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Bioengineering

Nagetier Verhaltens Tests, um funktionelle Defizite verursacht durch Mikroelektrode Implantation im motorischen Kortex Ratte bewerten

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/57829
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Advanced Platform Technology Center, Rehabilitation Research and Development, Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Wir haben gezeigt, dass eine Mikroelektrode Implantation im motorischen Kortex von Ratten sofortige und dauerhafte motorische Defizite verursacht. Die Methoden vorgeschlagen hierin Umriss einer Mikroelektrode Implantation Operation und drei Nagetier Verhaltens Aufgaben, mögliche Änderungen in die feine oder grobe Motorik durch Implantation verursacht Schäden an den motorischen Kortex aufzuklären.

Abstract

Medizinprodukte, die in das Gehirn implantiert halten enormes Potenzial. Als Teil eines Systems von Gehirn-Maschine-Schnittstelle (BMI) zeigen intracortical Mikroelektroden Aktionspotentiale von einzelnen oder kleinen Gruppen von Neuronen aufnehmen. Diese aufgezeichneten Signale sind erfolgreich benutzt worden, Patienten mit zulassen oder Computer, Roboter-Gliedmaßen und ihre eigenen Gliedmaßen zu kontrollieren. Jedoch haben frühere Tierstudien gezeigt, dass eine Mikroelektrode Implantation im Gehirn nicht nur das umliegende Gewebe schädigt, sondern auch funktionelle Defizite führen kann. Hier diskutieren wir eine Reihe von Verhaltensstörungen Tests, mögliche motorische Beeinträchtigungen nach der Implantation von intracortical Mikroelektroden in den motorischen Kortex einer Ratte zu quantifizieren. Die Methoden für die Freiland-Raster, Leiter Kreuzung und Griff Stärke testen liefern wertvolle Informationen über die möglichen Komplikationen infolge einer Mikroelektrode Implantation. Die Ergebnisse des Verhaltens Tests korrelieren mit Endpunkt Histologie, Bereitstellung zusätzlicher Informationen über die pathologische Ergebnisse und Wirkungen dieses Verfahrens auf das angrenzende Gewebe.

Introduction

Intracortical Mikroelektroden dienten ursprünglich ordnen Sie die Schaltkreise des Gehirns, und entwickelten sich zu einem wertvollen Werkzeug ermöglicht die Erkennung von motor Absichten derer funktionellen Ausgänge1produzieren. Erkannten funktionale Ausgänge können Personen leiden Verletzungen des Rückenmarks, Zerebralparese, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) oder andere Bewegung einschränkenden Bedingungen zur Kontrolle von einem Computer Cursor2,3 oder Roboter anbieten. Arm4,5,6, oder Funktion auf ihre eigenen behinderten Extremität7wiederherstellen. Daher hat eine vielversprechende und schnell wachsenden Feld8intracortical Mikroelektrode Technologie entwickelt.

Aufgrund der Erfolge im Bereich gesehen sind klinische Studien im Gange, zu verbessern und besser zu verstehen, die Möglichkeiten des BMI Technologie5,9,10. Erkennen das volle Potenzial der Kommunikation mit den Neuronen im Gehirn, sind die Reha-Anwendungen als grenzenlose8wahrgenommen. Zwar gibt es viel Optimismus für die Zukunft der intracortical Mikroelektrode Technologie, ist es auch bekannt, dass Mikroelektroden schließlich11, möglicherweise durch eine akute schwere Reaktion nach der Implantation nicht. Die Implantation von Fremdmaterial im Gehirn führt unmittelbare Schädigung des umliegenden Gewebes und führt zu weiteren Schäden, die durch die schwere Reaktion, die variiert je nach Eigenschaften des Implantats12. Darüber hinaus kann ein Implantat im Gehirn verursachen einen Microlesion-Effekt: ein Rückgang der Glukose-Stoffwechsel vermutlich durch akute Ödeme und Blutungen durch das Gerät einstecken13verursacht werden. Darüber hinaus sind die Signalqualität und die Länge der Zeit, die nützliche Signale aufgezeichnet werden können inkonsistente, unabhängig von der Tier-Modell11,14,15,16. Mehrere Studien belegen den Zusammenhang zwischen Neuroinflammation und Mikroelektrode Leistung17,18,19. Daher ist der Konsens der Gemeinschaft, dass die entzündliche Reaktion des neuronalen Gewebes, die die Mikroelektroden umgibt zumindest teilweise, Elektrode Zuverlässigkeit Kompromisse.

Viele Studien haben untersucht lokale Entzündung11,20,21,22 oder erforscht Methoden zur Schadensbegrenzung im Gehirn verursacht durch Einfügung11,23, 24,25, mit dem Ziel der Verbesserung der Aufnahme über Zeit14,26. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass eine iatrogene Schädigung durch eine Mikroelektrode Einfügung im motorischen Kortex von Ratten führt zu einer sofortigen und dauerhaften feinen motorischen Defizit27. Daher der hier vorgestellten Protokolle soll Forschern eine quantitative Methode zur Bewertung möglich motorische Defizite durch Hirn-Trauma nach der Implantation und anhaltende Präsenz intracortical Geräte geben (Mikroelektroden in der im Falle dieser Handschrift). Die hier beschriebene Verhalten-Tests wurden entwickelt, um sowohl grob- und motorischen Beeinträchtigungen herauskitzeln und können in vielen Modellen der Hirnverletzung verwendet werden. Diese Methoden sind einfach, reproduzierbar und können leicht in einem Nagetier Modell umgesetzt werden. Des weiteren können hier vorgestellten Methoden für eine Korrelation von motorischen Verhalten zu histologischen Ergebnisse, ein Vorteil, den bis vor kurzem die Autoren nicht gesehen haben im BMI-Bereich veröffentlicht. Endlich, wie diese Methoden entwickelt wurden, um feine Motorik28, die Grobmotorik29und Stress und Angst Verhalten29,30, Testen der hier vorgestellten Methoden können auch umgesetzt werden in ein Modellauswahl Kopfverletzung wo wollen die Forscher (oder in) herrschen motorischen Defizite.

