Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 4, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

Abstract

De replicaset methode is een benadering van kwantitatief meten van levensduur of voortbestaan van Caenorhabditis elegans nematoden in een high-throughput manier, waardoor een enkele onderzoeker op het scherm meer behandelingen of voorwaarden over dezelfde hoeveelheid tijd zonder verlies van kwaliteit van de gegevens. De methode vereist gemeenschappelijke uitrusting gevonden in de meeste laboratoria die werken met C. elegans en is dus eenvoudig te nemen. De aanpak op de keuring van onafhankelijke monsters van een populatie op elk observatiepunt, in plaats van één sample na verloop van tijd als met traditionele longitudinale methoden gecentreerd. Scoren met zich meebrengt vloeistof toe te voegen aan de putjes van de plaat in een multi goed, die C. elegans om te bewegen stimuleert en vergemakkelijkt quantifying veranderingen in healthspan. Andere grote voordelen van de replicaset methode zijn verminderde blootstelling van agar oppervlakken lucht verontreinigingen (bijvoorbeeld schimmel of schimmel), minimale behandeling van dieren, en bestandheid tegen sporadische mis scoren (zoals het bellen van een dier als dood wanneer het is nog steeds levend). Om op de juiste manier analyseren en visualiseren van de gegevens van een replicaset stijl experiment, was een aangepaste softwaretool ook ontwikkeld. Huidige mogelijkheden van de software omvatten plotten van overleving curven voor zowel replicaset en traditionele (Kaplan-Meier) experimenten, evenals statistische analyse voor de replicaset. De hier bedoelde protocollen beschrijven de traditionele experimentele aanpak en de replicaset methode, evenals een overzicht van de overeenkomstige data-analyse.

Introduction

Een van de meest transformatieve technologische vooruitgang naar het begrip van de genetische basis van veroudering was de ontwikkeling van voeding gebaseerde RNAi in C. elegans1; voorafgaand aan het experimenteel gebruik van RNAi waren vele fenotypes van veroudering niet genetisch hanteerbare. Voeding gebaseerde RNAi wordt bereikt door de productie van dsRNA binnen E. coli die overeenkomt met een endogene C. elegans mRNA: IPTG induceert bidirectionele transcriptie via een tussenvoegsel van ofwel C. elegans cDNA of een gedeelte van een Open leesraam binnen een plasmide-2. Wanneer C. elegans feed op intact is E. coli, dsRNA geproduceerd door bacteriën vervoerd vanaf de lumen in cellen van de darm via de SID-2 transmembraan eiwit3, en vervolgens wordt gedistribueerd door de rest van het dier via SID-14. Binnen elke cel, exogene dsRNA wordt verwerkt door de complexe Dicer in siRNA, die interactie met een volwassen mRNA via complementaire base paren maken een nieuwe siRNA-mRNA duplex. Deze duplex is erkend door de RISC-complex en gekloofd, waardoor de endogene mRNA5vernederende. Dus, door slechts veranderen de plasmide invoegen, kan een inactivering van de functie van bijna elk gen in het genoom van C. elegans . Deze ontdekking leidde tot de oprichting van verschillende grote voederen gebaseerde RNAi bibliotheken-collecties van getransformeerd E. coli -bestanden die kunnen worden gecombineerd om dekking van ongeveer 86% van bekend C. elegans genen6, 7.

Sinds de vooruitgang van voeding gebaseerde RNAi, hebben uitgebreide schermen in C. elegans geleid tot de ontdekking van meer dan 900 genen die levensduur wanneer geïnactiveerd (zoals blijkt uit de verenigingen van de RNAi-fenotype curator in WormBase), die we verwijzen veranderen om als gerogenes. Een rol voor de meerderheid van gerogenes in levensduur besturingselement werd ontdekt door voeding gebaseerde RNAi in slechts een paar baanbrekende rapporten (Zie figuur 1A en aanvullende bestand 1 voor details). In sommige gevallen zijn deze gerogenes gebaseerd op de meting van de levensvatbaarheid op één of een paar punten van de tijd, die niet een kwantificeerbare maatregel van de verandering in levensduur voorzien van RNAi behandeling geïdentificeerd. In andere gevallen, zijn deze genen kwantitatief beoordeeld voor veranderingen in levensduur, evenals extra leeftijd-geassocieerde fenotypen. Bijvoorbeeld, we eerder aangeduid 159 genen die noodzakelijk zijn voor zowel de normale als de verhoogde levensduur van dieren met verminderde insuline/IGF-1 signalering waren, en gekwantificeerd veranderingen in healthspan. Van deze, 103 gen inactivations leiden tot een progeric fenotype, zoals nederlaag in een of meer tekenen van vroegtijdige veroudering8 resulteerde.

Terwijl sommige gerogenes zijn geassocieerd met 100 of meer studies (bijvoorbeeld daf-16, daf-2, sir-2.1), hebben meer dan 400 gerogenes 10 of minder citaten (figuur 1Ben aanvullende bestand 2). Dus, terwijl uitgebreide voeding gebaseerde RNAi schermen hebben ontdekt en vluchtig gekenmerkt honderden vermeende gerogenes, hoe deze functie van genen in de controle van de levensduur en de genetische relaties tussen deze genproducten blijven slecht studeerde. Volledige longitudinale analyse voor leeftijd-geassocieerde fenotypen is een voorwaarde voor het identificeren van genetische interacties tussen gerogenes (b.v. epistatic interacties, asynthetic interacties, enz.). Verkrijgen van dieper inzicht in de genetische relaties tussen gerogenes vereist een kwantitatieve methode van hoge-doorvoer, die borduurt ook voort op de voordelen van voeding gebaseerde RNAi.

De meest voorkomende surrogaat maatstaf voor veroudering is levensduur. De traditionele aanpak voor het meten van C. elegans sterfte houdt de dood van individuele dieren na verloop van tijd in een steekproef van een kleine populatie. Een relatief klein aantal dieren na verloop van tijd worden gevolgd en regelmatig zachtjes zijn geprikt met een platina-draad of wimper, met beweging als een indicator van de levensvatbaarheid (figuur 2A). Deze methode heeft wijd gebruikt, want het biedt eenvoudige, directe metingen van het gemiddelde en de maximale levensduur. Deze traditionele methode is echter tijdrovend en relatief lage-doorvoer, die beperkt het aantal dieren en voorwaarden die tegelijkertijd op een gecontroleerde manier kunnen worden gemeten. Een recente studie van de simulatie vond dat veel C. elegans levensduur studies niet een groot genoeg aantal dieren om betrouwbaar detecteren van kleine veranderingen tussen voorwaarden9te kunnen doen assay. Deze traditionele methode omvat bovendien herhaaldelijk hanteren dezelfde cohort behoren van dieren na verloop van tijd, die op zijn beurt kan besmetting, introduceren en kunnen beschadigen of steeds fragiele, leeftijd dieren te doden.

We hebben een alternatieve "replicaset" methode voor het meten van C. elegans levensduur ontwikkeld. Te dien einde een grote populatie van leeftijd-gesynchroniseerd, isogene dieren zijn onderverdeeld in een aantal kleine populaties (of replica's). Genoeg replica monsters worden gegenereerd voor elk punt van de tijd in de geplande experiment. Op elk tijdstip van waarneming, worden een van de replica's is georkestreerd voor het aantal leven, dood en gecensureerde dieren en dieren binnen die repliceren verwijderd. Dus, meer dan de verwachte levensduur van de bevolking als geheel, een aantal onafhankelijke subpopulaties vormen regelmatig bemonsterd (figuur 2B). Bij het gebruik van replicasets is er geen herhaalde porren van dieren en geen herhaalde blootstelling aan potentiële verontreiniging van het milieu. Er wordt ook de levensvatbaarheid waargenomen bij de eenmalige punt volledig onafhankelijk van elke opmerking over een ander, die behandeling minimaliseert en verhoogt de doorvoer door ten minste een orde van grootte. Dit hebben wij kunnen kwantificeren veranderingen in levensduur voor honderden RNAi tegelijkertijd8,10 klonen.

