Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以获得一个大视野 (FOV) 三维 (3D) 荧光和 OCT 视网膜图像的新的成像多式联运平台。我们将介绍系统设置、校准方法和操作协议。在体内成像将被证明, 并有代表性的结果将提供。
Abstract
虽然荧光成像在眼科广泛应用, 但大视野 (FOV) 三维 (3D) 荧光视网膜图像仍然是一个巨大的挑战与最新的视网膜成像方式, 因为他们需要 z 叠加编译容量数据集。新的光学相干层析成像 (oct) 和 oct 血管造影 (奥克塔) 系统克服了这些限制, 提供三维 (3D) 解剖和血管图像, 但 OCT 的无染料性质不能想象泄漏指示血管功能 障碍。该协议描述了一种新的斜扫描激光检眼镜 (奥斯陆) 技术, 提供3D 容量荧光视网膜成像。成像系统的设置产生斜扫描的鸽子尾巴滑块, 并使最终成像系统的角度, 以检测荧光横断面图像。该系统采用激光扫描方法, 因此, 允许简单地将 OCT 作为互补容积结构成像模式。对大鼠视网膜的活体成像进行了演示。荧光素溶液是静脉注射注射, 以产生容量荧光素血管造影 (vFA)。
Introduction
眼科和视觉科学从现代光学成像技术中受益很大, 因为视网膜可以很容易地接触到光。荧光视网膜成像是诊断和治疗脉络膜视网膜血管疾病的重要工具, 如糖尿病视网膜病变 (DR) 和年龄相关的黄斑变性 (AMD), 这两者都是导致美国失明的主要原因。
然而, 利用荧光成像技术获得大视场 (FOV)、三维 (3D) 视网膜成像仍具有挑战性。眼底摄影没有深度分辨能力, 也不排斥漫射光。因此, 不同深度的信号混合可以降低图像质量。扫描激光检眼镜 (斯洛伐克) 和共焦斯洛伐克 (cSLO) 可通过共聚焦浇口1降低散射光的影响。然而, 由于其聚焦深度的限制, 斯洛伐克或 cSLO 很难获得3D 人的视网膜图像。自适应光学斯洛伐克 (AOSLO) 可以通过校正人眼所引入的波前畸变来提供高超的分辨率和对比度。然而, AOSLO 仍然需要 z 堆叠的容积成像2。光学相干层析成像 (oct)3和 oct 血管造影 (奥克塔) 系统克服这些限制, 提供三维 (3D) 解剖和血管图像 4,5,6, 但无染料的性质OCT 不能可视化泄漏指示血管功能障碍。
该协议描述了一种新的3D 容量荧光视网膜成像多模态平台, 即斜扫描激光检眼镜 (奥斯陆)。在这个成像系统中, 斜扫描是由鸽子尾滑块产生的, 最后的成像系统以角度对齐, 以检测荧光剖面图像。该系统采用激光扫描方法, 这些技术允许与 OCT 简单地结合, 作为一个互补的体积结构成像方式。目前, 大鼠视网膜的深度分辨率约为25µm, 视野为30°。从根本上说, 奥斯陆允许荧光版的 oct, 并可以同时结合 oct 和奥克塔在一个大 FOV。
在本议定书中, 我们将介绍奥斯陆的设置、对准和构造方法、大鼠视网膜活体成像方法和代表性结果。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了波士顿医疗中心动物护理和使用委员会 (ACUC) 的批准。
1. 系统设置
- 奥斯陆系统
- 使用超连续谱激光源作为系统激光源。
- 用分色镜 (DM1) 将可见光范围 (450-650 nm) 从较高波长范围 (650-2000 nm) 中分离出来。在光束通过偏振光束分配器 (PBS) 后, 用一对色散棱镜展开频谱。
- 放置一个狭缝, 以选择激发波长范围 (475-495 nm)。使用反射镜将过滤后的光束反射回棱镜对, 然后将光耦合到单模光纤中 (SMF 1)。
- 使用光谱仪来确认单模光纤输出的波长选择。
- 将单模光纤连接到两个级联光纤耦合器, 如图 2所示。第二光纤耦合器中的光纤输出端口之一向奥斯陆系统提供光。
- 瞄准首先在奥斯陆系统中进行激光。
- 用振镜 (GM1) 偏转激光。通过1:1 望远镜系统将激光器中继到第二个振镜 (GM2), 并通过3:1 望远镜系统进一步中继到眼睛的瞳孔。
- 在3:1 望远镜系统内安装一个分色镜 (DM2), 以反映荧光信号。
- 在自定义的鸽子尾滑块上安装3:1 望远镜系统和分色镜 (DM2), 以抵消光轴并创建倾斜扫描照明, 如图 3所示。使用卡尺精确地控制偏移长度根据需要。
- 荧光成像光路。
- 用分色镜反射荧光, 并继电器到第三振镜, 以消除扫描慢扫描。
- 用另外1:1 台望远镜系统将光传给成像物镜。在翻译阶段安装上述光学。
注: 在第三个振镜 (GM3) 下安装两个额外的平移阶段, 以提供在自由度上的冗余, 以优化成像。
- 在具有三自由度 (旋转和两个平移轴) 的舞台上安装最终成像系统。使用平面相机捕捉截面荧光图像。
- 使用超连续谱激光源作为系统激光源。
- 光学相干层析成像系统
- 使用相同的超连续谱激光源作为系统激光源。
- 用另一种分色镜 (DM3) 将近红外线 (近红外) 范围 (650-900 nm) 与剩余光 (650-2000 nm) 分开。使用长通滤波器进一步限制带宽到 800-900 nm。将光束耦合成单模光纤 (SMF 2)。
- 将单模光纤连接到两个级联光纤耦合器的另一个输入端口, 并与蓝色奥斯陆励磁相结合。将第二光纤耦合器的第二输出端口的光直接定向到 OCT 参考臂, 其中有一个可变中性密度滤波器 (VNDF)、色散补偿板和反射镜。
注: 在第二光纤耦合器上从参考臂和眼睛重组返回的光, 并传送到 OCT 光谱仪收集信号。
- 使用相同的超连续谱激光源作为系统激光源。
- 数据采集
- 使用在 LabVIEW 编写的数据采集系统软件, 并从奥克塔7、8、9、10的扫描协议中进行修改。对于每一个 B 扫描, 一个80% 工作周期锯齿与500步是输出的模拟输出板 (AO1), 以控制 x ' 快速扫描镜, GM2。
- 仅当镜像处于正向扫描方向时, 在每个步骤中触发行扫描摄像机以获取 OCT 的数据。将线扫描摄像机的曝光时间设置为17µs。
- 要获取奥克塔信号, 请在同一 B 扫描位置重复测量5次。
- 将 AO 输出速率设置为100赫, OCT 的 A 线速率为50赫。控制 y ' 慢扫描镜, GM1, 由一个倾斜的波形。同步扫描镜像, GM3, 与 GM1, 以消除扫描慢扫描。
- 通过另一个模拟输出板 (AO2) 触发平面摄像机, 在每个 y 位置捕获一个荧光图像。裁剪图像大小或 bin 相邻像素以提高所需的速度和灵敏度。
2. 系统对齐
- 调整奥斯陆光源中的狭缝以选择蓝色激发波长。使用光谱仪监测光谱范围约475-490 纳米。
- 调整鸽子尾部装入滑块, 将光轴移动5毫米。这将导致在老鼠瞳孔的偏移量为 ~ 1.7 毫米, 导致在视网膜上的斜角。
- 用相同的5毫米调整荧光检测光学的平移阶段。
- 将最终的荧光成像系统调整为 ~ 30°。
- 使用电能表测量光功率。确保蓝色奥斯陆励磁功率为≤0.2 兆瓦和 OCT 激光功率≤0.8 兆瓦, 不会引起视网膜损伤。
注: 根据 ANSI 标准, 最大许可暴露 (MPE) 到视网膜的水平为2兆瓦7,8在可见光范围内。根据 Delori等公式。9、近红外光的 MPE 比可见光高约两倍, 约4兆瓦。
3.活体动物实验
- 将12周长的埃文斯大鼠转移到感应室。用4.5% 异氟醚在氧气中麻醉10分钟, 用异氟醚蒸发器的流速为2升/分。
- 确认麻醉深度, 这是指在指数捏中缺乏退缩反射所决定的。