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Protocol

Alle Verfahren und Praktiken der Pflege der Tiere wurden genehmigt und in Übereinstimmung mit der Louis Stokes Cleveland Abteilung der Veteranen Angelegenheiten Medical Center institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschüsse durchgeführt.

Hinweis: Um die Forscher auf die Entscheidung über die Verwendung eines Stich-Verletzungen-Modells als Steuerelement zu erziehen, empfiehlt es sich, die Arbeit von Potter Et Al. überprüfen 21.

(1) Mikroelektrode chirurgische Implantationsverfahren

  1. Präoperative Vorbereitung der Tiere
    1. Betäuben Sie das Tier in einer Induktion Kammer mit Isofluran (2-4 %). Während Narkose kontinuierlich überwachen Sie das Tier mit einem lebenswichtigen Mess-System zur Überwachung der Herzfrequenz und BLUTSAUERSTOFF Inhalte.
    2. Bewegen Sie das Tier zu einem Prüfkopf weiterhin die Narkose. Subkutan (SQ) Spritzen ein Cephalosporin-Antibiotikum, z.B. Cefazolin (25 mg/kg) und ein nicht-steroidale Entzündungshemmer, z.B. Carprofen (5 mg/kg), Infektion zu verhindern und die Schmerzen, bzw. zu verwalten.
    3. Liberal gelten Sie ophthalmologischen Salbe für das Tier Augen um sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
    4. Mit kleinen Tier Nagelknipser, schneiden Sie die Zehennägel verhindern, dass das Tier kratzen die Nähte bei der Wundheilung. Stellen Sie sicher, dass die Nägel nicht zu kurz abgeschnitten werden, da dies zu Schmerzen und Blutungen für das Tier führen kann.
    5. Der Kopf des Tieres gründlich hinter die Ohren, zwischen den Augen mit einem elektrischen Rasierer Trimmer zu rasieren.
    6. Bieten Sie eine lokale Analgesie SQ Injektion von Bupivacain (0,3 mL 0,125 % Bupivacain aus Stammlösung verdünnt) an der Spitze der Kopf des Tieres im Bereich des Schnittes.
    7. Montieren Sie das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen, mit Ohr-Balken auf um den Kopf zu halten, während der Operation verschieben. Legen Sie ein zirkulierendes Wasser Heizkissen unter das Tier, die interne Temperatur des Tieres.
    8. Wenden Sie ein steriles Tuch, z. B. institutionell zugelassenen sterilen Plastikfolie, um das OP-Feld zu isolieren.
    9. Peeling der OP-Bereich mit einer wechselnden Betadine-Lösung und Isopropanol scheuert.
    10. Führen Sie eine Zehe Prise nach dem institutionellen Protokoll um sicherzustellen, dass das Tier unter der operativen Ebene ist.
  2. Tier für eine Implantation vorbereiten
    1. Erstellen Sie einen Schnitt von etwa 1 in unten Mittellinie Freilegung des Schädels mit einem Skalpellklinge Nr. 10. Unverblümt entfernen Sie der Knochenhaut mit einem Applikator Baumwoll-Spitze aus, bis Blutungen mit einem Tupfer. Einfahren des umliegenden Gewebes mit Krokodilklemmen und sauber und den Schädel mit Wasserstoffperoxid zu entwässern.
    2. Legen Sie ein paar Tropfen Klebstoff Cyanacrylat-basierte Gewebe auf der exponierten Schädel, den dental Zement Verklebung in späteren Schritten zu verbessern.
    3. Markieren Sie in der gewählten Hemisphäre der Region von den motorischen Kortex entsprechend Vorderpfote Bewegung ca. 3 mm lateral Mittellinie und 2 mm anterior Bregma durch einen Nick im Knochen zu schaffen.
    4. Einen Teil des Schädels mit Hilfe einer 1,75 mm abgerundeter Spitze Zahnbohrer, wobei besondere Aufmerksamkeit, die Sie nicht zu schnell oder zu tief bohren und unterstützen einerseits auf dem stereotaktischen Rahmen zu entfernen. Der Bohrer sollte mit dem Schädel zeitweise zur Vermeidung von Überhitzung31angewendet werden.
    5. Die Dura mit einem feinen Haken 45° Dura Pick zu reflektieren.
    6. Reinigen Sie jede Blutung mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator und Saline, dabei darauf achten, nicht direkt berühren der Oberfläche des Gehirns.
  3. Einfügung der Mikroelektrode im motorischen Kortex
    1. Montieren Sie sorgfältig die sterilisierten Mikroelektrode in Universalhalter am stereotaktischen Rahmen, wobei Vorsicht nicht, den Schaft der Elektrode zu stoßen. Stellen Sie sicher, dass die Headstage-Schnittstelle der Elektrode durch den Halter fest gehalten wird.
      Hinweis: Hier eine funktionsuntüchtige Michigan-Stil Silikon Schaft Elektrode misst 2 mm x 123 µm 15 µm diente, und der Schaft wurde eingefügt, mit feinen Pinzette.
    2. Positionieren Sie mit Hilfe der Mikromanipulatoren am stereotaktischen Rahmen, sorgfältig die Elektrodenspitze über die offenen Kraniotomie.
    3. Vorsichtig absenken die Elektrode ca. 2 mm in das Gehirn mit dem Mikromanipulatoren als Wegweiser zur Messung (abhängig von der Wahl der Elektrode, eine automatische Einfügung an kontrollierte Preise kann erforderlich sein.) Vorsicht, sichtbaren Gefäßsystem möglichst zu vermeiden. Sobald die Elektrode vorhanden ist, sorgfältig lassen Sie den Stecker aus der Universalhalter aus- und einfahren des Einfügung Arms.
    4. Reinigen Sie sorgfältig jede Blutung aus rund um die Elektrode mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator und Kochsalzlösung.
    5. Abdichtung der Kraniotomie um die implantierten Elektrode mit einem Silikon-Elastomer.
    6. Befestigen Sie die Elektrode an den Schädel mit dental Zement.
    7. Sobald der Kleber vollständig trocken ist, bringen Sie die Kanten des Schnittes zusammen auf der Vorder- und Rückseite der Zement wachsauflagen und Naht, die sie zu schließen.
  4. Postoperative Pflege
    1. Lassen Sie das Tier wieder auf eine zirkulierende Wasser Heizkissen während Sie weiterhin seine Vitalfunktionen überwachen. Vermeiden Sie Wärmelampen, da die Temperatur von Lampen schwieriger zu kontrollieren ist und Tiere können überhitzen.
    2. Sobald das Tier ganz wach ist, verschieben Sie das Tier zu einem sauberen Käfig mit einfachem Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
    3. Während der postoperativen Tage 1-3 bieten Sie die Tieren mit SQ Cephalosporin Antibiotikum (25 mg/kg) und eine nicht-steroidale entzündungshemmende (5 mg/kg) zur Prävention von Infektionen und verwalten Sie ihre Schmerzen.
    4. Beobachten Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden, Blutungen, Gewichtsveränderung oder Naht Probleme durch mindestens postoperativen Tag 5.

