Summary
Aquí, presentamos un protocolo para obtener una imagen retiniana OCT y fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) mediante una novedosa plataforma multimodal proyección de imagen. Vamos a introducir la configuración del sistema, el método de alineación y protocolos operacionales. Se demostrará en vivo la proyección de imagen, y se proporcionará resultados representativos.
Abstract
Mientras que la proyección de imagen de la fluorescencia es ampliamente utilizada en Oftalmología, una imagen retiniana de la fluorescencia (3D) tridimensional de gran campo de visión (FOV) sigue siendo un gran reto con la retina de vanguardia imagen modalidades porque requerirían z de apilamiento para compilar un conjunto de datos volumétrico. Nueva tomografía de coherencia óptica (OCT) y sistemas de angiografía (OCTA) OCT superan estas restricciones para proporcionar imágenes tridimensionales (3D) de anatómico y vasculares, pero la naturaleza libre de tinte de OCT no puede visualizar salida indicativa de vascular disfunción. Este protocolo describe un oblicuo novedoso láser oftalmoscopia (oSLO) técnica que ofrece la proyección de imagen retiniana fluorescencia volumétrica 3D de escaneo. La configuración del sistema de proyección de imagen genera el oblicuo de un deslizador de cola de Paloma y alinea el sistema de imagen final en un ángulo de detección fluorescentes imágenes seccionadas transversalmente. El sistema utiliza el láser método de análisis y por lo tanto, permite una fácil incorporación de OCT como una modalidad de proyección de imagen estructural volumétrica complementaria. En vivo la proyección de imagen en la retina de la rata se demuestra aquí. Solución de fluoresceína se inyecta por vía intravenosa para producir la angiografía de la fluoresceína volumétrica (vFA).
Introduction
Oftalmología y visión de la ciencia se beneficiaría enormemente de las modernas técnicas de imagen ópticas, puesto que la retina se puede acceder fácilmente con la luz. La proyección de imagen retiniana de la fluorescencia es una herramienta esencial en el diagnóstico y manejo de coriorretinal enfermedades vasculares como la retinopatía diabética (RD) y degeneración macular senil (DMS), los cuales son principales a causas de ceguera en los Estados Unidos.
Sin embargo, es todavía difícil para adquirir un gran campo de visión (FOV), retiniana de (3D) tridimensional de imágenes mediante el uso de imágenes por fluorescencia. Fotografía del fondo no tiene la capacidad de resolución de profundidad y no rechace la luz difusa. Como resultado, la mezcla de señales de diversa profundidad reduce la calidad de imagen. Exploración oftalmoscopia de láser (SLO) y confocal puede SLO (cSLO) reducir el efecto de luz difusa mediante el uso de bloquea confocal1. Sin embargo, es difícil para SLO o cSLO para adquirir una imagen 3D de retina humana debido al límite de su profundidad de foco. Óptica adaptativa SLO (AOSLO) puede proporcionar excelente resolución y contraste mediante la corrección de las aberraciones de frente de onda que el ojo humano. Sin embargo, AOSLO todavía tendría z de apilamiento para la proyección de imagen volumétrica2. Tomografía de coherencia óptica3 y sistemas de angiografía (OCTA) OCT superan estas restricciones para proporcionar tres dimensiones (3D) las imágenes anatómica y vascular4,5,6, pero la naturaleza libre de tinte de OCT no puede visualizar fugas indicativos de disfunción vascular.
Este protocolo describe una novela plataforma multimodal para retina de fluorescencia volumétrica 3D de imágenes, es decir oblicuas exploración oftalmoscopia de láser (oSLO). En este sistema de proyección de imagen, un análisis oblicuo se generaron por un deslizador de cola de Paloma, y un sistema de imagen final esté alineado en un ángulo para detectar fluorescencia Cruz imágenes seccionales. El sistema utiliza métodos de escaneo láser, y estas técnicas permiten la fácil incorporación con OCT como una modalidad de proyección de imagen estructural volumétrica complementaria. La resolución de profundidad actual es de 25 μm en la retina de la rata y el campo de visión es de 30°. Esencialmente, el oSLO permite una versión fluorescente de OCT y se puede combinar simultáneamente con OCT y OCTA sobre un gran campo de visión.
