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Bioengineering

Comportamiento pruebas para evaluar el déficit funcional causado por la implantación de microelectrodos en la corteza de Motor rata roedor

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/57829
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Advanced Platform Technology Center, Rehabilitation Research and Development, Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Hemos demostrado que una implantación de microelectrodos en la corteza motora de las ratas causa déficit motor inmediato y duraderos. Los métodos aquí propusieron contorno una cirugía de implantación de microelectrodos y tres roedores tareas conductuales para dilucidar posibles cambios en la función motora fina o gruesa debido al daño causado por la implantación a la corteza motora.

Abstract

Dispositivos médicos implantados en el cerebro tienen un enorme potencial. Como parte de un sistema de interfaz de máquina cerebral (IMC), microelectrodos intracortical demuestran la capacidad para registrar los potenciales de acción de individuos o pequeños grupos de neuronas. Tales señales registradas se han utilizado con éxito como para interfaz con o controlar equipos, extremidades robóticas y sus propios miembros. Sin embargo, estudios anteriores en animales han demostrado que una implantación de microelectrodos en el cerebro no sólo daña los tejidos circundantes pero también puede dar lugar a déficits funcionales. Aquí, discutimos una serie de pruebas de comportamiento para cuantificar posibles deficiencias motoras tras la implantación de intracortical microelectrodos en la corteza de motor de una rata. Los métodos para campo abierto grid, paso de escalera y prueba de resistencia de agarre proporcionan información valiosa con respecto a las complicaciones potenciales resultantes de una implantación de microelectrodos. Los resultados de las pruebas de comportamiento se correlacionan con la histología final, proporcionando información adicional sobre los resultados patológicos y los impactos de este procedimiento en el tejido adyacente.

Introduction

Intracortical microelectrodos fueron utilizados originalmente para asignar los circuitos del cerebro y se han convertido en una valiosa herramienta para habilitar la detección de las intenciones de motor que puede ser utilizado para producir salidas funcionales1. Salidas funcionales detectados pueden ofrecer a individuos que sufren de lesiones medulares, parálisis cerebral, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) u otras condiciones de limitación de movimiento del control de un cursor de ordenador2,3 o robótica brazo4,5,6, o restaurar la función a su propio miembro con discapacidad7. Por lo tanto, tecnología del microelectrodo intracortical ha surgido como un prometedor y de crecimiento rápido campo8.

Debido a los éxitos en el campo, están realizando estudios clínicos para mejorar y comprender mejor las posibilidades de IMC tecnología5,9,10. Realizando todo el potencial de comunicación con las neuronas en el cerebro, las solicitudes de rehabilitación son percibidas como ilimitada8. Aunque hay gran optimismo para el futuro de la tecnología de microelectrodo intracortical, también es bien sabido que los microelectrodos eventualmente no11, posiblemente debido a una respuesta de capensis aguda después de la implantación. La implantación de un material extraño en el cerebro provoca daños inmediatos en el tejido circundante y conduce a mayores daños causados por la respuesta de capensis que varía en función de propiedades del implante12. Además, un implante en el cerebro puede causar un efecto microlesion: una reducción en el metabolismo de la glucosa parece ser causada por edema agudo y la hemorragia debido a la inserción de dispositivo13. Además, la calidad de la señal y la longitud de tiempo que pueden grabar señales útiles son incompatibles, sin importar el modelo animal11,14,15,16. Varios estudios han demostrado la conexión entre la neuroinflamación y microelectrodo rendimiento17,18,19. Por lo tanto, el consenso de la comunidad es que la respuesta inflamatoria del tejido neural que rodea el microelectrodo, al menos en parte, compromete la confiabilidad de electrodo.

Muchos estudios han examinado la inflamación local11,20,21,22 o explorado métodos para reducir el daño al cerebro causado por inserción11,23, 24,25, con el objetivo de mejorar el rendimiento de grabación sobre tiempo14,26. Además, hemos demostrado recientemente que una lesión yatrogénica, causada por una inserción de microelectrodos en la corteza motora de las ratas causa un déficit motor fino inmediata y duradera27. Por lo tanto, el propósito de los protocolos presentados aquí es darle a los investigadores un método cuantitativo para evaluar el posible déficit motor como resultado del trauma cerebral después de la implantación y la persistente presencia de dispositivos intracortical (microelectrodos en la caso de este manuscrito). Las pruebas de comportamiento descritas aquí fueron diseñadas para embromar hacia fuera ambos impedimentos de motricidad gruesa y fina y pueden ser utilizadas en muchos modelos de lesión de cerebro. Estos métodos son sencillas, reproducibles y fácilmente pueden ser implementados en un modelo roedor. Además, los métodos presentados aquí permiten una correlación del comportamiento motor de los resultados histológicos, un beneficio que hasta hace poco, los autores no han visto publicado en el campo de índice de masa corporal. Por último, como estos métodos fueron diseñados para probar la función motora fina28, la función motora gruesa29y estrés y la ansiedad comportamiento29,30, los métodos presentados aquí también se pueden implementar en un variedad de modelos de lesión en la cabeza donde los investigadores quieren gobernar (o) cualquier déficit de la función motora.