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van C. elegans levensduur via zowel de replicaset en de traditionele methoden voor het scoren van C. elegans levensduur. We laten zien dat vergelijkbare resultaten worden verkregen tussen de methoden. We hebben software ontwikkeld om te helpen in de grafische analyse van gegevens van de levensduur gegenereerd door beide aanpak, waarmee we vrij onder een GPL V3-licentie (Zie tabel van materialen). "WormLife" is geschreven in11, en bevat een grafische gebruikersinterface (GUI) voor het uitzetten van gegevens, die is getest in Mac OS en Linux. Tot slot, wij vergelijken en contrast van de beperkingen van elke methode en markeren van andere overwegingen bij de keuze tussen benaderingen voor het meten van kwantitatieve wijzigingen in C. elegans levensduur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. traditionele methode voor Scoring C. elegans levensduur

  1. Bereiding van reagentia
    1. Identificatie van genen te worden geïnactiveerd via voeding gebaseerde RNAi. Koop getransformeerde voorraden HT115 E. coli2 met de RNAi kloon van belang. U kunt ook subclone cDNA van het gen van belang in de plaats van de multicloning van de L4440-plasmide.
      Opmerking: HT115 is een stam RNase III-deficiënte E. coli met IPTG-afleidbare T7 polymeraseactiviteit, die wordt gebruikt om te voorkomen dat de afbraak van dsRNA binnen de bacteriën. Voor levensduur studies die geen van voeding gebaseerde RNAi gebruikmaken, kunnen HT115 of OP50, E. coli op standaard NGM platen gebruikte.
    2. Bereiden van 3 – 6 (of meer) 6 cm RNAi platen per testvoorwaarde (aanvullende bestand 3 voor recept). Opslaan RNAi platen bij 4 ° C vóór het zaaien met bacteriën voor tot enkele maanden.
    3. Groeien getransformeerde E. coli's nachts (16-20 h, 37 ° C incubator schudden van 180-220 toeren per minuut).
      Opmerking: HT115 E. coli is gegroeid in LB met ampicilline (50 mg/mL). Standaard OP50 E. coli is geen antibiotica resistente en groeit zonder ampicilline. Cultuur volume is afhankelijk van het aantal platen, maar is meestal tussen de 8 en 100 mL voor LB, afhankelijk van de proefopzet.
      1. Concentreren bacteriën door centrifugeren op 3000 x g gedurende 15-20 min. in een benchtop centrifuge. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 1/10e beginnen volume (d.w.z. 10 x) in LB met ampicilline voor HT115 (of zonder ampicilline voor standaard OP50).
      2. Aliquot 200 µL van geconcentreerd 10 x bacteriën aan elke plaat van 6 cm. Voorbereiding 3-4 replicatieonderzoeken per testvoorwaarde, met 2 extra back-platen, om te worden gebruikt in geval van besmetting. Bij de voorbereiding van platen, label ze dus de experimentator scoren van de test blind voor de experimentele omstandigheden is, met een kleurcode of soortgelijke coderingsschema dat. Zorg ervoor dat de code is vastgelegd.
      3. Laat open platen te drogen in een schone omgeving zoals een laminaire flow-bench totdat alle vloeistof is geabsorbeerd of overdekte platen te drogen op de Bank 's nachts toe te staan. De platen van de monitor tijdens het drogen om ervoor te zorgen dat de agar zonder overdreven drogen droog is.
        Opmerking: Overdreven drogen de platen leidt tot scheuren van de agar die leiden C. elegans tot zullen om ingraven in de agar. Natte die oppervlakken van de agar ook holen gravende bevorderen.
    4. Opslaan van gedroogde platen binnen het vak van een worm's nachts (maximaal 24 h) bij kamertemperatuur toe inductie van dsRNA productie. Na 1 dag op RT, slaan platen bij 4 ° C voor maximaal 2 weken in een verzegelde zip-lock zak (om te voorkomen dat platen uitdrogen). Vóór gebruik, terug platen tot kamertemperatuur binnen het zip-lock zak om condensatie van de invoering van airborne schimmel verontreinigingen te voorkomen.
  2. Synchronisatie van C. elegans met hypochloriet behandeling
    Opmerking: Zie aanvullende bestand 3 voor M9 en hypochloriet oplossing recepten.
    1. Gravid volwassen dieren met M9 verzamelen. Met een aangesloten glazen pipet kunt u naar 2 x 15 mL tubes.
    2. Buizen voor 30-inch ~ 2.000 rpm draaien. Controleer voor een pool van bij nematoden aan de onderkant van de buis. De bovendrijvende substantie gecombineerd. Twee keer wassen met M9 oplossing, herhalende spin en aspiratie.
    3. Resuspendeer C. elegans in 4 mL M9. Voeg toe 2 mL hypochlorietoplossing. Onmiddellijk vortex voor ~ 3 min, met periodieke krachtig schudden. Na 3 min, zoekt u een wolk van eieren onder een Microscoop ontleden. Vortex een extra 10-20 s als eieren niet na 3 min vrijgelaten zijn.
      Opmerking: De behandeling van hypochloriet Timing is essentieel. Eieren in de gravid volwassenen zijn wat behandeling overleven. Na ~ 3 min de gravid volwassenen openbreken en de eieren morsen uit. Echter, als de eieren zijn verpakt in hypochlorietoplossing lang na release zullen ze sterven. Omgekeerd, als gravid volwassenen zijn niet links in hypochlorietoplossing lang genoeg, geen eieren zijn verwerkt zal worden vrijgegeven.
    4. Snel wassen met M9 oplossing tweemaal zoals in stap 2.1.2.
    5. Resuspendeer de pellet van C. elegans ei in 3 mL M9 en overdracht aan een nieuwe tube van 15 mL. Toestaan dat embryo's om uit te komen 's nachts in 3 mL M9 oplossing met rotatie bij 20 ° C.
    6. Bereken de dichtheid van L1 dieren (of embryo's) per µL door slepen en neerzetten 10 µL van L1 oplossing 3 x op een 6 cm plaat en tellen het aantal L1 dieren voor het berekenen van het gemiddelde aantal L1s/µL.
      Opmerking: L1 dieren zullen vestigen na verloop van tijd. L1 oplossingen moeten daarom periodiek worden gemengd.
    7. Zaad 50 L1 dieren per plaat. Omkeren van platen en verzegelen met een rubberen band. Plaats de platen in een plastic worm-doos. Verzegel de doos in een grote zip-lock zak. Verplaatsen naar een 20 ° C incubator.
  3. Voorkomen van nakomelingen productie door de toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Dieren groeien tot L4 fase bij 20 ° C. Controleren om te zien of gesynchroniseerd dieren hebben ontwikkeld om L4 ongeveer 40 h na het zaaien (stap 2.1.7).
      Opmerking:C. elegans ontwikkelings tijd zal variëren bij verschillende temperaturen12 en groei tarieven van mutant dieren waarvoor tarieven niet gekenmerkt empirisch getest moeten worden.
      1. Voeg 160 µL van 50 x FUdR aan elke 6 cm plaat met L4 dieren.
        Opmerking: Het is cruciaal voor de FUdR in de L4 stadium toevoegt. Zorg voor gemak, 1.000 x voorraden van FUdR door ontbinding van 1 g FUdR in 10 mL ultrazuiver H2O. Filter-steriliseren voorraad FUdR met een 0,2 µm filter en een 10 cc spuit. Aliquot ~ 1 mL voorraad in steriele 1,5 mL buizen. Bevriezen en opgeslagen bij-20 ° C.
    2. Inspecteren van platen voor de aanwezigheid van mannelijke C. elegans. Verwijder alle mannetjes.
      Opmerking: levensduur wordt meestal gemeten voor hermafrodieten en geen mannetjes. Hermafrodieten die paren leven korter dan unmated dieren, zelfs in aanwezigheid van FUdR13. Mannetjes zijn kleiner en dunner dan hermafrodieten en kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door een onderscheidend verslaafd staart14.
    3. Zet vak terug in de zip-lock zak. Terug naar 20 ° C incubator.
  4. Scoren van levensvatbaarheid
    1. Score van levensvatbaarheid dagelijks door het dier op het hoofd met een platina draad of wimper zachtjes aan te raken. Score van dieren die niet verplaatsen als dood en ze te verwijderen uit de plaat (figuur 2A). Noteer het nummer waargenomen dood voor elke voorwaarde voor elk tijdstip van de waarneming.
      Opmerking: Om het risico van het scoren van vooringenomenheid, de experimentator moet blijven blind voor experimentele omstandigheden en ook moet niet verwijst naar de resultaten van eerdere tijdstippen tijdens het scoren.
    2. Censor dieren die scheuren, sterven aan andere duidelijke ontwikkeling gebreken of crawl up aan de kant van de schotel: verwijderen deze dieren en record het nummer bij elk tijd waargenomen wijs voor behandeling in de statistische analyse. Bovendien, mannetjes zijn gevonden, verwijder ze en noteer deze als het aantal waargenomen.
    3. Herhaal vanaf stap 1.4.1 dagelijks totdat geen dieren niet levend.
      Opmerking: Moet het gazon van E. coli verminderen sterk of schimmel begint te groeien op de plaat, alle resterende dieren overdragen aan een nieuwe plaat met de juiste RNAi en FUdR.
  5. Data analyse - plotten en statistieken
    1. Input of open opgenomen observatie gegevens in software ondersteuning van survival analyse met de niet-parametrische Kaplan-Meier schatter15 en log-rank test16 (Zie aanvullende bestand 3). Zorg ervoor dat gecensureerde dieren omvatten. Neem geen mannen die werden waargenomen, indien van toepassing.
      Opmerking: gegevensindelingen kunnen variëren tussen software, maar een gemeenschappelijk formaat is opnemen van ieder dier afzonderlijk waargenomen op een aparte regel. De experimentele timepoint waartegen een dier werd waargenomen als dood is de "event"-tijd. Als gecensureerd, is de "event"-tijd het timepoint waartegen het dier werd gecensureerd. Er is meestal een veld of het aankruisvak in om aan te geven van de gecensureerde opmerkingen.
    2. Plot Kaplan-Meier overleving curven. Selecteer minder dan zes criteria voor een enkele plot als vele voorwaarden werden bepaald om de leesbaarheid te verbeteren.
      1. Kijk voor data problemen die visueel herkenbaar - metingen ontbreken, onverwachte controleresultaten, enz. — en richt deze voor statistische analyse.
    3. Gebruik van de functie log-rank test in uw software voor het uitvoeren van paarsgewijs statistische vergelijkingen. Ervoor zorgen dat alle beschikbare opties voor de behandeling van de gecensureerde resultaten voor recht-gecensureerd gegevens juist zijn ingesteld.