En este protocolo, describimos la configuración de la oSLO, el método de alineación y construcción, el método de las imágenes en vivo de retina de rata y los resultados representativos.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) del centro médico de Boston.
1. configuración del sistema
- Sistema de oSLO
- Utilizar una fuente láser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.
- Separar la gama ligera visible (450-650 nm) de mayor rango de longitud de onda (nm 650-2000) por un espejo dicroico (DM1). Ampliar el espectro con un par de prismas de dispersión después de la viga pasa a través de un divisor de haz de polarización (PBS).
- Lugar una rendija para seleccionar la gama de longitud de onda de excitación (475-495 nm). Use un espejo reflexivo para reflejar el rayo filtrado al par del prisma y luego acoplar la luz en una fibra monomodo (SMF 1).
- Utilice un espectrómetro para confirmar la selección de la longitud de onda en la salida de la fibra del solo modo.
- Conectar la fibra del solo modo con dos acopladores de fibra óptica en cascada como se muestra en la figura 2. Uno de los puertos de salida de fibra desde el segundo acoplador de fibra ofrece la luz para el sistema de oSLO.
- Colimar el láser primero en el sistema de oSLO.
- Desviar el láser por el espejo de un galvanómetro (GM1). Relé el láser a un segundo espejo del galvanómetro (GM2) por un sistema de telescopio de 1:1 y otras relé a la pupila del ojo mediante un sistema de telescopio de 3:1.
- Instale un espejo dicroico (DM2) en el sistema del telescopio de 3:1 para reflejar las señales de fluorescencia.
- Montar el sistema del telescopio de 3:1 y el espejo dicroico (DM2) en un deslizador de cola de Paloma modificado para requisitos particulares para compensar el eje óptico y crear el oblicuo análisis de iluminación como se muestra en la figura 3. Use un calibrador para controlar con precisión la longitud de desplazamiento como se desee.
- Camino óptico de fluorescencia.
- Reflejar la fluorescencia por el espejo dicroico y relé para el tercer espejo del galvanómetro a la exploración la exploración lenta.
- Relé de la luz a una imagen objetivo por otro sistema de telescopio de 1:1. Instalar la óptica arriba en una etapa de la traducción.
Nota: Dos etapas de traducción adicionales se instalan en el tercer espejo del galvanómetro (GM3) para proporcionar redundancia en los grados de libertad para optimizar la proyección de imagen.
- Montar un sistema de proyección de imagen final en un escenario que tiene tres grados de libertad (rotación y dos ejes de la traducción). Utilice una cámara planar para capturar las imágenes de fluorescencia transversal.
- Utilizar una fuente láser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.
- Sistema de tomografía de coherencia óptica
- Utilizar la misma fuente de laser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.
- Separar la gama cerca de (NIR) infrarroja (650-900 nanómetro) la luz restante (650-2000 nm) por otro espejo dicroico (DM3). Utilice un filtro de pase largo para limitar aún más el ancho de banda de 800-900 nm. Pareja la viga en una fibra monomodo (SMF 2).
- Conecte la fibra del solo modo al puerto de entrada de los dos acopladores de fibra óptica en cascada para combinar con la excitación de oSLO azul. Dirigir la luz desde el segundo puerto de salida del segunda fibra acoplador para el brazo de referencia OCT, que tiene un filtro de densidad neutra variable (VNDF), las placas de compensación de dispersión y un espejo reflectante.
Nota: La luz devuelta desde el brazo de referencia y el ojo recombina en el segundo acoplador de fibra óptica y se entrega al espectrómetro de OCT para recoger la señal.
- Utilizar la misma fuente de laser de supercontinuum como la fuente de láser de sistema.
- Adquisición de datos
- Utiliza un software de sistema de adquisición de datos escrito en LabVIEW y modificado a partir del Protocolo de exploración de OCTA7,8,9,10. Para cada B-scan, un ciclo de deber del 80% que la sierra diente con 500 pasos salida por una placa de salida analógica (OA1) controlar la x' espejo de escaneado rápido, GM2.
- Activar la cámara de exploración por línea en cada paso para la adquisición de datos para los PTU solamente cuando el espejo está en adelante dirección de análisis. Establecer el tiempo de exposición de la cámara de exploración de línea que 17 μs.
- Para adquirir la señal de la OCTA, repita la medición 5 veces en el mismo lugar de B-scan.