2. Verhalten testen

  1. Für alle Verhalten testen, testen die Tiere 2 X pro Test in der Woche vor der Elektrode Implantation Operation an ihrer Grundlinie präoperative Ergebnisse berechnen. Können Sie nach der Operation die Tiere für 1 Woche vor Beginn der Tests 2 X pro Woche auf jedem Test Verhalten ruhen. Einheitliche Testbedingungen sollte während der gesamten Studie verwendet werden, für die Prä- und postoperative Tests, um die Auswirkungen von Stress auf die Leistung zu minimieren, die eine Messung der Angst führen könnten.
    1. Reinigen Sie alle Prüfgeräte mit ein Chlor Dioxid basierenden Sterilisationsmittel am Anfang der einzelnen Testphasen und nach jedem Tier.
    2. Film der Freiland-Raster und Leiter-Tests. Diese Tests erfordern eine Video-Kamera (1080p, mindestens 15 fps, 78° diagonal Sichtfeld), ein Laptop und Platz zum Speichern von video-Daten.
    3. Zu Beginn des Tests täglich bringen Sie die Tiere in den Prüfraum und es ermöglichen Sie ihnen, für mindestens 20 Minuten vor Beginn der Prüfung zu akklimatisieren. Der Raum sollte hell und temperiert sein, und dem gleichen Personal sollte alle Tests abgeschlossen. Im Idealfall wird das gleiche Zimmer für alle Tiere im Verlauf der Prüfung ohne Änderungen an den Raum verwendet werden.
    4. Verwendung Essen Belohnungen für die Tiere um die Aufgaben, vor allem während der Leiter Ausbildung zu fördern. Getreide oder kleine Stücke von Bananen-Chips oder Cracker machen gute Belohnungen.
    5. Normalisieren Sie alle wöchentlichen Test Vorstellungen, die vor der Operation-Scores für jedes einzelne Tier (Gleichung 1).
      Gleichung 1:Equation 1
  2. Feldtests Gitter zu öffnen
    Hinweis: Freiland-Gitter-Test wurde im eigenen Haus gebaut und hat eine Lauffläche von 1 m2 mit ca. 40 cm hohe undurchsichtige Seitenwände. Die Lauffläche des Rasters unten gliedert sich in 9 gleiche Quadrate von der Unterseite mit Klebeband (Abb. 1A). Die Aufnahme-Kamera ist dauerhaft über der Mitte des Rasters auf Gerüst montiert.
    1. Um mit dem offenen Feld Raster Testen beginnen, legen Sie das Tier in der Mitte des Rasters der Tester abgewandten.
    2. Lassen Sie das Tier frei für 3 min zu laufen, während der Videoaufnahme.
    3. Wenn das Tier Tests abgeschlossen hat, entfernen Sie das Tier aus dem Netz zu und wieder in den Käfig. Reinigen Sie Raster mit Chlor Dioxid basierenden sterilisiermittel gründlich.
    4. Testen Sie jedes Tier 1 X pro Tag testen.
    5. Analysieren Sie die Anzahl der Rasterlinien gekreuzt, die insgesamt zurückgelegte Strecke und die maximale Geschwindigkeit des Tieres als Metrik für die Grobmotorik eine Video tracking-Software verwenden.
      Hinweis: Die hier vorgestellten Daten wurden manuell durch ausgebildete Forscher quantifiziert, aber es wird bevorzugt im eigenen Haus mit einer neu entwickelten tracking-Algorithmus32.
  3. Leiter zu testen
    Hinweis: Die Leiter-Test wurde im eigenen Haus gebaut und besteht aus 2 klaren Acryl Seitenwände, jeweils 1 m in der Länge von 3 mm Durchmesser Sprossen Abstand von 2 cm auseinander (Abb. 2A) verbunden. Leiter zu testen ist eine qualifizierte Prüfung und erfordert daher 1 Woche Training vor der Aufnahme die präoperative Baseline-Scores. Das Protokoll für die Ausbildung und Prüfung ist die gleiche.
    1. Bewegen Sie das Tier zu einem Käfig sauber temporärer Leiter Tests beginnen.