2. replica Set, methode voor Scoring C. elegans levensduur

Opmerking: terwijl de traditionele methode 3 – 6 platen per voorwaarde vereist (zie 1.1.2. hierboven), de replicaset methode vereist veel meer (zie stap 2.2.2 hieronder). De traditionele methode volgt dieren op de dezelfde plaat tijdens een experiment (figuur 2A). In tegenstelling met de replicaset dieren zijn slechts eenmaal scoorde: veel identieke replicatieonderzoeken worden aan het begin van het experiment zodanig instellen dat één repliceren gescoord wordt op elk tijdstip (per proef) (figuur 2B).

  1. De opstelling van de bibliotheek.
    Opmerking: Extra details over het afleveren van RNAi klonen geldt hier, als de replicaset protocol vatbaar is voor de gelijktijdige scoring van vele RNAi klonen, en kan worden geschaald naar ruim 100 klonen op een moment. Collecties van RNAi klonen zijn bewaard gebleven als glycerol voorraden bijgehouden in een indeling van de 96-wells-plaat. Replica Set experimenten gebruiken 24-Wells-platen. Nou is elk een verschillende testvoorwaarde, die kan overeenkomen met een verzameling van RNAi klonen, verschillende chemische behandelingen, dierlijke stammen, enzovoort.
    1. Monteer de lay-out van de sublibrary voor verzamelingen van RNAi klonen, zodanig dat de volgende voorwaarden wordt voldaan:
      1. Ervoor zorgen dat binnen een 96-Wells-collectie, goed A1 een lege vector negatieve controle.
      2. Voeg een extra lege vectorbestrijding willekeurig binnen elke 24 wells.
      3. De 96-wells-plaat in blokken van 24 wells, splitsen, zodat elke plaat 24-well heeft een willekeurig ingevoegd negatieve controle (figuur 2C).
      4. Een positieve controle willekeurig binnen elke groep van 24-putten (figuur 2C) invoegen.
        Opmerking: De positieve controle is afhankelijk van de experimentele vraag. Bijvoorbeeld, als een verzameling van RNAi kijken dat verhoging van de levensduur klonen, is daf-2(RNAi) vaak inbegrepen. Omgekeerd, wanneer we kijken naar verkorte levensduur, daf-16(RNAi) wordt vaak gebruikt.
  2. Voorbereiding van replicasets
    Opmerking: het aantal replicatieonderzoeken nodig is gelijk aan het minimum aantal tijdstippen (figuur 2B). A posteriori hoe lang voor het meten van de levensduur voor de aanvang van het experiment, evenals het scoren van de frequentie (bijvoorbeeld een replica instellen experiment uitgevoerd 40 dagen met elke andere dag scoren vereist een minimum van 20 replicasets voor voorbereiding moet je weten elke voorwaarde aan het begin van het experiment). Het is raadzaam om ~ 5 extra reservekopieseries (zie 2.2.2 en 2.2.2.3 hieronder).
    1. Als u wilt maken een verse stempel van de sublibrary van RNAi, beënten 200 µL LB + Amp per putje in een 96-Wells-indeling (600 µL platen) met behulp van een 96-pins plaat replicator door de volgende stappen uit:
      1. Steriliseren 96 pin plaat replicator door achtereenvolgens onder te dompelen de pinnen in 50% bleekwater, ultrazuiver H2O en ethanol. Houd de pennen ondergedompeld voor ten minste 30 s voor de bleekmiddel en ethanol.  Vlam de tips kort na onderdompeling in ethanol. Herhaal deze procedure.
        Opmerking: zorg dat alle bleekmiddel afspoelen, en laat niet de pinnen blootgesteld aan bleekmiddel voor langere perioden, zoals bleekmiddel de roestvrij-stalen pinnen corroderen kan.
      2. Verwijder voorzichtig zelfklevende folie dekking van bevroren 96-Wells-glycerol voorraad bibliotheek plaat en zachtjes maar stevig tips voor de gesteriliseerde plaat replicator vermalen in de putten van de voorraden nog bevroren glycerol. Inoculeer 200 µL LB + Amp culturen en verzegel de geënte plaat met een permeabel membraan. Culturen groeien 's nachts op de benchtop toestaan.
      3. De replicator van de plaat zoals in stap 2.1.1 steriliseren, zorgvuldig verwijderen van het zegel van de vloeibare cultuur plaat na overnachting groei en dompel toppen van de replicator pinnen. Passen de tips met zelfs druk voor een rechthoekige LB amp + tet agarplaat, en bacteriën van de overdracht van de pennen aan de plaat zachtjes met een kleine cirkelvormige beweging, ervoor te zorgen dat voldoende ruimte tussen aangrenzende vlekken overblijft. Toestaan van kolonies groeien 's nachts op de agarplaat bij 37 ° C. Zie aanvullende bestand 3 voor bereiding van LB + Amp/Tet platen.
      4. Vóór gebruik, slaan agarplaat bij 4 ° C omgekeerd (deksel zijde naar beneden), verpakt in paraffine film.
        Nota: Opslaan van kolonies deksel kant van condensatie aan het Kruis-besmetten RNAi klonen zal toestaan! Koloniën van E. coli kunnen worden opgeslagen voor 2 – 8 weken bij 4 ° C, afhankelijk van bepaalde RNAi klonen, zoals RNAi klonen werkzaamheid in inducerende dsRNA na IPTG inductie voor variabele lengtes van tijd behouden. Voor de kleine collecties van RNAi klonen, moet RNAi efficiëntie worden empirisch bepaald door RT-qPCR te bevestigen knockdown.
    2. Berekening van het minimumaantal 24-Wells-platen die nodig zijn voor een proces van het experiment: (# platen per replicaset) x (verwachte # tijd punten). Ervoor zorgen dat een paar extra replicasets opgenomen zijn voor de behandeling van vraagstukken zoals verontreiniging (figuur 2B).
      Opmerking: Het totale aantal RNAi klonen bepalen het aantal 24-Wells-platen te maken van één set replica's voor elk punt van de tijd (figuur 2C).
      1. Bereiden 24-Wells-platen, zoals stap 1.1.2 (aanvullende bestand 3 voor recept). Label platen bij de voorbereiding van hen dus de experimentator scoren van de test zal blind voor de experimentele omstandigheden, met een kleurcode of soortgelijke coderingsschema dat.
      2. Inoculeer één set van 1,5 mL LB + Amp culturen voor elke 10 replica's (zie 2.2.2). Inoculeer culturen in 96 goed diep-Wells-platen met behulp van de plaat replicator (zoals in 2.1.3) en bacteriële kolonies van 2.1.4 (figuur 2C, links). Zegel met ademend membraan, groeien 20u (37 ° C) met schudden.
      3. Beënt 120 µL van een overnachting cultuur aan elke plaat met een 6-well meerkanaalspipet met verstelbare tip afstand (figuur 2C, rechts). Droge platen ontdekt in de kap van een laminaire flow totdat alle vloeistof is geabsorbeerd. Niet te droog. Platen 's nachts bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
  3. Synchronisatie van C. elegans met behulp van hypochloriet behandeling
    1. Berekening van het minimumaantal dieren die nodig zijn voor het experiment: minimum aantal L1s nodig = (15-20 dieren per putje) (24 putten/plaat) (X platen/replicaset)(Y replica sets).
      Opmerking: de replicaset methode vereist meer dieren dan de traditionele methode. Een 10 cm plaat vol gravid wormen kunnen 20.000-50.000 L1 dieren afhankelijk van de dichtheid van gravid volwassenen. Evenzo opbrengst twintig 6 cm platen rond ~ 30.000 L1 dieren. Plan op te stellen van de voorbereiding van een ei dat het minimumaantal dieren nodig verdubbelt. Als de bevolking in voorbereiding heeft uitgehongerd, opnieuw feed of stuk aan een nieuwe plaat en laat minstens drie generaties op voedsel voor door17,18. Zorg ervoor dat te bevriezen terug overgebleven L1s.
    2. Volg de stappen 1.2 tot en met 1.2.6 zoals in de traditionele werkwijze te halen gesynchroniseerd L1 dieren. Beënt 15 – 20 L1 dieren in elk goed met een 6-well verstelbaar-spacing pipet en reagens reservoir, vergelijkbaar met 1.2.7. Periodiek Meng L1 oplossing voorkomen beslechting van dieren.
  4. Preventie van de productie van nageslacht door de toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Volg stap 1.3.1.  Bereiden van steriele 50 x FUdR voorraad (zie stap 1.3.1.1).
    2. Wanneer dieren reach L4, toevoegt 25 µL van 50 x FUDR aan elk putje van een 24-well plate met behulp van een precisiepipet 6-kanaals verstelbaar-spacing.
  5. Score levensvatbaarheid
    1. Verwijder één set repliceren platen en putjes met de M9 oplossing, record totaal dieren per putje, overstroming en dan zachtjes aanraken niet-bewegende dieren op het hoofd met een worm pick (figuur 2B). Dieren niet te verplaatsen zijn scoorde als dood. Gooi scoorde platen. Record levensvatbaarheid dagelijks.
      Opmerking: Dieren die breuk, Toon bruto morfologische afwijkingen, verzuimd te ontwikkelen of aan de zijkant van de put omhoog kroop moeten worden gecensureerd door hen uitsluiten van zowel de dode en totale waarden.
      1. Het registreren van het aantal dieren dat binnen elk putje op elk punt van de tijd los van de andere waarden zijn gecensureerd.
      2. Doen niet score putten die hebben geen voedsel of zijn besmet (bijvoorbeeld schimmel of slijm); Deze putjes worden beschouwd als gecensureerd. Ook een goed te censureren als alle dieren morfologische of developmental gebreken worden weergegeven. Het opnemen van de censurerende gebeurtenis voor deze RNAi kloon/putje op dit tijdstip.
      3. Na het scoren van een repliceren plaat, gooi het. Blijven scoren een nieuwe repliceren stelt u elke dag totdat alle dieren over alle putjes dood zijn. Om het risico van het scoren van vooringenomenheid, de experimentator moet blijven blind voor experimentele omstandigheden en ook moet niet verwijst naar de resultaten van eerdere tijdstippen tijdens het scoren.
      4. Als alle dieren binnen een goed waren dood op een gegeven tijdstip, dan na het scoren van die dag, nagaan of alle dieren hebben gescoord als dood voor twee opeenvolgende tijdstippen voor een gegeven goed. Zo ja, is scoren levensvatbaarheid niet langer nodig voor dat goed in latere tijd punten.
      5. Voeren extra onafhankelijke experiment proeven. De resultaten bijhouden van opeenvolgende proeven afzonderlijk van die in vorige proeven, met het nummer van de proef genoteerd.