- Establecer la tasa de salida AO a 100 kHz y la tasa-Vestido de noche de OCT a 50 kHz. Control de la y' lento análisis espejo, GM1, por una forma de onda de rampa. Sincronizar el espejo de la exploración, GM3, con GM1-escanear la exploración lenta.
- Activar la cámara planar por otro tablero de salida analógica (AO2) para capturar una imagen fluorescente en cada y' ubicación. Recortar el tamaño de imagen o bin los píxeles vecinos para aumentar la velocidad y la sensibilidad deseada.
2. el sistema alineación
- Ajuste la abertura en la fuente de luz de oSLO para seleccionar la longitud de onda de excitación azul. Usar un espectrómetro para monitorear el espectro para ser alrededor de 475-490 nm.
- Ajuste el regulador de montaje de cola de Paloma para desplazar el eje óptico por ~ 5 mm. Esto dará lugar a un desplazamiento en la pupila de rata ~1.7 mm, resultando en un ángulo oblicuo de ~ 15° en la retina.
- La misma de 5 mm para ajustar la etapa de la traducción de la óptica de detección de fluorescencia.
- Ajustar la fluorescencia final proyección de imagen para que sea ~ 30°.
- Medir la potencia óptica usando un medidor de potencia. Asegúrese de que el poder de excitación azul de oSLO es ≤0. 2 mW y OCT láser potencia ≤0.8 mW, que no causa daños de la retina.
Nota: Basado en el estándar ANSI, es la máxima exposición permisiva (MPE) a la retina a nivel de ~ 2mW7,8 en la gama de luz visible. Según la fórmula por Delori et al. 9, el error máximo permitido para la luz infrarroja cercana es aproximadamente dos veces mayor que la luz visible, en cerca de 4 mW.
3. en Vivo experiencia con animales
- Transferencia de una rata de Evans largo macho de 12 semanas en la cámara de inducción. Anestesiar la rata con 4.5% de isoflurano en oxígeno durante 10 minutos con un caudal de 2 L/min por un vaporizador de isoflurano.
- Confirmar la profundidad de la anestesia según lo determinado por la falta del reflejo de retirada durante una pizca interdigital.
- Después de la inducción, colocar la rata en un soporte de 5 ejes (x, y, traducciones de z, yaw y pitch). Proporcionar calor suplementario por el uso de una platina calefactada, manta de agua caliente u otro método adecuado en una experiencia prolongada de circulación. Mantener la anestesia en el 1,5% de isofluorane con un caudal de 2 litros/minutos durante la parte restante del experimento. Al no utilizar una cámara de inducción con escape activo, la cámara de inducción debe colocarse en una mesa de backdraft o campana extractora de encimera o bajo un snorkel para compactar isoflurano.
- Dilatar a la pupila con tropicamida solución oftálmica al 1% durante 2 minutos. Aplique solución oftálmica al 0.5% ácido clorhídrico del Tetracaine en el ojo de la rata para la anestesia local adicional, si es necesario. Mantener el ojo hidratado con lágrimas artificiales comerciales al menos una vez cada minuto durante el experimento.
- Inyectar fluoresceína sal (10% w/w) o FITC (10% w/w) diluido en solución salina estéril (0.1-0.3 mL) a través de la vena de la cola con un 1 mL aguja de jeringa y 29G.
- Encienda la fuente de láser. Coloque un filtro de densidad neutra para atenuar la excitación de luz azul durante la alineación. Medir la potencia de la luz OCT ~0.8 mW y la luz azul < 0,01 mW para evitar la formación de cataratas.
- Iniciar el modo de exploración y la alineación del galvanómetro. Ajuste la altura de la bola del ojo para hacer un láser estacionario mancha en la córnea. Ajustar la posición del ojo de rata para hacer el borde de la pupila más o menos perpendicular al láser y offset el láser al centro del ojo de ~1.5 mm apical.
- Más ajustar el soporte del animal hasta imágenes de OCT una calidad óptima. En el x' exploración rápida de dirección, asegúrese de que la imagen B-scan transversal aparezca plana. Cuando se cambia la y ' lenta exploración dirección, asegúrese de que la imagen B-scan de sección aparece inclinada, debido a la exploración oblicua.
- Retire el filtro de densidad neutra para la excitación de luz azul y monitorear el alimentación de la cámara en tiempo real. Imagen fluorescente seccional cruzada debe aparecer mostrando vasos que aparecen en diferentes profundidades.
- Ajuste el enfoque de la fluorescencia final sistema para alcanzar el objetivo óptimo de imagen. Permite un ajuste fino de la posición del ojo en el plano lateral para alcanzar una óptima calidad de imagen de oSLO.
- Después de la alineación, empieza a adquirir OCTA simultánea y angiografía de la fluoresceína volumétrica (vFA).
- Construir las imágenes volumétricas de OCTA y oSLO por Matlab. Los algoritmos son descritos en detalle10. Generar vasculatures retinianas profundidad resuelta por segmentación de la imagen.
- Después de terminar la proyección de imagen, apagar el láser, liberar el animal y aplicar alguna pomada oftálmica en los ojos y luego coloque el animal en una caja de recuperación.
- No descuide el animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal o según política institucional.
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Representative Results
Figura 4a muestra una imagen transversal del OCT de una retina de rata. Figura 4b c -4 muestran las mismas imágenes de retinales transversales de AGV OCTA y oSLO adquirió al mismo tiempo. El oSLO permite FA sección análoga al OCT B-scan. En comparación con el OCTA, la imagen transversal del AGV de oSLO identifica claramente los vasos de la capa de fibras nerviosas (NFL) y la capa de células ganglionares (GCL) y los capilares en la capa plexiforme externa (OPL). Figura 4 d y g 4 Mostrar la capa superficial de la imagen de vFA OCTA y oSLO. A diferencia de la OCTA, la imagen de la vFA de oSLO (figura 4 g) evita los artefactos de movimiento (rayas verticales en la figura 4 d) mediante la utilización de contraste de emisión de fluorescencia. Comparando las imágenes OCTA (figura 4 h) dentro de la retina capa intermedia y oSLO AGV (Figura 4e), los recipientes verticalmente buceo se muestran claramente en la imagen de la FA de oSLO pero no aparente en OCTA. Esto es probablemente porque la velocidad del flujo sanguíneo o la orientación de la nave afecta la señal OCTA pero no el contraste de la fluorescencia de oSLO.
Figura 4f y 4i mostrar las imágenes dentro de la capa del plexo capilar profundo. Las regiones señaladas por flechas azules en oSLO AGV tienen un mejor contraste que el OCTA en la vasculatura. El tamaño de la vénula señalado por flechas blancas en oSLO es más grande que en OCTA. En general, la imagen de la vFA de oSLO se asemeja a la actual morfología vascular más precisión que OCTA, puesto que no es dependiente sobre la velocidad de flujo de la sangre o la orientación de la nave. Una cara en volar a través del conjunto de datos volumétricos adquiridos simultáneamente dos de oSLO y OCTA se muestran en el Video 1.
Figura 1. El sistema esquemático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La fotografía de los dos acopladores de fibra en cascada que oSLO y OCT luz. Se etiquetan las rutas de paso de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La instalación de la montura de cola de Paloma para la iluminación oblicua. (a) el sólido trabajo modelo para la parte de iluminación oblicua. (b-c) La vista de zoom y la vista separada de la montura de cola de Paloma. (d) la fotografía de la instalación real de parte de la iluminación oblicua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imagen retiniana rata adquirida por oSLO y OCTA al mismo tiempo. El ejemplo de (a) la imagen transversal de OCT (b) OCTA y (c) FA de oSLO. Paneles (d) y (g) muestran el rostro en OCT y oSLO FA imágenes de la capa superficial. Los artefactos de movimiento en imagen OCTA fue señalado por flechas rojas. Panel (e) y (h) mostrarán los resultados de la capa intermedia. Los lugares donde los vasos bucear hacia abajo en la capa siguiente se señalaron por flechas amarillas, que son más claras en oSLO FA que OCTA. Paneles (f) y () mostrarán los resultados de la capa de plexos capilares profundos. El contraste de oSLO es mejor que el OCTA en la región señalada por flechas azules. El tamaño de la vénula señalado por flechas blancas en oSLO es más grande que en OCTA. Barras de la figura es 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, hemos descrito oSLO, un en vivo volumétrica fluorescente retinal imaging técnica con un campo de visión 30 ° excesivo. En comparación con octubre, un estándar actual de cuidado imagen método en Oftalmología, oSLO ofrece una proyección de imagen capacidad 3D similar pero permite contraste de fluorescencia que OCT no es sensible a. La ventaja de oSLO es que requiere sólo una exploración de raster y permite así la combinación perfecta de PTU, proporcionando dos técnicas complementarias para la proyección de imagen volumétrica estructural y fluorescente.
