시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법
Summary
현미경 검사기 에서 광 광학 은 세포 현탁액에서 직접 단일 세포의 크기를 모니터링하기 위해 개발되었다. 실시간 측정은 광 광학 멸균 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. 형태학적 변화는 성장 상태 및 재배 조건에 의존하여 나타납니다.
Abstract
미생물 바이오공정에서의 상시 모니터링은 주로 배지의 화학적 및 물리적특성(예를 들어,pH 값 및 용존 산소 농도)으로 제한된다. 그럼에도 불구하고, 세포의 형태는 성장 상태, 제품 축적 및 세포 스트레스에 의존하여 변화하기 때문에 최적의 조건에 적합한 지표가 될 수 있습니다. 더욱이, 단세포 크기 분포는 재배 조건에 대한 정보뿐만 아니라 인구 이질성에 대한 정보도 제공한다. 이러한 정보를 얻기 위해, 광-광학 적 현미경 장치1은 생물 반응기에서 세포 현탁액에서 직접 단일 세포 크기 분포의 모니터링을 가능하게하기 위해 개발되었다. 자동화된 이미지 분석은 사용자가 추가한 이미지로 학습되는 신경망 모델을 기반으로 현미경 검사법에 결합됩니다. 현미경의 포획에서 얻은 몇몇 매개변수는, 그들의 신진 대사 활동 같이 세포의 관련 특징을 처리하기 위하여 상관됩니다. 지금까지, 실라멘트 균주 현탁액에서 펠릿 크기를 측정하기 위해 시투 현미경 프로브 시리즈에 제시되었다. 미세조류 재배에서 단세포 크기를 구별하고 지질 축적과 관련시키기 위해 사용되었다. 세포 입자의 모양은 효모 배양에서 신진과 관련이 있었습니다. 현미경 분석은 일반적으로 세 단계로 분할 될 수있다: (i) 이미지 수집, (ii) 입자 식별, 및 (iii) 데이터 분석, 각각. 모든 단계는 유기체에 적응되어야하며, 따라서 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 특정 추가 정보가 필요합니다. 라인 또는 라인(바이패스)에서 세포 형태학의 변화를 직접 모니터링하는 기능을 통해 공정 개발 및 생산 규모에서 모니터링 및 제어를 위한 실시간 값을 구현할 수 있습니다. 오프라인 데이터가 실시간 데이터와 상관 관계가 있는 경우 셀 크기에 대한 알 수 없는 영향을 미치는 현재의 지루한 오프라인 측정은 불필요하게 됩니다.
Introduction
세포의 형태학적 특징은 종종 생리적 상태와 관련이 있으며, 형태와 기능 사이의 연관성은 많은 응용에 존재한다. 단일 세포의 형태는 성장 상태, 세포의 나이, 삼투성 및 기타 잠재적 인 세포 스트레스 또는 제품 축적에 의해 영향을받습니다. 세포의 형태학적 변화는 종종 배양의 성장 활력의 척도이다. 세포 내 제품 합성, 조류에 지질 축적 및 박테리아에 포함 신체 형성, 다른 사람의 사이에서, 뿐만 아니라 세포 크기와 관련. 세포 응집은 최근 요약 된 바와 같이 조사 가치가 또 다른 요인이 될 수 있습니다2.
집단 이질성은 개별 세포의 형태학적 특징에 기초하여 정량화될 수 있다. 연구 결과에 따르면 배양 내의 이질성은 유의할 수 있으며, 예를 들어대규모 생산조건 3하에서 전체 수율은 하위 모집단4의낮은 성능에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
일반적으로, 세포의 형태학적 특징의 평가는 수동 샘플링 또는 광 광학 장치에 결합된 바이패스 플로우 챔버로 수행된다. 이것은 몇 가지 제한으로 이어진다 : 획득 된 데이터의 제한된 양은 거의 통계적으로 신뢰할 수있는 측정을 제공 할 수 없습니다; 샘플링과 결과의 접근성 사이의 시간 지연은 프로세스의 역학에 비해 너무 길 수 있습니다. 그리고 가장 중요한 것은 샘플링 절차 (샘플링 포트의 위치, 측정 전에 샘플의 전처리, 샘플링 또는 우회 튜브의 불리한 조건)는 샘플 절차 자체가 이미 셀에 영향을 미칠 수 있기 때문에 편향된 오류를 유발할 수 있습니다. 형태학. 마지막으로, 샘플링 중 또는 바이패스 솔루션에서 멸균이 불가능한 경우 항상 오염 위험이 높습니다.
SITU 현미경 검사법 (ISM)의 적용은 이러한 문제 중 몇 가지를 우회 할 수 있습니다. 세포가 자동으로 감지되면 형태학적 특징의 정확한 식별을 조사할 수 있습니다5. 지금까지이 방법의 주요 제한 사항은 (i) 현장에서 너무 길었던 이미지의 평가 시간, 그리고 (ii) 특히 높은 세포 밀도에서 이미지의 잘못된 해상도였습니다. ISM의 첫 번째 솔루션은 기계적 샘플링, 프로브의 희석, 또는 바이 패스 시스템6,7로제한되었지만, 추가 접근법은 셀 서스펜션을 직접8로캡처할 수 있게 한다.
ISM의 최근 발전은 단일 세포 기준으로 세포의 인라인 또는 라인 모니터링을 허용하며, 이는 상당히 높은 세포 농도에서 세포 현탁액에서 직접 실시간으로 형태학적 매개 변수의 분포를 제공합니다. 셀의 주요 매개 변수에 대한 오프라인 분석을 통해 결합된 자동 셀 검출 및 ISM에서 제공하는 정보와의 상관 관계를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 단일 셀 형태로 측정 할 수없는 매개 변수를 추정하는 새로운 소프트 센서 설계가 달성됩니다.
이 보고서에서 ISM은 광 광학 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. ISM은 고해상도 CCD 카메라[MM-Ho = CCD GT2750(2750×2200) 및 MM 2.1 = CMOS G507c(2464×2056)]로 조정 가능한 측정 갭에서 알려진 초점 범위 내에서 이미지를 캡처할 수 있는 단일 로드 센서 프로브로 구성됩니다. 플래시 라이트 조명은 전송에 의해 수행됩니다. 따라서 라이트는 카메라9의 반대쪽에서 발생하며 강도를 조정할 수 있습니다. 세포는 액체 흐름과 이 간격을 연속하여 통과합니다. 따라서 대표적인 샘플 채우기가 수득됩니다. 프로브는 바이오리액터에 직접 장착하여 세포 현탁액에 도달하거나 멸균 가능한 바이패스로 사용할 수 있습니다. 센서 쉘은 멸균 전에 시스템에 연결되고, 광학 부품은 이후에 쉘에 장착됩니다.
지금까지, 관련 산업 미생물, 예를 들면,필라멘트 균류 (최대 200 μm의 직경), 이종 영양 미세 조류 크립토 페코디늄 cohnii (20 μm의 평균 세포 직경), 및 효모 Saccharomyces cerevisae (5 μm의 평균 세포 직경) 곧 이와 유사한 장치로 조사되었다.
필라멘트 균류는 특정 재배 조건 하에서 펠릿을 형성하는 경향이있다. 이들은 수백 μm까지의 크기입니다. 곰팡이 세포의 하이픈은 유체 단계에서 유체 역학 적 스트레스에 의존하여 서로 다른 길이를 개발합니다. 이것은 신진 대사 및 성장 활동, 기질 섭취 및 제품 방출에 영향을 미칩니다. ISM은 펠릿 의 가장자리에서 낮은 바이오 매스 밀도의 영역의 펠릿 크기 분포 및 폭을 식별하기 위해 적용되었다 (자신의 미공개 데이터).
C. cohnii의 크기는 세포가 질소 제한의 밑에 고도 불포화 지방산 docosahexaenoic 산 (DHA)를 축적할 때 15 그리고 26 μm 사이에서 변경합니다. 이 생명 공학 DHA 생산 과정은 세포가 분열하고 작아지는 성장 단계와 세포가 제품을 축적하여 더 커지는 생산 단계의 두 부분으로 구성됩니다. 따라서, 세포 크기는 성장 또는 DHA 생산이 유리한 공정 상태를 결정하는데 사용되었다. 마지막으로, 세포 크기와 DHA 함량 사이의 상관관계가 발견되었다. 이 경우 ISM은 샘플링, 세포 파괴 및 일반적인 가스 크로마토그래피 분석10의요구 없이 세포내 DHA 축적을 실시간으로 모니터링할 수 있다.
신진 효모는 일반적으로 3 ~ 8 μm 사이의 크기입니다. 신진지수(BI)와 같이 한 번에 성숙 상태에 있는 세포의 비율은, 성장 활력에 대한 정보를 제공하는11,12,및 재조합 단백질 분비와의 관계도13으로입증되었다. ISM의 도움으로, 신진 및 비 신진 효모 세포 (싹이있는 세포와 싹이없는세포)는 14를구별했습니다. 스트레스 조건은 또한 효모 인구 내의 세포 크기의 더 넓은 변화로 이끌어 낼 수 있습니다, 최근 스케일 다운 재배에서 나타난 바와 같이, 있는 대규모 영양소 제한 공급 배치 재배의 조건은 모방되었다3.
따라서 ISM은 최적의 재배 조건을 식별하거나 공정 제어를 목적으로 하는 생물공정의 모든 단계에서 단일 세포 수준에서 성장 활력 및 생성물 형성을 모니터링할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 여기에서 기술한 방법은 단 하나 세포를 가진 미생물 응용에 집중됩니다, 그러나 또한 인간과 동물 세포, 세포 응집체 및 필라멘트 유기체의 펠릿 같이 더 큰 입자에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 ISM은 동일하거나 매우 유사한 장치로 곰팡이, 미세 조류 및 효모 세포의 형태학적 역학을 측정하는 데 사용되었으며, 이는 성장 활성의 측정을 가능하게 하고, 조류의 경우, 세포내 제품 축적을 가능하게 하였다. 이 센서는 이동식 부품이 없으며 표준 포트를 통해 또는 멸균 가능한 바이패스로 표준 교반 탱크 생물 반응기에 직접 적용할 수 있습니다. 효모는 조류보다 훨씬 작기 때?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 프레임 워크 ZIM-Koop 내에서 독일 연방 경제 에너지부의 지원에 감사드립니다, 프로젝트 “스마트 프로세스 검사”, 부여 없음. ZF 4184201CR5.
Materials
| Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
| Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
| Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
| Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
| SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
| Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
| Fiji, ImageJ | open source | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |
References
- Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
- Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
- Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
- Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
- Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
- Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
- Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
- Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. – Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
- Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
- Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. , 222-225 (2017).
- Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
- Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
- Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
- Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
- Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. , 1225-1229 (2018).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
- Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
- Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).
