Summary
我们开发了一种异种乳癌模型, 由永生化的肿瘤和成纤维细胞组成的 bioprintable 海藻酸盐/明胶 bioink。该模型概括体内肿瘤微环境, 促进多细胞肿瘤球体的形成, 对肿瘤的发生机制有深入的认识。
Abstract
使用常规的二维 (2D) 细胞培养法, 生长永生化癌细胞株不概括本机肿瘤微环境的细胞、生物化学和生物物理异质性。这些挑战可以克服, 通过使用生物打印技术建立异构的三维 (3D) 肿瘤模型, 即不同类型的细胞嵌入。海藻酸盐和明胶是生物打印中使用的两种最常见的生物材料, 其生物相容性、仿生学和力学性能。通过结合这两种聚合物, 我们取得了 bioprintable 复合水凝胶与原生肿瘤基质的显微结构相似。通过流变学研究了复合水凝胶的适印性, 得到了最佳的印刷窗口。将乳腺癌细胞和成纤维细胞嵌入水凝胶中, 并印成3D 模型, 模拟体内微环境。bioprinted 异构模型为长期细胞培养 (> 30 天) 提供了很高的生存能力, 并促进了乳腺癌细胞的自组装成多细胞肿瘤球体 (MCTS)。我们观察了肿瘤相关成纤维细胞 (咖啡馆) 与 MCTS 在该模型中的迁移和相互作用。利用 bioprinted 细胞培养平台作为共培养系统, 为研究肿瘤发生对基质成分的依赖性提供了独特的工具。该技术具有吞吐量高、成本低、重现性高的特点, 也为常规细胞单层培养和动物肿瘤模型的研究提供了一种可替代的模型。
Introduction
虽然2D 细胞培养在癌症研究中得到广泛应用, 但由于细胞以单层格式生长, 营养和氧气浓度均匀, 所以存在局限性。这些文化缺乏在原生肿瘤微环境中存在的重要细胞细胞和细胞基质相互作用。因此, 这些模型不太概括的生理条件, 导致异常细胞行为, 包括非自然形态, 不规则的受体组织, 膜极化, 和异常的基因表达, 除其他情况1,2,3,4。另一方面, 3D 细胞培养, 细胞被扩展在一个体积空间作为聚合体, 球体, 或 organoids, 提供了一种替代技术, 以创造更准确的体内环境, 以研究基本细胞生物学和生理学。3D 细胞培养模型还可以鼓励细胞 ECM 相互作用, 这是本机1,4,5的重要生理特性。新兴的3D 生物打印技术为构建模仿异类的模型提供了可能性。
3D 生物打印是从快速原型, 并使制造的3D 显微组织, 可以模仿一些复杂的活体标本6,7。目前的生物打印方法包括喷墨、挤出和激光辅助印刷8。其中, 挤出方法可以在不同的初始位置精确定位各种不同类型的材料, 从而在印制矩阵中控制异质性。因此, 它是制造多类型细胞或矩阵的异质体模型的最佳方法。挤压生物打印已成功地用于建立耳形支架9, 血管结构10,11,12, 皮肤组织13, 导致高印刷保真度和细胞可行性。该技术还具有多种材料选择, 有能力储存与已知密度的细胞的材料, 高重现性14,15,16,17.天然和合成水凝胶经常被用作3D 生物打印的 bioinks, 因为它们的生物相容性, 生物活性, 和他们的亲水性网络, 可以工程结构类似 ECM7,18 ,19,20,21,22,23。水凝胶也很有利, 因为它们可以包括细胞的粘接部位、结构元素、养分和气体的渗透性, 以及促进细胞发育的适当机械特性24。例如, 胶原水凝胶提供整合素锚固点, 细胞可以用来连接到基质。凝胶, 变性胶原蛋白, 保留类似的细胞黏附部位。相比之下, 海藻酸盐是 bioinert, 但通过形成 crosslinks 与价离子25,26,27,28提供机械完整性。
在这项工作中, 我们开发了复合水凝胶作为 bioink, 由海藻酸盐和明胶组成, 与原生肿瘤基质的显微结构相似。乳腺癌细胞和成纤维细胞被嵌入在水凝胶中,通过挤压的 bioprinter 印刷, 以创建模拟体内微环境的3D 模型。设计的3D 环境允许癌细胞形成多细胞肿瘤球体 (MCTS), 具有很高的生存能力, 长时间的细胞培养 (> 30 天)。该协议展示了合成复合水凝胶的方法, 表征了材料的显微组织和适印性, 生物打印细胞异构模型, 观察 MCTS 的形成。这些方法可以应用于其他 bioinks 挤压生物打印, 以及不同的设计的异构组织模型的潜在应用, 在药物筛选, 细胞迁移检测, 和研究, 重点在基本细胞生理功能。
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Protocol
1. 材料、水凝胶和细胞培养材料的制备
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材料和溶液制备