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Protocol

Todos los procedimientos y prácticas de cuidado de los animales fueron aprobadas por y realizadas de acuerdo con los comités de uso y Louis Stokes Cleveland Departamento de veteranos asuntos centro institucional Animal atención médica.

Nota: Para educar a los investigadores en la decisión sobre el uso de un modelo de heridas de puñalada como control, se recomienda revisar el trabajo realizado por Potter et al. 21.

1. procedimiento quirúrgico de la implantación de microelectrodos

  1. Preparación pre-quirúrgica de animales
    1. Anestesiar al animal en una cámara de inducción con isoflurano (2-4%). Mientras que bajo anestesia, monitorear el animal mediante un sistema de medición vital para monitorear el ritmo cardíaco y el contenido de oxígeno en la sangre.
    2. Mueva al animal a un cono de nariz para continuar la anestesia. Por vía subcutánea (SQ) inyectar un antibiótico de cefalosporina, por ejemplo cefazolin (25 mg/kg) y un antiinflamatorio no esteroide, por ejemplo carprofen (5 mg/kg) para prevenir la infección y controlar el dolor, respectivamente.
    3. Liberalmente Aplique ungüento oftálmico para ojos del animal para evitar que seque.
    4. Utiliza el pequeño cortaúñas animales, recortar las uñas de los pies para evitar que el animal rascarse la sutura durante la cicatrización. Asegúrese de que los clavos no se recortan demasiado corto, esto puede llevar a dolor y sangrado del animal.
    5. Afeitar la cabeza del animal bien por detrás de las orejas entre los ojos usando un condensador de ajuste de la máquina de afeitar eléctrica.
    6. Proporcionar una analgesia local con una inyección SQ de bupivacaína (0,3 mL de bupivacaína 0.125% diluida de la solución stock) en la parte superior de la cabeza del animal en el área de la incisión.
    7. Montar el animal en un marco de estereotáctica, utilizando barras de oído para que la cabeza se mueva durante la cirugía. Coloque un cojín bajo el animal para mantener la temperatura interna del animal de calentamiento de agua circulante.
    8. Aplique un paño estéril, por ejemplo, institucionalmente aprobados estéril envoltura de plástico, para aislar el campo quirúrgico.
    9. Friega la zona quirúrgica con una solución de betadine alterna y peelings de isopropanol.
    10. Realizar un pellizco del dedo del pie según el protocolo institucional para asegurar que el animal está bajo el plano quirúrgico.
  2. Preparar el animal para la implantación
    1. Crear una incisión de aproximadamente 1 en abajo del midline exponer el cráneo con una hoja de bisturí Nº 10. Sin rodeos eliminar el periostio con un aplicador con punta de algodón y detener cualquier sangrado utilizando una gasa. Retracción del tejido circundante mediante pinzas de cocodrilo y limpiar y deshidratar el cráneo con peróxido de hidrógeno.
    2. Coloque unas pocas gotas de adhesivo tisular basado en cianoacrilato en el cráneo expuesto para mejorar el cemento dental adhesivo en pasos posteriores.
    3. En el hemisferio elegido, marcar la región de la corteza motora correspondiente a movimiento de forepaw aproximadamente 3 mm lateral a la línea media y 2 mm anterior bregma al crear un nick en el hueso.
    4. Quitar una porción del cráneo usando un taladro dental de 1,75 mm de punta redonda, tomando especial consideración no hacer demasiado rápido o demasiado profundamente y apoyando una mano sobre el marco estereotáxicas. El taladro debe aplicarse al cráneo intermitentemente para evitar el sobrecalentamiento de31.
    5. Reflejan la dura con una fino gancho 45° dura selección.
    6. Limpie cualquier sangrado utilizando un aplicador con punta de algodón y una solución salina, teniendo cuidado de no tocar la superficie del cerebro.
  3. Inserción de microelectrodos en la corteza de motor
    1. Con cuidado montar el microelectrodo esterilizado en el soporte universal en el marco estereotáxicas, teniendo cuidado de no golpear el mango del electrodo. Asegúrese de que el conector de interfaz del headstage del electrodo está sostenido firmemente por el titular.
      Nota: Aquí, un electrodo de caña de silicio de Michigan-estilo no funcional mide 2 mm x 123 μm x 15 μm fue utilizado, y la caña fue insertada con unas pinzas finas.
    2. Con los micromanipuladores en el marco de estereotáctica, coloque cuidadosamente la punta del electrodo sobre la craneotomía abierta.
    3. Baje suavemente el electrodo aproximadamente 2 mm en el cerebro con los micromanipuladores como una guía de medición (dependiendo de la elección del electrodo, una inserción automatizada a precios controlados puede ser requerida). Tomar las precauciones para evitar cualquier vasculatura visible siempre que sea posible. Una vez que el electrodo esté en su lugar, con cuidado suelte el conector del soporte universal y retraer el brazo de inserción.
    4. Limpie cuidadosamente cualquier sangrado de alrededor del electrodo usando un aplicador con punta de algodón y una solución salina.
    5. Sellan la craneotomía alrededor del electrodo implantado con un elastómero de silicón.
    6. Fijar el electrodo al cráneo con cemento dental.
    7. Una vez completamente seco el cemento, unir los bordes de la incisión en la parte delantera y trasera de la ningún cemento y sutura que cierra.
  4. Cuidados postoperatorios
    1. Permitir que el animal a recuperar en un cojín de calefacción sin dejar de monitorear sus signos vitales de agua circulante. Evitar el uso de lámparas de calor como la temperatura de las lámparas es más difícil de controlar y animales pueden sobrecalentarse.
    2. Una vez que el animal está totalmente despierto, hacia el animal una jaula limpia con fácil acceso al alimento y al agua.
    3. Durante los días postoperatorios 1-3, proporciona los animales cuadrados cefalosporinas (25 mg/kg) y un antiinflamatorio no esteroideo (5 mg/kg) para prevenir la infección y administrar su dolor.
    4. Monitorear los animales todos los días de los signos de dolor o malestar, sangrado, cambio de peso o problemas de sutura a través de día postoperatorio por lo menos 5.

2. comportamiento de la prueba

  1. Para las pruebas de comportamiento de todos, prueba de los animales 2 x por cada examen en la semana antes de la cirugía de implante de electrodo para calcular su puntuación basal preoperatoria. Después de la cirugía, deje reposar durante 1 semana antes de comenzar la prueba 2 x por semana en cada prueba de comportamiento de los animales. Condiciones de prueba constantes puede usarse durante todo el estudio de pre- y post-surgical pruebas para minimizar los efectos del estrés sobre el rendimiento, que podría resultar en una medición de la ansiedad.
    1. Limpie el equipo de todo prueba con un esterilizante basados en dióxido de cloro al inicio de cada sesión de evaluación y después de cada animal.
    2. La red de campo abierto y las pruebas de escala de la película. Estas pruebas requieren una cámara de vídeo (1080p, un mínimo de 15 fps, campo de visión de 78 º diagonal), un ordenador portátil y espacio para almacenar los datos de vídeo.
    3. Al principio de cada día de la prueba, llevar los animales a la sala de pruebas y que puedan aclimatarse durante al menos 20 minutos antes de comenzar la prueba. La habitación debe ser ligera y con control de temperatura, y el mismo personal debe completar todo pruebas. Idealmente, la misma sala se utilizará para todos los animales en el transcurso de la prueba sin cambios en la habitación.
    4. Uso recompensas de comida a los animales para completar las tareas, especialmente durante el entrenamiento de la escalera. Cereales o pequeños trozos de virutas del plátano o galletas, hacer buenas recompensas.
    5. Normalizar todos los funcionamientos de prueba semanales a los resultados de cirugía previa de cada animal individual (ecuación 1).
      Ecuación 1:Equation 1
  2. Abrir red pruebas
    Nota: La prueba de rejilla de campo abierto fue construida en el local y tiene una superficie de 1 m2 con aproximadamente 40 cm alta opaco laterales. El fondo ejecuta la superficie de la rejilla se divide en 9 cuadrados iguales de la parte inferior con cinta (figura 1A). La cámara de grabación está montada permanentemente sobre el centro de la rejilla en andamios.
    1. Para comenzar la prueba de rejilla de campo abierto, coloque el animal en el centro de la rejilla hacia el probador.
    2. Permitir que el animal a correr libremente para 3 minutos durante la grabación de un video.
    3. Cuando el animal ha completado la prueba, retirar el animal de la red y volver a la jaula. Limpie la rejilla con esterilizante basados en dióxido de cloro.
    4. Prueba cada animal 1 x por día de la prueba.
    5. Analizar el número de líneas de la cuadrícula cruzado, la distancia total recorrida y la velocidad máxima del animal como indicadores de la función motora gruesa usando un vídeo software de seguimiento.
      Nota: Los datos presentados aquí fueron cuantificados manualmente por investigadores capacitados, pero se prefirió utilizar una recientemente desarrollada en la empresa seguimiento algoritmo32.
  3. Pruebas de escala
    Nota: La prueba de la escalera fue construida en el local y consta de 2 laterales acrílico transparente, cada 1 m de longitud, conectado por peldaños de 3 mm de diámetro espaciados a 2 cm de separación (figura 2A). Pruebas de escalera es un examen especializado y por lo tanto requiere 1 semana de entrenamiento antes de registrar las puntuaciones basales pre-cirugía. El protocolo para el entrenamiento y la prueba es el mismo.
    1. Hacia el animal de una jaula temporal explotación limpia para comenzar la prueba de la escalera.