3. de grafiekgegevens

Opmerking: Met de replicaset methode een curve aanpassen wordt toegepast om de onderlinge aanpassing van de gemiddelde en maximale levensduur. De parameters voor de beoordeling van C. elegans sterfte passen een logit kromme19.  Zoals de meeste survival tools geen logit curve fitting ondersteunen, werd een nieuw programma ontwikkeld voor het plotten logit curven (voor Replica ingesteld); Kaplan Meier curves (voor de traditionele methode) worden ook ondersteund.

  1. Aan de slag met de software. Download het zip-bestand van versie voor de huidige versie (Zie Sectie materialen). Pak het zipbestand naar een map. Zie het bestand "readme" in de gehaalde omslag voor aanvullende installatie-instructies.
  1. Start de plotting interface. Zoek de locatie van de "code"-map in de map uitgepakt uit het zipbestand (bv  "/ Gebruikers/gebruikersnaam Desktop/WormLife/code").
    1. Voer de volgende commando's in de R console, vervangen door het pad van de map gewoon geïdentificeerd. Druk op enter of return na elk regel ingevoerd: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code") 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Tijd gunnen om de interface te laden in een nieuw venster, het standaardscherm opvoeden zoals weergegeven in figuur 3A. Laat de R op de achtergrond uitgevoerd.
  2. Gegevens opmaken als door komma's gescheiden waarden (CSV) of tabs gescheiden waarde (TSV) bestanden. Het opgeven van kolommen en namen, afhankelijk van het soort analyse. Zie aanvullende bestand 4 (replicaset) en aanvullende bestand 5 (traditionele/Kaplan-Meier) voor vooraf opgemaakte voorbeeldgegevens.
    Opmerking: gegevens moeten worden opgegeven in een "lange" formaat, dat wil zeggen één rij per stam/behandeling per tijdstip per proef. CSV-bestanden worden aanbevolen voor de beste compatibiliteit tussen platformen.
    1. Verwijderen van rijen die overeenkomen met waarnemingen die werden overgeslagen of gecensureerd. Controleren op de afwezigheid van ontbrekende of niet-numerieke waarden, aangezien het in een fout resulteren kan wanneer de gegevens worden geïmporteerd.
    2. P.a. traditionele Kaplan-Meier stijl, doen niet bundelen gegevens uit onafhankelijke proeven-plot hen afzonderlijk. Voor de analyse van de replicaset, bundelen gegevens uit meerdere proeven, en vervolgens onderzoeken met behulp van de functionaliteit van de "TrialView" (zie 6.3.3.4).
  3. Met behulp van de plotting interface
    1. Een gegevensbestand ("importeren" onder het menu "Bestand") te laden met behulp van het dialoogvenster. ".Csv" om bestanden te openen, het bestandstype in de drop down naar aan ".csv" te wijzigen (de standaardwaarde is ".txt/.tsv"), ga naar de map met het gegevensbestand. Het bestand is hier de voorbeeldgegevens replicaset (aanvullende bestand 4).
      Opmerking: Importeren van een bestand als een dataset al geopend is zal vervangen de huidige dataset.
    2. Selecteer een bestand om te importeren om te starten van de wizard importeren, die helpt bij het identificeren van de kolommen van het geselecteerde bestand (Figuur S1A voor de replicaset). Als de invoergegevens correspondeert met een replicaset experiment, kies "Logit" voor studie type.
      Nota: De workflow importeren is verschillend tussen replicaset (Figuur S1A) en traditionele (Kaplan-Meier) (Figuur S1B).
    3. "Gegevens uitzetten". Selecteer "Regel toevoegen" om te beginnen met het uitzetten van gegevens. (Een regel komt overeen met een reeks voorwaarden. Er zijn mogelijkheden om te helpen met experimenten waar veel voorwaarden werden getest).
      1. Plot de controle voorwaarden-in het geval van de voorbeeldgegevens N2 (WT) met L4440 (lege vector) RNAi geschikt zijn. Selecteer "Regel toevoegen" onder het menu "Grafieken" om te starten van de wizard toevoegen regel: Selecteer de voorwaarde aan de plot en de grafische parameters voor de representatie van de lijn.
        1. Als u wilt een kromme voor een andere aandoening handmatig toevoegen, herhaalt u de stappen in 3.3.3.1
        2. Om te veranderen van kleur of symbool voor een lijn uitzetten, Kiesderegel "wijzigen" in het "menu van de grafiek".
        3. Als u wilt een lijn verwijderen zonder de goedkeuring van alle lijnen, Kiesderegel "verwijderen" onder het menu"grafiek".
        4. Schakel alle regels in het huidige perceel, Kiesderegel "wissen" onder het menu"grafiek".
        5. U "Set X schaal" onder het menu"grafiek" overschrijven de waarde automatisch geselecteerde maximale x-as (keer).
          Opmerking: de y-as (overlevende Fractie) geeft altijd 100% (boven) op 0% (onder) in stappen van 20%. De x-as wordt altijd weergegeven in stappen van 5. Aslabels niet uitgezet om flexibiliteit in labeling na het opslaan van afbeeldingen van de plot.
      2. JPEG-formaat als beelden wilt opslaan van de momenteel weergegeven plot, de optie "Opslaan Plot" in het "menu van bestand"; alleen het huidige perceel wordt opgeslagen.
      3. Voor het maken van afzonderlijke percelen voor vele verschillende voorwaarden in één experiment, kunt de software bepalen en uitzetten van een "series".
        Opmerking: De implementatie van het concept van de serie verhoogt efficiëntie bij het werken met grote experimenten.
        1. Als begint met een leeg perceel werkruimte, regels overeenkomt met controlevoorwaarden die moeten consistent worden over alle percelen in de reeks (zie 3.3.3.1) toevoegen.
        2. De reeks met "Define Series" definiëren in het menu van grafieken. Selecteer een voorwaarde die overeenkomt met de lijn eerst weer te geven in de serie; slechts één kan worden geselecteerd. Kies grafische parameters (lijn kleur en plot symbool) voor de regel, zoals in 3.3.3.1.
        3. Bekijk de percelen voor de verschillende testomstandigheden. De weergave van de "lijn van de serie" afwisselend voorwaarden met behulp van de links/rechts pijlknoppen op de zijkanten van het belangrijkste plot-venster en in het bovenste menu bar (figuur 3A-C).
          Opmerking: Als de regel van de geselecteerde reeks dezelfde voorwaarde als één van de eerder toegevoegde controle/referentielijnen is, de nieuwe regel kan verschijnen overlay.
        4. De reeks om bepaalde andere functies beschikbaar (opslaan serie percelen en Trialview-zie 3.3.3.4 voor de laatste) definiëren. Na het definiëren van een reeks, de optie "Opslaan serie Plots" uit het menu "File" waarnemingspunt image bestanden voor ieder waarnemingspunt in de serie in een nieuwe map opslaan.
      4. Trialview — visualiseren van de resultaten van onafhankelijke experimenten van een replicaset experiment. Als meerdere proeven werden uitgevoerd voor één of meer van de monster-groepen, plot de gegevens van de afzonderlijke trials en de samengevoegde gegevens uit alle proeven afzonderlijk om te evalueren van de samenhang tussen onafhankelijke experimenten (Zie afbeelding 3D).
        1. Een reeks opgezet zoals beschreven in 3.3.3.3. De verschillende proeven zullen worden uitgezet voor elk van de "verschillende" monster groepen in een ander beeld over de respectieve processen voor de opgegeven verwijzing/controlemonsters.
        2. De TrialView als beelden wilt opslaan, gaat u naar "Print TrialViews" in het menu Data; een JPEG-afbeelding zal worden uitgevoerd voor ieder waarnemingspunt in de serie.
          Opmerking: De resultaten van het voorbeeld in figuur 3D is voor een geval met twee proeven.
    4. Overzichtstabel van de gemiddelde levensduur voor de replicaset gegevens. Visueel inspecteren curven om redelijk fit van de gegevens, en selecteer vervolgens de samenvattende tabel "" optie in het menu Data op te slaan van een tabel met gemiddelde levensduur waarden (tijd op 50% overleving op logit curve) voor elk type monster.
  4. Statistische evaluatie van gegevens die zijn gegenereerd via de methode van replicaset
    1. Voor statistische analyse tussen twee groepen uit een replicaset experiment, wijzigen en uitvoeren van een script dat R, wordt geleverd in de release zip-bestand (zie "WormLife statistische analyse sjabloonscript. R").
      Opmerking: Vaardigheid in R is niet nodig om het script uitvoert. Aanvullende documentatie is in opmerkingen in het bestand. Het script is klaar voor analyse van het voorbeeld Replica Set gegevens. Gebruiker-geproduceerde gegevens in de juiste indeling kunnen (Zie aanvullende bestand 4) ook worden geanalyseerd.
      1. Open het scriptbestand in R (R GUI of RStudio).
        Opmerking: Dit geeft het script zonder het te lopen.
      2. Wijzig de locaties van de benodigde bestanden overeenkomt met de locatie op uw computer.
        Opmerking: Deze bestandspaden moet "qualified" (d.w.z. dient de locatie van het volledige bestand, inclusief mappen).
        1. Wijzigen van de paden (bestand/map plaatsen) voor "wlDir" (locatie van de map), "dataFile" (de replicaset gegevensbestand te analyseren), "compFile" (specificatie van vergelijkingen uit te voeren, indien van toepassing) en "outputPath" (de locatie waar de bestanden met resultaten zal worden geschreven to).
      3. Stel de kolomnamen in de sectie "Opgeven kolommen in het gegevensbestand" als de namen van de kolommen in het bestand dat moet worden geanalyseerd verschillend van het voorbeeldbestand zijn. Een kolom voor elke parameter opgeven. Als een studie meerdere stammen heeft, maar geen RNAi (of een andere behandeling) moet u een kolom in het gegevensbestand met lege items of hetzelfde voor alle rijen (bijvoorbeeld "no_treatment", enz.).
      4. Stel de parameter "compFile". Als de "compFile"-parameter is ingesteld op NA, dan is alle mogelijke paarsgewijze vergelijkingen van groepen zal worden uitgevoerd.
        Opmerking: Een groep wordt gedefinieerd door de combinatie van de stam/genotype en behandeling, die zijn samengevoegd en weergegeven als "strain_treatment". Grotere studies met vele groepen, kan een CSV-bestand opgeven vergelijkingen worden verkregen. Zie het voorbeeldbestand "comps_rsm_example.csv".
      5. Stel het aantal iteraties voor Monte Carlo resampling ("k.resamp", de standaardwaarde is 1000).
        Noot: P-waarden van 0 kunnen worden teruggestuurd wanneer er te weinig herhalingen worden uitgevoerd; in dergelijke gevallen dient te worden verslag "p < 0.01" (als k.resamp = 100), of "p < 0,001" (als k.resamp = 1.000), enz.
      6. Voer het script uit: "source" knop in RStudio (rechtsboven in het bewerkingsvenster) of "brondocument" in het menu "bewerken" in de R-GUI. (Uitvoering kan enige tijd duren.)
      7. Wanneer de "drukke" R-indicator niet meer wordt weergegeven, opent u de output directory-er zullen een tabel met de resultaten van elke vergelijking (mediane overleving, p-waarden, veranderings-% gemiddelde levensduur).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de ontwikkeling van een nieuwe methode is het noodzakelijk dat de nieuwe methode aanvaarde resultaten uit vorige benaderingen recapituleert en voldoet aan de norm binnen een veld. Eerder hebben wij empirisch aangetoond dat de replicaset en de traditionele methoden voor de keuring van C. elegans levensduur soortgelijke resultaten20produceren. Wild-type C. elegans (N2) onderhouden bij 20 ° C typisch leven tussen 20 en 25 dagen, die we waargenomen met zowel de traditionele (figuur 4A, zwarte lijn) en de replicaset aanpak (figuur 4B, zwart). Dus geschatte beide methoden redelijk levensduur van de wild-type. Het is ook essentieel dat een nieuwe methode de resolutie heeft te kwantificeren nauwkeurig wijzigingen tussen de testomstandigheden en de statistische power om significante wijzigingen te herkennen. In onze eerdere studie ontdekten we dat het Myc-familie van transcriptiefactoren determinanten van C. elegans levensduur zijn. mml-1 en FMN-2 coderen de C. elegans homologen van zoogdieren Mondo A / koolhydraten respons-element bindend proteïne (ChREBP) en Mlx, respectievelijk. In zowel C. elegans en zoogdieren, deze Myc-familie leden heterodimerize voor het regelen van de transcriptie. We vonden dat verlies van mml-1 of FMN-2 normale levensduur, zoals gemeten door hetzij een traditionele levensduur test of replicaset (figuur 4A-B, geel en kastanjebruin) aanzienlijk vermindert. In tegenstelling tot het MML-1::MXL-2-complex vonden we dat verlies van mdl-1 (homoloog aan zoogdieren Mad) of FMN-1 (Max) aanzienlijk verhoogd C. elegans levensduur zoals gemeten door beide methodologie (Figuur 4 paars en blauw, respectievelijk, in beide panelen).