    2. Richten Sie die Leiter so ein, dass es 2 Käfige überbrückt. Start Ende der Leiter ruht auf einem sauberen Käfig, und Ende Ende ruht auf das Tier zu Hause Käfig als eine Motivation zur Vervollständigung der Strecke dienen.
    3. Positionieren Sie die gleiche (oder ähnliche) Videokamera auf einem Stativ in der Mitte der Leiter. Die Position der Kamera sollte auf Höhe der Sprosse werden und für die ganze Leiter zu sehen.
    4. Halten Sie mit der Videokamera laufen das Tier an den Start der Leiter, so dass ihre Vorderpfoten auf die erste Sprosse berühren.
    5. Lassen Sie das Tier, die Leiter in ihrem eigenen Tempo zu überqueren. Die verstrichene Zeit zwischen dem Moment, wenn das Tier Pfote berührt die erste Sprosse und die Ziellinie an der dritten bis zur letzten Sprosse wird das Tier Zeit zu überqueren.
    6. Wenn das Tier dreht sich auf der Leiter oder sich nicht für einen Zeitraum von 20 bewegt s, betrachten das Tier die Ausführung gescheitert. Weisen Sie die Tieren eine Strafe Gäste Zeit für jede konnte nicht ausgeführt werden. Bestimmen Sie die Strafzeit von der langsamste Leistung während präoperative Test27aufgenommen.
    7. Ermöglichen jedem Tier, überqueren Sie die Leiter 5 X pro Tag mit ca. 1 min. Rest zwischen jedem Lauf zu testen.
    8. Durchschnitt der schnellste 3 Abfahrten pro Tag als Metrik der feinen Motorik. Darüber hinaus erfassen Sie die Anzahl der Male, die jeweils vorderen Pfoten rutscht aus den Sprossen mit einem Video tracking-Software.
      Hinweis: Die hier vorgestellten Daten wurden manuell durch ausgebildete Forscher quantifiziert, aber es ist bevorzugt, verwenden Sie einen neu entwickelten eigene Tracking-Algorithmus mit Dona Et al. 32.
  4. Grip Stärke testen
    1. Einzelnen Testphasen kalibrieren Sie Griff Stärke Meter und Messen Sie die Stärke in Gramm.
    2. Lage der Griff Stärke Meter am Rande eines Zählers mit dem Griff Lenker erstreckte sich über den Boden.
    3. Lassen Sie das Tier, den Lenker mit beiden Vorderpfoten greifen, halten Sie das Tier durch die Schwanzwurzel(Abbildung 3).
    4. Sobald das Tier einen festen Griff mit jeder Pfote hat, ziehen Sie das Tier das Messgerät von der Schwanzwurzel mit langsamen und stetigen Kraft.
    5. Notieren Sie die maximalen Grip Stärke ausgeübt durch das Tier, das auf der Digital Ausgang vom Griff Stärke Messgerät angezeigt wird.
    6. Testen Sie jedes Tier 3 X pro Tag mit ca. 2 min. Rest zwischen jedem Test testen.
    7. Als Metrik der feinen Motorik aufzeichnen und die maximalen Grip Stärke Ausgang von jedem der 3 Studien im Durchschnitt.

3. Post-Verhaltens-Protokoll

  1. Nach allem Verhaltensstörungen Tests (z.B.8-16 Wochen nach der Implantation), Betäuben die Tiere tief mit Ketamin (160 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg), Transcardially durchspülen sie, ihr Gehirn und Cryo-Scheibe zu ernten, und das Gewebe zu beflecken mittels immunhistochemischen Marker, um die zelluläre Reaktion auf dem Gelände der Implantation33,34,35,36,37,38zu quantifizieren.

4. statistische Analyse

Hinweis: Eine prospektive Power-Analyse wird dringend empfohlen für alle Studien, die versuchen, eine bestimmte Fragestellung zu beantworten. Power-Analyse, die die Anzahl der Tiere erforderlich, um eine statistische Signifikanz für besonderen Studiendesign erreichen informiert, die insbesondere die Forschung Hypothese, das Design des Experiments, die geschätzte Effektgröße und Variabilität der beruhen die vorgesehenen Behandlungen, als auch die Effektgröße erforderlich, klinischen oder wissenschaftlichen Relevanz zu erreichen.

  1. Analysen Sie statistische mit gemeinsamen statistischen Software.
  2. Tabellieren die deskriptiven Statistiken und zeigt sie als Mittelwert ± Standardfehler.
  3. Analysieren Sie die Verhaltensstörungen Performance [im Freiland Raster (Schritt 2.2), Leiter (Schritt 2.3), und Griff Stärke testen (Schritt 2.4)] jeder wöchentlichen Zeitpunkt vs. implantiert Kontrollgruppen mit einem zwei-Stichproben-t-Test zu vergleichen. Betrachten Sie jeden wöchentlichen Zeitpunkt eine eigenständige Maßnahme.
  4. Quantifizieren Sie die longitudinale Leistung mit einem gemischten Effekt linearen Modell. Die Woche und die Gruppe sind Faktoren festgelegt und ein Versuchstier ist verschachtelt innerhalb der Gruppe als ein zufälliger Effekt. Eine Varianzanalyse (ANOVA) wird verwendet, um den Faktor Effekt mit einem Signifikanzniveau von p < 0,05 zu bestimmen.
  5. Vergleichen Sie die Leiter-Leistung mit Immunglobulin G (IgG) Intensität mit einer linearen Regressionsanalyse. Berechnen Sie den Korrelationskoeffizienten, indem ein Pearson-Methode.

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Representative Results

Mithilfe der hier vorgestellten Methoden, ist eine Mikroelektrode Implantation Operation im motorischen Kortex abgeschlossene folgenden festgelegten Verfahren39,40,41,42, gefolgt von Freiland Raster testen zur Beurteilung der Grobmotorik und Leiter und Griff funktionieren Stärke testen, um die Feinmotorik zu beurteilen27. Motorische Funktionstests wurde fertiggestellt 2 X pro Woche für 16 Wochen nach der Operation bei implantierten Tieren, keine Operation nicht implantierten Tiere als Kontrolle. Alle postoperative Ergebnisse waren im Durchschnitt pro Woche und auf jedes einzelne Tier vor der Operation Grundlinie Partituren normalisiert. Alle Fehler wird als Standardfehler des Mittelwertes (SEM) gemeldet.

Zur Messung ihrer Grobmotorik und betonen Verhalten, durften die Tiere laufen frei in einem Freiland-Gitter-Test für 3 min (Abb. 1A). Verschiedene Metriken aus diesem Test können erfasst werden, einschließlich der Anzahl der Raster, die Linien kreuzen, die insgesamt zurückgelegte Strecke, und die maximale Geschwindigkeit erreicht durch das Tier. In dieser zuvor gemeldeten Daten wird die Anzahl der Rasterlinien gekreuzt27dargestellt. In der ersten Woche nach der Erholungsphase (2-Wochen-Timepoint), ein signifikanter Unterschied in der Freiland-Raster-Leistung zwischen den 2 Gruppen gesehen wurde. Allerdings gab es keine weitere Bedeutung, während der Rest der Studie (Abbildung 1B). Die Kontrolle und Mikroelektrode implantierten Tiere erzielte ebenso während der Testphase und die Varianz in der Leistung war in beiden Gruppen von Tieren relativ hoch. Keine Bedeutung galt als Freiland Raster in beiden Sätzen von Tieren über die gesamte experimentelle Zeit Leistungsvergleich. Da gab es keinen Unterschied in der Leistung zwischen den 2 Gruppen von Tieren, wurde dieses Ergebnis interpretiert, um anzugeben, dass es keine groben motorischen Defizit oder stark einschränkenden Belastungen durch eine Mikroelektrode Implantation in den motorischen Kortex27. Bei der Interpretation der Daten, eine Abnahme in der Anzahl der Rasterlinien gekreuzt, die insgesamt zurückgelegte Strecke, oder die maximale Geschwindigkeit erreicht, indem das Tier alle zeigen einen Rückgang der Grobmotorik (Tabelle 1).

Um die koordinierte Griff und feinen Motorik zu messen, beteiligte sich Tiere in einem horizontalen Leiter Test (Abb. 2A) wo verzeichneten die Zeit dauerte es, das Tier, die Leiter und die Häufigkeit der Pfote rutscht zu überqueren. Nach der Operation Leiter Kreuzung Zeiten wurden für jedes Tier, jedes einzelne Tier vor der Operation Partituren normalisiert. Daher ein positiver Prozentsatz fällt mit einem Rückgang in der Zeit, die Leiter und eine Leistungssteigerung zu überqueren, und ein negativer Prozentsatz fällt mit einer Zunahme der Zeit, die Leiter und eine verminderte Leistung (Abbildung 2B, überqueren Tabelle 1).

In dieser zuvor gemeldeten Daten angezeigt der Kontrolltiere, kein Implantat erhalten haben die langsamste Leistung Zeiten (82,6 ± 26,0 %) während der ersten Woche der postoperative Prüfung unmittelbar nach der Wiederherstellung phase27. Ab der zweiten Woche nach der Operation Leiter testen, der Kontrolltiere ihre Grundlinie Leistung mal wieder aufgenommen und gepflegt Partituren vergleichbar mit ihrer Grundlinie Partituren im Verlauf der Studie mit sehr wenig Varianz.

Die Tiere erhalten eine intracortical Mikroelektrode sah eine reduzierte Leistung sofort nach der Operation. Diese Tiere zeigten eine erhöhte Leiter überqueren Zeit im Vergleich zu ihrer Grundlinie von 199,1 ± 61,4 % in der ersten Woche nach der Operation zu testen. Die implantierten Tiere angezeigt eine reduzierten Leistung um die Dauer der Studie und ihre Leistung nicht in ihre Grundlinie Noten zurück. Am schlimmsten, implantierten Tiere verringerte sich im Leistung während der Woche 11 auf einen Durchschnitt von 526,9 ± 139,4 % im Vergleich zu ihrer Basisleistung. Darüber hinaus zeigte die implantierten Tiere eine höhere Abweichung im Vergleich zu den Kontrolltieren. Während der ersten Woche des Testens gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen Steuerung und implantierten Tiere. Jedoch ein signifikanten Unterschied in der prozentuale Veränderung gegenüber der Baseline-Zeiten zwischen den Gruppen alle nachfolgenden Wochen in der Studie (p < 0,05) gesehen wurde (Abbildung 2B).