- 洗涤和干250毫升和100毫升玻璃烧杯, 磁性搅拌器, 铲子, 10 毫升墨盒, 25 克圆柱形喷嘴 (长度0.5 英寸和内径250µm)。在121摄氏度/15 min/1 atm 机上热处理, 对材料进行杀菌灭菌. 使物料在无菌条件下使用。
注: 请参考物料表以了解供应商信息。 - 重3克海藻酸盐 (3% 瓦特/v) 和7克的明胶 (7% 瓦特/v) (表示为 A3G7 以后)。
- 在 UV 光下杀菌以下物品至少4小时: 海藻酸盐和明胶粉, 石蜡膜, 铝箔片5厘米2, 和1毫升和5毫升注射器。将端盖、尖端帽和活塞浸泡在70% 乙醇中至少4小时, 用灭菌过的超纯水清洗2x。
注: 请参考物料表以了解供应商信息。 - 用超纯水溶解4克琼脂糖, 用热处理消毒。
注: 琼脂糖在热处理过程后完全溶解。 - 在使用前, 在灭菌的超纯水和无菌过滤器 (孔径为0.22 µm) 的情况下, 准备100毫米无水氯化钙 (CaCl2) 溶液。
- 对于琼脂糖涂层的6井板, 在微波中熔化无菌琼脂糖以获得液体溶液;然后, 在生物安全柜 (BSC) 和使用1毫升微, 增加2毫升每井和混合它轻轻地创建一个统一的层在井底部。把它冷却下来, 用石蜡膜封好。保持室温 (RT), 直到使用。
- 洗涤和干250毫升和100毫升玻璃烧杯, 磁性搅拌器, 铲子, 10 毫升墨盒, 25 克圆柱形喷嘴 (长度0.5 英寸和内径250µm)。在121摄氏度/15 min/1 atm 机上热处理, 对材料进行杀菌灭菌. 使物料在无菌条件下使用。
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A3G7 水凝胶前驱体的制备
- 将3克海藻酸盐和7克明胶粉混合在平衡计分卡内的250毫升烧杯中。加入一个磁力搅拌器和100毫升的 DPBS。用无菌石蜡膜和铝箔 (5 厘米2) 封住烧杯以避免污染。
- 用 600 rpm 在60摄氏度的磁性/热板上, 在恒定的搅拌下将粉末溶解在 1 h 和 RT 上, 额外的2小时。
- 加热的材料在37°c, 直到凝胶经历了相变的液体状态 (为100毫升的股票凝胶溶液, 这需要大约45分钟)。将溶液转化为无菌50毫升锥形离心管, 将其密封, 并将管子离心在 834 x g 处5分钟, 以消除材料中的任何气体气泡。
- 将水凝胶前驱体吸入10毫升注射器。用瓶盖和石蜡膜密封注射器。储存在4摄氏度, 直到使用。
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细胞培养
注: 本节中的步骤必须在无菌条件下执行。- 准备基本的 DMEM 培养基如下 (1 升): 在平衡计分卡, 混合100毫升胎牛血清 (血清) 加上10毫升的抗生素/防霉溶液 (100x 稳定溶液) 进入一个新鲜的无菌容器。添加 DMEM 培养基, 以调整混合物多达1000毫升。密封容器并保持在4摄氏度。
- 在以前温暖的水浴 (37 °c), 解冻1瓶 MDA-MB-231-GFP (人乳腺癌细胞线 GFP 标记, 核本地化) 和1瓶 IMR-90-mCherry (癌症伴生的成纤维细胞线 mCherry 标记, 与细胞质定位) 细胞从液氮储存中轻轻地移动到水中。这两种细胞系, 以及 GFP 和 mCherry 标签的质粒, 都是商业上可用的。
- 将160µL/井的细胞溶液 (3 x 106细胞/毫升) 转移到6井板中, 加入5毫升的温热 (37 °c) 基底 DMEM 培养基。孵化板在37°c/5% CO2 24-48 小时, 直到细胞达到80% 汇合。
- 细胞到达汇合处后, 丢弃培养基, 用 DPBS 冲洗两次细胞;培养细胞与500µL 的胰蛋白酶-EDTA 溶液/井 (0.25%, 1x, 以前温暖37°c) 在37摄氏度为6分钟。然后, 通过添加500µL 的血清, 恢复细胞溶液并将其转移到 T-75 瓶中, 使胰蛋白酶钝化。再次孵化他们在37°c/5% CO2 , 直到细胞达到80% 汇合。
注: 胰蛋白酶-EDTA 溶液的体积可以根据细胞生长血管的不同而变化。 - 重复前面的步骤, 在通道 3-4 上使用细胞, 因为那是细胞有更多的新陈代谢活动和稳定性。
- 用台盼蓝法 (0.4%) 计数细胞, 确定与水凝胶混合的细胞初始浓度。
2. 水凝胶流变性能的测定
- 如步骤1.2 所述, 制备海藻酸盐/明胶水凝胶前驱体。
注: 机械测试和分析所产生的样品不需要无菌条件。所有流变试验均以三份进行。 - 取一注射器的水凝胶前驱物和温暖它在37°c 水浴1小时。
- 打开流变仪并根据以下步骤初始化系统。
- 打开连接到流变仪的空压机, 让空压机运行30分钟. 在流变仪的温度控制盒上切换, 切换流变仪本身, 并在连接到流变仪的计算机上切换。
- 打开流变仪软件, 单击控制面板上的 "初始化", 并让初始化过程完成。在控制面板上将平台温度设置为37°c。
- 单击 "测量集" 选项卡并导航到 "开始服务" 功能, 在下拉菜单中选择 "调整驱动程序惯性", 然后单击弹出窗口中的 "开始调整"。
- 在流变仪中安装平行测量工具。这里所做的所有实验都使用25毫米直径的板, 在板材之间有1毫米的间隙。
- 单击 "控制面板" 上的 "设置零间隙", 然后等待过程完成。在这个过程中要注意正常的力。
注: 本程序后, 正常力应为0。 - 单击 "测量集" 选项卡并导航到 "启动服务" 功能, 选择 "调整上测量系统惯性", 然后单击弹出窗口中的 "开始调整"。完成后, 单击 "控制" 面板上的 "三角形" 按钮, 以允许测量工具向上移动。
- 进行振幅扫描。
- 单击 "开始", 然后单击 "顶部" 菜单中的 "插入", 从下拉菜单中选择 "等待"。拉起安装窗口, 并将等待时间设置为2小时。
注意: 这将在测试之前添加等待步骤。 - 单击 "开始", 然后再次单击 "插入" 按钮, 然后从下拉菜单中选择 "设备"。拉起安装窗口, 选择温度, 并设置为25摄氏度。取消选中 "等待" 复选框,直到达到值。
- 单击步骤测量, 然后单击可变振荡应变, 拉起设置窗口, 设置剖面为斜坡对数, 并将值更改为0.001% 和100% 作为初始应变和最终应变,分别。将频率设置为0.01 赫兹。
- 单击 "添加" 按钮添加温度变量。单击可变温度并将其设置为25°c。在拉式窗口中, 展开计算器, 设置点密度为10磅/十年。
- 从水浴中取出注射器, 将前体的大约0.5 毫升拉伸到流变仪平台上。
- 单击 "控制" 面板上的 "向下三角形" 按钮。等待测量工具向下移动到修剪位置。
- 使用刮刀修剪在测量工具的边缘上逃逸的多余的前体, 并丢弃多余的材料。
- 用吸管将矿物油放到测量工具的边缘, 等到油完全密封边界。
- 单击 "控制面板" 上的 "继续"。然后单击 "开始" 按钮 (绿色三角形), 接着单击底部屏幕上的 "继续" 按钮。
- 完成测试后, 释放测量工具, 然后单击 "控制面板" 上的 "向上三角形" 按钮。取出测量工具, 用70% 乙醇清洗。用70% 乙醇清洁平台。
- 在当前项目中, 单击步骤度量并向上拉安装窗口。现在, 设置频率为100赫兹. 保持所有其他参数不变。
- 重复步骤 2.4.5-2.4.10。
- 单击 "图表"。观察 g '、g '与振荡应变的曲线。查找 G 的偏转点为两个频率 (0.01 赫兹和 100 hz)。找出两个偏转点对应的振荡应变。
- 选择较小的振荡应变, 并使用1/10 的这种应变的所有振荡测试之后进行。
注意: G ' 偏转的开始被认为是在后续试验中不应超过的极限线性弹性应变 (ULES)。比1/10 通常用于工程中的安全原因。这个计算的应变被表示为 gC。 - 完成测试后, 单击 "表", 复制所有数据, 然后将其粘贴到文本文件中。
- 单击 "开始", 然后单击 "顶部" 菜单中的 "插入", 从下拉菜单中选择 "等待"。拉起安装窗口, 并将等待时间设置为2小时。
- 进行温度扫描。
- 单击我的应用程序并选择模板温度斜坡, 振荡剪切: 凝胶。
- 命名项目。
- 单击工作流中的步骤度量。然后单击可变温度, 拉起设置窗口, 并将初始和最终温度分别设置为37°c 和25摄氏度。
- 在拉窗上, 设置振荡应变为 0.1%, 振荡频率为1Hz。然后将数据点的数量设置为61。将数据收集频率设置为1点/分钟. 单击计算器并将点密度设置为0.2 °c/点。
注: 这将使温度变化的速率为0.2 摄氏度/分钟。 - 在流变仪平台上加载示例, 并按照以下步骤 2.4.5 2.4.10 执行测试。
- 单击图, 观察 g ', g '与温度。找到 g ' 和 g ' 的交叉点。在交叉点找到温度。
注: 这是水凝胶前驱体的溶胶/凝胶过渡温度。 - 重复步骤2.4.15。
- 进行等温时间扫描。
- 单击 "我的应用程序" 并查找并单击模板等温时间温度测试。单击工作流中的步骤度量, 然后单击可变振荡应变, 向上拉安装窗口, 将振荡应变设置为 0.1%, 并将振荡频率设置为1赫兹。在 "拉" 窗口中, 将数据点的数量设置为120。将数据收集频率设置为1点/分钟。
注意: 这个应变的值是基于振幅扫描的结果。 - 单击 "添加" 按钮添加温度变量。单击中间窗口中的可变温度, 并将其设置为25摄氏度。
- 右键单击步骤设备移动到工作流中的测量点, 单击 "删除"。然后单击步骤设备设置值, 取消选中该框等待值到达, 并将值设置为25°c。单击底部屏幕上的 "图片"、"点击"按钮, 取消选中 "继续" 框。然后单击步骤开始, 命名项目并保存它。
- 将该示例加载到流变仪平台上, 并通过以下步骤 2.4.5 2.4.10 开始测试。
- 观察 g ', g '与时间。找到 g ' 和 g ' 的交叉点。在交叉点找到时间。完成测试后, 单击 "表", 复制所有数据, 然后将其粘贴到文本文件中。
注: 这是凝胶前驱体的溶胶/凝胶过渡时间为25摄氏度。
- 单击 "我的应用程序" 并查找并单击模板等温时间温度测试。单击工作流中的步骤度量, 然后单击可变振荡应变, 向上拉安装窗口, 将振荡应变设置为 0.1%, 并将振荡频率设置为1赫兹。在 "拉" 窗口中, 将数据点的数量设置为120。将数据收集频率设置为1点/分钟。
- 在不同的胶凝时间内测量屈服强度。
- 点击我的应用程序, 找到并点击模板产量和流动压力, 凝胶样。命名项目。单击工作流中的步骤开始。单击顶部菜单中的 "插入", 然后在下拉菜单中选择 "等待"。拉起安装窗口, 并将等待时间设置为20分钟。
注意: 这将在测试之前添加等待步骤。 - 单击"开始 ", 然后再次单击 "插入", 然后在下拉菜单中选择 "设备"。拉起安装窗口, 选择温度,并将其设置为25摄氏度。取消选中该框,等待值到达。
- 单击工作流中的步骤测量, 选择可变剪切应力, 拉起设置窗口, 并分别将初始和最终剪切应力设置为0和 1万 Pa。 点击计算器, 将点密度设置为0.2 点/宾夕法尼亚州在左侧的 "数据点" 选项卡上, 设置1磅/秒。
注: 这将导致应力加速率为 5 Pa/秒。 - 单击下拉窗口底部的 "事件控制" 选项卡, 并设置停止条件: 如果剪切速率 > 100s-1, 则停止测量。
注: 如果材料产生, 这将自动停止测量。 - 将该示例加载到流变仪平台上, 并通过以下步骤 2.4.5 2.4.10 开始测试。
- 单击 "图表"。观察应变-应力曲线。找出应变的挠度点及其对应的应力。重复步骤 2.7.2 2.7.6, 但每次复制时将等待时间更改为30、40和50分钟。这将导致在不同的凝胶时间的屈服强度。
注: 这种应力被视为明显的屈服强度。
注: 软件点击可能会因流变模型和软件版本而异。我们建议读者参考我们提供的测试参数, 同时参考具体的流变器/软件的实际使用手册。
- 点击我的应用程序, 找到并点击模板产量和流动压力, 凝胶样。命名项目。单击工作流中的步骤开始。单击顶部菜单中的 "插入", 然后在下拉菜单中选择 "等待"。拉起安装窗口, 并将等待时间设置为20分钟。
3. 脚手架设计, 含细胞水凝胶和3D 打印模型
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脚手架设计
- 在纸上画一个螺旋桨样的模型。
注: 螺旋桨样模型是根据以下考虑设计的: (a) 模拟在体内的情况下, 癌细胞被咖啡馆包围;(b)通过使用圆形几何图形, 最大限度地减少应力集中;(c) 灵活性, 以便将来可以增加更多的部门, 而不改变现有的几何图形;和 (d) 它的垂直规模平坦, 以促进养分扩散。 - 让螺旋桨的中心是起源和使用符号r0, r1, r2 代表的最大半径的内圈, 中间部门, 和外部部门, 分别。使用符号m和n分别表示扇区内的内部圆弧和辐条的数目。
- 计算螺旋桨状模型上每个节点的坐标, 并将它们写在r0、 r1、 r2、 m和n的符号表达式中。
- 启动程序脚本, 将r0、 r1、 r2、 m和n设置为变量, 并输入每个键节点的符号表达式。
注: 有关任何软件信息, 请参阅材料表。 - 排列连接节点的路径, 并为内部圆、中间扇区和外部扇区分配一个墨盒。将层厚度设置为150µm, 层数为4。
- 让程序以 G 代码格式输出文本文件, 这是由 bioprinter 识别的。