Een ernstige beperking voor de traditionele aanpak voor het meten van duurzaamheid is doorvoer. Beide methoden zijn afhankelijk van beweging te bellen of een dier is een levend of dood, die steeds moeilijker te beoordelen. Jonge dieren zal bewegen in een plaat in de afwezigheid van prikkels en zijn dus makkelijk te scoren. C. elegans steeds veroudering sedentaire maar zal reageren op een lichte aanraking aan het hoofd door een omkering beweging op een plaat. Echter als de dieren ouder worden kunnen in terugwaartse richting vermindert en wordt steeds ongecoördineerde. Uiteindelijk dieren worden verlamd, een fenotype lijkt sterk op sarcopenie, en wanneer scoren via de levensvatbaarheid van de traditionele methode kunnen alleen worden bepaald door het observeren van subtiele kramp aan het extreme voorste uiteinde van het dier. Daarentegen wanneer scoren levensvatbaarheid via de replicaset-methode, wordt de vloeistof toegevoegd aan de put, die fungeert als een stimulans die genereert een pak slaag respons die kan worden gekwantificeerd als een uitlezing van healthspan8. Verkeer in de vloeistof is gemakkelijker te houden voor zelfs oudere dieren: chronologisch leeftijd-matched afgeleefde dieren produceren subtiele hoofdbewegingen op droge platen maar een meer uitgesproken (zij het trage) lichaam bocht in vloeistof. Tot slot, wanneer scoren replicaset, de hele put is binnen het gezichtsveld (~1.1 cm in diameter) en alle dieren zijn in schorsing - waardoor observatie van alle dieren tegelijk. Daarentegen wanneer scoren een 6 cm plaat via de traditionele methode, moet een scan over de gehele plaat - zoeken via het bacteriële gazon en langs de randen voor dieren. De netto consequentie van deze verschillen is dat de doorvoer bij het gebruik van de methode replicaset ten minste een orde van grootte groter is dan de traditionele aanpak, die het mogelijk maakt is te kwantificeren gelijktijdig wijzigingen in levensduur over meer dan 100 voorwaarden in een enkele experiment met één onderzoeker. Bijvoorbeeld van een genoom-brede voederen gebaseerde RNAi scherm we eerder aangeduid 159 genen die noodzakelijk zijn voor de verhoogde levensduur toekent waren daalde daf-2 /insuline-achtige signalering van8. In die analyse, gekwantificeerd we de veranderingen in de levensverwachting in wild-type, een langlevende daf-2(e1370) mutant en kortstondige daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) dubbele mutant dieren (figuur 5A), waardoor ons te ontcijferen de genetische modificatie relaties tussen insuline-achtige signalering en meer dan 100 progeric gen inactivations. Verder, wij beoordeeld hoe deze progeric gen inactivations healthspan gewijzigd (destijds genaamd "activespan") door het observeren van de daling in C. elegans dorsen over wordt gerepliceerd na verloop van tijd (figuur 5B).

Figure 1
Figuur 1: de komst van voeding gebaseerd RNAi leiden tot een tijdperk van ontdekking van het gen in onderzoek van veroudering, maar de meeste gerogenes blijven slecht bestudeerde. (A) veel gerogenes werden aanvankelijk ontdekt van grootschalige functionele genomic screens. Van de meer dan 900 C. elegans gerogenes ontdekt tot nu toe, werden velen geïdentificeerd met behulp van voeding gebaseerde RNAi, markeren de waarde van functionele Toepassingsgeoriënteerde benaderingen in de ontdekking van het gen. De grafiek toont het aantal gerogenes per manuscript met behulp van RNAi ontdekt, gebaseerd op fenotype aantekening (Zie tabel van materialen) voor fenotype ontologie uitgebreide levensduur voorwaarden, verkorte levensduur en life span variant. Zie aanvullende bestand 1 voor de volledige lijst van studies die gerogenes ontdekt. (B) de meeste gerogenes blijven slecht bestudeerde. In tegenstelling tot goed bestudeerde gerogenes zoals daf-16/FOXO (pijl), die heeft meer dan 800 verwijzingen, de meerderheid van de gerogenes hebben minder dan 10 verwijzingen (algemene referentie-niet noodzakelijkerwijs gericht op levensduur). Betrouwbare hoge gegevensdoorvoer methoden zijn essentieel voor het afleiden van dieper inzicht in de genetische onderlinge relaties tussen gerogenes. De grafiek is gebaseerd op toewijzingen tussen publicaties in PubMed en de gerogenes van de C.elegans van RNAi fenotypen ontdekt. Zie aanvullende bestand 2 voor de volledige lijst van gerogenes en aantal studies die zijn gekoppeld aan elk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: De traditionele en de Replica ingesteld methode voor het scoren van de levensduur van de C.elegans (A). De traditionele methode voor het scoren van C. elegans levensduur. Verschillende kleine gesynchroniseerde populaties van isogene dieren per voorwaarde worden gevolgd na verloop van tijd. Dezelfde populatie van dieren wordt gevolgd in de loop van de studie. Levensvatbaarheid wordt beoordeeld door beweging, die kan worden gestimuleerd door de zachte porren. Dieren die niet bewegen zijn scoorde als dood en zijn verwijderd (aspiratie weergegeven) totdat er geen levensvatbare dieren niet. (B). de Replica ingesteld methode voor het scoren van C. elegans levensduur. Een grote populatie van leeftijd-gesynchroniseerde isogene dieren zijn verdeeld over een aantal identieke repliceren platen. Op elk tijdstip, een enkele kopie is georkestreerd: een milde gebufferde oplossing (M9) wordt toegevoegd, die beweging stimuleert. Dieren die niet spontaan wordt verplaatst wanneer overstromingen putten worden ook beoordeeld touch stimulans. De scorende duur van het experiment wordt bepaald voorafgaand aan de start. Elk dier is slechts eenmaal scoorde en levensduur voor de grotere bevolking is afgeleid van vele onafhankelijke waarnemingen. (C). de replicaset aanpak is een hoge-doorvoer-methode voor het kwantitatief meten van C. elegans levensduur. 100 of meer onafhankelijke RNAi klonen kunnen gelijktijdig worden bijgehouden. HT115 E. coli uiten dsRNA voor een bepaalde RNAi kloon wordt weergegeven. Praktisch zijn elke 24 monsters van de 96-wells-plaat onderverdeeld in een enkele 24-well-plaat. Elke resulterende 24-well plaat heeft een negatieve (d.w.z. lege vector, rode goed) en de positieve controle (groen goed) willekeurig verdeeld in een collectie van RNAi klonen (gele wells). De eerste put (A1) in een collectie bevat meestal een lege vector. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: de grafische gebruikersinterface (GUI). (A). de belangrijkste plot venster interface toont het welkomstscherm van de standaard. Dit is wat er wordt weergegeven bij het openen van de software. Verschillen in uiterlijk tussen platforms moeten minimale ten gevolge van gebruik van een platform-onafhankelijke windowing toolkit. (B). overzicht van de menu-opties, voor de drop-down menu's beschikbaar vanuit het belangrijkste plot-venster. (C). voorbeeld perceel output voor beide replicaset stijl (links) en traditionele Kaplan-Meier stijl (rechts) gegevens. De weergegeven gegevens verzameld in onafhankelijke experimenten. Geëxporteerde percelen bevatten geen vooraf uitgezette aslabels, voor een maximale flexibiliteit in dergelijke labels toe te voegen. Om dit te vergemakkelijken, zijn altijd de assen verdeeld in stappen van 20% voor de y-as, en stappen van 5 voor de x-as. In dit voorbeeld zijn de as en de lijn etiketten (spanning/behandeling) toegevoegd aan de opgeslagen percelen, met behulp van een zeer eenvoudige en gemeenschappelijk beeld het uitgeven hulpmiddel. (D). een voorbeeld van de uitvoer van de "TrialView"-functionaliteit, waardoor de visuele vergelijking tussen de resultaten van onafhankelijke experimenten voor de replicaset stijl datasets. Deze grafiek toont het resultaat tussen twee verschillende processen en de bijbehorende gebundelde resultaten voor daf-2 EV(RNAi) (blauw, gesloten cirkels), N2 EV (RNAi) (zwart, gesloten cirkels) en daf-2 met daf-16 (RNAi) (rode, open diamanten). TrialView zorgt voor het snel controleren op proef-specifieke data problemen die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van de pasvorm van de gebundelde dataset. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: de traditionele en replicaset methoden vergelijkbare resultaten geven. Verlies van beide componenten van de MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimer verhoogt levensduur. In contrast, verlies van beide componenten van de MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) vermindert levensduur dit cijfer is herdruk van referentie20 met toestemming via een licentie Creative Commons Naamsvermelding (CC BY) (Zie materiaal). (A). Kaplan-Meier resultaten met de traditionele methode. (B). Logit curve aanpassen met behulp van de methode replicaset. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: De methode genetische interacties op basis van wijzigingen in levensduur (A) en wijzigingen in de healthspan (B) voor meer dan 100 ontcijferen kan replicaset RNAi gelijktijdig klonen. Dit cijfer is herdruk van8 met toestemming onder de Creative Commons Naamsvermelding-niet-commercieel 4.0 internationale licentie (CC-door-NC) (Zie materiaal). (A) genetische levensduur analyse van progeric gen inactivations in het kader van de verminderde insuline-achtige signalering (ILS) (daf-2, x-as) en het ontbreken van daf-16/FoxO (y-as), een centrale transcriptionele effector van ILS21 . Gene inactivations met soortgelijke functies als daf-16 doen niet verder verkorten levensduur bij gebrek aan daf-16 (zwarte puntjes). Gene inactivations met functies volledig onafhankelijk van daf-16 verkorten beide genetische achtergronden ook (grijs). Gene inactivations waar het negatieve effect op de levensduur in daf-2 > daf-2; daf-16, suggereert functie parallel (wit). (B) wijzigingen in pak slaag tarieven na verloop van tijd kunnen ontlenen de gemiddelde healthspan voor vele genetische verstoringen (x-as) terwijl de beoordeling van wijzigingen in levensduur (y-as). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur S1: werkstromen in WormLife. Illustratie van de stappen van een aantal begeleide werkstromen (soms "wizards" genoemd). In elk van deze gevallen, na de laatste stap in de werkstroom, wordt de focus terug naar het belangrijkste plot venster geretourneerd. (A) de gegevens importeren werkstroom voor replicaset stijl datasets (B) de gegevens workflow voor traditionele Kaplan Meier stijl datasets importeren. (C) de werkstroom voor het toevoegen van lijnen aan een perceel voor de replicaset stijl datasets. (D) de werkstroom voor het toevoegen van lijnen aan een perceel voor traditionele Kaplan Meier stijl datasets. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 1: Studies die hebben aangegeven gerogenes. De komst van voeding gebaseerde RNAi leidde tot een tijdperk van ontdekking van het gen voor fenotypen die niet hanteerbare waren door de voorwaartse genetica, met inbegrip van veroudering. Vermeld, zijn in de volgorde van het aantal gerogenes ontdekt, onafhankelijke studies die genen waarvan de activiteit gewijzigd levensduur. Merk op dat de studie die het meest gerogenes de repliceren set, methode8 gebruikt. De aard van hoe gen inactivations gewijzigd levensduur is ook geïndiceerd: lange levensduur en progeric genen zijn die vergroot of verkleind levensduur wanneer geïnactiveerd, respectievelijk. "Life span variant" verwijst naar gevallen waar directionaliteit van verandering (d.w.z. verhoogd of verlaagd levensduur) niet is opgegeven of niet heeft zijn samengesteld. Gegevens van WormBase WS262 (januari 2018) (Zie materialen), met de toevoeging van RNAi-behandeling levensduur resultaten van referentie10, die nog niet zijn opgenomen in de curator collectie van WormBase RNAi fenotypen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende File 2: het aantal studies die zijn gekoppeld aan elke gerogene. De meeste gerogenes worden slecht bestudeerd. Terwijl sommige genen, zoals daf-16/FoxO, het onderwerp van veel aandacht voor onderzoek zijn, hebben meer dan 400 gerogenes minder dan 10 bijbehorende publicaties. Gegevens van WormBase WS262 (januari 2018), met de toevoeging van RNAi-behandeling levensduur resultaten van10 die nog niet zijn opgenomen in de curator collectie van WormBase RNAi fenotypen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 3: voorbereiding van de gemeenschappelijke reagentia voor C. elegans experimenten. (A). recept voor standaard NGM en RNAi platen. (B). recept voor M9 buffer en hypochloriet oplossing. (C). voorbereiding van LB + Amp/Tet platen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 4: voorbeeldgegevens replicaset. Een voorbeeld van de dataset van een replicaset levensduur experiment. Deze dataset is al opgemaakt om te worden geschikt voor invoer/analyse. Omvat twee proeven per voorwaarde (combinatie van stam/genotype en RNAi). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 5: traditionele longitudinale voorbeeldgegevens. Een voorbeeld van de dataset van een traditionele longitudinale levensduur experiment, met rechts-censureren, geformatteerd voor klaar import/analyse met behulp van Kaplan-Meier overleving perceel functionaliteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zowel de traditionele en replica set methoden vereisen de synchronisatie van chronologisch leeftijd dieren. We nemen een methode waarmee wordt gesynchroniseerd van dieren met behulp van hypochloriet behandeling van gravid volwassenen, waar alleen bevruchte eieren met de gravid volwassene behandeling overleven. Deze embryo's uitkomen in vloeibare suspensie en ontwikkelingsachterstand aanhouding op de eerste larvale stadium (L1). Na het zaaien L1 dieren op voedsel ( E. coli bijvoorbeeld waarin dsRNA naar een gen van belang), hervatten dieren ontwikkeling. Synchroniseren van L1 dieren door hypochloriet behandeling van gravid volwassenen heeft het voordeel dat de overgebleven unseeded L1 dieren kunnen worden bevroren en voor onbepaalde tijd in vloeibare stikstof- of een vriesvaartuig-80 ° C opgeslagen. Op deze manier een voorbeeld van elke stam ten tijde van de experimentele opstelling is bewaard gebleven, maken een waardevolle bron voor toekomstige studies en verbetering van de reproduceerbaarheid. Echter, terwijl hypochloriet behandeling van gravid volwassen dieren een gemeenschappelijke manier is om gesynchroniseerde dieren voor veroudering onderzoek22, de arrestatie van L1 is een reactie van de honger. Dus, enkele laboratoria verkiezen hetzij om broedeieren optreden op platen, of om helemaal afzien van hypochloriet behandeling en een paar gravid meerderjarigen om eieren te leggen gedurende enkele uren (dat wil zeggen een ei leggen). In het laatste geval, ouders worden verwijderd en de levensduur van de nakomelingen wordt gevolgd. Tot de beste van onze kennis, geen duidelijke verschillen in levensduur tussen dieren die zijn gesynchroniseerd in M9, uitgekomen op platen, of nakomelingen van een ei lay gemeld. Gezien het feit dat wijzigingen in de beschikbaarheid van nutriënten nauw met de veranderingen in levensduur verbonden zijn, is er echter voorrang dat specifieke genetische achtergronden verschillende uitkomsten tussen deze benaderingen van de synchronisatie produceren kon. Een meer zorgvuldige analyse is vereist om te lossen deze theoretische zorg.