Weiterer Beweis für feine motorischen Beeinträchtigungen zeigte sich nach der Häufigkeit ihrer Rechte Vorderpfote rutscht zwischen den 2 Gruppen von Tieren. Die Leistung der Rechte Vorderpfote war von besonderem Interesse, weil Mikroelektroden in der linken Hemisphäre des Gehirns in der Region von den motorischen Kortex verantwortlich für die Kontrolle der Vorderpfote implantiert wurden. Durch sorgfältige Videoanalyse Pfote rutscht wurden aufgezeichnet und quantifiziert (Abbildung 2C). Während keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit der linke Pfote rutscht gesehen wurden, ergab, dass die implantierten Tiere deutlich mehr Rechte Vorderpfote rutscht im Vergleich zu den Kontrolltieren erlebt (durchschnittlich 0,54 ± 0,07 Rechte Vorderpfote rutscht pro Woche in der implantierten Tiere im Vergleich zu durchschnittlich 0,32 ± 0,02 vorne rechts Pfote rutscht pro Woche in der Kontrolltiere). Bei der Interpretation der Daten zeigt eine Zunahme der Zeit, die Leiter zu überqueren oder eine Zunahme der Zahl von Pfote rutscht eine Abnahme der feinen Motorik (Tabelle 1).

Als sekundäre Maßnahme koordinierte Verständnis und feine Motorik die Tiere einen Griff Stärketest(Abbildung 3)wo die maximalen Grip Stärke, ausgeübt von den Tieren aufgenommen wurde abgeschlossen. Das einzelne Tier wöchentliche Griff Partituren wurden auf ihre Griffkraft präoperative Grundlinie normalisiert. Es zeigte sich, dass die implantierten Tiere nach der Operation Griffkraft deutlich im Vergleich zu Kontrolltieren zu fast jedem Zeitpunkt nach der Operation reduziert werden konnte. (Abbildung 3B). Der Kontrolltiere Griffkraft verbessert nach vor der Operation testen, wahrscheinlich aufgrund der Trainingseffekt. Darüber hinaus wurde der Kontrolltiere Griffkraft deutlich größer als die Grundlinie im Verlauf der Studie (p < 0,05). Interessanterweise wurde die implantierten Tiere Griff Stärke Leistung deutlich schlechter als die Grundlinie (p < 0,01) in der ersten Woche des Testens nach der Erholungsphase, aber langsam ihre Standardleistung zurückgegeben. Der Hinweis zeigt eine Abnahme der maximalen Grip Festigkeit erreicht, indem das Tier einen Rückgang der feine Motorik (Tabelle 1).

Verschiedene histologische Marker können verwendet werden, um die Mikroumgebung in der Nähe von einem Gehirn-Implantat, einschließlich neuronalen Kernen, Astrozyten und Stabilität der Blut - Hirn-Schranke zu visualisieren. Hier führten wir immunhistochemische Färbung für IgG, eine gemeinsame Blut-Protein nicht allgemein im Gehirn gefunden. Frühere Arbeit hat gezeigt, dass IgG ein nützlicher Indikator für die Integrität der Blut - Hirn-Schranke, ist da es ein Antikörper im Blut gefunden, und normalerweise nicht in das Gehirn16,18, und daher das Vorhandensein von IgG in das umgebende Hirngewebe präsentieren kann die Integrität der Blut - Hirn-Schranke43korreliert werden. Hier wurde IgG Fluoreszenzintensität normiert auf Hintergrund Hirngewebe und quantifizierte beginnend an der Grenze der Elektrode Explantation Bohrung und Umzug in konzentrischen Lagerplätze bis IgG nicht mehr in das Gewebe vorhanden war. Die implantierten Tiere zeigte einen signifikanten Anstieg der IgG Intensität nahe dem Loch, bis 150 µm im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die IgG-Intensität in den implantierten Tieren hintergrundintensität allmählich wieder mehr über die Distanz von implantierten Mikroelektrode Loch ausstrahlt. In der Kontrolltiere, haben noch nie mit einer Mikroelektrode eingepflanzt worden war die normalisierten IgG Intensität nicht in signifikanten Mengen oben hintergrundintensität als die Blut - Hirn-Schranke bei diesen Tieren nicht beschädigt wurde.

Da erhebliche Unterschiede in der Ladder Leistung und IgG Intensität galten, wurden die beiden korreliert (Abbildung 4). Hier wurde die normalisierten fluoreszente Intensität der IgG-Fläche unter der Kurve von 0-50 µm aus dem Gewebe-Elektrode-Interface für jedes Tier mit dem Durchschnitt der jedes Tier Leiter Leistung im Laufe der Studie korreliert. Ein Korrelationskoeffizient von 0,90 war entschlossen, zeigen eine sehr starke Korrelation zwischen der feinen Motorleistung und Schäden an der Blut - Hirn-Schranke.

Figure 1
Abbildung 1 . Repräsentative Freiland Raster Testergebnisse. (A) dieses Panel zeigt eine Behaviorale Test Setup für ein offenes Feldraster testen (für grobe Motor und Angst zu testen). Freiland-Gitter-Test besteht aus einem 1 m2 Acryl mit 4 Trennwände von 40 cm Höhe und quadratische Unterseite Abschnitte von ca. 33 cm. (B) dieses Panel zeigt die Anzahl der Rasterlinien eine Grobmotorik Leistung gemessen überschritten, im Vergleich zur Standardleistung. Ein signifikanter Unterschied in der Leistung galt zwischen der Kontrolle (n = 10) und die implantierten (n = 17) Gruppen in 2 Wochen nach der Operation (p < 0,05). Als SEM wird alle Fehler gemeldet. Diese Zahl ist von Goss Varley Et Al. nachgedruckt. 27 mit freundlicher Genehmigung von der Nature Publishing Group. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Repräsentative Leiter Testergebnisse. (A) dieses Panel zeigt eine Behaviorale Test Setup für eine Leiter testen (für feine Motorik Tests). Die Leiter besteht aus 2 klare Acryl Seiten von 1 m Länge und 25 cm in der Höhe, Abstand von 2 cm mit einem Durchmesser von 3 mm Edelstahl-Sprossen eine Zwangspause einlegen. (B) dieses Panel zeigt feine Motorik Leistung gemessen an der Zeit, die Leiter, im Vergleich zur Standardleistung zu überqueren. Die Ergebnisse unterhalb der gestrichelten Linie zeigen eine Abnahme der Leistung im Vergleich zu der Basisleistung. Ein signifikanter Unterschied in der Leistung zwischen der Kontrolle entdeckt wurde (n = 10) und die implantierten (n = 17) Gruppen für den postoperativen Wochen 3-16 (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) und längs über die gesamte Studie ( # = p < 0,05). (C) dieses Panel zeigt eine quantifizierte Instanz der rechten Vorderpfote rutscht. Ein signifikanter Unterschied im Auftreten von rechten Vorderpfote rutscht pro Woche entdeckt wurde beim Vergleich der Kontrolle und der implantierten Gruppen (* = p < 0,05). (D) Dies ist ein Beispiel für eine Pfote rutschen. Als SEM wird alle Fehler gemeldet. Diese Zahl ist von Goss Varley Et Al. nachgedruckt. 27 mit freundlicher Genehmigung von der Nature Publishing Group. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Repräsentative Griff-Stärke-Test-Ergebnisse. (A) dieses Panel zeigt eine behavioral testing setup für Griffkraft (für feine Motorik Tests). Das Griff-Stärke-Messgerät besteht aus einer gewichteten Basis mit einem montierten Stärke-Messgerät mit einem Griff Lenker verbunden. (B) dieses Panel zeigt die feine Motorik Leistung, gemessen von der maximalen Grip Stärke ausgeübt Standardleistung verglichen. Die Ergebnisse unterhalb der gestrichelten Linie zeigen eine Abnahme der Leistung im Vergleich zu der Basisleistung. Signifikante Unterschiede zwischen der Kontrolle gesehen wurden (n = 5) und die implantierten (n = 6) Tiere für fast alle postoperativen Wochen (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Weitere Bedeutung galt zwischen den Kontrolltieren Wochen- und Grundlinie Leistungen (# = p < 0,05) und zwischen den implantierten Tiere wöchentlich und Grundlinie Leistungen (## = p < 0,01). Die Kontrolle und die implantierten Tiere durchgeführt längs über die gesamte Studie signifikant verschieden (@@@ = p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Korrelation von IgG und Leiter Performance. Eine normalisierte IgG Fluoreszenzintensität rund um den Ort der Implantation war mit einer Änderung in der Ladder Leistung korreliert, und ein Korrelationskoeffizienten von 0.901 fand (p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Table 1
Tabelle 1. Insgesamt repräsentativen Daten zeigen erhöhen und Abnahme der Leistung im Vergleich zur Baseline-Scores für jede Prüfung Metrik. Die grünen Felder eine Leistungssteigerung, die eine motorische Defizit unwahrscheinlich macht und die roten Kästchen darstellen eine Leistungsminderung die motorischen Defizite wahrscheinlich macht.

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Discussion

Die hier beschriebene Protokoll wurde zur fein- und Grobmotorik motorischen Defizit in einem Modell der Nagetier-Hirn-Trauma effektiv und reproduzierbar zu messen. Darüber hinaus ermöglicht es die Korrelation von feinen motorischen Verhalten zur histologischen Ergebnisse nach einer Mikroelektrode Implantation im motorischen Kortex. Die Methoden sind einfach zu folgen, kostengünstig einzurichten und können geändert werden, um individuelle Bedürfnisse des Forschers. Darüber hinaus verursacht das Verhalten testen großem Stress oder Schmerz zu den Tieren keine; vielmehr glauben die Forscher, dass die Tiere wuchsen die Übung und Belohnungen, die kam mit Tests zu genießen. Frühere Studien haben vorgeschlagen, dass motorische Kortex Motor, Speicher und funktionellen Schäden44,45beschädigen können. Trotz dieses Wissens ist jedoch nur begrenzte Informationen über die funktionellen Beeinträchtigungen, verursacht durch eine Mikroelektrode Implantation in den motorischen Kortex27, die sich negativ auf die klinischen Ergebnisse bei Patienten auswirken könnte.