- 感应后, 把老鼠放在一个5轴 (x, y, z 平移, 偏航和音高) 持有人。通过加热阶段、循环温水毯或其他适宜的方法在长期试验中提供补充热量。保持麻醉在1.5% 的 isofluorane 与流速为2升/分钟在余下的部分的实验。当不使用具有主动排气的感应腔时, 感应腔应放置在回燃现象或下沉台或在通气管下以清除异氟醚。
- 用 1% Tropicamide 眼科溶液扩张瞳孔2分钟。如有必要, 在大鼠眼中应用0.5% 丁卡因眼科溶液进行额外的局部麻醉。在实验中, 每分钟至少用一次商业人工泪让眼睛湿润。
- 注射荧光素盐 (10% 瓦特/w) 或 FITC (10% 瓦特/w) 稀释在无菌生理盐水 (0.1-0.3 毫升) 通过尾静脉与1毫升注射器和29G 针。
- 打开激光源。放置中性密度过滤器, 在对齐过程中衰减蓝光激发。测量 OCT 光的功率为0.8 兆瓦, 蓝光 < 0.01 兆瓦, 以避免白内障的形成。
- 启动振镜扫描和对齐模式。调整眼睛球的高度, 使角膜上固定的激光点。调整大鼠的眼睛位置, 使瞳孔的边缘大致垂直于激光, 并将激光偏移到眼睛的顶端中心约1.5 毫米。
- 进一步调整动物持有者, 直到 OCT 图像达到最佳质量。在 x ' 快速扫描方向, 确保横截 B 扫描图像显示为平面。当切换到 y ' 慢扫描方向, 确保横断面 B 扫描图像出现倾斜, 由于倾斜扫描。
- 将中性密度滤波器移至蓝光励磁, 并监控摄像机的实时馈源。横断面荧光图像应显示出不同深度的血管。
- 调整最终荧光成像系统的聚焦, 达到最佳聚焦。允许微调的眼睛位置在横向平面, 以达到最佳的奥斯陆图像质量。
- 对齐后, 开始获得同时奥克塔和容量荧光素血管造影 (vFA)。
- 利用 Matlab 构造奥克塔和奥斯陆的容积图像。这些算法以前是详细描述的10。通过图像分割生成深度分辨的视网膜 vasculatures。
- 完成成像后, 关闭激光, 释放动物, 并在眼睛上涂抹一些眼膏, 然后将动物放在康复箱中。
- 不要让动物无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以维持胸骨卧床或根据机构政策。
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Representative Results
图 4a显示了大鼠视网膜的横断面 OCT 图像。图 4b-4c显示同一时间获得的奥克塔和奥斯陆 vFA 相同的视网膜横断面图像。奥斯陆使横断面法类似于 OCT B 扫描。与奥克塔相比, 奥斯陆 vFA 横断面图像清楚地识别出神经纤维层 (NFL) 和神经节细胞层 (协鑫) 中的血管, 以及外层网状层 (OPL) 中的毛细血管。图 4d和4g显示了奥克塔和奥斯陆 vFA 图像的表层。与奥克塔不同, 奥斯陆 vFA 图像 (图 4g) 利用荧光发射对比度避免了运动工件 (图 4d中的垂直条纹)。通过比较奥斯陆 vFA (图 4e) 和奥克塔 (图 4h) 在视网膜中间层的图像, 垂直跳水船清楚地显示在奥斯陆 FA 图像, 但不明显在奥克塔。这大概是因为血流速度或血管定向会影响奥克塔信号, 而不是奥斯陆荧光对比度。
图 4f和4i显示了深毛细血管丛层内的图像。在奥斯陆 vFA 蓝色箭头指出的区域比奥克塔在脉管中有更好的对比。奥斯陆的白色箭头指出的静脉的大小比奥克塔的大。总的来说, 奥斯陆 vFA 图像比奥克塔更准确地与实际的血管形态学相似, 因为它不依赖于血流速度或血管方向。视频 1显示了从奥斯陆和奥克塔两个同时获得的容量数据集的en 面飞行。
图1。系统示意图.请单击此处查看此图的较大版本.
图2。两个级联光纤耦合器的照片, 直接奥斯陆和 OCT 光.光通行证的路线被标记。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。鸽子尾部安装的设置, 用于倾斜照明.(a) 斜光照部分的固体工作模型。(b)放大的视图, 和鸽子尾部安装的单独视图。(d) 拍摄斜照部分的实际设置。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。奥斯陆和奥克塔同时获得的大鼠视网膜图像.(a) 《华侨城》 (b) 奥克塔和 (c) 奥斯陆法的横断面图像的例子。面板 (d) 和 (g) 显示从表层的表面 OCT 和奥斯陆 FA 图像。用红色箭头指出了奥克塔图像中的运动伪影。面板 (e) 和 (h) 显示中间层的结果。船只潜入下一层的位置被黄色箭头指出, 奥斯陆法比奥克塔更清楚。面板 (f) 和 (i) 显示的结果, 从深毛细管丛层。奥斯陆的对比比奥克塔在蓝色箭头指出的区域要好。奥斯陆的白色箭头指出的静脉的大小比奥克塔的大。图表中的条形图为200µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们已经描述了奥斯陆, 一个在体内容积荧光视网膜成像技术与 FOV 超过了30°。与目前眼科护理成像方法标准的 OCT 相比, 奥斯陆提供了类似的3D 成像能力, 但也允许了 oct 不敏感的荧光对比度。奥斯陆的优势在于它只需要一个光栅扫描, 从而允许 OCT 的无缝组合, 为结构和荧光容积成像提供两种互补技术。
在该协议中, 获得良好图像质量的关键是大鼠眼的清晰度。如果奥斯陆图像被遮蔽, 检查是否有白内障形成。氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉、角膜干燥、蓝光照射等几个因素会导致白内障的形成, 这将显著恶化图像质量。预防白内障, 避免连续暴露在蓝光中超过2分钟;至少每分钟涂抹一次人工眼泪, 以防止角膜干燥;并允许眼睛休息至少30秒的成像部分通过阻止光。
我们设想, 奥斯陆可以显著影响荧光成像的临床实践。结果表明, 深度分辨力能有效地消除外源视网膜的信号, 使高对比度的容积法图像下降到单毛细管水平, 这是传统斯洛伐克所无法获得的。显着改善的图像清晰度将允许更灵敏的检测和量化的血-视网膜屏障破坏和视网膜毛细血管渗漏, 标志性黄斑水肿在 DR 和其他脉络膜视网膜血管疾病。
在目前的系统中, CCD 摄像机的速度是每秒20帧, 导致 > 25 秒的采集时间。一个科学的 CMOS 相机将大大提高系统的速度。荧光检测具有与光照相分离的不同光路。在今后的设计中使用相同的光路进行光照和检测, 将简化系统。综述了一种新型的容积式视网膜成像多模态平台, 即斜扫描激光检眼镜 (奥斯陆)。应用奥斯陆和同时光学相干层析成像 (OCT) 对大鼠视网膜的 FOV 角进行体外成像。
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Disclosures
济易持有奥斯陆的未决专利。其他作者声明没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
资金来源来自波士顿医疗中心的埃文斯医疗基金会提供的资金, 以及来自 NIH 5R01CA183101、CTSI 试点赠款1UL1TR001430、乔斯林试点项目和 CTSI KL2TR001411 的分包合同。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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