    2. Establecer la escala para que puentes 2 jaulas. El principio final de la escalera se basa en una jaula limpia, y el acabado final se basa en jaula casera del animal para servir como una motivación para completar la carrera.
    3. Coloque el mismo (o similar) video Cámara en un trípode en el centro de la escalera. La posición de la cámara debe estar a la altura de peldaño y permiten la escalera entera ser visto.
    4. Con la video cámara, mantener al animal a la línea de salida de la escalera, permitiendo que sus patas delanteras tocar el primer peldaño.
    5. Permitir que el animal a la escalera a su propio ritmo. El tiempo transcurrido entre el momento en que la pata del animal toca el primer peldaño y la línea de meta en la tercera al último peldaño determinará el tiempo del animal a la Cruz.
    6. Si el animal da vuelta alrededor de la escalera o no se mueve durante un período de 20 s, considerar el animal no han logrado el funcionamiento. Asignar a los animales una pena anotar el tiempo para cada uno no se pudo ejecutar. Determinar el tiempo de pena por el rendimiento más lento registrado durante pruebas preoperatorias27.
    7. Permitir que cada animal a la escalera 5 veces por día con aproximadamente 1 minuto de descanso entre cada serie de pruebas.
    8. Promedio de los funcionamientos más rápidos 3 al día como una medida de la función motora fina. Además, registre el número de veces que cada una del frente paws resbalones de los peldaños con un vídeo de software de seguimiento.
      Nota: Los datos presentados aquí fueron cuantificados manualmente por investigadores capacitados, pero se prefiere utilizar un algoritmo de seguimiento interno recientemente desarrollados con Doña et al. 32.
  4. Prueba de resistencia de agarre
    1. Calibrar el medidor de fuerza de agarre antes de cada sesión de evaluación y medir la fuerza en gramos.
    2. Coloque el medidor de fuerza de agarre en el borde de un contador con el manillar de agarre extendido sobre el piso.
    3. Permitir que el animal agarrar el manillar con ambas patas delanteras sujetando el animal por la base de la cola (figura 3A).
    4. Una vez que el animal tiene un agarre firme con cada pata, tirando el animal del medidor de la base de la cola con fuerza lenta y constante.
    5. Registrar la fuerza máxima ejercida por el animal que aparece en la salida por el medidor de fuerza de agarre digital.
    6. Prueba cada animal 3 veces por día con aproximadamente 2 minutos de descanso entre cada prueba de la prueba.
    7. Como una medida de la función motora fina, grabar y promedio de la fuerza de agarre máxima salida de cada uno de los 3 ensayos.

3. la conducta protocolo

  1. Tras todo comportamiento pruebas (por ejemplo, 8-16 semanas después de la implantación), anestesiar los animales profundamente utilizando ketamina (160 mg/kg) y xilacina (20 mg/kg), transcardially les perfusión, sus cerebros y cryo-rebanada de la cosecha y el tejido de la mancha uso de marcadores immunohistochemical para cuantificar la respuesta celular alrededor del sitio de implantación33,34,35,36,37,38.

4. estadístico análisis

Nota: Un análisis prospectivo se sugiere fuertemente para estudios tratando de responder a una pregunta de investigación particular. El análisis del poder, que informa al número de animales necesario para alcanzar una significación estadística para un diseño de estudio en particular, debe basarse en la hipótesis de investigación en particular, el diseño del experimento, el efecto estimado tamaño y variabilidad de los tratamientos previstos, como así el tamaño del efecto requerido para alcanzar relevancia clínica o científica.

