube överst i glasburken med slang utloppet. Effektiv borttagning av TnBP från venen efter dess användning i varje cykel kan ses av avsaknaden av flytande TnBP droppar i tvättad vattnet. Vi har också märkt att hoppa över steget DNAS producerade också en cell-lösa vävnad men i några fall, märktes en jämförelsevis hög DNA-innehåll i cell-lösa vävnaden. Som högt tryck och höga flöden inte krävs för effektiv DNAS aktivitet, kan en låg perfusion hastighet (10 mL/min) användas. En annan peristaltiska pumpen användes som dess mindre storlek bidrar till smidig hantering av installationen. Eftersom vi märkt att skador av de flesta celler under decellularization resultat i cykel 2, föreslår vi att hoppa DNAS behandling under cykler 1 och 3 (opublicerade resultat). Även om karakterisering och kvantifiering av extracellulära matrix proteiner inte utfördes i detta manuskript, vår tidigare erfarenhet av liknande decellularization protokoll visade bevarandet av biomekaniska egenskaper, extracellulär matrix struktur och proteiner7. Men våra preliminära kvantifiering experiment med dessa vener produceras ett liknande resultat (opublicerade), kommer att våra redan publicerade resultat stärka detta förtroende.
Recellularization med blod är en bekväm och enkel process över benmärgsceller expanderat som man kan undvika långa cellen expansion gånger, spontana mutationer i utökad celler, kirurgiska invasion och obehag för patienten. Eftersom det är känt att endothelialization kan också uppstå från cirkulerande EPCs, vi hypotesen att perfusion med blod följt av perfusion med endothelial medium kommer räcka för recellularization. Säkerheten för ven vävnader konstruerad med en liknande metod ses från framgångsrika resultaten av transplantation när två sådana vener var implanteras i barn med extra nedsatt portvenen obstruktion7. Vi spekulerar i att tillväxtfaktorerna i cell-lösa extracellulära matrix kommer att möjliggöra fastsättning av cirkulerande EPCs från blod24. Recellularization i venerna efter en liknande protokoll visade celler positivt för VEGF-receptor-2 och kluster av differentiering (CD) 14 på lumen medan CD45 uttrycker celler sågs i adventitia7. Vi har också tänka sig att en kontinuerlig endothelial lagret inte kan observeras i alla fall speciellt när man använder blod från äldre och sjuka patienter eftersom det är känt att sådana individer har minskat antalet cirkulerande stamceller celler25. Vi antar att perfusion med mottagarens eget blod kan dölja många av de antigener som är utsatta på grund av decellularization och kan därför minska risken för inflammatoriska biverkningar när transplanterade i motsats till omplantering endast cell-lösa blodkärl. Dessutom kan blodgenomströmning insättning ökade nivåer av tillväxtfaktorer på lumen och adventitia som i sin tur kan rekrytera ökade antalet cirkulerande stamceller som resulterar i en snabb process av recellularization i vivo.
Fördelarna med den bioreaktor design används i denna studie är komplett autoklavering, enkel montering, kostnadseffektivitet, enkel hantering och minst möjligheten till skada. Vår erfarenhet använder nuvarande design, vener upp till 10 cm i längd var recellularized. Även om vener upp till 25 cm i längd kan också vara recellularized genom att hålla ven i ”U”-formen inuti bioreaktor, detta ska valideras. Bioreaktor design visar att flödesriktningen i venen är mot gravitationen och är utformad som sådant eftersom det är den normala riktningen av flödet för dessa vener hos människor. 12 h perfusionen av endothelial medium steget är att förutsättning venen och öka affinitet för fastsättning av inkommande EPCs. Tillägg av extra heparin och perfusion för 1 h kommer risken att bilda blodproppar i rören under blodgenomströmning.
Volymen av blod som krävs är beroende av längden på venen. Den grundläggande principen vi följer för blodvolym är att venen bör vara nersänkt i blod. Vid hantering av blod-volymer som är större än 45 mL, kan tillfällig blandning krävas för att förhindra cell ackumulering i botten av bioreaktor. Vi lagt till Steen lösning på blod eftersom den innehåller en hög mängd proteiner och komponenter som krävs för att underhålla vävnader friska under organtransplantation26,27. Tillägg av VEGF och b-FGF är fördelaktigt eftersom de är potenta angiogena tillväxtfaktorer28 och deras närvaro inducerar migration, proliferation och differentiering av EPCs29,30,31,32 . Mängden VEGF lagt till bygger på våra tidigare opublicerade resultat där spridningen av EPCs sågs vid 80 ng/mL. Tillägg av acetylsalicylsyra hämmar aktiveringen av trombocyter33 vilket minskar chanserna för deras fastsättning endothelial lagret. Kontinuerlig övervakning och tillsats av glukos kommer också vara fördelaktigt för cellproliferation och förhindra hemolys av röda blodkroppar.
Eftersom det krävs endast ett enkelt blodprov från mottagaren, kan det betraktas som ett enkelt och genomförbart förfarande som kräver mindre teknisk expertis. Även om hela proceduren visas här från början till slut tar 20 dagar, lagra cell-lösa venerna som en från hyllan produkt kommer att förkorta förfarandet till 8 dagar för patienter. Även lagring av cell-lösa vener tekniskt inte bör påverka recellularization effektivitet, måste det utvärderas. Vävnadstekniska vener genereras följande procedur kan användas i kliniken för bypass operationer, ersätter blockerade vener, venös insufficiens leder till åderbråck utan behov av immunsystemet och vilket ger en bättre kvalitet på liv för patienten.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Professor Anders Jeppsson för hjälp med att ge blod fartyg som används i experiment. Studien finansierades av LUA ALF bidraget till SSH.
4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
Shaker | Ika | KS4000 i control | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Steen solution | Xvivo | 19004 | |
Suture | Agnthos | 14817 | |
Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |