Summary

In situ Mikroskopi for Real-Time bestemmelse av single-celle morfologi i Bioprocesses

Published: December 05, 2019
doi:

Summary

En foto-optisk in situ mikroskopi enheten ble utviklet for å overvåke størrelsen på enkeltceller direkte i cellen suspensjonen. Sann tids målingen utføres ved å kobling Foto-optiske vanndampsteriliseres sonde til en automatisert bildeanalyse. Morfologiske endringer vises med avhengighet av vekst tilstand og dyrking forhold.

Abstract

In situ overvåking i mikrobiell bioprocesses er hovedsakelig begrenset til kjemiske og fysiske egenskaper av mediet (f. ekspH-verdi og oppløst oksygen konsentrasjon). Likevel kan morfologi av celler være en passende indikator for optimale forhold, siden det endres med avhengighet av vekst staten, produkt akkumulering og celle stress. Videre gir enkelt Cellestørrelse fordelingen ikke bare informasjon om dyrking forhold, men også om befolkningen heterogenitet. For å få slik informasjon, ble en foto-optisk in situ mikroskopi enhet1 utviklet for å muliggjøre overvåking av enkelt Cellestørrelse fordeling direkte i celle suspensjonen i bioreaktorer. En automatisert bildeanalyse er koplet til mikroskopi basert på et nettverk modell, som er trent med bruker-kommenterte bilder. Flere parametre, som er oppnådd fra fanger av mikroskopet, er korrelert å behandle relevante funksjoner i cellene, som deres metabolske aktivitet. Inntil nå, den presenterte in situ mikroskopi sonde serien ble brukt for å måle pellet størrelse i trådformede sopp suspensjoner. Den ble brukt til å skille enkelt Cellestørrelse i mikroalger dyrking og forholde det til lipid akkumulering. Formen på cellulære partikler var relatert til spirende i gjær kulturer. Den mikroskopi analysen kan vanligvis deles inn i tre trinn: (i) bildeoppkjøp, (II) partikkel identifisering, og (III) dataanalyse, henholdsvis. Alle tiltak må tilpasses organismen, og derfor er spesifikk kommentert informasjon kreves for å oppnå pålitelige resultater. Muligheten til å overvåke endringer i celle morfologi direkte i linje eller på linje (i et by-pass) muliggjør sann tidsverdier for overvåking og kontroll, i Prosessutvikling og i produksjonsskala. Hvis av linje dataene samsvarer med sanntidsdataene, blir gjeldende kjedelige av- linje målinger med ukjente påvirkninger på cellestørrelsen unødvendig.

Introduction

Morfologiske funksjoner av celler er ofte knyttet til den fysiologiske tilstand, en forbindelse mellom form og funksjon finnes for mange programmer. Morfologi av en enkelt celle er påvirket av tilstanden til vekst, cellens alder, osmotisk og andre potensielle celle påkjenninger eller produkt akkumulering. Morfologiske endringer av celler er ofte et mål på vekst vitalitet i en kultur. Intracellulære produkt syntese, lipid akkumulering i alger og inkludering kroppens dannelse i bakterier, blant andre, er i slekt med cellestørrelsen også. Cell agglomerering kan være en annen faktor som er verdt å undersøke som oppsummert nylig2.

Befolknings heterogeniteter kan være kvantifisert basert på morfologiske trekk ved individuelle celler. Studier viste at heterogenitet innenfor en kultur kan være betydelig, for eksempelunder store produksjonsforhold3 den totale avkastningen kan påvirkes av en lav ytelse av subpopulasjoner4.

Vanligvis er vurderingen av morfologiske funksjoner av celler utført av manuell prøvetaking eller med en by-pass Flow kammer koplet til en foto-optisk enhet. Dette fører til flere restriksjoner: den begrensede mengden ervervet data kan neppe gi statistisk pålitelige målinger; tidsforsinkelsen mellom prøvetaking og tilgjengeligheten av resultatene kan være for lang i forhold til dynamikken i prosessen; og viktigst, prøvetaking prosedyren (plassering av prøvetaking porten, pre-behandling av prøven før målingen, ugunstige forhold i prøvetaking eller bypass tube) kan utløse en partisk feil som prøven prosedyren i seg selv kan allerede påvirke celle Morfologi. Til slutt, det finnes alltid en høy risiko for forurensning under prøvetaking eller i by-pass løsninger, hvis de ikke er vanndampsteriliseres på plass.

