En foto-optisk in situ mikroskopi enhet utvecklades för att övervaka storleken på enskilda celler direkt i cellsuspensionen. Realtids mätningen utförs genom att koppla den foto optiska steriliserbara sonden till en automatiserad bildanalys. Morfologiska förändringar visas med beroende av tillväxt tillstånd och odlingsförhållanden.
In situ övervakning i mikrobiella bioprocesser är oftast begränsad till kemiska och fysikaliska egenskaper hos mediet (t. ex.pH-värde och upplöst syrekoncentration). Ändå kan morfologin av celler vara en lämplig indikator för optimala förhållanden, eftersom det förändras med beroende av tillväxt tillstånd, produkt ackumulering och cell stress. Dessutom ger encellig storleksfördelning inte bara information om odlingsförhållandena, utan också om befolkningens heterogenitet. För att få sådan information utvecklades en fotooptisk in situ -mikroskopi enhet1 för att möjliggöra övervakning av encelliga storleksfördelning direkt i cellsuspensionen i bioreaktorer. En automatiserad bildanalys är kopplad till mikroskopi baserat på en neurala nätverk modell, som är utbildad med användare-kommenterade bilder. Flera parametrar, som erhålls från fångar av mikroskopet, är korrelerade att bearbeta relevanta funktioner i cellerna, som deras metabolisk aktivitet. Fram till nu, den presenterade in situ mikroskopi sond serien tillämpades för att mäta pelleten storlek i trådformiga svampar suspensioner. Det användes för att skilja Single-cellstorlek i mikroalger odling och relatera det till lipid ackumulering. Formen på cellulära partiklar var relaterad till spirande i jästkulturer. Mikroskopi analys kan i allmänhet delas upp i tre steg: (i) bild förvärv, (II) partikel identifiering, och (III) dataanalys, respektive. Alla steg måste anpassas till organismen, och därför krävs specifik kommenterade uppgifter för att uppnå tillförlitliga resultat. Förmågan att övervaka förändringar i cellmorfologi direkt i linje eller på rad (i en by-pass) möjliggör realtidsvärden för övervakning och kontroll, i processutveckling samt i produktionsskala. Om off line data korrelerar med realtidsdata, den nuvarande tråkiga off linje mätningar med okända influenser på cellstorleken blir onödigt.
Morfologiska egenskaper hos celler är ofta relaterade till fysiologiska tillstånd, en koppling mellan form och funktion finns för många program. Morfologin av en enda cell påverkas av tillståndet av tillväxt, cellens ålder, osmotiska och andra potentiella cellspänningar eller produkt ackumulering. Morfologiska förändringar av celler är ofta ett mått på tillväxt livskraften i en kultur. Intracellulär produkt syntes, lipid ackumulering i alger och inkludering organ formation i bakterier, bland annat, är relaterade med cellstorleken samt. Cell tätorten kan vara en annan faktor som är värt att utreda som sammanfattas nyligen2.
Befolknings heterogen kan kvantifieras baserat på morfologiska egenskaper hos enskilda celler. Studier visade att heterogenitet inom en kultur kan vara betydande, till exempelunder storskaliga produktionsvillkor3 den totala avkastningen kan påverkas av en låg prestanda av subpopulationer4.
Vanligtvis utförs bedömningen av cellernas morfologiska egenskaper genom manuell provtagning eller med en flödes kammare kopplad till en fotooptisk enhet. Detta leder till flera restriktioner: den begränsade mängden förvärvade data kan knappast ge statistiskt tillförlitliga mätningar; tidsfördröjningen mellan provtagning och resultatens tillgänglighet kan vara för lång i jämförelse med processens dynamik. och viktigast av allt är att provtagningsförfarandet (provtagnings hamnens lokalisering, förbehandling av provet före mätningen, ogynnsamma förhållanden i provtagnings-eller bypass-röret) kan utlösa ett partiskt fel eftersom själva urvalsförfarandet redan kan påverka cell Morfologi. Slutligen finns det alltid en hög risk för kontaminering under provtagning eller i by-pass lösningar, om de inte är steriliserbara på plats.
Tillämpningen av in situ -mikroskopi (ISM) kan kringgå flera av dessa problem. Om celler upptäcks automatiskt kan en korrekt identifiering av deras morfologiska egenskaper undersökas5. Fram till nu var de huvudsakliga begränsningarna i denna metod (i) utvärderingstiden för bilder, som var för lång för in situ -tillämpningar, och (II) den dåliga upplösningen av bilder, särskilt vid höga cell tätheter. Även om de första lösningarna av ISM inkluderade Mekanisk provtagning, utspädning av sonden, eller begränsades till ett by-pass system6,7, ytterligare metoder tillåta avskiljning av cellsuspensionen direkt8.
De senaste framstegen inom ISM gör det möjligt att i linje eller på rad övervaka celler på en enda cell basis, vilket ger fördelningen av morfologiska parametrar i realtid direkt i cellsuspensioner vid betydligt höga cellkoncentrationer. Genom off line analyser av cellernas nyckelparametrar kan korrelationer med information som tillhandahålls av den kopplade automatiserade cell detekteringen och ISM identifieras. Sedan, nya mjuk sensor design uppnås, där en omätbar parameter uppskattas med Single-cell morfologi.
I denna rapport, ISM utförs genom att koppla en foto optisk sond till en automatiserad bildanalys. ISM består av en enda stång sensor sond som gör det möjligt att fånga bilder inom ett känt fokusområde i ett justerbart mått Gap med en högupplöst CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) och MM 2,1 = CMOS G507c (2464×2056)]. Blixt belysningen leds av transmission. Därför kommer ljuset från motsatt sida av kameran9 och dess intensitet kan justeras. Celler passerar kontinuerligt genom denna lucka med vätskeflödet. Därför erhålls en representativ prov population. Sonden kan monteras direkt på bio reaktorn så att den når in i cellsuspensionen, eller den kan användas i en steriliserbar by-pass. Sensor skalet är anslutet till systemet före sterilisering, de optiska delarna monteras efteråt i skalet.
Fram till nu, relevanta industriella mikroorganismer, t. ex., trådformiga svampar (diameter på upp till över 200 μm), den heterotrofiska mikroalger Crypthecodinium cohnii (genomsnittlig cell diameter på 20 μm), och jästen Saccharomyces cerevisiae (genomsnittlig cell diameter av 5 μm), undersöktes med denna eller liknande enheter, som kort beskrivas.
Filamentösa svampar tenderar att bilda pellets under vissa odlingsförhållanden. Dessa är av en storleksanpassa av upp till flera hundra μm. Den hyfer av svampceller utveckla olika längder i beroendet av den hydrodynamiska stressen i vätskefasen. Detta har en inverkan på metabolisk och tillväxt aktivitet, substrat upptag och produkt release. ISM tillämpades för att identifiera pellets storleksfördelning och bredden av zoner med lägre biomassa densitet vid kanterna av pellets (egna opublicerade data).
Storleken på C. cohnii förändrar mellan 15 och 26 μm när cellerna ackumuleras den fleromättade fettsyran dokosahexaensyra (DHA) under kväve begränsning. Denna bioteknologiska DHA produktionsprocess består av två delar, tillväxtfasen, där cellerna delar sig och blir mindre, och produktionsfasen, där celler ackumulerar produkten och därmed blir större. Därför användes cellstorleken för att bestämma process tillståndet, där antingen tillväxten eller DHA-produktionen var gynnsam. Slutligen hittades ett samband mellan cellstorleken och DHA-innehållet. I detta fall, ISM gör det möjligt att övervaka den intracellulära DHA ackumulering i realtid utan krav på provtagning, cell störningar, och den gemensamma gaskromatografi analys10.
Spirande jäst är vanligtvis av en storlek mellan 3 och 8 μm. Andelen celler som är i mogningen tillstånd i taget, som beskrivs med spirande index (BI), ger information om tillväxt vitalitet11,12, och även en relation med rekombinant protein sekretion har bevisats13. Med hjälp av ISM var blivande och icke-spirande jästceller (celler med och utan knopp) distingerade14. Stress villkor kan också leda till en bredare variation av Cellstorlek inom en jäst population, som nyligen visas i skala ner odlingar, där villkoren för storskalig näringsämne-begränsad Fed-batch odlingar härmade3.
Därför har ISM potential att övervaka tillväxt vitalitet och produkt bildning på en enda cellnivå under alla stadier av en Bioprocess för identifiering av optimala odlingsförhållanden, eller för ändamålet med processtyrning. De metoder som beskrivs här är inriktade på mikrobiella tillämpningar med enstaka celler, men är också tillämpliga på större partiklar som mänskliga och animaliska celler, cell agglomerater och pellets av trådformiga organismer.
ISM som presenteras här med samma eller mycket liknande anordningar användes för att mäta morfologisk dynamik av svampar, mikroalger, och jästceller, vilket möjliggjorde bestämning av tillväxt aktivitet, och i händelse av alger, intracellulär produkt ackumulering. Sensorn har inga rörliga delar och är direkt tillämplig i någon vanlig omrörd tank bioreaktor, antingen genom en standard port eller i en steriliserbar by-pass. Eftersom jäst är mycket mindre än alger, minskning av Cellstorlek krävde några n…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för stödet från det tyska federala ministeriet för ekonomi och energi inom ramen ZIM-Koop, projektet “Smart process Inspection”, Grant No. ZF 4184201CR5.
Sensor MM 2.1 – MFC | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell |
Sofware version v1R.003.0092 | SOPAT GmbH, Germany | n.a. | |
Thickness gauge | n.n. | It can be any supplier, DIN 2275:2014-03 | |
Ethanol 70% | n.n. | It can be any supplier | |
SOPAT manual Version 2.0.5 | SOPAT GmbH, Germany | ||
Optical lense paper | VWR | 470150-460 | |
Fiji, ImageJ | open source | ||
50 mL conical centrifuge tubes | It can be any supplier |