Ongeacht de methode die wordt gebruikt voor het synchroniseren van de startende bevolking, moeten maatregelen worden getroffen om te voorkomen hetzij dat nakomelingen productie of om te scheiden van de gesynchroniseerde start bevolking van toekomstige nageslacht. In ons protocol, duidelijk naar voren komt het gebruik van FUdR om te voorkomen dat de productie van nageslacht, zoals het scheiden van dieren is niet een haalbare optie voor de replicaset methode. Het is ook mogelijk om te voorkomen dat de productie van nakomelingen genetisch door het gebruik van een Gefeminiseerde genetische achtergrond (bijvoorbeeld fer-15(b26);fem-1(hc17), die een temperatuur-afhankelijke steriele stam23). Echter geen is zonder tekortkomingen: het gebruik van genetische achtergronden latere analyse kan bemoeilijken, en in sommige genetische achtergronden FUdR levensduur24,25,26kunt wijzigen.

Als alternatief voor het voorkomen van nakomelingen betekent productie door middel van chemische of genetische, volwassen dieren kunnen periodiek worden verplaatst naar verse RNAi platen isoleren hen van hun nageslacht. Dit vereenvoudigt de achtergrond overwegingen ten koste van doorvoer. Periodiek verplaatsen dieren naar vers voedsel heeft de extra voordelen van preventie mogelijk honger en blootstelling aan dsRNA vernieuwen. Echter, sommige genetische interacties die van invloed zijn levensduur werden pas ontdekt wanneer nakomelingen productie werd geremd: vroege analyse van de TGFβ weg voor een levensduur fenotype ten onrechte geconcludeerd dat verminderde TGFβ signalering beïnvloed C. elegans duur vorming maar niet veroudering27,28. Een follow-up studie waarmee FUdR bleek echter dat daalde TGFβ signalering toegenomen levensverwachting door insuline signalering van29. Waarom niet eerdere studies zie verhoogde levensduur in TGFβ mutant dieren? TGFβ traject mutaties produceren een lichte ei leggen defect (egl) en reproductieve levensduur, waardoor de interne broedeieren van nakomelingen wordt later in het leven dat de ouder doodt uit te breiden. Het is waarschijnlijk dat de langlevende TGFβ mutant dieren leek te hebben een normale levensduur vanwege de egl fenotype gedood de dieren rond de tijd wanneer normaal wild-type dieren sterven. Dit zou relevant zijn voor andere genetische trajecten gekoppeld aan DR, zoals uitgehongerd wild-type dieren ook een egl fenotype, misschien als een voordeel van de adaptieve overleving aan nakomelingen onder omstandigheden van lage voedsel manifesteren. Dit wijst op de onderliggende complexiteit van adaptieve reacties dieren ondergaan onder stress-omstandigheden, en de noodzaak voor zorgvuldige analyse en aandacht bij het ontwerpen van experimenten van de levensduur.

In het ontwerpen en uitvoeren van levensduur experimenten door beide methoden is het van cruciaal belang om te voorkomen dat vooringenomenheid. Experimenten moeten plaatsvinden in een dubbelblinde wijze: hoe monsters waren eerder op vorige keer punten scoorde en de identiteit van een testvoorwaarde onbekend aan de experimentator moet worden. Bovendien is het altijd noodzakelijk om zowel de positieve als de negatieve controles; in het geval van de replica set, methode, worden deze willekeurig ingevoegd in een 24-well-plate. E. coli uiting van een plasmide die geen een insert met de reeks bevat is overeenkomt met de C. elegans genoom de lege vector negatieve controle (d.w.z. "L4440"-Zie materialen). Positieve controles zijn afhankelijk van de specifieke aard van een experiment. Bijvoorbeeld, daf-2 codeert de C. elegans insuline/IGF-1-receptor en daf-2 inactivering via voeding gebaseerde RNAi krachtig verhoogt levensduur ten minste twee-voudige in wild-type dieren27. Dus zou kunnen daf-2(RNAi) dienen als positieve controle bij het zoeken naar gene inactivations, waardoor de levensduur. Omgekeerd, daf-16 codeert de FOXO transcriptie factor orthologue30. DAF-16 is een essentieel onderdeel van vele levensduur paradigma's en wild-type dieren (N2) behandeld met daf-16(RNAi) zijn een kort leefde en symptomen van progeria31vertonen.