- 设置R0 = 3.85, r1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2, 和n = 5。运行脚本并检索生成的 G 代码文件。将文件复制并粘贴到 bioprinter 的专用 G 代码文件夹中。
- 打开 bioprinter 及其控制软件。初始化打印机。打开刚刚创建的 G 代码脚本, 并将所有压力设置为零。返回到控制软件, 单击选项卡建筑工生成器, 然后单击右下角的 "运行" 按钮。观察打印机的移动路径。
注意: 这将测试生成的 G 代码的精度。有关 bioprinter 的信息, 请参阅材料表。 - 此步骤是可选的。通过计算机辅助设计 (CAD) 软件, 建立了基于上述参数的演示3D 模型。
注: 请参阅供应商软件信息的材料表。
- 在纸上画一个螺旋桨样的模型。
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A3G7 水凝胶前驱体的制作
注: 本节中的步骤必须在无菌条件下执行。把 bioprinter 放在平衡计分卡里。- 彻底喷洒70% 乙醇, 并在一夜之间将其暴露在紫外线照射下, 对 bioprinter 进行消毒。
- 取出一注射器的水凝胶前驱体 (在4°c) 和温暖它在一个水浴在37°c 1 小时。
- 把 T 瓶与细胞 (见步骤 1.3) 从 CO2孵化器, 并把它放在平衡计分卡。丢弃培养基, 用 DPBS 冲洗细胞两次。添加一个温暖的胰蛋白酶-EDTA 溶液 (3.0 毫升) 和孵化的细胞在37°c 6 分钟. 用相同体积的血清使胰蛋白酶灭活。用台盼蓝法计算细胞数。
- 从水浴中提取凝胶前驱体的注射器, 清洁它, 用70% 乙醇消毒。把注射器放进平衡计分卡里。
- 将大约3毫升的水凝胶前驱体挤出10毫升的印刷墨盒。将前驱体与 MDA-MB-231-GFP 细胞混合在 1 x 106细胞/毫升上, 缓慢吹打, 避免气泡的产生。用无菌端和顶盖盖住墨盒, 用石蜡膜密封。离心机以 834 x g 为1分钟, 以消除产生的任何气体气泡。
- 重复步骤 3.2.3 3.2.5 IMR-90-mCherry 细胞的前体细胞和无细胞前驱体。
- 用70% 乙醇消毒所有3个墨盒, 然后将它们装入 bioprinter 的房间。在打印机的控制软件中, 将墨盒温度设置为25摄氏度。等待35分钟, 以允许前体达到可打印的条件。
注意: 这一次不影响嵌入在水凝胶中的细胞的生存能力。
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3D 打印型号
- 在打印机的控制软件中, 展开打印机控制软件中的 "工具头" 选项卡, 单击左侧图形界面上的1墨盒, 然后单击 "测量短" 按钮以测量喷嘴尖端的位置。对其他2墨盒重复此操作。
- 放置一个明确的聚苯乙烯微板块, 打开 G 代码文件, 并改变压力, 以200帕为所有墨盒。返回到控制软件, 单击选项卡建筑工生成器, 选择要开始打印的点, 然后单击右下角的 "运行" 按钮。重复此步骤可获得3更多的复制。
- 在打印螺旋桨模型的所有复制后, 添加一个 100 mM CaCl2解决方案, 以交叉链接模型为1分钟, 并冲洗2x 与 DPBS, 以消除过量的 Ca+ +离子。
- 用刮刀将模型小心地转移到琼脂糖涂层的6井板上。向每个井中添加5毫升的 DMEM 介质。孵化在孵化器37摄氏度和 5% CO2的板块。
注: 确保模型在井中浮动。 - 每3天用新鲜培养基替换细胞培养培养基, 总培养30天。
4. 水凝胶盘的可行性和球体形成实验。
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水凝胶盘准备
- 重复步骤 3.2.1-3.2.6。
注: 可以用一个小的无菌容器代替墨盒。 - 使用无菌的毕业1毫升注射器和削减喷嘴, 以创建一个大的洞在注射器 (该孔有相同的直径, 其余的注射器管)。用70% 乙醇把它清洗干净, 直到它干燥为止。
注: 在无菌平衡计分卡。 - 使用一个良好的板盖, 添加100毫米 CaCl2 , 直到表面覆盖;然后, 用装有细胞的水凝胶填满注射器;用吊滴法挤出100µL。把水凝胶放1分钟, 用过量的 DPBS 冲洗。将水凝胶盘转移到琼脂糖涂层的6井板上, 加入5毫升的基底 DMEM, 并在37摄氏度和 5% CO2上孵化, 最多30天。每3天刷新一次培养基。
- 重复步骤 3.2.1-3.2.6。
