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Bioengineering

Comportamentais de testes para avaliar déficits funcionais causados pela implantação de microeletrodos no córtex Motor rato roedor

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/57829
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Advanced Platform Technology Center, Rehabilitation Research and Development, Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Mostramos que uma implantação de microeletrodos no córtex motor de ratos provoca déficits motor imediatos e duradouros. Os métodos propuseram neste documento contorno uma cirurgia de implante de microeletrodos e três roedores tarefas comportamentais para elucidar possíveis alterações na função motor fina ou bruta devido aos danos causados a implantação para o córtex motor.

Abstract

Dispositivos médicos implantados no cérebro têm enorme potencial. Como parte de um sistema de Interface de máquina cerebral (IMC), intracortical microeletrodos demonstram a capacidade de gravar os potenciais de ação de individuais ou pequenos grupos de neurônios. Tais sinais gravados com êxito tem sido usados para permitir pacientes para interface com ou controlar seus próprios membros, membros robóticos e computadores. No entanto, estudos anteriores com animais mostraram que uma implantação de microeletrodos no cérebro não só danifica o tecido circundante, mas também pode resultar em déficits funcionais. Aqui, vamos discutir uma série de testes comportamentais para quantificar potenciais deficiências motor seguindo a implantação de microeletrodos intracortical no córtex motor de um rato. Os métodos para a grade de campo aberto, cruzamento de escada e testes de resistência de aderência fornecem informações valiosas sobre as potenciais complicações resultantes de uma implantação de microeletrodos. Os resultados dos testes comportamentais estão correlacionados com histologia de ponto de extremidade, fornecendo informações adicionais sobre os resultados patológicos e os impactos deste procedimento no tecido adjacente.

Introduction

Microeletrodos intracortical foram originalmente usados para mapear os circuitos do cérebro e desenvolveram-se em uma valiosa ferramenta para habilitar a detecção de intenções motor que pode ser usado para produzir saídas funcional1. Saídas funcionais detectadas podem oferecer a indivíduos que sofrem de lesões na medula espinhal, paralisia cerebral, esclerose lateral amiotrófica (ela) ou outras condições de limitação de movimento do controle de um cursor de computador2,3 ou robótica 4,5,6do braço, ou restaurar a função própria de membro com deficiência7. Portanto, tecnologia de microeletrodos intracortical tem emergido como um promissor e rapidamente crescente campo8.

Devido o sucesso visto no campo, estudos clínicos estão em andamento para melhorar e entender melhor as possibilidades de BMI tecnologia5,9,10. Por perceber o potencial de comunicação com os neurônios no cérebro, as aplicações de reabilitação são percebidas como ilimitado8. Embora haja grande optimismo para o futuro da tecnologia de microeletrodos intracortical, também é bem conhecido que microeletrodos eventualmente falharem11, possivelmente devido a uma resposta aguda MPTP pós-implante. A implantação de um material estranho no cérebro resulta em danos imediatos para os tecidos circundantes e leva a mais danos causados por MPTP resposta que varia de acordo com propriedades do implante12. Além disso, um implante no cérebro pode causar um efeito de microlesion: uma redução no metabolismo da glicose, pensado para ser causado por edema agudo e hemorragia devido a inserção de dispositivo13. Além disso, a qualidade de sinal e o comprimento de tempo que os sinais úteis podem ser registrados são inconsistentes, independentemente do modelo animal11,14,15,16. Vários estudos têm demonstrado a conexão entre neuroinflammation e microeletrodos desempenho17,18,19. Portanto, o consenso da Comunidade é que a resposta inflamatória do tecido neural que rodeia os microeletrodos, pelo menos em parte, compromete a confiabilidade do eletrodo.

Muitos estudos têm examinado a inflamação local11,20,21,22 ou explorado métodos para reduzir os danos ao cérebro causado por inserção11,23, 24,25, com o objetivo de melhorar o desempenho de gravação ao longo do tempo14,26. Além disso, nós recentemente mostraram que uma lesão iatrogênica causada por uma inserção de microeletrodos no córtex motor de ratos provoca uma imediata e duradoura déficit motor bem27. Portanto, o objetivo dos protocolos aqui apresentados é dar pesquisadores um método quantitativo para avaliar possíveis déficits motor como resultado de trauma crânio-encefálico após a implantação e a presença persistente de dispositivos intracortical (microeletrodos na caso deste manuscrito). Os testes de comportamento descritos aqui foram projetados para destrinchar ambas as deficiências da motricidade grosseira e fina e podem ser usados em muitos modelos de lesão cerebral. Esses métodos são simples, reprodutível e podem ser facilmente implementados em um modelo de roedor. Além disso, os métodos aqui apresentados permitem uma correlação de comportamento motor para resultados histológicos, um benefício que, até recentemente, os autores não vi publicada no campo de IMC. Finalmente, como esses métodos foram projetados para testar a função motora fina28, a função motora bruta29e stress e ansiedade comportamento29,30, os métodos apresentados aqui também podem ser implementados em uma variedade de modelos de ferimento na cabeça, onde os investigadores querem governar para fora (ou em) eventuais déficits de função motora.

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Protocol

Todos os procedimentos e práticas de cuidados com animais foram aprovadas pela e realizadas em conformidade com o Louis Stokes Cleveland departamento de veteranos dos Assuntos centro institucional Animal cuidados médicos e comissões de utilização.

Nota: Para educar os pesquisadores sobre a decisão sobre o uso de um modelo de ferimento de facada como um controle, recomenda-se revisar o trabalho feito por Potter et al 21.

1. procedimento cirúrgico de implantação de microeletrodos

  1. Preparação pré-cirúrgica de animais
    1. Anestesia o animal em uma câmara de indução utilizando isoflurano (2-4%). Enquanto sob anestesia, Monitore continuamente o animal usando um sistema de medição vital para monitorar a frequência cardíaca e o conteúdo de oxigênio do sangue.
    2. Mova o animal para um cone de nariz para continuar o anestésico. Por via subcutânea (SQ) injectar um antibiótico de cefalosporina, por exemplo, cefazolina (25 mg/kg) e um anti-inflamatório não-esteroide, por exemplo, o carprofeno (5 mg/kg) para prevenir a infecção e controlar a dor, respectivamente.
    3. Liberalmente aplica pomada oftálmica aos olhos do animal para impedi-los de secagem.
    4. Usando o cortador de unhas de animais pequenos, apare as unhas dos pés para impedir que o animal coçar as suturas durante a cicatrização de feridas. Certifique-se de que as unhas não são cortadas muito curtos, como isso pode levar a dor e sangramento para o animal.
    5. Rapar a cabeça do animal completamente por trás das orelhas para entre os olhos usando um aparador barbeador elétrico.
    6. Fornece uma analgesia local com uma injeção SQ de bupivacaína (0,3 mL de bupivacaína a 0,125% diluída da solução-mãe) na parte superior da cabeça do animal na área da incisão.
    7. Monte o animal em uma armação estereotáxica, usando barras de orelha para manter a cabeça de mover-se durante a cirurgia. Coloque uma almofada sob o animal para manter a temperatura interna do animal de aquecimento de água circulante.
    8. Aplica um pano estéril, por exemplo, aprovado institucionalmente estéril envoltório plástico, para isolar o campo cirúrgico.
    9. Esfregue a área cirúrgica, usando uma solução de betadine alternados e isopropanol scrubs.
    10. Execute uma pitada de dedo do pé de acordo com o protocolo institucional para garantir que o animal está sob o plano cirúrgico.
  2. Preparar o animal para implantação
    1. Crie uma incisão de aproximadamente 1 em baixo da linha média, expondo o crânio usando uma lâmina de bisturi n º 10. Sem rodeios remover o periósteo usando um aplicador com ponta de algodão e parar qualquer sangramento usando uma gaze esterilizada. Retrair o tecido circundante usando clipes de crocodilo e limpar e desidratar o crânio com peróxido de hidrogênio.
    2. Coloque algumas gotas de cola de tecido à base de cianoacrilato no crânio exposto para melhorar o cimento dental, colagem em etapas posteriores.
    3. No hemisfério escolhido, marca a região do córtex motor correspondente ao movimento de pata dianteira aproximadamente 3 mm laterais à linha mediana e 2 mm à frente do bregma criando um nick no osso.
    4. Remova uma parte do crânio com uma broca de dentista 1,75 mm ponta arredondada, tomando especial atenção para não furar demasiado depressa ou demasiado profundamente e apoiando uma mão na armação estereotáxica. A broca deve ser aplicada ao crânio intermitentemente para evitar sobreaquecimento31.
    5. Refletir a dura-máter usando uma picareta de dura-máter bem viciado 45°.
    6. Limpe qualquer sangramento usando um cotonete e soro fisiológico, tendo o cuidado de não diretamente toque a superfície do cérebro.
  3. Inserção de microeletrodos no córtex motor
    1. Monte cuidadosamente o microeléctrodo esterilizado no suporte universal na armação estereotáxica, tomando cuidado para não bater a pata do eléctrodo. Certifique-se de que o conector de interface headstage do eléctrodo está firmemente mantido pelo titular.
      Nota: Aqui, utilizou-se um eletrodo haste de silicone Michigan-estilo não-funcional medindo 2 mm x 123 µm x 15 µm, e a haste foi inserida usando pinça fina.
    2. Usando os Micromanipuladores na armação estereotáxica, cuidadosamente Posicione a ponta do eletrodo sobre a craniotomia aberta.
    3. Desça cuidadosamente o eletrodo de aproximadamente 2 mm para o cérebro usando os Micromanipuladores como um guia de medição (dependendo a escolha de eletrodo, uma inserção automatizada em taxas controladas pode ser necessária.) Tenha cuidado para evitar qualquer vasculatura visível sempre que possível. Quando o eletrodo está no lugar, cuidadosamente, liberar o conector do suporte universal e retrai o braço da inserção.
    4. Limpe cuidadosamente qualquer sangramento ao redor do eletrodo usando um cotonete e solução salina.
    5. Sele a craniotomia em torno do eletrodo implantado usando um elastómero de silicone.
    6. Fixe o eletrodo no crânio usando cimento dental.
    7. Uma vez que o cimento é completamente seco, juntar as bordas da incisão na parte da frente e de trás o dorso de cimento e sutura-los Calem.
  4. Cuidados pós-operatórios
    1. Permitir que o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento enquanto continua a monitorar seus sinais vitais de água de circulação. Evite usar lâmpadas de calor, como a temperatura das lâmpadas é mais difícil de controlar e animais podem superaquecer.
    2. Uma vez que o animal está totalmente acordado, mova o animal para uma gaiola limpa, com fácil acesso à comida e água.
    3. Durante dias pós-operatórios 1-3, fornece os animais com antibiótico de cefalosporina SQ (25 mg/kg) e um anti-inflamatório não-esteroide (5 mg/kg) para prevenir a infecção e controlar sua dor.
    4. Monitore os animais diariamente para os sinais de dor ou desconforto, sangramento, mudança de peso ou problemas de sutura através de pelo menos pós-operatória dia 5.

2. teste comportamentais

  1. Para todos os testes de comportamento, teste os animais 2 x por teste na semana antes da cirurgia de implante de eletrodo para calcular suas notas de base pré-cirurgia. Após a cirurgia, permitir que os animais possam descansar por 1 semana antes de iniciar o teste 2x por semana em cada teste de comportamento. Condições de testes consistentes devem ser usadas ao longo do estudo para pré e pós-cirúrgico testes para minimizar os efeitos do stress sobre o desempenho, o que poderia resultar em uma medida de ansiedade.
    1. Limpe o equipamento de teste tudo com um esterilizante baseado no dióxido de cloro no início de cada sessão de teste e depois de cada animal.
    2. Filme a grade de campo aberto e teste de escada. Esses testes exigem uma câmera de vídeo (1080p, mínimo de 15 fps, 78° diagonal campo de visão), um laptop e espaço para armazenar os dados de vídeo.
    3. No início de cada dia de teste, trazer os animais para a sala de testes e permitir-lhes aclimatar-se durante pelo menos 20 minutos antes de começar o teste. O quarto deve ser leve e temperatura controlada, e o mesmo pessoal deve completar todos os testes. Idealmente, a mesma sala será usada para todos os animais ao longo do curso dos testes sem alterações para o quarto.
    4. Uso alimentar recompensas para encorajar os animais para completar as tarefas, especialmente durante o treinamento de escada. Cereais ou pequenos pedaços de microplaquetas da banana ou biscoitos fazem boas recompensas.
    5. Normalize todas as performances de testes semanais para o golo de pre-cirurgia para cada animal (equação 1).
      Equação 1:Equation 1
  2. Abrir campo grade testes
    Nota: O teste de rede de campo aberto foi construído internamente e tem uma superfície de 1 m2 , com aproximadamente 40 cm alta opaco laterais. O fundo executando a superfície da grade é dividido em 9 quadrados iguais da face inferior usando fita (Figura 1A). A câmera de gravação é fixada acima do centro da grade no andaime.
    1. Para começar o teste da grade de campo aberto, coloque o animal no centro da grade de costas para o testador.
    2. Permitir que o animal executar livremente por 3 min, durante a gravação de um vídeo.
    3. Quando o animal foi concluído o teste, retire o animal da grelha e devolvê-lo para a gaiola. Limpe a grade completamente com esterilizante baseado no dióxido de cloro.
    4. Teste cada animal 1 x por dia de teste.
    5. Analise o número de linhas de grade cruzadas a distância total percorrida e a velocidade máxima do animal como métricas da função motora bruta usando um software de monitoramento de vídeo.
      Nota: Os dados aqui apresentados foram quantificados manualmente por pesquisadores treinados, mas é preferível usar um recentemente desenvolvido in-house algoritmo32de rastreamento.
  3. Teste de escada
    Nota: O teste da escada foi construído internamente e consiste em 2 paredes de acrílico transparente laterais, cada 1 m de comprimento, ligado por degraus de 3 mm de diâmetro espaçados de 2 cm de distância(Figura 2). Escada de teste é um teste qualificado e, portanto, requer 1 semana de treinamento antes da gravação as pontuações de base pré-cirurgia. O protocolo para o treinamento e o teste é o mesmo.
    1. Mova o animal para uma gaiola de contenção temporária limpa para iniciar os testes de escada.
    2. Configurar a escada para que lo pontes 2 gaiolas. Início e fim da escada baseia-se em uma gaiola limpa, e o acabamento final baseia-se na gaiola de casa do animal para servir como uma motivação para completar a corrida.
    3. Posicione a mesma (ou similar) câmara de vídeo em um tripé no centro da escada. A posição da câmera deve ser a altura do degrau e permitir a escada inteira para ser visto.
    4. Com a câmera rodando, segure o animal à linha de partida da escada, permitindo que suas patas dianteiras tocar o primeiro degrau.
    5. Permitir que o animal cruzar a escada em seu próprio ritmo. O tempo decorrido entre o momento quando a pata do animal toca o primeiro degrau e a linha de chegada em terceiro ao último degrau determinará tempo do animal para atravessar.
    6. Se o animal se vira na escada ou não se move por um período de 20 s, considerar o animal ter falhado a fugir. Atribua os animais uma penalidade marcar tempo para cada falha executar. Determine o tempo de pena pelo desempenho mais lento gravado durante pré-cirurgia teste27.
    7. Permitir que cada animal cruzar a escada 5 x por dia com aproximadamente 1 minuto de descanso entre cada execução de teste.
    8. Média as mais rápidas 3 corridas por dia como uma métrica de motricidade fina. Além disso, registre o número de vezes que cada um da frente patas escorregar os degraus usando um software de monitoramento de vídeo.
      Nota: Os dados aqui apresentados foram quantificados manualmente por pesquisadores treinados, mas é preferível usar um algoritmo recentemente desenvolvido in-house rastreamento usando Dona et al 32.
  4. Teste de resistência de aderência
    1. Calibrar o medidor de força de aperto antes de cada sessão de teste e medir a força em gramas.
    2. Posição do medidor de força de aperto na borda de um contador com o guidão aperto estendido no chão.
    3. Permitir que o animal agarrar o guidão com as duas patas da frente, mantendo o animal pela base da cauda(Figura 3).
    4. Uma vez que o animal tem um aperto firme com cada pata, puxe o animal longe o medidor pela base da cauda com força lenta e constante.
    5. Grave a força de preensão máxima exercida pelo animal que é exibido sobre o digital de saída do medidor de força de aperto.
    6. Teste cada animal 3 x por dia com cerca de 2 min de descanso entre cada teste de teste.
    7. Como uma métrica de motricidade fina, gravar e média da força de preensão máxima de saída de cada um dos 3 testes.

3. pós-comportamental protocolo

  1. Seguindo tudo comportamental testes (por exemplo, 8-16 semanas após a implantação), anestesiar os animais usando profundamente cetamina (160 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg), transcardially perfuse-los, colher seus cérebros e cryo-fatia-los e manchar o tecido usando marcadores imuno-histoquímicos para quantificar a resposta celular ao redor do local de implantação33,34,35,36,37,38.

4. análise estatística

Nota: Uma análise do poder em perspectiva é fortemente sugerida para quaisquer estudos buscando responder a uma pergunta de investigação particular. A análise do poder, que informa o número de animais necessários para alcançar uma significância estatística para um projeto de estudo particular, deve basear-se na hipótese de investigação particular, o projeto do experimento, o tamanho do efeito estimado e variabilidade de os tratamentos se destina, como bem o efeito tamanho necessário para conseguir relevância clínica ou científica.

  1. Realizar análises estatísticas usando o software estatístico comum.
  2. Tabulate a estatística descritiva e exibi-los como média ± erro padrão.
  3. Analise o desempenho comportamental [na grade do campo aberto (passo 2.2), escada (passo 2.3) e aperto teste de força (passo 2.4)] em cada ponto de tempo semanal para comparar os grupos de controle vs implantado usando um teste t de duas amostras. Considere cada ponto de tempo semanal uma medida independente.
  4. Quantificar o desempenho longitudinal, usando um modelo linear de efeito misturado. A semana e o grupo são fatores e um animal experimental está aninhado dentro do grupo como um efeito aleatório. Análise de variância (ANOVA) é usado para determinar o efeito do fator com nível de significância de 0,05 < p .
  5. Compare o desempenho de escada com intensidade de imunoglobulina G (IgG) usando uma análise de regressão linear. Calcule o coeficiente de correlação pelo método de um Pearson.

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Representative Results

Usando os métodos apresentados aqui, uma cirurgia de implante de microeletrodos no córtex motor é concluído seguir procedimentos estabelecidos39,40,41,42, seguido pelo teste da grade de campo aberto para avaliar a função motora bruta e escada e aperto força testes para avaliar o motor bem função27. Teste de função motora foi concluído 2 x por semana para pós-cirurgia de 16 semanas em animais implantados, com os animais não implantados sem cirurgia como um controle. Todas as partituras de pós-operatório foram em média por semana e normalizadas para o golo de pre-cirurgia de base de cada animal. Todo erro é relatado como o erro padrão da média (SEM).

Para medir sua função motora bruta e salientar o comportamento, os animais foram autorizados a funcionar livremente em um teste de rede de campo aberto por 3 min (Figura 1A). Várias métricas de teste podem ser gravadas, incluindo o número de grade linhas se cruzam, a distância total percorrida, e a velocidade máxima alcançada pelo animal. Esses dados anteriormente relatados, o número de linhas de grade cruzadas é apresentado27. Na primeira semana após o período de recuperação (o Commit de 2 semanas), uma diferença significativa foi vista no desempenho de rede de campo aberto entre os 2 grupos. No entanto, não havia nenhum significado adicional em todo o restante do estudo (Figura 1B). O controle e animais microeletrodos implantados marcaram similarmente durante todo o teste, e a variação no desempenho foi relativamente alta em ambos os conjuntos de animais. Nenhum significado foi visto quando se compara o desempenho de rede de campo aberto em ambos os conjuntos de animais em todo o tempo experimental. Porque não havia nenhuma diferença no desempenho entre os 2 grupos de animais, este resultado foi interpretado para indicar que não há nenhum déficit motor bruto ou severamente limitando estresse causado por uma implantação de microeletrodos na córtex motor27. Ao interpretar os dados, cruzou uma diminuição no número de linhas de grade, a distância total percorrida, ou a velocidade máxima alcançada pelo animal todos indicam uma diminuição em sua função motora bruta (tabela 1).

Para medir o alcance coordenada e função motora fina, animais participaram de um teste de escada horizontal(Figura 2)onde o tempo que levou o animal para cruzar a escada e a frequência de pata deslizamentos foram registrado. Tempos de travessia de pós-operatório escada foram normalizados para cada animal para pontuações do cada animal pré-cirurgia. Portanto, uma porcentagem positiva coincide com uma diminuição no tempo de atravessar a escada e um aumento de desempenho, e uma porcentagem negativa coincide com um aumento no tempo de atravessar a escada e uma diminuição do desempenho (Figura 2B, Tabela 1).

Em dados relatados anteriormente, os animais de controle, não tendo recebido nenhum implante, exibido o desempenho mais lento vezes (82,6 ± 26,0%) durante a primeira semana de pós-operatório, teste imediatamente após a recuperação de fase27. Começando na segunda semana de pós-operatório escada de teste, os animais controle retomou seus tempos de desempenho de linha de base e mantiveram pontuações comparáveis às suas notas de base ao longo do estudo, com muito pouca variação.

Os animais recebendo um microeléctrodo intracortical viram uma cirurgia seguir imediatamente de desempenho reduzido. Estes animais demonstraram uma aumentada escada cruzando tempo em comparação com sua linha de base de 199,1 ± 61,4% na primeira semana de teste depois da cirurgia. Os animais implantados exibido um desempenho reduzido para a duração do estudo e seu desempenho não retornou para seus resultados de linha de base. No seus piores, implantados animais diminuíram no desempenho durante a semana de 11 a uma média de 526,9 ± 139.4% em relação ao seu desempenho de linha de base. Além disso, os animais implantados mostraram uma variação maior em comparação com os animais controle. Não houve nenhuma diferença significativa entre o controle e animais implantados durante a primeira semana de testes. No entanto, uma diferença significativa na mudança por cento em comparação com os tempos de linha de base foi vista entre os grupos em todas as semanas no estudo (p < 0,05) (Figura 2B).

Mais uma prova da deficiência motora fina foi demonstrada pela frequência da pata direita da frente desliza entre os 2 grupos de animais. O desempenho da pata direita da frente foi de particular interesse porque microeletrodos foram implantados no hemisfério esquerdo do cérebro na região do córtex motor, responsável pelo controle de pata dianteira. Por meticuloso análise de vídeo, pata deslizamentos foram narrados e quantificados (Figura 2C). Enquanto não há diferenças significativas foram vistas na frequência dos deslizamentos pata esquerda, verificou-se que os animais implantados experimentaram significativamente mais pata direita da frente desliza em comparação com os animais controle (uma média de 0,54 ± 0,07 pata direita da frente desliza por semana na os animais implantados em comparação com uma média de 0,32 ± 0,02 frontal direito pata desliza por semana nos animais controle). Ao interpretar os dados, um aumento no tempo de atravessar a escada ou um aumento no número de deslizamentos de pata indica uma diminuição na função motora fina (tabela 1).

Como medida secundária de alcance coordenada e função motora fina, os animais completou um teste de força de aperto(Figura 3)onde a força de preensão máxima exercida pelos animais foi gravada. Golo de aderência semanal individual do animal foram normalizados para a sua força de aderência de base pré-cirurgia. Foi visto que a força de preensão de pós-operatório dos animais implantado foi significativamente reduzida em comparação com os controle dos animais em quase todos os pontos do tempo de pós-operatório. (Figura 3B). Força de preensão dos animais controle melhorou após a pré-cirurgia teste, provavelmente devido ao efeito de treinamento. Além disso, a força de preensão dos animais controle foi significativamente maior do que a linha de base no decorrer do estudo (p < 0,05). Curiosamente, desempenho de força de aperto dos animais implantado foi significativamente pior do que a linha de base (p < 0,01) na primeira semana de testes após a fase de recuperação, mas lentamente retornou para o seu desempenho de linha de base. Digno de nota, uma diminuição da força de preensão máxima alcançada pelo animal indica uma diminuição na função motora fina (tabela 1).

Vários marcadores histológicos podem ser usados para visualizar o microambiente perto de um implante de cérebro, incluindo núcleos neuronais, astrócitos e estabilidade da barreira hemato - encefálica. Aqui, realizamos a imuno-histoquímica mancha para IgG, uma proteína do sangue comum não comumente encontrada no cérebro. Trabalhos anteriores mostraram que IgG é um indicador útil da integridade da barreira hemato - encefálica, pois é um anticorpo no sangue e normalmente não presentes no cérebro16,18e, portanto, a presença de IgG nos tecidos cerebrais circundantes pode ser correlacionada com a integridade da barreira hemato - encefálica43. Aqui, intensidade de fluorescência de IgG foi normalizada para o tecido cerebral de fundo e quantificados começando no limite do buraco explantação eletrodo e movendo-se para fora em tulhas concêntricas até IgG já não estava presente no tecido. Os animais implantados mostraram um aumento significativo na intensidade de IgG perto do furo para fora a 150 µm, em comparação com os animais controle. A intensidade de IgG nos animais implantados voltou gradualmente a intensidade de fundo sobre a distância que irradia a partir do orifício de microeletrodos implantados. Nos animais controle, nunca tendo sido implantados com um microeléctrodo, a intensidade de IgG normalizada não estava presente em quantidades significativas, acima da intensidade de fundo como a barreira sangue - cérebro não foi danificada nesses animais.

Porque diferenças significativas foram vistas no desempenho de escada e intensidade de IgG, os dois foram correlacionados (Figura 4). Aqui, a intensidade fluorescente normalizada da área sob a curva de 0-50 µm a partir da interface de tecido-eletrodo para cada animal de IgG foi correlacionada com a média de desempenho de cada animal escada ao longo do estudo. Determinou-se um coeficiente de correlação de 0,90, demonstrando uma forte correlação entre o desempenho motor fino e danos para a barreira hemato - encefálica.

Figure 1
Figura 1 . Resultados do teste de campo aberto representante grade. (A), este painel mostra uma configuração de teste comportamental para uma grade de campo aberto de teste (para motor bruto e teste de ansiedade). O teste de rede de campo aberto consiste de uma folha de acrílico 1 m2 com 4 paredes opacas de 40 cm de altura e seções de fundo quadrado de aproximadamente 33 cm cada. (B), este painel mostra um função motora bruta o desempenho medido pelo número de linhas de grade cruzados, em comparação com o desempenho da linha de base. Uma diferença significativa no desempenho foi vista entre o controle (n = 10) e o implantado (n = 17) grupos no pós-operatório de 2 semanas (p < 0,05). Todo erro é relatado como SEM. Esta figura é reproduzida a partir de Goss-Varley et al 27 com a permissão do Nature Publishing Group. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Resultados do teste de escada representativa. (A), este painel mostra uma instalação de teste comportamental para uma escada de teste (para testar a função motora fina). A escada é composto por 2 claro acrílicos lados de 1 m de comprimento e 25 cm de altura, acompanhado por aço inoxidável degraus espaçados em 2 cm com um diâmetro de 3 mm. (B) este painel mostra o desempenho de função motora fina, medido pelo tempo de atravessar a escada, em comparação com o desempenho da linha de base. Os resultados abaixo da linha tracejada indicam uma diminuição no desempenho em comparação com o desempenho da linha de base. Descobriu-se uma diferença significativa no desempenho entre o controle (n = 10) e o implantado (n = 17) grupos nas semanas de pós-operatório 3-16 (* = p < 0.05, * * = p < 0,01) e longitudinalmente em toda a estudar ( # = p < 0,05). (C), este painel mostra uma instância quantificada da pata dianteira direita desliza. Descobriu-se uma diferença significativa na ocorrência da pata dianteira direita desliza por semana quando comparando o controle e os grupos implantados (* = p < 0,05). (D) este é um exemplo de um deslizamento de pata. Todo erro é relatado como SEM. Esta figura é reproduzida a partir de Goss-Varley et al 27 com a permissão do Nature Publishing Group. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Resultados de teste de força de aperto representativa. (A), este painel mostra um teste comportamental setup para força de preensão (para testar a função motora fina). O medidor de força de aperto consiste de uma base ponderada com um medidor de força montada conectado a um guiador de aperto. (B), este painel mostra o desempenho da função motora fina, medido pela força de preensão máxima exercida em comparação com o desempenho da linha de base. Os resultados abaixo da linha tracejada indicam uma diminuição no desempenho em comparação com o desempenho da linha de base. Viam-se diferenças significativas entre o controle (n = 5) e o implantado (n = 6) animais por semanas quase tudo pós-cirúrgica (* = p < 0.05, * * = p < 0,01, * * * = p < 0,001). Mais importância foi vista entre apresentações de base semanal dos animais controle (# = p < 0,05) e entre performances de semanais e linha de base dos animais implantados (# # = p < 0,01). O controle e os animais implantados realizaram significativamente diferentes longitudinalmente através o estudo inteiro (@ @ @ = p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Correlação do desempenho IgG e escada. Uma intensidade de fluorescência IgG normalizada em torno do local de implantação correlacionou-se com uma mudança no desempenho da escada, e um coeficiente de correlação de 0.901 foi encontrado (p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Table 1
Tabela 1. Global dados representativos do comportamento mostrando aumentar e diminuir no desempenho em comparação com golo de linha de base para cada métrica de teste. As caixas verdes representam um desempenho melhorado que torna improvável um déficit motor, e as caixas vermelhas representam uma diminuição do desempenho que torna provável a déficits de função motora.

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Discussion

O protocolo descrito aqui tem sido usado para efetivamente e reproducibly medir déficit motor fino e bruto em um modelo de lesão cerebral de roedores. Além disso, permite a correlação de comportamento motor fino a resultados histológicos pós-implante um microeléctrodo no córtex motor. Os métodos são fáceis de seguir, barato para configurar e podem ser modificados para atender às necessidades individuais do pesquisador. Além disso, os testes de comportamento não causa grande stress ou dor aos animais; em vez disso, os pesquisadores acreditam que os animais cresceram para desfrutar do exercício e recompensas que veio com o teste. Estudos anteriores sugeriram que o córtex motor danos podem causar danos funcionais44,45, memória e motor. No entanto, apesar desse conhecimento, há informações limitadas sobre o impacto funcional causada por uma implantação de microeletrodos na córtex motor27, que poderia afetar negativamente os resultados clínicos em pacientes.

As modificações podem ser feitas em todo o protocolo, o procedimento cirúrgico e em testes o comportamento. Este protocolo descreve o procedimento para implante de microeletrodos no córtex motor de animais na região, afetando as dianteiras. Este procedimento pode ser facilmente adaptado para variar o implante, incluindo eletrodos para estimulação elétrica46 ou cânulas para drogas entrega47, ou o tipo de lesão, incluindo um TBI modelo48. Outras modificações podem ser feitas para as métricas de Pontuação utilizadas no teste da grade de campo aberto e a escada, aparelhos de teste. Além do número de linhas de grade cruzados, a distância total percorrida e a velocidade máxima alcançada pelo animal, o tempo gasto estagnado e o número de voltas de direita e esquerdas também pode ser registado como parâmetros adicionais de desempenho motor32 . No teste da escada, removendo os degraus49 ou colocar a escada em um declive de50 pode aumentar dificuldade, embora com os implantes atuais os autores não encontraram isto necessário para destrinchar déficits motor bem nesta aplicação. Finalmente, embora o aparelho de teste aqui apresentado foram projetado para ser usado com ratos, as unidades poderiam ser escaladas acima ou para baixo para ser usado com vários tamanho de roedores. É importante observar que, caso surjam questões onde um animal não é capaz de completar a pré-cirurgia testes consistentemente, o animal deve ser removido do estudo.

Como com todos os testes comportamentais, é fundamental para manter-se tão coerente quanto possível ao longo do estudo. Tem sido demonstrado que os resultados de teste podem variar baseado no pesquisador que trabalha com os animais,51, o local em que o teste é realizado52e fatores ambientais, incluindo animais alojamento e criação de procedimentos53. Além disso, a pesquisa mostrou grande variabilidade na produção de uma lesão cerebral por meio de aquecimento durante um procedimento de craniotomia31 e modelos de TCE, incluindo a queda de peso modelo54 e variação mecânica em um controlado cortical de crânio impacto do modelo55. Pesquisadores devem, portanto, tomar cuidado especial para manter a consistência no procedimento cirúrgico, teste e condições de habitação e no teste pessoal, entre outros.

Sentidos futuros destes métodos de ensaio de comportamento poderiam expandem os testes aqui apresentados para fornecer resultados mais minucioso. Por exemplo, um teste de labirinto de água ou um teste de vara de rotor poderia ser incorporado para mais extrair ansiedade56 ou bruta défices de57 a função motora, respectivamente. Além disso, trabalho futuro pode também visam reduzir os danos do tecido causado por uma inserção de dispositivo no cérebro. Trabalho atual nesta área centrou-se na redução da inflamação através de tratamentos antioxidante42,58, mecanicamente compatível com implantes41,59,60, a inibição da inata imunidade, sinalizando o caminho14,15e reduzir os danos vasculares durante uma implantação de dispositivo31,61.

Por último, deve-se considerar que o trabalho atual foi concluído usando ratos saudáveis, juvenis, masculinos, que não necessariamente incorporam as características do paciente humano típico receber um implante cerebral. Explorar ainda mais as tarefas da função motora fina e bruta em modelos característicos da doença a pesquisa adicional é necessária para ratificar os resultados aqui apresentados. Em diferentes modelos de doença, as diferenças entre animais Souza implantado e não implantados podem exigir as modificações acima mencionadas para testar condições.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado em parte pela revisão de mérito #B1495-R (Capadona) e o Prêmio presidencial de carreira precoce para cientista e engenheiros (PECASE, Capadona) dos Estados Unidos (EUA) departamento de veteranos dos assuntos reabilitação pesquisa e Serviço de desenvolvimento. Além disso, este trabalho foi financiado em parte pela estância de assistente de defesa para assuntos de saúde, através de Peer revisão médica programa de pesquisa sob n º prêmio W81XWH-15-1-0608. O conteúdo não representam a opinião do departamento dos EUA de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos. Os autores gostaria de agradecer o Dr. Hiroyuki Arakawa no núcleo de comportamento do roedor CWRU para sua orientação em projetar e testar protocolos comportamentais roedores. Os autores também gostaria de agradecer sua ajuda na concepção e fabrico no teste de roedores escada James Drake e Kevin Talbot do CWRU departamento de mecânica e engenharia aeroespacial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225g Charles River CD
Compac5 anesthesia system Vetequip 901812
Electric trimmers Wahl 9918-6171
Stereotaxic frame David Kopf Instruments 1760
Gaymar heated water pad and pump Braintree Scientific Inc  TP-700
Vetbond tissue adhesive 3M 07-805-5031
Dental drill Pearson Dental O60-0045
Dura pick Fine Science Tools 10064-14
Silicon shank microelectrode Made in-house at Cleveland VA Medical Center N/A
KwikCast silicone elastomer World Precision Instruments KWIK-CAST
Teets dental cement  A-M Systems 525000
Webcam HD Pro c920 Logitec 960-000764
Grip strength meter Harvard Apparatus 565084
Minitab 17 statistical software Minitab Inc
Open field grid test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Ladder test Made in-house at Case Western Reserve University N/A
Rabbit anti rat IgG antibody Bio-Rad 618501

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