Änderungen können im gesamten Protokoll, sowohl in den chirurgischen Eingriff Verhalten Tests erfolgen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorgehensweise zum Implantat-Mikroelektroden im motorischen Kortex der Tiere in der Region beeinflussen die Vorderpfoten. Dieses Verfahren kann leicht angepasst werden, um das Implantat, einschließlich Elektroden zur Elektrostimulation46 oder Kanülen für Drug Delivery47oder Art der Verletzungen, darunter ein TBI Modell48variieren. Weitere Änderungen können vorgenommen werden, um die scoring Metrik auf dem Freiland-Gitter-Test und die Leiter Prüfung Apparat. Neben der Anzahl der Gitterlinien gekreuzt die insgesamt zurückgelegte Strecke und die Maximalgeschwindigkeit erreicht, indem das Tier, Zeit stagniert, und die Anzahl der rechten und linken Drehungen kann auch als zusätzliche Parameter der "motor"-Leistung32 aufgezeichnet werden . Im Leiter Test kann Sprossen49 entfernen oder platzieren die Leiter auf eine Steigung50 Schwierigkeit, erhöhen, obwohl mit den aktuellen Implantaten die Autoren nicht dies notwendig, herauskitzeln, feine motorischen Defizite in dieser Anwendung fanden. Schließlich, obwohl der Test Apparat hier vorgestellten konzipiert mit Ratten verwendet werden, könnte die Einheiten nach oben oder unten skaliert werden mit verschiedener Größe Nagetiere eingesetzt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn Probleme auftreten, wo ein Tier nicht in der Lage, die vor der Operation konsequent Tests abgeschlossen ist, das Tier aus der Studie genommen werden sollte.

Wie bei allen Verhaltens testen, ist es wichtig, im Laufe der Studie so konsistent wie möglich bleiben. Es hat sich gezeigt, dass die Testergebnisse variieren können basierend auf der Forscher arbeiten mit Tieren-51, der Speicherort, in dem die Prüfung durchgeführt,52und Umweltfaktoren einschließlich tierischen Gehäuse und Tierhaltung Verfahren53. Darüber hinaus hat Forschung große Variabilität gezeigt bei der Herstellung einer Hirnverletzung im Wege der Schädel, die Heizung während einer Kraniotomie Verfahren31 und Modelle der TBI einschließlich der Gewicht-Drop Modell54 und mechanische Variation in einer kontrollierten kortikalen Auswirkungen Modell55. Forscher nehmen daher besonderen Sorgfalt auf ihre Kohärenz in den chirurgischen Eingriff, Tests und Wohnverhältnisse und Prüfpersonal, unter anderem.

Zukünftige Richtungen diese Testmethoden Verhalten könnte zu erweitern auf die Tests hier vorgestellt, um genauere Ergebnisse zu erzielen. Beispielsweise könnte ein Wasser-Labyrinth-Test oder ein Rotor Stab Test aufgenommen werden, um weiter Angst56 zu extrahieren oder grobe Motorik57 Defizite, beziehungsweise. Darüber hinaus könnten zukünftige Arbeit auch sollen die Gewebeschädigung durch ein Gerät einschieben im Gehirn verursacht. Aktuelle Arbeit in diesem Bereich konzentriert sich auf die Eindämmung der Entzündung durch Anti-oxidative Behandlungen42,58, mechanisch kompatibel Implantate41,59,60, die Hemmung der der angeborenen Immunität Weg14,15-Signalisierung und Reduzierung von Gefäßschäden während ein Gerät Implantation31,61.

Schließlich ist davon auszugehen, dass die aktuelle Arbeit abgeschlossen wurde mit gesunden, Jugendkriminalität, männliche Ratten, die nicht unbedingt die Eigenschaften des typischen menschlichen Patienten erhalten eine Gehirn-Implantat verkörpern. Zusätzliche Forschung erforschen weiter feine und grobe Motorik Aufgaben in charakteristischen Krankheitsmodelle ist erforderlich, um die hier vorgestellten Ergebnisse zu ratifizieren. In unterschiedlichen Krankheitsmodelle erfordern Unterschiede zwischen Tieren implantiert und nicht implantierten Schein die oben genannten Änderungen an Bedingungen zu testen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Studie wurde teilweise durch den Verdienst Review Award #B1495-R (Capadona) und die Presidential Early Career Award für Wissenschaftler und Ingenieure (PECASE, Capadona) aus den Vereinigten Staaten (US) Veteranen Angelegenheiten Rehabilitation Forschungsabteilung unterstützt und Entwicklungsdienst. Darüber hinaus wurde diese Arbeit vom Amt des Assistant Secretary Of Defense for Health Affairs durch das Peer überprüft medizinische Forschungsprogramm unter Award Nr. teilweise unterstützt. W81XWH-15-1-0608. Den Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des US-Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten. Die Autoren möchte Dr. Hiroyuki Arakawa in der Home-Nagetier Verhalten Kern für seine Führung im entwerfen und Testen von Nagetier Verhaltens Protokolle zu danken. Die Autoren möchten auch James Drake und Kevin Talbot vom Department of Mechanical Home- und Luft-und Raumfahrttechnik Danke für ihre Hilfe bei der Entwicklung und Herstellung von Nagetier Leiter Test.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225g Charles River CD
Compac5 anesthesia system Vetequip 901812
Electric trimmers Wahl 9918-6171
Stereotaxic frame David Kopf Instruments 1760
Gaymar heated water pad and pump Braintree Scientific Inc  TP-700
Vetbond tissue adhesive 3M 07-805-5031
Dental drill Pearson Dental O60-0045
Dura pick Fine Science Tools 10064-14
Silicon shank microelectrode Made in-house at Cleveland VA Medical Center N/A
KwikCast silicone elastomer World Precision Instruments KWIK-CAST
Teets dental cement  A-M Systems 525000
Webcam HD Pro c920 Logitec 960-000764
Grip strength meter Harvard Apparatus 565084
Minitab 17 statistical software Minitab Inc
Open field grid test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Ladder test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Rabbit anti rat IgG antibody Bio-Rad 618501

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