Anvendelsen av in situ MIKROSKOPI (ISM) kan omgå flere av disse problemene. Hvis celler oppdages automatisk, kan en korrekt identifisering av deres morfologiske funksjoner bli kartlagt5. Hittil var de viktigste begrensningene ved denne metoden (i) evaluerings tidspunktet for bilder, som var for lang for in situ -applikasjoner, og (II) den dårlige oppløsningen av bilder, spesielt ved høy celle tetthet. Selv om første løsninger av ISM inkluderte mekanisk prøvetaking, fortynning av sonden, eller var begrenset til et by-pass system6,7, ytterligere tilnærminger tillate fangst av cellen suspensjon direkte8.

Nylige fremskritt i ISM gir mulighet for in line eller on line overvåking av celler på en enkelt celle basis, som gir fordelingen av morfologiske parametre i sanntid direkte i celle suspensjoner ved betydelig høye celle konsentrasjoner. Gjennom off linje analyser av cellenes nøkkelparametre, sammenhenger med informasjon gitt av sammenkoblede automatiserte celle deteksjon og ISM kan identifiseres. Deretter oppnås nye Soft sensor design, der en unmeasurable parameter er anslått med enkelt celle morfologi.

I denne rapporten utføres ISM ved å kopling en foto-optisk sonde til en automatisert bildeanalyse. ISM består av en enkelt stang sensor sonde som gjør det mulig å fange opp bilder innenfor et kjent fokusområde i et justerbart mål gap med et høyoppløselig CCD-kamera [MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) og MM 2,1 = CMOS G507c (2464×2056)]. Blits lys belysningen utføres ved overføring. Derfor kommer lyset fra motsatt side av kameraet9 og dens intensitet kan justeres. Celler passerer kontinuerlig gjennom dette gapet med væsken flyt. Derfor oppnås en representativ utvalgs populasjon. Sonden kan monteres direkte på bioreactor slik at den når inn i celle fjæringen, eller den kan brukes i en vanndampsteriliseres by-pass. Sensor skallet er koblet til systemet før sterilisering, de optiske delene er etterpå montert inn i skallet.

Inntil nå, relevante industrielle mikroorganismer, f. eks, trådformede sopp (diameter på opptil over 200 μm), heterotrofe mikroalger Crypthecodinium cohnii (gjennomsnittlig celle diameter på 20 μm), og gjær Saccharomyces cerevisiae (gjennomsnittlig celle diameter på 5 μm), ble undersøkt med denne eller lignende enheter, som er kort beskrevet.

Trådformede sopp tendens til å danne pellets under visse dyrking forhold. Disse er av en størrelse på opp til flere hundre μm. Hyfer av sopp cellene utvikle ulike lengder i avhengighet til hydrodynamisk stress i væskefasen. Dette har en innflytelse på metabolsk og vekst aktivitet, substrat opptak og produkt utgivelse. ISM ble brukt til å identifisere pellet størrelsesfordelingen og bredden av soner av lavere biomasse tetthet på kantene av pellets (egne upubliserte data).

Størrelsen på C. cohnii endrer mellom 15 og 26 μm når cellene akkumuleres flerumettede fatty acid dokosaheksaensyre acid (DHA) under nitrogen begrensning. Denne bioteknologisk DHA produksjonsprosessen består av to deler, vekstfasen, der cellene deler seg og blir mindre, og produksjonsfasen, der cellene akkumulerer produktet og dermed blir større. Derfor ble cellestørrelsen brukt til å bestemme prosess tilstanden, der enten vekst eller DHA-produksjon var gunstig. Til slutt ble det funnet en korrelasjon mellom cellestørrelsen og DHA-innholdet. I dette tilfellet gjør ISM det mulig å overvåke den intracellulære DHA-akkumulering i sanntid uten kravet om prøvetaking, celle avbrudd og felles gass kromatografi analyse10.