En el presente Protocolo, el punto clave para obtener buena calidad de imagen es la claridad de los ojos de rata. Si se oculta la imagen de oSLO, examinar si hay formación de cataratas. Varios factores como anestesia ketamina/xilacina, sequedad de la córnea y la exposición excesiva a la luz azul hará que la formación de cataratas, que deterioraría significativamente la calidad de imagen. Para prevenir las cataratas, evite la exposición continua a la luz azul por más de 2 minutos; aplicar lágrimas artificiales ojo al menos una vez cada minuto para evitar la sequedad de la córnea; y permitir que el ojo descanse por lo menos 30 segundos entre las secciones de la imagen mediante el bloqueo de la luz.
Nuestra visión es que oSLO puede afectar significativamente a la práctica clínica de imágenes por fluorescencia. Hemos demostrado que la energía de resolución de profundidad puede eliminar con eficacia la señal de la retina externa, produciendo imágenes de FA volumétricos alto contraste hasta el nivel capilar único, que es inalcanzable con SLO convencional. La claridad de imagen considerablemente mejorada permite detección más sensible y cuantificación de sangre-retina barrera interrupción y retina capilar de la salida, el sello de la visión-que amenaza el edema macular en DR y otros coriorretinal vascular enfermedades.
En el sistema actual, la velocidad de la cámara CCD es 20 fotogramas por segundo, lo que conduce a > 25 segundo tiempos de adquisición. Una cámara CMOS científica mejorará dramáticamente la velocidad del sistema. La detección de fluorescencia tiene un camino óptico diferente, separado de la iluminación. Simplificará el sistema si usando la misma trayectoria óptica para la iluminación y la detección en el futuro diseño. En Resumen, una novela plataforma multimodal para la proyección de imagen retiniana volumétrica, es decir oblicuas exploración oftalmoscopia de láser (oSLO), se presentó. Se demostró la gran FOV en vivo la proyección de imagen en un ángulo de visión de 30 ° de retina de rata con oSLO y tomografía de coherencia óptica simultánea (OCT).
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Disclosures
Ji Yi tiene una patente pendiente para oSLO. Los otros autores no declaran a intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Financiamiento es de la financiación de Fundación Evans médicos de Boston Medical Center así como un subcontrato de NIH 5R01CA183101, piloto de BU-CTSI conceder 1UL1TR001430, programa piloto Joslin BU y BU-CTSI KL2TR001411.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supercontinuum Laser Source | NKT Photonics | SuperK EXTREME EXU-OCT6 | |
| Dichroic Mirror (DM1) | Thorlabs | DMLP650R | |
| Dichroic Mirror (DM2) | Chroma | ZT514/1064rpc | |
| Dichroic Mirror (DM3) | Thorlabs | DMLP900R | |
| Single Mode Fiber (SMF 1) | Thorlabs | P3-460B-FC-2 | |
| Single Mode Fiber (SMF 2) | Thorlabs | P3-780A-FC-2 | |
| Optic Fiber Coupler | Thorlabs | TW850R5A2 | |
| 1:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-100-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-150-A×2 | |
| 3:1 Telescope System | Thorlabs | AC254-50-A×2 | |
| Galvo Mirrors (GM1,GM2) | Thorlabs | GVS201×2 | |
| De-sacn Galvo Mirrors (GM3) | Thorlabs | GVS011 | |
| Objective Lens | Olympus | UplanSApo 20×/0.75 | |
| Final imaging system | Olympus | UplanFL N 10×/0.3 | |
| Final imaging system | Computar | 12-36mm/1:2.8 | |
| Camera | PCO | Pco.pixelfly usb | |
| Filter | Thorlabs | FEL0800 | |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M-A | |
| Line Scan Camera | Thorlabs | SPL2048-140K | |
| Analog Output Board (AO1) | National Instrument | PCI-6731 | |
| Analog Output Board (AO2) | National Instrument | PCIe-6351 | |
| Long pass filter | Thorlabs | FEL0800 |
References
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