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细胞和球体的生存能力
- 使用 MTS 检测来确定细胞的生存能力。用 DPBS 清洗每个圆盘, 并将其切成4部, 用一条细的无菌刀片。收集整个磁盘的部分, 并将其转移到一个96井板。然后, 添加 100 ul 的 DMEM 加上 20 ul 的 MTS 试剂, 每一个井和孵化的混合物在37°c 2 小时。
- 在 MTS 反应后, 恢复上清并将其转移到干净的96井板上。测量样品在 490 nm 的吸光度。
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球体形成
- 取出孵化的螺旋桨或磁盘模型从孵化器在0天, 7, 15, 21 和30的文化和转移他们到一个干净的6井板。
- 使用共焦旋转圆盘倒置显微镜可视化球体, 并利用多个位置和 z 栈获取图像。图像每个螺旋桨, 或磁盘模型, 沿其水平直径从左向右与500µm 的差距, 并获得一个 z 栈从底部到顶部的焦点平面在每个水平位置。
注: 请参阅供应商信息的材料表。 - 使用程序 ImageJ 提供的最大堆栈算术工具重建图像, 以创建用于球体分析的2D 图像。
5. 扫描电子显微镜 (SEM)
- 如步骤1.2 所述, 制备海藻酸盐/明胶水凝胶。
注意: 不需要无菌条件。
注意: 液氮和多聚甲醛是危险的, 必须小心处理。 - 将1毫升的水凝胶放入砂浆中, 加入液氮, 用杵研磨。继续添加液氮以避免除霜的水凝胶。将粉末转移到1.5 毫升离心管, 密封, 并储存在-80 摄氏度2小时冷冻干燥样品24小时。
- 对于球体成像, 用 DPBS 2x 轻轻地冲洗水凝胶, 通过浸泡在37摄氏度的4% 多聚甲醛来固定细胞, 然后用 DPBS 冲洗, 然后用液氮冷冻。最后, 将样品冷冻干燥24小时。
- 用扫描电镜 (SEM) 分析水凝胶/球形结构和形貌, 25.0 伏, 在 70 Pa (腔压力) 下, 放大40X 至5,000X。
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Representative Results
温度扫描显示 A3G7 前驱体在25°c 和37°c 上的明显差异。前体是液体在37°c 和有一个复杂的粘度 1938.1, 84.0 mPa x s, 这是验证由一个更大的 g "超过 g"。随着温度的降低, 前驱体经过物理凝胶, 由于明胶分子自发物理纠缠成三螺旋形成29,30。g ' 和 g ' 增加和汇合在30.6 °c, 表明溶胶-凝胶转折。模数继续增加, 温度降低, 达到 468.5 34.2 pa g ' 和 140.7 * 9.3 pa g "在25°c (图 1a)。根据温度扫描的结果, 我们选择了25摄氏度作为印刷温度。凝胶动力学实验模拟在样品准备和处理过程中发生的温度变化 (即从37°c 水浴中除去样品, 并将其放入25°c bioprinter 室)。g ', g ', 和 | η * |随着时间的推移, 温度降低, 溶胶-凝胶转变发生在17分钟在25摄氏度, 当 g ' ≈ g "≈ 64.3 Pa 和损失因数等于 1 (图 1b和1c)。在 50-90 分钟的凝胶后, 前驱体继续变硬, 达到印刷窗口。在这个印刷窗口中, 前体可以顺利地挤压使用 G25 圆柱喷嘴, 压力为200帕。屈服应力的存在意味着材料的固体行为, 并提高了挤压后的结构完整性, 以承受其自身的重量31。应力斜坡在凝胶的不同时间识别屈服应力。结果表明, 随着凝胶时间的增加, 屈服应力增大。在50分钟的凝胶作用下, 屈服应力达到 325.9 Pa, 保证了挤出后模型稳定。
打印的螺旋桨模型如图 2a所示。共焦显微镜证实了 MDA-MB-231-GFP 和 IMR-90-mCherry 细胞的初始挤压位置 (图 2b)。MDA-MB-231-GFP 细胞开始发展球体15天到文化期间, 然后增加大小和数量球体直到天 30 (图 2c - 2f)。有些 IMR-90-mCherry 细胞也形成聚集 (图 2g - 2j)。引人注目的是, 经过30天的培养后, IMR-90-mCherry 细胞在最初被 MDA-MB-231-GFP 细胞占据的区域被观察到 (图 2f), 暗示着模型中可能的迁移事件。同样, 迁移的 MDA-MB-231-GFP 细胞也可以观察到在 IMR-90-mCherry 占主导地位的区域在30天 (图 2j)。
磁盘模型如图 3a所示。共焦显微镜证实了圆盘内均匀的细胞分布 (图 3b)。MDA-MB-231-GFP 单元格在磁盘模型中的行为类似于作为螺旋桨模型打印时所做的那样。代表性图像显示在图 3c - 3f中。扫描电镜成像显示, 21 天的文化后 MDA-MB-231-GFP 球形的水凝胶 (图 4a)。通过将 SEM 图像与无细胞水凝胶 (图 4b) 进行比较, 验证了球体的产生和存在。
图 4c显示了两种细胞的细胞活力。与 IMR-90-mCherry 细胞相比, MDA-MB-231-GFP 细胞具有更高的细胞活力。有趣的是, MDA-MB-231-GFP 细胞在15天前呈现出更高的生存趋势, 与0天相比, 存活细胞的数量倍。其次是21天的减少, 然后在30天恢复。相比之下, IMR-90-mCherry 细胞在整个培养期内的生存能力的波动极小。MDA-MB-231-GFP 细胞在21天的生存能力递减值对应于一个大的 MTCSs 形成, 它发育坏死核。
图 1: 水凝胶前驱体的流变特性.(a) 温度扫描显示溶胶-凝胶转变为30.6 摄氏度。(b)A3G7 前驱体的凝胶动力学表现为 g '、g ' 和 | η*|在凝胶时, 溶胶-凝胶体的转变发生在大约17分钟在25°c。(d) 本小组显示前体的屈服应力与凝胶时间。在较长的凝胶时间内观察到屈服应力的增加。结果显示在平均 * SD, n≥3。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: MCTS 形成在 3D bioprinted体外模型中, 由 IMR-90-mCherry 上皮细胞和 MDA-MB-231-GFP 乳腺癌细胞组成.(一) 这些照片显示了 bioprinted 的体外样本 (左) 和 CAD 模型 (右)。(b) 这一代表性的共焦时间推移图像显示 MDA-MB-231-GFP (绿色) 和 IMR-90-mCherry (红色) 细胞 bioprinted 在模型内。(c ) 这些放大功能显示 MDA-MB-231-GFP 单元格区域 (白色虚线框)。(g j) 这些放大功能显示 IMR-90-mCherry 单元格区域 (黄色虚线框)。刻度条在面板2a中为2毫米, 面板2b为1毫米, 500 µm 在面板2c - 2j中选定区域, 放大倍数为10X。图像中的大写 "D" 是指 "文化的天"。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 3D MDA-MB-231-GFP-laden 水凝胶盘内的 MCTS 形成.(一) 这张照片显示了水凝胶盘。(b) 这一代表性的共焦图像显示了嵌入在复合材料中的 MDA-MB-231-GFP 细胞。(c)这些放大功能在 (c) 0、(d) 7、(e) 15 和 (f) 文化的21天中显示 MDA-MB-231-GFP 单元格区域 (面板3b中的白色虚线框)。刻度条在面板3a中为2毫米, 面板3b为1毫米, 500 µm 在面板3c - 3f中选定区域, 放大倍数为10X。图像中的大写 "D" 是指 "文化的天"。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: MTCSs 的形态学和细胞活力.(a) 这一扫描电镜图像显示, 在21天的文化 MDA-MB-231-GFP MCTS 内的凝胶, 显示小 MCTS (箭头指出)。(b) SEM 图像显示海藻酸盐/明胶水凝胶无细胞。放大倍数为350X。(c) 本小组显示了水凝胶内30天内 MDA-MB-231-GFP 和 IMR-90-mCherry 的细胞活力。对结果进行了分析, 并以双向方差分析和 Bonferroni 后验的方法对其进行了统计学研究。p (*) < 0.05, n ≥3。数据被规范化为用于在0天创建样本的单元密度。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
如果污染 (生物或化学) 发生在过程中的任何一点上, 就会危及细胞的结构。通常, 生物污染是在三天的文化后, 作为一种颜色变化的文化媒体或 bioprinted 结构。因此, 灭菌 (物理和化学消毒) 是所有细胞相关过程的关键步骤。值得注意的是, 热处理明胶改变了其凝胶性质, 这使得它在我们进行的试验中更慢。因此, 我们通过紫外线照射对海藻酸盐和明胶的能量进行杀菌。由于 UV 光的穿透能力非常有限, 所以应该使用非常薄的层 (< 0.5 毫米)。海藻酸盐和明胶的浓度可任意改变以调节机械和生物性能32。在目前的工作中 , 我们选择了 A3G7 , 因为它在印刷窗口中提供了理想的适印联水凝胶通过 30 天的实验提供了很高的稳定性。将粉末溶入 DPBS 加热至60摄氏度有助于提高明胶的液化, 从而减轻搅拌。还可以使用较低的温度;然而, 将需要更长的搅拌时间。
流变温度扫出的溶胶-凝胶点在30.6 摄氏度, 这是兼容其他出版物33。理论上, 任何高于30.6 摄氏度的温度都可以液化前驱体。我们选择了37摄氏度来简化工作, 因为细胞培养基在37摄氏度的水浴中预热。根据凝胶动力学 (前体凝胶), 有大约17分钟的细胞混合;经过这段时间, 混合细胞和水凝胶前驱是困难的, 由于粘度和弹性模量的增加, 导致非均匀的细胞 bioink。因此, 我们建议处理的细胞混合工作在前10分钟的凝胶。屈服应力不被认为是影响印刷适性的物质属性, 直到最近34;无论如何, 它已被高分子科学家广泛认可为糊状/粒状流体的标记31,35,36,37。屈服应力的存在有助于建立一个结构完整性, 以承受其自身的重量。高屈服应力也会要求挤出时增加启动压力;因此, 这可能导致细胞损伤, 由于过度的剪切应力32。如果挤出过程发生在最佳打印窗口之外, 则模型保真度可能会受到影响。这个问题的共同指标显示在最后的 bioprinted 结构: 它要么是太粗糙或太液体的边缘。A3G7 前驱体在 50-90 分钟的凝胶中表现出最佳的印刷窗口, 既能满足结构稳定性, 又能保证细胞存活, 可作为构建异质肿瘤模型14的培养基。
螺旋桨模型的总高度是600µm, 因为它是由四层150µm 花丝产生的。这种设计允许养分和气体交换, 因为细胞是最多300µm 从表面接触媒体在孵化期间。更高的模型是可实现的在制造, 但是瓶颈的有限扩散距离的营养素在水凝胶38, 这可能导致低细胞生存在核心地区。
在体外形成 MCTS, 如悬滴、微流控芯片、组装和生物打印39, 均有不同的发展策略。然而, 其中一些方法可以改变细胞生理学和生物化学, 产生不同的细胞行为发生在正常的肿瘤组织。例如, 悬滴法强迫单细胞通过物理禁闭40来保持细胞团聚。此外, 通过肽添加 MCTS 形成的化学诱导可以改变球体41的生物化学。这里描述的水凝胶复合材料通过创建一个没有外部压力源的仿生环境, 使 MCTS 形成。作为单一的分散细胞, 在7天的文化, 细胞重组为小 MCTS (每球体6多个细胞), 增加其大小和数量在30天的文化。
在这项研究的结果中, 我们发现 MDA-MB-231-GFP 球体减少21天的细胞生存能力, 这一现象与大球体的形成相关。一个固体肿瘤由三个不同的层组成, 据此, 外层呈现出高增殖率, 与中间层和球体18的内部坏死或衰老核心相比较。这可以解释结果的可行性下降。
此协议的限制是 (1) bioink 动力学和 (2) 单元格类型兼容性。Bioink 动力学是指在凝胶过程中变化的材料特性, 导致印刷结构有缺陷的最佳打印窗口。单元格类型兼容性指的是某些细胞类型 (细胞系或主文化) 的丧失能力, 以展示本机的体内行为。
A3G7 水凝胶具有较高的稳定性和细胞活力。3D 生物打印可用于构建具有高通量、低成本、高重现性的3D 异构疾病模型, 作为传统细胞培养和小动物肿瘤模型更现实的替代方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
陶江感谢中国奖学金委员会 (201403170354) 和麦吉尔工程博士奖 (90025) 为他们提供奖学金。何塞 g. Munguia-洛佩兹感谢 CONACYT (250279, 290936 和 291168) 和 FRQNT (258421) 为他们的奖学金资助。萨尔瓦多 CONACYT 感谢他们的奖学金资助 (751540)。约瑟夫 m. 金塞拉感谢国家科学和工程研究理事会, 加拿大创新基金会, 汤森-Lamarre 家庭基金会, 麦吉尔大学为他们提供资金。我们要感谢艾伦 Ehrlicher 允许我们使用他的流变仪, 丹 Nicolau 允许我们使用他的共焦显微镜, Morag 公园让我们访问荧光标记的细胞线。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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