Spirende gjær er vanligvis av en størrelse mellom 3 og 8 μm. Andelen celler som er i modnings tilstand om gangen, som beskrevet med den spirende index (BI), gir informasjon om vekst vitalitet11,12, og selv en forbindelse med rekombinant protein sekresjon er påvist13. Med hjelp av ISM var spirende og ikke-spirende gjærceller (celler med og uten en knopp) fremtredende14. Stress forhold kan også føre til en bredere variant av cellestørrelsen i en gjær befolkning, som nylig vist i skala ned dyrket, der forholdene i storstilt nærings-begrenset matet-batch dyrket var etterlignet3.

Derfor har ISM potensial til å overvåke vekst vitalitet og produkt dannelse på et enkelt cellenivå under alle stadier av en bioprosessen for identifisering av optimale dyrking forhold, eller for det formål å behandle kontroll. Metodene som er beskrevet her er fokusert på mikrobielle applikasjoner med enkeltceller, men er også gjeldende for større partikler som menneske-og dyreceller, celle agglomerater og pellets av trådformede organismer.

Protocol

Merk: følgende trinn er nødvendige for å tilpasse parametrene til de respektive mikroorganismen og kultur forhold. Justeringen av sonde innstillingene varer ca 20 min for en erfaren bruker. En detaljert beskrivelse av verktøy og trinn er gitt i den korresponderende sonde manualen fra SOPAT GmbH. Generelt er verktøyene som presenteres i følgende protokoll nødvendig: (i) probe Controller for sonde justeringer og bildeoppkjøp; (II) Fiji (ImageJ) for kommentarer på ervervet bilder; (III) SOPAT …

Representative Results

Den Cellestørrelse deteksjon i gjær kulturer med ISM og automatisert bildegjenkjenning for å skille mellom spirende og ikke-spirende celler ble vellykket gjennomført. Både stroboscope intensitet og valg av måle gapet har en rekke toleranse, der partikkel identifikasjonen ikke påvirkes. For eksempel ble S. cerevisiae celler målt med ulike stroboscope intensitet innenfor et variasjonsområde på 11% ved en tørr biomasse konsentrasjon av 4 g L-1. De tilsvarende b…

Discussion

ISM som presenteres her med samme eller svært like enheter ble brukt til å måle morfologiske dynamikk av sopp, mikroalger, og gjærceller, som gjorde det mulig fastsettelse av vekst aktivitet, og i tilfelle av alger, intracellulære produkt akkumulering. Sensoren har ingen bevegelige deler og er direkte anvendelig i enhver standard rørt tank bioreactor, enten gjennom en standard port eller i en vanndampsteriliseres by-pass. Siden gjær er mye mindre enn alger, reduksjonen i Cellestørrelse kreves noen nyere maskinvar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlig for støtte fra det tyske føderale departementet for økonomi og energi innenfor rammeverket ZIM-Koop, prosjektet “Smart Process inspeksjon”, gi nei. ZF 4184201CR5.

Materials

Sensor MM 2.1 – MFC SOPAT GmbH, Germany n.a. Inline Monocular Microscopic probe Version 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092 SOPAT GmbH, Germany n.a.
Thickness gauge n.n. It can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70% n.n. It can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5 SOPAT GmbH, Germany
Optical lense paper VWR 470150-460
Fiji, ImageJ open source
50 mL conical centrifuge tubes It can be any supplier

References

  1. Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
  2. Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
  3. Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
  4. Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
  5. Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493 (2011).
  6. Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
  7. Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
  8. Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007 (2015).
  9. Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. – Rev. IFP Energies. 72 (3), 14 (2017).
  10. Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
  11. Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
  12. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  13. Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
  14. Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. , 222-225 (2017).
  15. Marbà-Ardébol, A. -. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73 (2018).
  16. Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
  17. Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
  18. Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
  19. Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. , 1225-1229 (2018).
  20. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  21. Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
  22. Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
  23. Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).

Play Video

Cite This Article
Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses. J. Vis. Exp. (154), e57823, doi:10.3791/57823 (2019).

View Video