  1. Llevar a cabo análisis estadísticos utilizando el software estadístico común.
  2. Tabular la estadística descriptiva y mostrarlos como media ± Error estándar.
  3. Analizar el comportamiento en la cuadrícula de campo abierto (criterio 2.2), escalera (paso 2.3) y prueba de resistencia y agarre (paso 2.4)] en cada punto de tiempo semanal para comparar los grupos vs implantado de control utilizando una prueba t de dos muestras. Considerar cada momento semanal una medida independiente.
  4. Cuantificar el desempeño longitudinal usando un modelo lineal de efecto mixto. La semana y el grupo se fijan factores y un animal experimental está anidado dentro del grupo como un efecto aleatorio. Un análisis de varianza (ANOVA) se utiliza para determinar el efecto del factor con un nivel de significancia de p < 0.05.
  5. Comparar el rendimiento de la escala de intensidad G (IgG) de inmunoglobulina mediante un análisis de regresión lineal. Calcular el coeficiente de correlación por el método de Pearson.

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Representative Results

Utilizando los métodos presentados aquí, una cirugía de implantación de microelectrodos en la corteza de motor es completa siguientes procedimientos establecidos39,40,41,42, seguido por la prueba de rejilla de campo abierto para evaluar la función motora gruesa y escalera y agarre fuerza para evaluar el motor fino función27. Función de motor de prueba fue terminado 2 x por semana para la cirugía después de 16 semanas en animales implantados, no animales no implantados de cirugía como un control. Todas las puntuaciones después de la cirugía fueron en promedio por semana y normalizadas en los puntajes de cirugía de la base de cada animal individual. Todo error es reportado como error estándar de la media (SEM).

Para medir su función motora gruesa y estrés comportamiento, animales podían correr libremente en una prueba de campo abierto red durante 3 minutos (figura 1A). Pueden grabar varias métricas de esta prueba, incluyendo el número de líneas se cruzan, la distancia total recorrida, la red y la velocidad máxima alcanzada por el animal. En estos datos previamente divulgados, el número de líneas de rejilla cruzada se presenta27. En la primera semana después del período de recuperación (punto de 2 semanas), se observó una diferencia significativa en el rendimiento de la red de campo abierto entre los 2 grupos. Sin embargo, había no más significación en el resto del estudio (figura 1B). El control y el microelectrodo implantado animales anotaron asimismo a lo largo de la prueba, y la varianza en el rendimiento fue relativamente alta en ambos grupos de animales. Ninguna importancia se observó al comparar el rendimiento de la red de campo abierto en ambos grupos de animales a través de todo el tiempo experimental. Porque no hubo diferencias en rendimiento entre los 2 grupos de animales, este resultado fue interpretado para indicar que no hay déficit motor bruto o severamente limitando el estrés causado por una implantación de microelectrodos en la corteza de motor27. Al interpretar los datos, una disminución en el número de líneas de rejilla cruzada, la distancia total recorrida, o la velocidad máxima alcanzada por el animal que todos indican una disminución en su función motora gruesa (tabla 1).

Para medir el alcance coordinado y motricidad fina, animales participaron en una prueba de la escala horizontal (figura 2A) donde se registró el tiempo que tardó el animal a la Cruz de la escalera y la frecuencia de la pata se desliza. Tiempos de cruce de escalera después de la cirugía fueron normalizados para cada animal en los puntajes de la cirugía de cada animal individual. Por lo tanto, un porcentaje positivo coincide con una disminución en el tiempo para cruzar la escalera y un mayor rendimiento, y un porcentaje negativo coincide con un aumento en el tiempo para cruzar la escalera y un rendimiento disminuido (figura 2B, Tabla 1).

En estos datos previamente divulgados, los animales de control, después de haber recibido ningún implante, muestran el funcionamiento más lento (82,6 ± 26.0%) durante la primera semana de prueba inmediatamente después de la recuperación de la fase27después de la cirugía. Comenzando en la segunda semana de escalera después de la cirugía la prueba, los animales de control reasumieron sus tiempos de rendimiento de línea de base y había mantenido puntuaciones comparables a sus puntuaciones de referencia en el transcurso del estudio con muy poca variación.

Los animales reciben un microelectrodo intracortical vieron una disminución del rendimiento inmediato después de la cirugía. Estos animales demostraron una escalera mayor cruzando el tiempo comparado con su base de 199,1 ± 61.4% en la primera semana de pruebas después de la cirugía. Los animales implantados muestran un menor rendimiento para la duración del estudio y su rendimiento no volvió a sus cuentas de línea de base. A sus animales peores, implantados disminuyeron en funcionamiento durante la semana 11 para un promedio de 526,9 ± 139.4% comparado con su rendimiento inicial. Además, los animales implantados mostraron una mayor variación en comparación con los animales control. No hubo ninguna diferencia significativa entre el control y animales implantados durante la primera semana de pruebas. Sin embargo, se observó una diferencia significativa en el porcentaje de cambio en comparación con los tiempos de referencia entre los grupos en semanas posteriores en el estudio (p < 0.05) (figura 2B).

Otra evidencia de deficiencia motora fina fue demostrada por la frecuencia de la pata delantera derecha se desliza entre los 2 grupos de animales. El rendimiento de la pata derecha delantera era de particular interés porque se implantaron microelectrodos en el hemisferio izquierdo del cerebro en la región de la corteza motora responsable del control de la pata delantera. Análisis vídeo minucioso, la pata se desliza se narraba y había cuantificado (figura 2C). Mientras que no hubo diferencias significativas se observaron en la frecuencia de resbalones de la pata izquierda, se encontró que los animales implantados experimentaron significativamente más resbalones de la pata derecha delantera en comparación con los animales de control (un promedio de 0.54 ± 0.07 pata derecha delantera se desliza por semana en el garra de animales implantados en comparación con un promedio de 0.32 ± 0.02 frontal derecha se desliza por semana en los animales de control). Al interpretar los datos, un incremento en el tiempo para cruzar la escalera o un aumento en el número de hojas de pata indica una disminución en la función motora fina (tabla 1).

Como medida secundaria de asimiento coordinación y motricidad fina, los animales completó una prueba de fuerza de agarre (figura 3A) donde se registró la fuerza máxima ejercida por los animales. Partituras de agarre semanal individual de los animales se normalizaron a su fuerza de agarre de la cirugía inicial. Se ha observado que fuerza de prensión después de la cirugía de los animales implantados se redujo significativamente en comparación con los animales control en casi todo momento después de la cirugía. (Figura 3B). Fuerza de prensión de los animales control mejorado después de la pre-cirugía prueba, probablemente debido al efecto de entrenamiento. Además, fuerza de prensión de los animales de control fue significativamente mayor que la línea de fondo durante el curso del estudio (p < 0.05). Curiosamente, rendimiento de fuerza de agarre de los animales implantados fue significativamente peor que la línea de base (p < 0,01) en la primera semana de pruebas después de la fase de recuperación, pero poco a poco volvió a su rendimiento inicial. De nota, una disminución en la fuerza de agarre máxima alcanzada por el animal indica una disminución en la función motora fina (tabla 1).

Diversos marcadores histológicos pueden utilizarse para visualizar el microambiente cerca de un implante de cerebro, incluyendo núcleos neuronales, astrocitos y la estabilidad de la barrera blood - brain. Aquí realizamos la coloración immunohistochemical para IgG, proteína sanguínea común no comúnmente encontrada en el cerebro. Trabajos anteriores han demostrado que IgG es un indicador útil de la integridad de la barrera hematoencefálica ya que es un anticuerpo encontrado en la sangre y normalmente no está presente en el cerebro16,18y por lo tanto la presencia de IgG en el tejido de cerebro circundante puede ser correlacionada con la integridad de la barrera blood - brain43. Aquí, intensidad de fluorescencia de IgG se normalizó al tejido cerebral de fondo y cuantificada a partir del límite del agujero de explantación de electrodo y moviéndose hacia fuera en los compartimientos concéntricos hasta IgG ya no estaba presente en el tejido. Los animales implantados mostraron un aumento significativo de IgG intensidad cerca del agujero a 150 μm en comparación con los animales control. La intensidad de la IgG en los animales implantados volvió gradualmente a la intensidad de fondo sobre la distancia de radiación del agujero del microelectrodo implantado. En los animales control, nunca haber sido implantados con un microelectrodo, la intensidad normalizada de IgG no estaba presente en cantidades significativas por encima de la intensidad de fondo como la barrera blood - brain no fue dañada en estos animales.

Porque se observaron diferencias significativas en el rendimiento de la escala y la intensidad de IgG, las dos fueron correlacionadas (figura 4). Aquí, la intensidad fluorescente normalizada de la IgG área bajo la curva entre 0-50 μm de la interfaz electrodo tejido para cada animal se correlacionó con el promedio de rendimiento de escala de cada animal a lo largo del estudio. Se determinó un coeficiente de correlación de 0.90, demostrando una muy fuerte correlación entre el desempeño motor fino y el daño a la barrera blood - brain.