De belangrijkste voordelen van de traditionele longitudinale levensduur benadering zijn dat heel goed blijkt, en experimenten gemakkelijk zijn aan opstelling. Relatief weinig dieren komen op slechts een paar platen voor elke testvoorwaarde. Dus, de stammen die slecht groeien of vereisen balancers doorgeven kunnen gemakkelijk worden getest. De traditionele benadering is zeer flexibel en kan worden gebruikt met elke een van de beschikbare methoden voor de behandeling van nakomelingen productie, met inbegrip van behandeling met FUdR, oversteken naar een Gefeminiseerde genetische achtergrond of periodiek verplaatsen van volwassen dieren aan nieuwe platen tijdens de periode van de ei-leggen. Terwijl het verplaatsen van de dieren aanzienlijk vermindert doorvoer, werken met een mutant achtergrond is nooit ideaal, en hoewel FUdR niets aan wild-type levensduur32,33,34 verandert, het kan invloed hebben op de levensduur en leeftijd gerelateerde fenotypen in sommige genetische achtergronden35,25,26. Merk op dat de aanwezigheid van mannen, zelfs met het gebruik van FUdR, zal aanzienlijk verkorten hermafrodiete levensduur13, een plaat die mannetjes nadat het hermafrodieten L4 bereikt is dus onbruikbaar. Eveneens, is een analyse door de schatter Kaplan-Meier en bijbehorende bochten, en de log-rank test, gevestigde voor sterftecijfers. Er zijn echter ook verschillende nadelen aan de analyse van de traditionele levensduur. Herhaalde behandeling van platen (d.w.z. bloot van de platen in de lucht) vergemakkelijkt de invoering van airborne schimmel besmetting. Bovendien herhaalde prikken kan beschadigen of doden van dieren, vooral naarmate de bevolking in leeftijd voorschotten en kwetsbaar. Oudere dieren worden grotendeels verlamd en vastzit in E. coli, terwijl E. coli een opportunistisch pathogeen (koloniseren de lumen en verpakking van de keelholte)36 wordt. Zeer oude levende dieren kunnen slechts worden geïdentificeerd door subtiele hoofdbewegingen. Het is dus makkelijk te classificeren een afgeleefde levend dier als dood. Tot slot, de traditionele benadering wordt beperkt door de doorvoer.

De methode replicaset is hoge doorvoer en kwantitatieve. Het nadeel van deze methode is echter een grotere investering van tijd en middelen in de eerste instellen. Een matig groot experiment te onderzoeken 100 RNAi klonen meer dan 20 keer punten vereist 30.000 L1 dieren (waar ongeveer 15 dieren per RNAi kloon per tijdstip worden onderzocht), terwijl voor de meeste stammen, gemakkelijk kan worden problematisch in sommige gevallen. Bijvoorbeeld, zonder een grote-deeltje sorter ("worm sorter") stammen die moeten worden gehandhaafd met balancers of transgene lijnen die kan niet een slecht verzonden extra chromosomale matrix worden gemakkelijk onderzocht door deze methode. Een tweede nadeel is dat nakomelingen productie moet worden geremd, waarvoor het gebruik van FUdR of een Gefeminiseerde genetische achtergrond. Tot slot moet je weten hoe lang die de test kan worden uitgevoerd, zoals een een replicaset voor elk punt van de tijd aan het begin van het experiment moet voorbereiden. De voordelen van deze methode zijn echter talrijk. Bovenal scoren levensvatbaarheid is veel sneller en men kan gemakkelijk volgen dieren over 100 testomstandigheden gelijktijdig (d.w.z. RNAi klonen). Aangezien een replicaset is slechts eenmaal scoorde dan afgedankt, er is geen herhaalde behandeling van platen of van dieren die minimaliseert de kans op schimmel verontreiniging en elimineert sterfte veroorzaakt door de occasionele ruwe porren met een worm prikken halen. De toevoeging van vloeistof naar de waterput vergemakkelijkt bovendien sterk scoren. Bevrijden van oude dieren van de plaat en de omliggende bacteriën helpt bij het toestaan van subtiele hoofdbewegingen om gemakkelijker worden gescoord. Toevoeging van vloeibare biedt ook de mogelijkheid voor het meten van pak slaag tarieven als een maatregel van fitness (b.v. healthspan8,37).

Veroudering is een complex verschijnsel waarbij meerdere causale mechanismen waarvoor gebruik van systemen biologische benaderingen te ontrafelen. Deze benaderingen vaak nemen data-gedreven modellering, met behulp van grote gegevensvolumes genomic/transcriptomic, en vereisen aanvullende robuust en high-throughput methoden voor het meten van de levensduur en healthspan. De high-throughput replicaset methode zal lengterichting, terwijl het minimaliseren van de batch effecten en technische fouten, dus het bevorderen van de ontwikkeling van dynamische modellen die kunnen afleiden dat de interacties tussen causale trajecten in vergelijking van vele RNAi klonen toestaan een kwantitatieve manier. Bovendien is integratie van verschillende benaderingen van het genoom-brede genomics met de replicaset methode haalbaar, omdat een grote populatie van dieren leeftijd-gesynchroniseerde is onderverdeeld in een aantal kleine populaties.

Andere methoden zijn eerder ontwikkeld ter verbetering van de doorvoer van C. elegans levensduur experimenten, vaak gericht op aanpassing van de traditionele longitudinale benadering (d.w.z. na dezelfde set dieren na verloop van tijd) tot geautomatiseerde observatie en opname via gemeenschappelijke flatbed scanners38,39, of meer gespecialiseerde apparatuur zoals microfluidic platen40. De scanner gebaseerde benaderingen gebruiken het licht als een stimulans en vergelijk sequentieel opnames om te bepalen van leven/dood status gebaseerd op verkeer voor meerdere platen tegelijk; tijdens dergelijke benaderingen geen eigen wetenschappelijke hardware vereisen, kan tijd die betrokken zijn bij het opzetten van de werkstromen echter aanzienlijke afhankelijk van de gewenste omvang. U kunt ook toestaan levensduur experimenten in aangepaste microfluidic apparaten voor diepgaande fenotypische karakterisering van enkele dieren na verloop van tijd, en zonder behandeling om te voorkomen dat de nakomelingen, maar vereisen van de fabricage van de microfluidic platen en de verwerving van de bijbehorende microfluidic pompen en beeldvormende apparatuur. In tegenstelling, de replicaset methode, in combinatie met de software hier, gedetailleerde sterk verbeterde doorvoersnelheid kan met behulp van tools die gelden al in laboratoria die werken met C. elegans.

De software van de WormLife zal in de toekomst worden verbeterd om gemakkelijker toegang bieden tot de statistische vergelijking, en compatibiliteit met aanvullende platforms. De meest recente documentatie voor de software kan worden gevonden op de GitHub pagina, inclusief installatie-instructies voor de platformen waarop de software is getest. Een web-based versie zal ook worden ontwikkeld om gemakkelijke toegang hoeft geen software te installeren.

Kortom biedt de combinatie van de replicaset methode en de vrij beschikbare software hier gedetailleerde een krachtig platform voor het verbeteren van de gegevensdoorvoer en de robuustheid van de experimenten van de levensduur en een breed scala van overleving gebaseerde tests (bv benadrukken van tolerantie, toxicologische studies, healthspan, enz.). Met name wanneer deze wordt gecombineerd met functionele genomica, deze aanpak maakt gebruik van de vele voordelen van het metazoan modelsysteem C. elegans voor het ontcijferen van de talloze genetische interacties die aan de progressie bijdragen van veroudering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Financiering voor dit werk beschreven in dit manuscript werd verstrekt door: het Bureau van de Universiteit van Rochester van de Proost en de School van geneeskunde en tandheelkunde Dean's Office via de Health Sciences Center voor computationele innovatie (HSCCI); de Ellison medische Foundation nieuwe geleerden in Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) de financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).

Tags

Genetica kwestie 136 veroudering levensduur survival analyse C. elegans hoge-doorvoer statistische analyse van kwantitatieve fenotypen software
De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel <em>Caenorhabditis elegans</em> levensduur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornwell, A. B., Llop, J. R.,… More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter