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Genetics

La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement Caenorhabditis elegans durée de vie

doi: 10.3791/57819 Published: June 29, 2018

Summary

Nous décrivons ici la méthode de jeu de réplicas, une approche quantitative mesure la durée de vie/survie de c. elegans et healthspan d’une manière robuste et haut débit, permettant ainsi la projection de nombreuses conditions sans sacrifier la qualité des données. Ce protocole décrit la stratégie et fournit un outil logiciel pour l’analyse des données de jeu de réplicas.

Abstract

La méthode de jeu de réplicas est une approche pour mesurer quantitativement la durée de vie ou la survie des nématodes Caenorhabditis elegans de manière haut débit, permettant ainsi un seul enquêteur cribler des traitements ou des conditions plus au cours de la même quantité de temps sans perte de qualité des données. La méthode nécessite des équipements communs trouvés dans la plupart des laboratoires travaillant avec c. elegans et est donc simple à adopter. L’approche se concentre sur titrage des échantillons indépendants d’une population à chaque point d’observation, plutôt que d’un seul échantillon au fil du temps comme avec les méthodes traditionnelles de longitudinales. Notation consiste à ajouter du liquide sur les puits d’une plaque multipuite, qui stimule c. elegans pour déplacer et facilite la quantification changements dans healthspan. Autres atouts majeurs de la méthode de jeu de réplicas comprennent la réduction de l’exposition de la surface des géloses de contaminants atmosphériques (p. ex. de moisissure ou champignon), un minimum de manipulation des animaux et la robustesse de sporadiques mal marquant (par exemple appeler un animal comme mort quand il est encore Alive). Pour bien analyser et visualiser les données d’une expérience de style de jeu de réplicas, a également été développé un outil de logiciel personnalisé. Les capacités actuelles du logiciel comprennent le tracé des courbes de survie pour le jeu de réplicas et des expériences traditionnelles (Kaplan-Meier), tant que l’analyse statistique pour le jeu de réplicas. Les protocoles fournis ici décrivent l’approche expérimentale traditionnelle et la méthode de jeu de réplicas, ainsi un aperçu de l’analyse de données correspondante.

Introduction

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Une des avancées technologiques plus transformatrices dans la compréhension de la base génétique du vieillissement était le développement de l’alimentation-basé Arni dans c. elegans1; avant l’utilisation expérimentale de l’ARNi, nombreux phénotypes du vieillissement n’étaient pas génétiquement tractable. Arni axée sur l’alimentation est assurée par la production d’ARNdb dans e. coli qui correspond à un endogène ARNm c. elegans : IPTG induit la transcription bidirectionnelle à travers l’insertion de l’ADNc de c. elegans soit ou une partie d’un cadre de lecture ouvert dans un plasmide2. Lorsque c. elegans se nourrissent intact dsRNA d’e. coli, produite par les bactéries est transporté de la lumière dans les cellules intestinales par l’intermédiaire de la protéine transmembranaire de SID-23et ensuite distribué sur le reste de l’animal par l’intermédiaire de SID-14. Dans chaque cellule, dsRNA exogène est transformé par le complexe de Dicer en siRNA, qui interagissent avec un ARNm mature par appariement de base complémentaires pour créer un nouveau duplex siARN-ARNm. Ce duplex est reconnu par le complexe RISC et clivé, donc dégradation des ARNm endogène5. Ainsi, en changeant simplement l’insert de plasmide, on peut inactiver la fonction de presque n’importe quel gène dans le génome de c. elegans . Cette découverte a mené à la création de plusieurs grandes base alimentation RNAi-collections des bibliothèques de transforment les stocks d’e. coli qui peuvent être combinés pour obtenir une couverture d’environ 86 % de connue c. elegans gènes6, 7.

Depuis l’avancement de l’ARNi axée sur l’alimentation, les écrans complets chez c. elegans ont conduit à la découverte de plus de 900 gènes qui modifient la durée de vie lorsque inactivée (comme en témoignent les associations RNAi-phénotype organisées dans WormBase), que nous appelons à titre gerogenes. Un rôle pour la majorité des gerogenes dans le contrôle de la longévité a été découvert par ARNi axée sur l’alimentation dans quelques rapports séminales (voir Figure 1 a et 1 de fichier supplémentaire pour plus de détails). Dans certains cas, ces gerogenes ont été identifiés, basée sur la mesure de la viabilité à un seul ou quelques points dans le temps, qui ne parvient pas à fournir une mesure quantifiable de la variation de la durée de vie avec le traitement de l’ARNi. Dans d’autres cas, ces gènes ont été évaluées quantitativement des changements dans la durée de vie, ainsi que des phénotypes supplémentaires liés à l’âge. Par exemple, nous avons identifié précédemment 159 gènes qui ont été nécessaires pour la durée de vie normale et une augmentation des animaux avec une diminution de signalisation de l’insuline/IGF-1 et quantifier les changements healthspan. Parmi ceux-ci, 103 inactivations gènes entraîner un phénotype progeric, que le sinistre résulte en une ou plusieurs des signes de vieillissement prématuré,8.

Alors que certains gerogenes ont été associés à des études de 100 ou plus (p. ex. 16-daf, daf-2, sir-2.1), plus de 400 gerogenes ont des citations 10 ou moins (Figure 1 bet 2 fichier supplémentaire). Ainsi, alors que les écrans de RNAi globales axée sur l’alimentation ont découvert et caractérisé superficiellement des centaines de gerogenes putatif, comment la fonction de ces gènes dans contrôle de longévité et des liens génétiques entre les produits de ces gènes restent mal a étudié. Analyse complète longitudinale pour les phénotypes liés à l’âge est une condition sine qua non pour l’identification des interactions génétiques entre gerogenes (p. ex. les interactions épistatiques, asynthetic interactions, etc.). Se faire une idée plus profonde dans les relations génétiques entre gerogenes exige une méthode quantitative de haut débit, qui s’appuie également sur les avantages de l’ARNi axée sur l’alimentation.

La mesure de substitution plus courante du vieillissement est la durée de vie. L’approche traditionnelle pour la mesure de la mortalité de c. elegans suit la mort de chaque animal dans le temps au sein d’un échantillon de population réduite. Un nombre relativement restreint d’animaux est suivi au fil du temps et périodiquement est poussé doucement avec un fil de platine ou cils, avec le mouvement comme un indicateur de la viabilité (Figure 2 a). Cette méthode a été largement utilisée, comme il fournit des mesures simples et directes de la moyenne et la durée de vie maximale. Toutefois, cette méthode traditionnelle est fastidieuse et relativement faible débit, qui limite le nombre d’animaux et les conditions qui peuvent simultanément être mesurées de façon contrôlée. Une récente étude de simulation constaté que de nombreuses études de durée de vie de c. elegans doser pas un assez grand nombre d’animaux pour pouvoir détecter les petits changements entre conditions9de façon fiable. En outre, cette méthode traditionnelle consiste à manipuler à plusieurs reprises la même cohorte d’animaux au fil du temps, qui à son tour peut introduire de contamination et peut endommager ou tuer les animaux de plus en plus fragiles, âgé.

Nous avons développé une méthodologie alternative « jeu de réplicas » pour mesurer la durée de vie de c. elegans . À cette fin, une grande population d’isogéniques, synchronisé à l’âge des animaux sont divisés en un certain nombre de petites populations (ou répliques). Des échantillons assez réplique sont générés pour couvrir chaque instant dans l’expérience prévue. Chaque point de temps d’observation, un des réplicas est orchestré pour le nombre de morts vivants et animaux censuré, puis animaux au sein de cette duplication est ignorées. Ainsi, plus la durée de vie prévue de la population dans son ensemble, une série de sous-populations indépendantes sont régulièrement échantillonnées (Figure 2 b). En utilisant des jeux de réplicas il n’y a aucune insistance répétée des animaux et aucune exposition répétée à la contamination de l’environnementale. La viabilité a observé au point unique est totalement indépendante de toute autre observation, qui minimise la manipulation et augmente le débit d’au moins un ordre de grandeur. Cela nous a permis de quantifier les changements dans la durée de vie pour des centaines de RNAi clones simultanément8,10.

Nous présentons des protocoles détaillés pour la conduite de c. elegans durée de vie du jeu de réplicas et des méthodes traditionnelles pour la notation c. elegans longévité par. Nous démontrons que des résultats similaires sont obtenus entre les méthodes. Nous avons un logiciel développé pour aider à l’analyse graphique des données de durée de vie générées par le biais de deux approches, que nous fournissons gratuitement sous licence GPL V3 (voir le tableau des matériaux). « WormLife » est écrit en R11et inclut une interface utilisateur graphique (GUI) pour le traçage des données, ce qui a été testées sur Mac OS et Linux. Enfin, nous comparer et contraster les limites de chaque méthode et mettre en évidence d’autres considérations lors du choix entre les approches pour mesurer des changements quantitatifs dans la durée de vie de c. elegans .

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Protocol

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1. traditionnelle méthode de Scoring c. elegans longévité

  1. Préparation des réactifs
    1. Identifier les gènes à être inactivé par l’intermédiaire de RNAi axée sur l’alimentation. Achat de stocks transformées de HT115 e. coli2 contenant le clone de RNAi d’intérêt. Sinon, subclone l’ADNc du gène d’intérêt dans le site multicloning du plasmide L4440.
      Remarque : HT115 est une souche de RNase III-deficient Escherichia coli avec activité polymérase T7 IPTG inductible, qui sert à prévenir la dégradation de l’ARNdb dans les bactéries. Pour les études de durée de vie qui n’utilisent pas de RNAi axée sur l’alimentation, soit HT115, soit OP50 e. coli sur les plaques NGM standard peut être utilisé.
    2. Préparer 3 – 6 (ou plus) 6 cm plaques d’Arni par la condition de test (3 de fichier supplémentaire pour la recette). Stocker les Arni plaques à 4 ° C avant l’ensemencement de bactéries pour plusieurs mois.
    3. Croître transformé e. coli du jour au lendemain (16 – 20 h, 37 ° C, agitation incubateur à 180 – 220 tr/min).
      Remarque : HT115 e. coli est cultivé dans des livres avec de l’ampicilline (50 mg/mL). Standard OP50 e. coli n’est pas résistant aux antibiotiques et est cultivée sans ampicilline. Volume de culture dépend du nombre de plaques, mais se situe habituellement entre 8 et 100 mL de LB, selon le protocole expérimental.
      1. Concentré de bactéries par centrifugation à 3 000 x g pendant 15 à 20 min dans une centrifugeuse de paillasse. Aspirer le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré au 1/10ème à partir du volume (c'est-à-dire 10 x) dans des livres avec de l’ampicilline pour HT115 (ou sans ampicilline pour OP50 standard).
      2. Aliquote 200 µL de concentré 10 bactéries x sur chaque plaque de 6 cm. Préparer 3 à 4 répétitions par la condition de test, avec 2 plaques supplémentaires de sauvegarde, à utiliser en cas de contamination. Lors de la préparation de plaques, étiquetez-les donc l’expérimentateur marquant le dosage est aveugle devant les conditions expérimentales, en utilisant un code couleur ou un schéma de codage similaire. Veiller à ce que le code est enregistré.
      3. Permettre aux plaques ouvertes sécher dans un endroit propre comme un banc de flux laminaire jusqu'à ce que tout le liquide a été absorbé ou autoriser couverte de plaques à sécher toute la nuit sur le banc. Surveiller les plaques pendant le séchage pour veiller à ce que l’agar est sec sans trop sécher.
        NOTE : Trop sécher les plaques mène à la fissuration de l’agar qui provoquera c. elegans à s’enfouir dans la gélose. Humides, que les surfaces d’agar également promouvoir des terriers.
    4. Stocker des plaques sèches dans une boîte de ver du jour au lendemain (jusqu'à 24h) à température ambiante pour permettre à l’induction de la production de l’ARNdb. Après 1 jour à ta, stocker les plaques à 4 ° C jusqu'à 2 semaines dans un sac ziplock scellé (pour éviter les plaques ne se dessèchent pas). Avant utilisation, retourner les plaques à température ambiante dans le sac à fermeture à glissière pour empêcher la condensation de l’introduction des contaminants fongiques.
  2. Synchronisation de c. elegans avec traitement d’hypochlorite
    Remarque : Voir 3 de fichier supplémentaire pour M9 et hypochlorite de recettes de solution.
    1. Recueillir des animaux adultes gravides avec M9. Utiliser une pipette de verre bouché pour passer à tubes 2 x 15 mL.
    2. Tourner les tubes de 30" à ~ 2 000 tr/min. Vous recherchez une piscine de nématodes au fond du tube. Aspirer le surnageant. Laver deux fois avec la solution de M9, répétant spin et l’aspiration.
    3. Remettre en suspension c. elegans dans 4 mL de M9. Ajouter 2 mL de solution d’hypochlorite. Immédiatement vortex pendant environ 3 min, avec une agitation vigoureuse périodique. Après 3 min, recherchez un nuage d’oeufs sous un microscope à dissection. Vortex un supplémentaire de 10 – 20 s si les oeufs n’ont pas été libérés après 3 min.
      NOTE : Timing le traitement à l’hypochlorite est essentiel. Leurs œufs, dans les adultes gravides sont ce qui survivent. Après que environ 3 min, que Brisez les adultes gravides et les œufs déborder. Toutefois, si les oeufs sont dans la solution d’hypochlorite trop longtemps après la sortie ils mourront. À l’inverse, si les adultes gravides ne restent pas dans la solution d’hypochlorite assez longtemps, aucuns oeufs ne qui sortira.
    4. Laver rapidement avec une solution M9 deux fois comme au point 2.1.2.
    5. Resuspendre le culot d’oeuf de c. elegans dans 3 mL M9 et le transfert dans un nouveau tube de 15 mL. Permettre aux embryons d’éclore toute la nuit dans 3 mL de solution de M9 avec rotation à 20 ° C.
    6. Calculer la densité d’animaux de L1 (ou embryons) par µL en laissant tomber de 10 µL de solution de L1 3 x sur une plaque de 6 cm et compter le nombre d’animaux de L1 pour calculer le nombre moyen de L1s/µL.
      NOTE : Les animaux L1 se déposent au fil du temps. Par conséquent, des solutions de L1 doivent être périodiquement mélangées.
    7. Graines de 50 animaux de L1 par plaque. Inverser les plaques et sceller avec un élastique. Placer les plaques dans une boîte en plastique ver. Joint de boîte dans un sac de grande fermeture à glissière. Se déplacer dans un incubateur à 20 ° C.
  3. Prévenir la production de descendants par l’addition de 5-Fluoro-2'-déoxyuridine (FUdR)
    1. Cultiver des animaux jusqu’au stade de L4 à 20 ° C. Vérifier pour voir si synchronisé animaux ont développé à L4 environ 40 h après l’ensemencement (étape 2.1.7).
      Remarque :C. elegans développement temps varie à différentes températures, taux de12 et de la croissance des animaux mutants, dont les tarifs n’ont pas été caractérisées doit être testées empiriquement.
      1. Ajouter 160 µL de 50 x FUdR pour chaque plaque de 6 cm avec des animaux de L4.
        Remarque : Il est essentiel d’ajouter FUdR au stade L4. Pour plus de commodité, faire 1 000 actions de x de FUdR en dissolvant 1 g FUdR dans 10 mL ultrapure H2O. filtre-stériliser stock FUdR avec un filtre à 0,2 µm et une seringue cc 10. Aliquote ~ 1 mL de stock dans des tubes stériles de 1,5 mL. Congeler et conserver à-20 ° C.
    2. Inspecter les plaques pour la présence du mâle elegans de c. Supprimer tous les mâles.
      Remarque : durée de vie est généralement mesurée pour pas de mâles et hermaphrodites. Hermaphrodites qui s’accouplent vivent plus courtes que les animaux non accouplés, même en présence de FUdR13. Les mâles sont plus petits et plus minces alors hermaphrodites et peuvent être facilement identifiés par un crochet Queue14.
    3. Boîte de remettre dans le sac à fermeture à glissière. Retourner à l’incubateur de 20 ° C.
  4. Notation de viabilité
    1. Score de viabilité quotidiennement en touchant délicatement l’animal sur la tête avec un fil de platine ou les cils. Marquer des animaux qui ne parviennent pas à se déplacer comme morte et retirez-les de la plaque (Figure 2 a). Consigner le nombre observé morts pour chaque condition pour chaque point de temps d’observation.
      Remarque : Pour réduire le risque de marquer la partialité, l’expérimentateur doit rester aveugle à des conditions expérimentales et de même de ne doit pas référencer les résultats des précédents points dans le temps au cours de la cotation.
    2. Animaux de censeur qui se rompent, die provenant d’autres défauts de développement évident, ou analyse vers le haut sur le côté de la capsule : supprimer ces animaux et le nombre à chaque record temps point pour considération dans l’analyse statistique. En outre, si les hommes sont retrouvent, retirez-les et consigner le nombre observé.
    3. Répétez étape 1.4.1 tous les jours jusqu'à ce qu’aucun animal vivant.
      Remarque : Devrait porter atteinte sensiblement à la pelouse d’Escherichia coli ou champignon commence à se développer sur la plaque, transfert de tous les animaux restants à un plat frais avec l’ARNi approprié et FUdR.
  5. Analyse - traçage de données et de statistiques
    1. Entrée ou données d’observation enregistrée ouvert dans logiciel prenant en charge d’analyse de la survie avec le non paramétrique d’estimateur de Kaplan-Meier15 et log-rank test16 (voir le fichier supplémentaires 3). N’oubliez pas d’inclure les animaux censuré. N’incluez pas les hommes qui ont été observés, le cas échéant.
      Remarque : les formats de données peuvent varier entre le logiciel, mais un format commun est d’enregistrer chaque animal observé sur une ligne distincte. Le validant expérimentale au cours de laquelle l’animal a été observé comme morte est le temps de le « événement ». Si censuré, le temps de le « événement » est le validant au cours de laquelle l’animal a été censuré. Il y a habituellement un champ ou une case à cocher pour indiquer les observations censurées.
    2. Tracer les courbes de survie de Kaplan-Meier. Sélectionnez moins de six conditions pour une seule parcelle si plusieurs conditions ont été dosées pour améliorer la lisibilité.
      1. Recherchez les problèmes de données qui sont visuellement apparentes - observations manquantes, des résultats inattendus de contrôle, etc. — et de traiter ces avant l’analyse statistique.
    3. Utiliser la fonction de log-rank test dans votre logiciel pour effectuer la comparaison statistique. Veiller à ce que toutes les options disponibles pour le traitement des résultats censurés sont définies convenablement pour données droit-censuré.

2. réplique méthode Set pour la longévité de c. elegans Scoring

Remarque : tandis que la méthode traditionnelle nécessite 3 à 6 plaques par condition (voir 1.1.2. ci-dessus), la méthode de jeu de réplicas nécessite bien d’autres encore (voir étape 2.2.2 ci-dessous). La méthode traditionnelle suit les animaux sur la même plaque tout au long de l’expérience (Figure 2 a). En revanche, avec le jeu de réplicas animaux est seulement a marqué une fois : nombreuses répétitions identiques sont mises en place au début de l’expérience pour qu’une réplique est marqué à chaque point dans le temps (par essai) (Figure 2 b).

  1. Installation de la bibliothèque.
    Remarque : Des détails supplémentaires sur la remise des clones de l’ARNi sont abordé ici, comme le jeu de réplicas Protocole se prête à la cotation simultanée de nombreux clones de l’ARNi, et peuvent être adapté à plus de 100 clones à la fois. Collections de clones d’Arni sont conservées comme stocks de glycérol maintenus dans une plaque à 96 puits format. Replica Set expériences utilisent des plaques 24 puits. Eh bien, chacun est une condition de test différent, qui pourrait correspondre à une collection de clones Arni, différents traitements chimiques, souches animales et ainsi de suite.
    1. Assembler le tracé de la sublibrary pour les collections de clones de l’ARNi, tels que les conditions suivantes sont remplies :
      1. S’assurer que dans une collection de 96 puits, puits A1 est un contrôle négatif vecteur vide.
      2. Insérer un contrôle de vecteur vide supplémentaire au hasard au sein de chaque 24 puits.
      3. Diviser la plaque 96 puits en blocs de 24 puits, telle que chaque plaque 24 puits a un insérées au hasard témoin négatif (Figure 2).
      4. Insérer un contrôle positif au hasard au sein de chaque groupe de 24 puits (Figure 2).
        Remarque : Le contrôle positif est tributaire de la question expérimentale. Par exemple, lors de la recherche à une collection de l’ARNi clones cette augmentation de la durée de vie, daf-2(RNAi) est fréquemment inclus. À l’inverse, lorsque vous regardez la durée de vie raccourcie, daf-16(RNAi) est fréquemment utilisé.
  2. Préparation de jeux de réplicas
    Remarque : le nombre de répétitions nécessaires est égal à un nombre minimum de points dans le temps (Figure 2 b). Il faut savoir a posteriori combien de temps pour mesurer la durée de vie avant le début de l’expérience, mais aussi marquant fréquence (par exemple une expérience set réplique l’exécution de 40 jours avec chaque autre jour marquant nécessite de préparer un minimum de jeux de réplicas 20 pour chaque condition au début de l’expérience). Il est conseillé de faire ~ 5 jeux de sauvegarde supplémentaire (voir 2.2.2 et 2.2.2.3 ci-dessous).
    1. Pour créer un timbre frais de l’ARNi sublibrary, ensemencer 200 µL LB + Amp / puits dans un format de 96 puits (plaques de 600 µL) en utilisant un réplicateur 96 broches plaque par les étapes suivantes :
      1. Stériliser réplicateur de plaque 96 broches en plongeant dans l’ordre les chevilles en 50 % eau de Javel, ultrapure H2O et l’éthanol. Garder les broches immergés pendant au moins 30 s pour les étapes de l’eau de Javel et l’éthanol.  Après immersion dans de l’éthanol, la flamme brièvement les pointes. Répéter les étapes.
        Remarque : n’oubliez pas de rincer tous les bleach et ne pas laisser les tiges exposés pour blanchir pendant de longues périodes, comme l’eau de Javel peut corroder les broches en acier inoxydable.
      2. Retirer délicatement le film adhésif protecteur de plaque de bibliothèque stock congelé 96 puits glycérol et doucement mais fermement moudre conseils du réplicateur plaque stérilisé dans les puits des stocks glycérol encore congelés. Ensemencer les 200 µL LB + cultures Amp et sceller la plaque inoculée avec une membrane perméable. Permettre aux cultures de croître pendant la nuit sur la paillasse.
      3. Stériliser le réplicateur plaque comme au point 2.1.1, soigneusement retirer le joint de la plaque de culture liquide après une nuit ou plus de croissance et immerger les bouts des goupilles replicator. Appliquer les conseils avec une pression uniforme d’un ampli LB rectangulaire + gélose au tet et les bactéries de transfert des broches pour la plaque doucement avec de petits mouvements circulaires, en veillant à ce qu’un espace suffisant est laissé entre les endroits adjacents. Permettre aux colonies de croître pendant la nuit sur la gélose à 37 ° C. Voir 3 de fichier supplémentaire pour la préparation de LB + Amp/Tet plaques.
      4. Avant utilisation, ranger de gélose à 4 ° C inversé (côté couvercle vers le bas), enveloppé dans le film de paraffine.
        Remarque : Stockage côté couvercle colonies permettra à condensation à la contamination croisée Arni clones ! Colonies d’e. coli peuvent être conservés pendant 2 à 8 semaines à 4 ° C, fonction particulière Arni clones, Arni clones conservant l’efficacité dans l’induction de dsRNA après induction d’IPTG pour des longueurs variables de temps. Pour les petites collections de clones de l’ARNi, Arni efficacité doit être déterminée empiriquement par RT-qPCR pour confirmer le knockdown.
    2. Calculer le nombre minimal de plaques 24 puits nécessaires à un essai portant sur l’expérience : (plaques # par le jeu de réplicas) x (points # attendus dans le temps). Veiller à ce que quelques jeux de réplicas supplémentaires est inclus pour le traitement des questions telles que la contamination (Figure 2 b).
      Remarque : Le nombre total de clones de RNAi déterminent le nombre de plaques 24 puits pour faire un jeu de réplicas pour chaque point dans le temps (Figure 2).
      1. Préparer les plaques 24 puits, entrerez de 1.1.2 (3 de fichier supplémentaire pour la recette). Étiquettes de marquage en préparant ainsi l’expérimentateur marquant l’essai sera aveugle devant les conditions expérimentales, en utilisant un code couleur ou un schéma de codage similaire.
      2. Ensemencer une seule série de 1,5 mL LB + cultures Amp pour chaque 10 répliques (voir 2.2.2). Ensemencer les cultures en plaques de 96 puits profonds bien utilisant le réplicateur de plaque (comme dans 2.1.3) et les colonies bactériennes de 2.1.4 (Figure 2, gauche). Sceller avec membrane respirante, poussent de 20 h (37 ° C) avec agitation.
      3. Graines de 120 µL d’une culture d’une nuit ou plus pour chaque plaque à l’aide d’une pipette multicanaux 6 puits avec Buse réglable espacement (Figure 2, à droite). Plaques sèches découverts sous une hotte à flux laminaire, jusqu'à ce que tout le liquide a été absorbé. Ne séchez pas trop. Ranger les assiettes du jour au lendemain à la température ambiante.
  3. Synchronisation c. elegans en utilisant l’hypochlorite traitement
    1. Calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour l’expérience : nombre minimal de L1s nécessaire = (15-20 animaux/puits) (24 puits/plaque) (X jeu de plaques/réplicas)(Y replica sets).
      Remarque : la méthode de jeu de réplicas requiert plus d’animaux que la méthode traditionnelle. Une plaque de 10 cm pleine de vers gravides peut fournir 20 000-50 000 L1 animaux selon la densité des adultes gravides. De même, vingt plaques de 6 cm rendement autour de ~ 30 000 animaux de L1. Vous souhaitez préparer une préparation d’oeuf qui double le nombre minimal d’animaux nécessaires. Si la population en préparation a affamé, ré-alimentez ou segmentons pour une nouvelle plaque et laisser au moins trois générations sur les denrées alimentaires avant de commencer17,18. N’oubliez pas de le geler L1s retour restes.
    2. Suivez les étapes 1,2 à 1.2.6 comme dans la méthode traditionnelle pour obtenir synchronisé L1 animaux. Graines 15 – 20 L1 animaux dans chaque bien à l’aide de 6 puits réglable-espacement pipette et réactif réservoir, semblable à la 1.2.7. Périodiquement, mélanger L1 solution empêcher la sédimentation des animaux.
  4. Prévention de la production de la progéniture par l’addition de 5-Fluoro-2'-déoxyuridine (FUdR)
    1. Suivez l’étape 1.3.1.  Préparer stérile 50 x FUdR stock (voir étape 1.3.1.1).
    2. Lorsque portée animaux L4, ajouter 25 µL de 50 x FUDR dans chaque puits d’un 24-puits plaque à l’aide d’une pipette réglable-espacement de 6 canaux.
  5. Viabilité de score
    1. Supprimez un jeu de plaques répétées et inonder les puits avec la solution de M9, record total animaux / puits, puis touchez légèrement animaux immobile sur la tête avec une pique de ver (Figure 2 b). Animaux en omettant de se déplacer est notés comme étant décédés. Jeter les plaques sécables. Viabilité de l’enregistrement tous les jours.
      NOTE : Animaux rupture, spectacle des anomalies morphologiques brut, n’a pas pu développer ou rampé vers le haut sur le côté du puits sont d’être censuré en les excluant de fois les valeurs mortes et totales.
      1. Record du nombre d’animaux qui sont censurés dans chaque puits à chaque point séparément des autres valeurs dans le temps.
      2. Ne score pas de puits qui n’ont pas de nourriture ou sont contaminés (p. ex. champignon ou boue) ; ces puits sont considérés comme censuré. En outre, de censurer un puits si tous les animaux d’affichage des défauts morphologiques ou de développement. Enregistrer l’événement censure pour ce RNAi clone/puits à ce point dans le temps.
      3. Après avoir marqué une plaque répétée, jetez-le. Continuent de marquer une nouvelle réplication définie chaque jour jusqu'à ce que tous les animaux à travers tous les puits sont morts. Pour réduire le risque de marquer la partialité, l’expérimentateur doit rester aveugle à des conditions expérimentales et de la même façon de ne doit pas référencer les résultats de précédents points dans le temps au cours de la cotation.
      4. Si tous les animaux dans un puits étaient morts à un moment donné, puis après avoir marqué ce jour-là, examinez si tous les animaux ont été marqués comme mort pour deux moments consécutifs pour une raison bien. Dans l’affirmative, marquant la viabilité n’est plus nécessaire pour que bien dans les périodes subséquentes.
      5. Mener des essais supplémentaires expérience indépendante. Suivre les résultats des essais successifs séparément de ceux des essais précédents, avec le nombre de procès a fait remarqué.

3. graphique des données

Remarque : Avec le jeu de réplicas méthode une courbe est appliquée pour se rapprocher de la moyenne et la durée de vie maximale. Les paramètres permettant d’évaluer la mortalité de c. elegans conviennent à une courbe de logit19.  Comme la plupart des outils de survie ne supportent pas l’ajustement de la courbe logistique, un nouveau programme a été élaboré pour le tracé des courbes de logit (pour le jeu de réplicas) ; Courbes de Kaplan-Meier (pour la méthode traditionnelle) sont également pris en charge.

  1. Démarrer avec le logiciel. Télécharger le fichier zip de libération pour la version actuelle (voir la Section matériel). Extrayez le fichier zip dans un dossier. Voir le fichier « readme » dans le dossier extrait pour obtenir des instructions supplémentaires pour l’installation.
  1. Démarrez l’interface de traçage. Trouver l’emplacement du répertoire « code » dans le dossier extrait du fichier zip (par exemple  « / Utilisateurs/nom d’utilisateur /Desktop/WormLife/code »).
    1. Entrez les commandes suivantes dans la console de R, son remplacement par le chemin du dossier juste identifié. Appuyez sur entrée ou retour après chaque entrée ligne : 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), openMain() 3).
    2. Laisser l’interface charger dans une nouvelle fenêtre, ce qui porte vers le haut de l’écran par défaut, comme illustré à la Figure 3 a. Laissez le R fonctionner en arrière-plan.
  2. Données au format valeurs séparées par des virgules (CSV) ou des fichiers de valeurs séparées par des tabulations (TSV). Spécifier des colonnes et des noms, dépendants du type d’analyse. Voir supplémentaire 4 fichier (jeu de réplicas) et Supplemental fichier 5 (traditionnel/Kaplan-Meier) pour les données de l’exemple pré formaté.
    Remarque : données doivent être spécifiées dans un format « long », c'est-à-dire une ligne par souche/traitement par point dans le temps par procès. Les fichiers CSV sont recommandés pour une meilleure compatibilité entre les plates-formes.
    1. Supprimer les lignes qui correspondent aux observations qui ont été ignorées ou censurées. Vérifier l’absence de valeurs manquantes ou non numériques, car elle peut entraîner une erreur lorsque les données sont importées.
    2. Pour analyse de style traditionnelle de Kaplan-Meier, poule pas de données d’essais indépendant-parcelle eux séparément. Pour l’analyse de jeu de réplicas, poule données issues des essais multiples et ensuite étudier à l’aide de la fonctionnalité de « TrialView » (voir 6.3.3.4).
  3. À l’aide de l’interface de traçage
    1. Charger un fichier de données (« importer » sous le menu « Fichier ») à l’aide de la boîte de dialogue. Pour ouvrir les fichiers « .csv », changer le type de fichier dans la liste déroulante pour « .csv » (la valeur par défaut est «.txt/.tsv »), placez-vous dans le dossier avec le fichier de données. Voici le fichier les données exemple de jeu de réplicas (Supplemental dossier 4).
      NOTE : Importation d’un fichier lorsqu’un groupe de données est déjà ouverte remplacera le dataset en cours.
    2. Sélectionnez un fichier à importer pour démarrer l’Assistant d’importation, qui parcourt en identifiant les colonnes du fichier sélectionné (Figure S1A pour jeu de réplicas). Si les données d’entrée correspondant à une expérience de jeu de réplicas, choisir « Logit » pour le type d’étude.
      NOTE : Le workflow d’importation est différent entre le jeu de réplicas (Figure S1A) et traditionnel (Kaplan-Meier) (S1 FigureB).
    3. « Tracer des données ». Sélectionnez « Ajouter Line » pour commencer le traçage de données. (Une ligne correspond à un ensemble de conditions. Il y a fonctionnalités pour aider avec des expériences où de nombreuses conditions ont été testées).
      1. Tracer les conditions de contrôle-dans le cas des données exemple N2 (WT) avec L4440 (vecteur vide) Arni sont appropriés. Sélectionnez « Ajouter la ligne » sous le menu « Graphiques » pour lancer l’Assistant Ajouter ligne : sélectionner la condition pour l’intrigue et les paramètres graphiques pour représenter la ligne.
        1. Pour ajouter manuellement une courbe pour une condition différente, répétez les étapes de 3.3.3.1
        2. Pour modifier la couleur ou tracer le symbole pour une ligne, sélectionnez « Modifier la ligne » sous le menu « graphique ».
        3. Pour supprimer une ligne sans effacer toutes les lignes, sélectionnez « Supprimer la ligne » sous le menu « graphique ».
        4. Pour effacer toutes les lignes de l’intrigue actuelle, sélectionnez « Ligne claire » sous le menu « graphique ».
        5. Pour substituer la valeur de l’axe maximum automatiquement sélectionnée (temps), utilisez « Échelle de l’ensemble X » sous le menu « graphique ».
          Remarque : l’axe des ordonnées (fraction survivante) affiche toujours 100 % (dessus) à 0 % (en bas) par tranche de 20 %. L’axe des abscisses sont toujours affiché par incréments de 5. Étiquettes de l’axe ne sont pas tracés pour donner une souplesse dans l’étiquetage après avoir enregistré des images de l’intrigue.
      2. Pour enregistrer des images au format JPEG de l’intrigue actuellement affiché, utilisez l’option « Enregistrer le complot » dans le menu « fichier » ; seulement l’intrigue actuelle est enregistrée.
      3. Pour la création de parcelles individuelles pour plusieurs conditions différentes dans une expérience, le logiciel permet de définir et tracer une « série ».
        Remarque : La mise en œuvre de la notion de série améliore l’efficacité lorsque vous travaillez avec grandes expériences.
        1. Si le démarrage avec un espace de travail de terrain vierge, additionnez les lignes correspondant aux conditions de contrôle qui doivent être cohérentes dans l’ensemble de toutes les parcelles de la série (voir 3.3.3.1).
        2. Définir la série avec la série « définir » dans le menu de graphes. Sélectionnez une condition correspondant à la ligne à afficher en premier dans la série ; seul peut être sélectionné. Choisissez les paramètres graphiques (symbole de couleur et le tracé de ligne) pour la ligne, comme dans 3.3.3.1.
        3. Revoir les parcelles pour les conditions d’essai différentes. Basculer l’affichage de la « ligne de la série » entre les conditions, en utilisant les flèches gauche/droite sur les côtés de la fenêtre de l’intrigue principale, ainsi que dans le menu du haut bar (Figure 3 a-C).
          Remarque : Si la ligne de la série sélectionnée est la même condition qu’une des lignes de commande/référence précédemment ajoutée, la nouvelle ligne peut apparaître superposée.
        4. Définir la série pour faire certaines autres fonctions disponibles (Save série parcelles et Trialview-see 3.3.3.4 pour ce dernier). Après avoir défini une série, utilisez l’option « Enregistrer la série parcelles » dans le menu « Fichier » pour enregistrer des fichiers image parcelle individuelle pour chaque parcelle de la série dans un nouveau dossier.
      4. Trialview — visualisation des résultats d’essais indépendants d’une expérience de jeu de réplicas. Si plusieurs essais ont été exécutés pour une ou plusieurs des groupes‑échantillons, tracer les données des essais individuels et les données regroupées de tous les essais séparément afin d’évaluer la cohérence entre les essais indépendants (voir Figure 3D).
        1. Mettre en place une série comme décrit dans 3.3.3.3. Les différents essais sont tracées pour chacun des groupes échantillon « variable » dans une image différente sur les procès respectifs pour les échantillons de référence/contrôle spécifié.
        2. Pour enregistrer les images TrialView, aller à « Print TrialViews » dans le menu données. une image JPEG sera émis pour chaque parcelle de la série.
          NOTE : Les résultats de l’exemple en Figure 3D est pour une affaire avec deux essais.
    4. Durée de vie médiane tableau récapitulatif pour les données de jeu de réplicas. Visuellement inspecter les courbes pour assurer un ajustement raisonnable des données, puis sélectionnez le " "tableau récapitulatif » option dans le menu données pour enregistrer une table des valeurs de durée de vie médiane (temps de survie de 50 % sur la courbe de logit) pour chaque type d’échantillon.
  4. Évaluation statistique des données obtenues par l’intermédiaire de la méthode de jeu de réplicas
    1. Pour l’analyse statistique entre deux groupes d’une expérience de jeu de réplicas, modifier et exécuter un script R dans le fichier zip de libération (voir « WormLife analyse statistique modèle script. « « « R »).
      NOTE : La compétence dans l’affaire R n’est pas tenu d’exécuter le script. Des documents supplémentaires sont dans les commentaires dans le fichier. Le script est prêt pour l’analyse de l’exemple de données de jeu de réplicas. Généré par les utilisateurs des données dans le format approprié (voir 4 de fichier supplémentaire) peuvent également être analysées.
      1. Ouvrez le fichier de script dans R (R GUI ou RStudio).
        NOTE : Cela permet d’afficher le script sans courir.
      2. Modifier l’emplacement des fichiers nécessaires pour correspondre à l’emplacement sur votre ordinateur.
        Remarque : Ces chemins d’accès doivent être « complets » (c'est-à-dire doit inclure l’emplacement du fichier complet, y compris les dossiers).
        1. Modifiez les chemins d’accès (emplacements de fichier/dossier) pour « wlDir » (l’emplacement du répertoire), « fichier de données » (le jeu de réplicas fichier de données à analyser), « compFile » (spécification de comparaisons à exécuter, le cas échéant) et « outputPath » (l’emplacement où les fichiers de résultat seront écrite to).
      3. Définissez les noms des colonnes dans la section « Spécifiez les colonnes dans le fichier de données » si les noms de colonne dans le fichier à analyser sont différents du fichier d’exemple. Spécifier une colonne pour chaque paramètre. Si une étude a plusieurs souches, mais aucun Arni (ou autre traitement) inclure une colonne dans le fichier de données avec les entrées vides ou le même pour toutes les lignes (par exemple « no_treatment », etc.).
      4. Définissez le paramètre « compFile ». Si le paramètre « compFile » est défini à NA, puis seront déroulera toutes les comparaisons possibles des groupes.
        Remarque : Un groupe est défini par la combinaison de souche/génotype et de traitement qui sont concaténées et affiché sous la forme « strain_treatment ». Pour grandes études avec de nombreux groupes, un fichier CSV en spécifiant les comparaisons peut être fourni. Voir l’exemple de fichier « comps_rsm_example.csv ».
      5. Définir le nombre d’itérations de rééchantillonnage de Monte-Carlo (« k.resamp », la valeur par défaut est 1 000).
        Remarque : Les P-valeurs de 0 peuvent être retournés lorsque trop peu itérations sont effectuées ; dans ce cas, il convient au rapport « p < 0,01 » (si k.resamp = 100), ou « p < 0,001"(si k.resamp = 1 000), etc.
      6. Exécutez le script : bouton « source » en RStudio (en haut à droite de la fenêtre d’édition) ou « source document » dans le menu « Edition » dans l’interface graphique de R. (L’exécution peut prendre un certain temps).
      7. Lorsque le voyant « busy » R n’est plus affiché, ouvrir la sortie répertoire-il y aura un tableau avec les résultats de chaque comparaison (durée médiane de survie, p-values, variation en % durée de vie médiane).

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Representative Results

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Dans le développement d’une toute nouvelle méthodologie, il est impératif que la nouvelle méthode récapitule les résultats reconnus des approches précédentes et répond à la norme dans un champ. Nous avons déjà démontré empiriquement que les méthodes traditionnelles pour doser la durée de vie de c. elegans et jeu de réplicas produisent des résultats semblables20. Sauvage c. elegans (N2) maintenue à 20 ° C en général vivent entre 20 et 25 jours, que nous avons observées avec les traditionnels (Figure 4 a, ligne noire) et approche de jeu de réplicas (Figure 4 b, noir). Ainsi, les deux méthodes approximativement raisonnablement la durée de vie sauvage. Il est également essentiel qu’une nouvelle méthode a la résolution pour quantifier avec précision les changements entre les conditions d’essai et de la puissance statistique pour détecter des changements significatifs. Dans notre étude précédente, nous avons découvert que la famille Myc de facteurs de transcription est des facteurs déterminants de la longévité de c. elegans . MML-1 et mxl-2 encoder les homologues de c. elegans de mammifères Mondo A / élément de réponse aux glucides binding protein (ChREBP) et Mlx, respectivement. Dans les c. elegans et les mammifères, ces heterodimerize Myc-famille de membres à réglementer la transcription. Nous avons trouvé que perte de mml-1 ou 2-mxl diminue de manière significative la durée de vie normale, telle que mesurée par soit un test de durée de vie traditionnels ou de jeu de réplicas (Figure 4 a-B, jaune et marron). Par contraste avec le complexe de MML-1::MXL-2, nous avons constaté que perte de mdl-1 (homologue à Mad mammifères) ou mxl-1 (Max) a sensiblement augmenté c. elegans durée mesurée par une méthodologie (Figure 4 violet et bleu, respectivement, dans les deux panneaux).

Une grave restriction à l’approche traditionnelle pour mesurer la longévité est un débit. Les deux méthodes reposent sur le mouvement d’appeler si un animal est vivant ou mort, qui devient de plus en plus difficile d’évaluer. Jeunes animaux seront déplacera tout au long d’une plaque en l’absence de stimuli et sont donc faciles à marquer. Vieillissement c. elegans de plus en plus sédentaire mais répondra à une touche de lumière à la tête par un mouvement de renversement sur une plaque. Cependant, comme les animaux vieillissent la capacité de se déplacer vers l’arrière diminue et devient de plus en plus mal coordonnée. En fin de compte les animaux deviennent paralysés, un phénotype ressemblant fortement à la sarcopénie et lorsque le score par l’intermédiaire de la viabilité de la méthode traditionnelle ne peuvent être déterminées en observant une secousse subtile à l’extrémité antérieure de l’animal. En revanche, lors de scoring viabilité via la méthode de jeu de réplicas, le liquide est ajouté dans le puits, qui agit comme un stimulant qui génère une réponse raclée qui peut être quantifiée comme une lecture de healthspan8. Mouvement dans le liquide est plus facile d’observer des animaux encore plus anciennes : chronologiquement appariés selon l’âge décrépit animaux produisent des mouvements de tête subtils sur les plaques sèches mais un plus prononcé (bien que lente) corps plier dans un liquide. Enfin, lorsque le score de jeu de réplicas, le puits tout est dans le champ de vision (~1.1 cm de diamètre) et tous les animaux sont en suspension - observation qui permet de tous les animaux en même temps. En revanche, lorsque la notation d’une plaque de 6 cm par l’intermédiaire de la méthode traditionnelle, on doit scanner sur l’ensemble plaque - la recherche par le biais de la pelouse bactérienne et le long des bords pour les animaux. La conséquence nette de ces différences est que le débit lorsque vous utilisez la méthode de jeu de réplicas est au moins un ordre de grandeur supérieur à l’approche traditionnelle, ce qui rend possible quantifier simultanément les changements dans la durée de vie à travers plus de 100 conditions dans une seule expérience avec un enquêteur. Par exemple, d’un génome-large d’alimentation d’Arni écran nous avons déjà identifié des 159 gènes qui étaient nécessaires pour la durée de vie accrue conférée par a diminué daf-2 /8de signalisation analogue à l’insuline. En ce que l’analyse, nous avons mesuré les changements dans la durée de vie de type sauvage, un mutant de longue durée de vie daf-2(e1370) et éphémère daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) double animaux mutants (Figure 5 a), qui nous a permis de déchiffrer la génétique relations entre la signalisation analogue à l’insuline et plus de 100 inactivations gènes progeric. En outre, nous avons évalué comment ces inactivations progeric gène altéré healthspan (à l’époque appelé « activespan ») en observant le déclin chez c. elegans volée dans l’ensemble de répétitions au fil du temps (Figure 5 b).

Figure 1
Figure 1 : l’avènement de l’alimentation fonde Arni conduisent à une époque de la découverte de gènes dans la recherche sur le vieillissement, et pourtant la plupart gerogenes restent mal étudiés. (A) de nombreux gerogenes ont été initialement découvert à partir des écrans de génomique fonctionnelle à grande échelle. Les plus de 900 gerogenes de c. elegans découverts à ce jour, beaucoup ont été identifiés à l’aide d’Arni axée sur l’alimentation, en soulignant la valeur des approches génomiques fonctionnelles dans la découverte de gènes. Le graphique montre le nombre de gerogenes découvert par le manuscrit à l’aide d’Arni, basées sur le phénotype annotation (voir Table des matières) pour ontologie phénotype termes de durée de vie prolongée, raccourci la durée de vie et durée de vie variant. Voir dossier supplémentaire de 1 pour la liste complète des études qui ont découvert gerogenes. (B) gerogenes la plupart restent mal étudiés. En revanche, gerogenes à bien étudiés comme daf-16/FOXO (flèche), qui a plus de 800 références, la plupart des gerogenes ont moins de 10 références (général référence-pas nécessairement centrée sur la durée de vie). Méthodes fiables de haut débit sera essentielles pour mieux comprendre les relations génétiques entre gerogenes de dériver. Le graphique est basé sur des mappages entre des publications sur PubMed et la gerogenes de C.elegans découvert de phénotypes d’Arni. Voir les 2 fichier supplémentaire pour la liste complète des gerogenes et nombre d’études associées à chacun. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : La traditionnelle et la méthode de la valeur Replica pour la notation C.elegans durée de vie (A). De la méthode traditionnelle pour marquer la durée de vie de c. elegans . Plusieurs petites populations synchronisées d’animaux isogéniques par condition sont suivies au fil du temps. La même population d’animaux est suivie tout au long de l’étude. Mouvement qui peut être stimulé par une insistance douce évalue la viabilité. Les animaux qui ne parviennent pas à se déplacer sont marqués comme morte et sont enlevée (aspiration montrée) jusqu'à ce qu’aucun animal viable. B. la réplique méthode Set pour marquer la durée de vie de c. elegans . Une importante population d’âge synchronisé isogéniques animaux sont répartis sur un certain nombre de plaques répliques identiques. À chaque instant, une seule réplique est marqué : on ajoute une solution de tampon douce (M9), qui stimule la circulation. Les animaux qui ne parviennent pas à se déplacer spontanément après que inondations puits sont également évaluées au moyen de touchent stimulus. La durée de cotation pour l’expérience est déterminée avant le début. Chaque animal est inscrit qu’une seule fois et longévité pour l’ensemble de la population est issue de nombreuses observations indépendantes. C. approche du jeu de réplicas est une méthode de haut débit pour mesurer quantitativement la durée de vie de c. elegans . 100 ou plus indépendants des clones d’Arni peuvent être suivis simultanément. HT115 e. coli exprimant l’ARNdb pour un clone de RNAi donné s’affiche. En pratique, chaque 24 échantillons de la plaque à 96 puits sont divisés en une seule plaque 24 puits. Chaque plaque 24 puits qui en résulte a un négatif (c'est-à-dire vecteur vide, bien rouge) et le contrôle positif (bien vert) distribuées au hasard au sein d’une collection de clones de RNAi (puits jaunes). En règle générale, le premier puits (A1) dans une collection contient un vecteur vide. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : l’interface utilisateur graphique (GUI). (A). l’interface de fenêtre intrigue principale montrant l’écran d’accueil par défaut. C’est ce qui s’affiche lorsque vous ouvrez le logiciel. Différences d’aspect entre les plateformes devraient être minimes en raison de l’utilisation d’un outil indépendant de la plateforme fenêtrage. B. aperçu des options de menu, pour les menus déroulants disponibles dans la fenêtre de l’intrigue principale. C. exemple de sortie terrain pour les deux jeu de réplicas style (à gauche) et données (à droite) style de Kaplan-Meier traditionnelles. Les données affichées ont été recueillies dans des expériences indépendantes. Parcelles exportés n’incluent pas les étiquettes de l’axe des tracés, pour une flexibilité maximale en ajoutant ces étiquettes. Pour faciliter cela, les axes sont toujours divisés en incréments de 20 % pour l’axe y et par incréments de 5 pour l’axe des abscisses. Dans cet exemple, les étiquettes de l’axe et de ligne (souche/traitement) ont été ajoutés aux parcelles enregistrés, à l’aide d’une outil de retouche d’image de très simple et commune. D. un exemple de sortie de la fonctionnalité de « TrialView », ce qui permet la comparaison visuelle entre les résultats d’essais indépendants pour les datasets de style jeu de réplicas. Ce graphique montre le résultat entre deux différents essais et les résultats correspondants groupés pour daf-2 EV(RNAi) (cercles bleus, fermés), N2 EV (ARNi) (cercles noirs, fermés) et daf-2 avec daf-16 (ARNi) (diamants rouges, open). TrialView permet de vérifier rapidement pour des problèmes de données spécifiques au procès susceptibles d’affecter la qualité de l’ajustement de l’ensemble de données regroupée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : les traditionnels et jeu de réplicas méthodes donnent des résultats similaires. Perte d’une pièce de l’hétérodimère MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) augmente la durée de vie. En revanche, la perte d’une pièce de la MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) diminue la durée de vie ce chiffre est tiré à part de référence20 avec autorisation via une licence Creative Commons Attribution (CC-BY) (voir documents). (A). les résultats de Kaplan-Meier avec la méthode traditionnelle. (B). Logit ajustement à l’aide de la méthode de jeu de réplicas de la courbe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Le jeu de réplicas méthode peut déchiffrer les interactions génétiques issues des changements dans la durée de vie (A) et les modifications dans healthspan (B) depuis plus de 100 Arni clones en même temps. Ce chiffre est tiré à8 avec la permission, aux termes de la Creative Commons Attribution-Non commerciale 4.0 International License (CC-BY-NC) (voir documents). Analyse génétique de durée de vie (A) d’inactivations gènes progeric dans le contexte d’une diminution de signalisation analogue à l’insuline (ILS) (daf-2, axe x) et en l’absence de daf-16/FoxO (axe y), un central effecteur transcriptionnel de ILS21 . Inactivations gènes ayant des fonctions similaires au daf-16 ne raccourcissez pas davantage la durée de vie en l’absence de daf-16 (points noirs). Inactivations gènes avec fonctions totalement indépendantes du daf-16 raccourcir les deux antécédents génétiques de la même façon (gris). Inactivations gènes dans lesquels influencent directement le négatif sur la durée de vie dans le daf-2 > daf-2 ; daf-16, suggère la fonction en parallèle (blanc). (B) de fluctuation des taux de raclée au fil du temps peut dériver le healthspan moyen de nombreuses perturbations génétiques (axe x) tout en évaluant les changements dans la durée de vie (axe y). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure S1 : flux de travail dans WormLife. Illustration des étapes de certains guidé les workflows (parfois appelés « assistants »). Dans chacun de ces cas, après la dernière étape du flux de travail, l’accent est retourné à la fenêtre de l’intrigue principale. (A) les données importer des flux de travail pour ensembles de style jeu de réplicas (B) les données d’importation "workflow" pour les datasets de style traditionnel Kaplan Meier. (C) le flux de travail pour l’ajout de lignes à un complot pour ensembles de style jeu de réplicas. (D) le flux de travail pour l’ajout de lignes à un complot pour ensembles de style traditionnel Kaplan Meier. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire 1 fichier : des études ont identifié gerogenes. L’avènement de l’ARNi axée sur l’alimentation a conduit à une époque de la découverte de gènes pour les phénotypes qui n’étaient pas traitables par la génétique vers l’avant, y compris le vieillissement. Dans la liste, dans l’ordre du nombre de gerogenes découvert, sont des études indépendantes qui ont identifié des gènes dont l’activité altérée de durée de vie. Veuillez noter que l’étude qui a identifié le plus gerogenes utilisait la méthode set répétées8. La nature de comment le gène inactivations modifiées la durée de vie est également indiquée : longévité et gènes progeric sont ceux qui augmente ou diminue la durée de vie lorsque inactivée, respectivement. « Variante de la durée de vie » se rapporte aux cas où directionalité du changement(augmenté ou diminué la durée de vie) n’était pas précisé ou n’a pas été organisée. Données de WormBase WS262 (janvier 2018) (voir documents), avec l’ajout de la durée de vie de RNAi-traitement résultant de référence10, qui ne figurent pas encore dans la collecte organisée des phénotypes WormBase RNAi. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

2 fichier supplémentaire : le nombre d’études associées à chaque gerogene. La plupart des gerogenes sont peu étudiées. Alors que certains gènes, comme le daf-16/FoxO, ont fait l’objet d’une grande attention de la recherche, plus de 400 gerogenes ont moins de 10 publications connexes. Données de WormBase WS262 (janvier 2018), avec l’ajout de la durée de vie de RNAi-traitement résultant de10 qui ne figurent pas encore dans la collecte organisée des phénotypes WormBase RNAi. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire 3 fichier : préparation de réactifs courants pour Expériences c. elegans . (A). recette pour les plaques standards de NGM et Arni. B. recette pour solution de tampon et l’hypochlorite M9. C. préparation des LB + Amp/Tet planches. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire fichier 4 : jeu de réplicas des données exemple. Un exemple dataset à partir d’une expérience de durée de vie de jeu de réplicas. Cet ensemble de données est déjà formaté pour être utilisés pour l’importation/analyse. Comprend deux essais par État (combinaison de souche/génotype et RNAi). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

5 de fichier supplémentaire : données exemple longitudinal traditionnel. Exemple d’un jeu de données d’une expérience traditionnelle lifespan longitudinal, avec troncation, formaté pour prêt import/analyse utiliser les fonctionnalités de traçage de survie Kaplan-Meier. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

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Les deux méthodes traditionnelles et replica set nécessitent la synchronisation des animaux âgés chronologiquement. Nous incluons une méthode qui synchronise les animaux à l’aide de traitement hypochlorite d’adultes gravides, où seulement des oeufs fécondés avec les adultes gravides survivent. Ces embryons éclosent en suspension liquide et développemental arrêtent au premier stade larvaire (L1). Après l’ensemencement L1 animaux sur les aliments (p. ex. e. coli exprimant dsRNA à un gène d’intérêt), animaux reprend le développement. Synchronisation de L1 animaux par traitement de l’hypochlorite des adultes gravides a l’avantage que les restes animaux non ensemencées de L1 peuvent être congelés et conservés indéfiniment dans l’azote liquide ou d’un congélateur à-80 ° C. De cette façon, un échantillon de chaque souche au moment de l’installation expérimentale est préservé, créer une ressource précieuse pour les futures études et améliorer la reproductibilité. Cependant, alors que l’hypochlorite traitement des animaux adultes gravides est un moyen courant d’obtenir des animaux synchronisé pour le vieillissement recherche22, l’arrestation de L1 est une réponse de famine. Ainsi, certains laboratoires préfèrent soit pour permettre l’éclosion se produit sur les plaques, ou de renoncer à tout traitement de l’hypochlorite et quelques adultes gravides à pondre pendant plusieurs heures (c'est-à-dire un oeuf non juriste). Dans ce dernier cas, parents sont supprimés et la durée de vie de la progéniture est suivie. Au meilleur de notre connaissance, aucune différences évidentes dans la durée de vie n’ont été signalés entre les animaux qui ont été synchronisées en M9, éclos sur les plaques, ou descendants d’un oeuf de lay. Toutefois, étant donné que les changements dans la disponibilité des nutriments sont étroitement liées à l’évolution de la durée de vie, il y a priorité que les antécédents génétiques spécifiques pourraient produire des résultats différents entre ces approches de synchronisation. Une analyse plus approfondie est nécessaire pour résoudre ce problème théorique.

Quelle que soit la méthode utilisée pour synchroniser la population de départ, les mesures doivent être prises pour soit prévenir la production de la descendance ou séparer la population départ synchronisée de la futur descendance. Dans notre protocole, nous exposons comment utiliser FUdR pour prévenir la production de la progéniture, comme la séparation des animaux n’est pas une option viable pour le réplica de définie la méthode. Il est aussi possible de prévenir la production de descendance génétiquement par l’utilisation d’un fond génétique féminisée (par exemple fer-15(b26);fem-1(hc17), qui est une souche stérile dépend de la température à23). Toutefois, aucune n’est sans défauts : l’utilisation des fonds génétiques peut compliquer l’analyse ultérieure, et dans certains fonds génétiques FUdR peut modifier la longévité24,25,26.

Comme alternative à la prévention de la progéniture production chimique ou génétique signifie, animaux adultes peuvent être déplacés périodiquement aux plaques de RNAi fraîches pour les isoler de leur progéniture. Cela simplifie les considérations de fond au détriment du débit. Déplacement périodiquement des animaux pour la nourriture fraîche a des avantages supplémentaires de prévention possible famine et renouvelant l’exposition d’ARNdb. Toutefois, certaines interactions génétiques qui influencent la durée de vie ont été découverts seulement quand la production de la progéniture est inhibée : analyse préliminaire de la voie TGFβ pour une durée de vie de phénotype conclu à tort qu’une diminution de signalisation de TGFβ influencé C. elegans dauer formation mais ne vieillit pas27,28. Cependant, une étude qui utilisé FUdR de suivi a révélé qui a diminué de TGFβ longévité accrue grâce à l’insuline29de signalisation de signalisation. Pourquoi les études antérieures n’a manqué de voir la durée de vie accrue chez les animaux mutants de TGFβ ? TGFβ voie mutations produisent un léger défaut (egl) de ponte et longévité reproductif, ce qui cause interne d’éclosion de la progéniture plus tard dans la vie qui tue le parent. Il est probable que les longue durée de vie animaux mutants de TGFβ semblaient avoir une durée de vie normale à cause du phénotype egl tués les animaux autour du temps quand les animaux sauvage meurt normalement. Cela pourrait être pertinente d’autres voies génétiques liés au docteur, comme affamées sauvage animaux aussi manifeste un phénotype egl , peut-être comme un avantage de survie adaptative aux descendants dans des conditions d’alimentation faible. Cela met en évidence la complexité sous-jacente dans les réponses adaptatives animaux soumis en vertu des conditions de stress et la nécessité d’une analyse attentive et prise en compte lors de la conception des expériences de durée de vie.

Dans la conception et la réalisation d’expériences de durée de vie par les deux méthodes, il est essentiel d’éviter les biais. Des expériences doivent être menées d’une manière en double-aveugle : comment les échantillons ont été marqués précédemment aux périodes précédentes et l’identité d’une condition de test doit être inconnue de l’expérimentateur. En outre, il est toujours nécessaire inclure les contrôles positifs et négatifs ; dans le cas de la méthode set de la réplique, celles-ci sont insérées au hasard dans une plaque de 24 puits. E. coli exprimant un plasmide qui ne contient-elle pas une insertion avec la séquence correspondant à c. elegans génome est le témoin négatif vecteur vide (i.e. « L4440 "-voir matériaux). Les témoins positifs dépendent de la nature spécifique d’une expérience. Par exemple, daf-2 code pour le récepteur de l’insuline/IGF-1 de c. elegans et inactivation de daf-2 par l’intermédiaire de RNAi axée sur l’alimentation robuste augmente la durée de vie au moins deux fois dans le type sauvage animaux27. Ainsi daf-2(RNAi) pourrait servir de témoin positif quand vous cherchez inactivations gènes qui augmentent la durée de vie. À l’inverse, le daf-16 encode le FOXO transcription factor orthologue30. DAF-16 est une composante essentielle de nombreux paradigmes de longévité et sauvage animaux (N2) traités avec daf-16(RNAi) est de courte durée et montrer des signes de progeria31.

Les principaux avantages de l’approche traditionnelle lifespan longitudinale sont qu’il est très bien établi, et expériences sont faciles à mettre en place. Relativement peu d’animaux est nécessaires sur les quelques plaques pour chaque condition de test. Ainsi, les souches qui poussent mal ou qui nécessitent des équilibreurs de propager peuvent être testés facilement. L’approche traditionnelle est très adaptable et peut être utilisé avec n’importe quel une des approches disponibles pour la production de descendants de manutention, y compris le traitement avec FUdR, traversant un bagage génétique féminisée ou déplacement périodiquement des animaux adultes pour nouvelles plaques au cours de la période de ponte. Alors que le déplacement des animaux grandement réduit le débit, travail avec un fond mutant n’est jamais idéal, et bien que FUdR ne modifie pas la durée de vie sauvage32,33,34, il peut affecter la durée de vie et âge des phénotypes liés dans certains fonds génétiques35,25,26. Notez que la présence de mâles, même avec l’utilisation de FUdR, raccourcira considérablement hermaphrodites de durée de vie13, une assiette qui contenait les hommes après que les hermaphrodites atteint L4 est donc inutilisable. De même, l’analyse par le biais de l’estimateur de Kaplan-Meier et courbes associées et le test du log-rank, est bien établie pour les données sur la mortalité. Cependant, il y a plusieurs inconvénients à l’analyse de la durée de vie traditionnel. Répète la manipulation des plaques (c'est-à-dire exposer les plaques à l’air) facilite l’introduction de la contamination fongique aéroportée. Par ailleurs, répété piquer peut endommager ou tuer les animaux, en particulier que la population avance en âge et deviennent fragile. Les animaux plus âgés deviennent largement paralysé et embourbés dans e. coli, tandis qu’e. coli devient un pathogène opportuniste (qui colonisent la lumière et d’emballage du pharynx)36. Très vieux animaux vivants ne peuvent être identifiées par les subtils mouvements de la tête. Ainsi, il est facile de classer un animal vivant décrépit comme morte. Enfin, l’approche traditionnelle est limitée par le débit.

La méthode de jeu de réplicas est haut débit et quantitative. Cependant, l’inconvénient de cette méthode est un plus grand investissement de temps et de ressources dans l’installation initiale. Une expérience modérément importante à examiner 100 Arni clones, plus de 20 points dans le temps nécessite 30 000 animaux de L1 (où environ 15 animaux est examinés par ARNi clone par point dans le temps), qui bien que facile pour la plupart des souches, peut être problématique dans certains cas. Par exemple, sans une souches trieuse de grandes particules (« trieuse de ver ») qui doivent être maintenu avec les programmes d’équilibrage ou de lignées transgéniques porteuses une gamme extra chromosomique mal transmise ne peut être facilement examinée par cette méthode. Un deuxième inconvénient est que la production de descendance doit être invalidée, qui nécessite l’utilisation de FUdR ou un bagage génétique féminisée. Enfin, on doit connaître la durée de que l’essai se déroulera, comme on doit préparer un jeu pour chaque point de temps au début de l’expérience de réplicas. Toutefois, les avantages de cette méthode sont nombreux. Avant tout, marquant la viabilité est beaucoup plus rapide et on peut facilement suivre des animaux sur les conditions d’essai 100 simultanément (c.-à-d. les clones d’Arni). Comme un jeu de réplicas est seulement inscrit une fois puis jetés, il n’y a aucune manipulation répétée de plaques ou piquer des animaux, ce qui minimise le risque de contamination fongique et d’éliminer la mortalité causée par l’insistance rugueux occasionnel avec un ver pick. En outre, l’ajout de liquide dans le puit facilite grandement marquant. Libérant des vieux animaux de la plaque et qui entoure les bactéries aide permettant des mouvements subtils de la tête d’être marqué plus facilement. Ajout de liquide fournit également l’occasion de mesurer le taux de s’emballer comme une mesure de remise en forme (par exemple ,8,de healthspan37).

Le vieillissement est un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs mécanismes causaux qui nécessitent l’utilisation d’approches biologiques des systèmes à démêler. Ces approches souvent incorporent pilotés par les données de modélisation, à l’aide de gros volumes de données génomiques/transcriptomique et exigent des méthodes robustes et à haut débit complémentaires pour mesurer la durée de vie et healthspan. La méthode de jeu de réplicas haut débit permettra la comparaison de nombreux clones de RNAi longitudinalement, tout en minimisant les effets du traitement par lots et des erreurs techniques, facilitant ainsi le développement de modèles dynamiques qui peut déduire les interactions entre les voies de causalité dans manière quantitative. En outre, l’intégration de plusieurs approches de génomique de Génome-large avec la méthode de jeu de réplicas est possible parce qu’une importante population d’animaux d’âge synchronisé est divisée en un certain nombre de petites populations.

Autres méthodes ont été développées précédemment afin d’améliorer le débit d’expériences de durée de vie de c. elegans , souvent en se concentrant sur l’adaptation de l’approche longitudinale traditionnelle (c'est-à-dire suivant le même ensemble d’animaux au fil du temps) à automatisé observation et enregistrement à l’aide de la commune à plat scanneurs38,39ou équipement plus spécialisé comme microfluidique plaques40. Les approches axées sur le scanner utilisent la lumière comme un stimulus et comparer les images capturées dans l’ordre pour déterminer l’état de vie/mort basé sur le mouvement des plaques multiples en une seule fois ; Bien que ces approches ne nécessitent pas de matériel scientifique, temps nécessaires à la mise en place du flux de travail peut être important selon l’échelle désirée. Alternativement, des expériences de durée de vie en Dispositifs microfluidiques personnalisé permettant de profondeur caractérisation phénotypique des animaux au fil du temps et sans traitement pour empêcher les descendants, mais nécessite la fabrication des plaques de la microfluidique et acquisition des pompes de microfluidique associés et équipement d’imagerie. En revanche, la méthode de jeu de réplicas, en combinaison avec le logiciel détaillé ici, permet de grandement améliorer le débit à l’aide d’outils qui sont déjà courantes dans les laboratoires qui travaillent avec le c. elegans.

Le logiciel WormLife améliorera à l’avenir pour offrir un accès plus facile à la comparaison statistique et la compatibilité avec des plates-formes supplémentaires. La documentation à jour du logiciel se trouvent à la page de GitHub, y compris les instructions d’installation pour les plateformes sur lequel le logiciel a été testé. Une version basée sur le web est également développée pour permettre un accès facile sans avoir à installer de logiciel.

En résumé, la combinaison de la méthode de jeu de réplicas et le logiciel disponible gratuitement détaillées ici fournit une plateforme puissante pour améliorer le débit et la robustesse des expériences de vie et un large éventail de tests basés sur la survie (par exemple insister sur la tolérance, des études de toxicologie, healthspan, etc.). En particulier lorsqu’il est combiné avec la génomique fonctionnelle, cette approche s’appuie sur les nombreux avantages du système modèle métazoaires c. elegans pour déchiffrer la myriade d’interactions génétiques qui contribuent à la progression du vieillissement.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Le financement de ces travaux décrit dans ce manuscrit a été fourni par : le Bureau de l’Université de Rochester de The Provost et de l’école de médecine et de dentisterie Décanat via le centre de Sciences de la santé pour l’Innovation informatique (HSCCI) ; la Ellison médicaux nouveaux boursiers de la Fondation en vieillissement Fellowship (AG-NS-0681-10) les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement <em>Caenorhabditis elegans</em> durée de vie
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Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

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