Figure 1
Figura 1 . Resultados de la prueba de campo abierto representante red. (A) este panel muestra una configuración de pruebas conductual para una red de campo abierto de prueba (para motor bruto y ansiedad de prueba). La prueba de rejilla de campo abierto consiste en una hoja de acrílico de 1 m2 con 4 paredes opacas de 40 cm de altura y cuadrado inferior secciones de aproximadamente 33 cm. (B) este panel muestra un rendimiento de función motora gruesa se mide por el número de líneas de rejilla cruzada, comparados con los rendimientos de referencia. Se observó una diferencia significativa en rendimiento entre el control (n = 10) y el implantado (n = 17) grupos en la cirugía después de 2 semanas (p < 0.05). Todo error se informa como SEM. Esta figura es reimpreso de Goss-Varley et al. 27 con el permiso de la Nature Publishing Group. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Resultados de la prueba escala representante. (A) este panel muestra una configuración de pruebas conductual para una escalera de prueba (para las pruebas de la función motora fina). La escalera consta de 2 lados de acrílico de 1 m de longitud y 25 cm de altura, Unidas por peldaños de acero inoxidable espaciados a 2 cm con un diámetro de 3 mm claro. (B) este panel muestra rendimiento de función motora fina medido por el tiempo para cruzar la escala, en comparación con el rendimiento de la línea de base. Los resultados por debajo de la línea de guiones indican una disminución del rendimiento en comparación con el rendimiento de la línea de base. Una diferencia significativa en rendimiento fue descubierta entre el control (n = 10) y el implantado (n = 17) grupos durante las semanas después de la cirugía 3-16 (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) y longitudinalmente a través de todo el estudio () # = p < 0.05). (C) este panel muestra una instancia cuantificada de la pata delantera derecha se desliza. Se descubrió una diferencia significativa en la ocurrencia de la pata delantera derecha se desliza por semana cuando se comparó el control y los grupos implantados (* = p < 0.05). (D) este es un ejemplo de un resbalón de la pata. Todo error se informa como SEM. Esta figura es reimpreso de Goss-Varley et al. 27 con el permiso de la Nature Publishing Group. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Resultados de prueba de fuerza de agarre representante. (A) este panel muestra una prueba conductual de configuración para la fuerza de agarre (para pruebas de motricidad fina). El medidor de fuerza de agarre consiste en una base ponderada con un medidor de fuerza montado conectado a un manillar de agarre. (B) este panel muestra el desempeño de la función motora fina, medido por la fuerza de agarre máxima ejercida en comparación con el rendimiento de la línea de base. Los resultados por debajo de la línea de guiones indican una disminución del rendimiento en comparación con el rendimiento de la línea de base. Se observaron diferencias significativas entre el control (n = 5) y el implantado (n = 6) animales durante semanas casi todos post-surgical (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0,001). Más importancia se observaron entre actuaciones semanales y línea base de los animales de control (# = p < 0.05) y entre actuaciones semanales y línea base de los animales implantados (## = p < 0.01). El control y los animales implantados realizaron significativamente diferentes longitudinalmente a través de todo el estudio (@@@ = p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Correlación de IgG y escalera. Una intensidad de fluorescencia de IgG normalizada alrededor del sitio de implantación se correlacionó con un cambio en el rendimiento de la escalera, y un coeficiente de correlación de 0,901 fue encontrado (p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1. General datos representativos del comportamiento aumentan y disminuyen en rendimiento comparado con puntuaciones de referencia para cada métrica prueba. Las cajas verdes representan un rendimiento mejorado que hace improbable un déficit motor, y los cuadros rojos representan un menor rendimiento que hace probable déficit de función motora.

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Discussion

El protocolo descrito aquí ha sido utilizado eficaz y reproducible medir déficit motor fino y grueso en un modelo de lesión cerebral de roedor. Además, permite la correlación de comportamiento motor fino los resultados histológicos después de una implantación de microelectrodos en la corteza de motor. Los métodos son fáciles de seguir, de bajo costo configurar y pueden modificarse para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores. Además, la prueba de comportamiento no causa dolor o estrés a los animales; más bien, los investigadores creen que los animales crecieron a disfrutar el ejercicio y las recompensas que vienen con pruebas. Estudios previos han sugerido que el daño de la corteza de motor puede causar motor, memoria y daño funcional44,45. Sin embargo, a pesar de este conocimiento, hay información limitada sobre el impacto funcional causado por una implantación de microelectrodos en la corteza de motor27, que podría impactar negativamente en los resultados clínicos en pacientes.

Modificaciones pueden hacerse en el protocolo, el procedimiento quirúrgico tanto en la prueba de comportamiento. Este protocolo describe el procedimiento para implantar microelectrodos en la corteza motora de los animales de la región que afecta a las patas delanteras. Este procedimiento se puede adaptar fácilmente para variar el implante, incluyendo electrodos para estimulación eléctrica46 o cánulas para entrega de drogas47, o el tipo de lesión, incluyendo un TBI modelo48. Pueden hacerse otras modificaciones a los parámetros de la puntuación utilizados en la prueba de rejilla de campo abierto y a la escalera aparato. Además del número de líneas de la cuadrícula cruzado, la distancia total recorrida y la velocidad máxima alcanzada por el animal, el tiempo estancado y el número de vueltas izquierdas y derecha también puede grabarse como parámetros adicionales de funcionamiento del motor32 . En la prueba de la escalera, peldaños49 de retirar o colocar la escalera en una pendiente de50 puede aumentar dificultad, aunque con los implantes actuales los autores no encontraron esto necesario para provocar un déficit motor fino en esta aplicación. Por último, aunque el aparato de prueba presentado aquí fueron diseñado para utilizarse con las ratas, las unidades podrían escalar hacia arriba o hacia abajo para ser utilizado con distintos tamaños de roedores. Es importante tener en cuenta que si surgen problemas donde un animal no es capaz de completar la pre-cirugía pruebas constantemente, el animal debe retirarse del estudio.

Como con todas las pruebas conductuales, es fundamental permanecer tan consistente como sea posible en el transcurso del estudio. Se ha demostrado que los resultados de la prueba pueden variar de acuerdo con el investigador que trabaja con los animales51, la ubicación en la que la prueba realizó52y factores ambientales incluyendo animales alojamiento y cría de procedimientos53. Además, la investigación ha mostrado gran variabilidad en la producción de una lesión cerebral por medio de calefacción durante una craneotomía procedimiento31 y modelos de TBI incluyendo la caída de peso modelo54 y la variación mecánica en un control cortical de cráneo impacto del modelo55. Investigadores por lo tanto, deben tener especial cuidado en mantener la consistencia en el procedimiento quirúrgico, la prueba y las condiciones de vivienda y en la prueba personal, entre otros.

Direcciones futuras de estos métodos de prueba de comportamiento podrían ampliar las pruebas presentadas aquí para proporcionar resultados más a fondo. Por ejemplo, una prueba de laberinto de agua o una prueba de la barra de rotor podría incorporarse más Extracto de ansiedad56 o bruto déficits de motricidad57 , respectivamente. Además, trabajo futuro también podría apuntar a reducir el daño de tejido causado por una inserción de un dispositivo en el cerebro. Trabajo actual en esta área se ha centrado en la reducción de la inflamación a través de tratamientos antioxidantes42,58, mecánicamente compatible con los implantes41,59,60, la inhibición de lo innato inmunidad señalización ruta14,15y la reducción de daño vascular durante un dispositivo implantación31,61.

Por último, debe considerarse que el trabajo actual fue terminado usando ratas sanas, juveniles, hombres que no necesariamente las características de la típica paciente humano recibir un implante de cerebro. Explorar aún más las tareas de motricidad fina y gruesa en modelos de enfermedad característico de investigación adicional es necesaria para ratificar los resultados presentados aquí. En diferentes modelos de la enfermedad, las diferencias entre los animales implantados y no implantados simulada pueden requerir las mencionadas modificaciones a condiciones de prueba.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado en parte por el mérito de premio #B1495-R (Capadona) y el Premio Presidencial de la carrera temprana de científico e ingenieros (PECASE, Capadona) desde el Departamento de veteranos asuntos investigación rehabilitación de Estados Unidos (US) y Servicio para el desarrollo. Además, este trabajo fue financiado en parte por la oficina del Secretario de defensa asistente para asuntos de salud a través del Peer revisada médica investigación programa bajo Nº de premio W81XWH-15-1-0608. Los contenidos no representan las opiniones del Departamento de Asuntos Veteranos de Estados Unidos o el gobierno de Estados Unidos. Los autores desean agradecer a Dr. Hiroyuki Arakawa en la CWRU roedor comportamiento base para su orientación en el diseño y prueba de protocolos de comportamiento roedores. Los autores también desean agradecer a James Drake y Kevin Talbot de la CWRU Departamento de mecánica e ingeniería aeroespacial por su ayuda en el diseño y fabricación de la prueba escala roedores.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225g Charles River CD
Compac5 anesthesia system Vetequip 901812
Electric trimmers Wahl 9918-6171
Stereotaxic frame David Kopf Instruments 1760
Gaymar heated water pad and pump Braintree Scientific Inc  TP-700
Vetbond tissue adhesive 3M 07-805-5031
Dental drill Pearson Dental O60-0045
Dura pick Fine Science Tools 10064-14
Silicon shank microelectrode Made in-house at Cleveland VA Medical Center N/A
KwikCast silicone elastomer World Precision Instruments KWIK-CAST
Teets dental cement  A-M Systems 525000
Webcam HD Pro c920 Logitec 960-000764
Grip strength meter Harvard Apparatus 565084
Minitab 17 statistical software Minitab Inc
Open field grid test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Ladder test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Rabbit anti rat IgG antibody Bio-Rad 618501

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