Summary
Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.
Abstract
Immunophenotypic karakterizasyonu ve moleküler analiz uzun heterojenite betimlemek ve farklı hücre popülasyonlarının tanımlamak için kullanılmıştır. FACS doğal olarak moleküler analiz ancak uygulamasından önce hedef hücreleri kez prospektif toplu olarak yalıtılır bir tek hücreli tahlil böylece tek hücreli çözünürlük kaybediyor. Tek hücreli gen ifade analizi türdeş olmayan hücre popülasyonlarının tek tek hücreleri arasında moleküler farklılıkları anlamak için bir araç sağlar. Toplu hücre analizi farklı hücre tipi bir overrepresentation önyargıları ve nadir hücrelerindeki sinyallerin occlusions biyolojik önemi ile sonuçlanır. Orta hücre yüzey marker ifade içeren hücreleri de yakalanır iken, tek hücreli gen ifade analizi için birleştiğinde Dizin FACS sıralama kullanarak, nüfus tek hücreli çözünürlük kaybı olmadan araştırılması değerlendirilmesi etkinleştirme sürekli yüzey marker ifade alaka. Burada, tek hücreli Ters transkripsiyon birleştiren bir yaklaşımı açıklamak kantitatif PCR (RT-qPCR) ve FACS dizini aynı anda moleküler ayırdetmek için sıralama ve immunophenotypic heterojenlik hücre popülasyonlarının içinde.
Hücre hücre çeşitleri için read ilgili sorunlar tarafından şaşırmış değil iken tek hücreli RNA sıralama yöntemleri aksine, düşük-bereket transkript sağlam ölçümleri ile daha az bırakan, için qPCR ile belirli hedef amplifikasyon kullanımı sağlar Derinlik. Dizin sıralama tek-hücre lizis içine bu yöntemi arabellek doğrudan Ayrıca, tarafından cDNA sentezi ve belirli hedef öncesi amplifikasyon moleküler imzalarla sonradan türetilmiş hücre yüzeyine korelasyon gelince bir adım de gerçekleştirilecek sağlar Marker ifade. Açıklanan yaklaşım hematopoetik tek-hücreleri araştırmak, ama aynı zamanda başarılı bir şekilde diğer hücre türleri kullanılmıştır için geliştirilmiştir.
Sonuç olarak, tatlı ayrı altgrupları sonraki potansiyel yalıtım için protokolleri geliştirmek için bir panel mRNA ifade imkanı ile önceden seçilmiş genlerin hassas ölçüm için burada açıklanan yaklaşım sağlar.
Introduction
Her bireysel kan hücresi nerede kök hücre sonunda ölümcül belirli taşıyan son efektör hücrelere ayırt etmek giderek taahhüt ara ataları bir dizi üstüne tepe formu hücresel bir hiyerarşi içinde bulunan inanılıyor biyolojik fonksiyonlar1. Kök hücre sistemleri nasıl düzenlendiği hakkındaki bilginin çok hematopoetik sistem, prospektif çok kök hücre veya çeşitli ataları2 için zenginleştirilmiş farklı hematopoetik nüfus izole yeteneği büyük ölçüde nedeniyle oluşturulan FACS sıralama tarafından. Bu nüfusun çoğu için bu işlevsel olarak veya tatlı,3,4profil oluşturma gen ekspresyonu ile ağırlıklı olarak çözümlenmesi için izin verdi. Ancak ne zaman gen ekspresyonu hücreleri arasında toplu nüfus bireysel farklılıklar analiz ortalama ve5kaybettim. Böylece, hücre küçük alt kümeleri nüfus6inferred biyolojik işlev için hesap Eğer hücre hücre çeşitleri türdeş olmayan hücre kesirler içinde algılamak için iş göremezlik anlayışımız kritik biyolojik süreçlerin yıkmak, 7. Tersine, gen ifade imzalar tek hücreli çözünürlükte incelenmesi heterojenite betimlemek ve overrepresented hücreleri8kümelerine gölgede bırakan etkilerden kaçınmak imkanı sunuyoruz.
Bugüne kadar tek hücreli gen ifade analizi için birçok iletişim kuralları geliştirilmiştir; Her bir yaklaşım ile kendi uyarılar sahip. İlk yöntem RNA floresan situ hibridizasyon (RNA-balık), hangi transkript sınırlı sayıda ölçer ama RNA yerelleştirme9,11soruşturma için sağlar benzersizdir oldu. Erken yöntemleri tek veya çok az tutanaklar da vardı algılamak için PCR ve qPCR kullanarak12geliştirdi. Ancak, bu son zamanlarda aynı anda tutanaklar ile qPCR arasında yer alan yüzlerce hücre başına yüzlerce ifade analiz ve böylece yüksek boyutlu heterojen analiz kullanmak için izin verebilirsiniz Havacilik tabanlı yöntemler tarafından yerini almış gen panelleri10,13önceden belirlenir. Bunlar teorik olarak tüm transcriptome bir hücrenin ölçebilir ve böylece heterojenite analiz10' a, bir keşif boyut eklemek gibi son zamanlarda RNA-dayandırılmış yaygın tek hücre analiz için kullanılan teknolojiler haline 14. Multiplexed qPCR analiz ve tek hücreli RNA sıralamanın farklı özelliklere sahip, bu nedenle yanı sıra hedef popülasyon hücre sayısı sorulan soru üzerine yöntemden birini kullanarak için mantığı bağlıdır. Ne zaman bilinmeyen hücre veya büyük popülasyonlarda incelenmiştir yüksek işlem hacmi ve düşük maliyetli tek hücreli RNA sıralama tarafsız, araştırmacı özellikleri ile birlikte hücre başına arzu edilir. Ancak, tek hücreli RNA sıralama aynı zamanda yüksek bol transkript transkript düşük bereket ile terkinin için eğilimli olmakla birlikte daha sık sıralama karşı önyargılı. Bu çoğu zaman ince veya teknik gürültü15dakika sonra gizli önemli moleküler sinyaller ortaya çıkarmak için bioinformatic analiz yüksek talepleri koyar oldukça karmaşık veri yol açabilir. Böylece, iyi karakterize dokular için tek hücreli qPCR analizi ile işlevsel olarak önemli gen veya moleküler işaretleyiciler için seçili astar panelleri heterojen belirlemek için hassas, kolay bir yaklaşım hizmet verebilir önceden belirlenen bir nüfus. Ancak, bu kıyasla unutulmamalıdır tek hücreli RNA-seq için hücre başına maliyet tek hücreli qPCR yöntemleri için genellikle yüksektir. Burada, tek hücreli RT-qPCR (düzeltilmiş Teles J. ve ark. bir araya getiren bir yaklaşımı açıklamak 16), FACS dizinine nüfus içinde moleküler ve immunophenotypic heterojenlik karakterize17 ve Biyoinformatik Analizi18 için aynı anda sıralama.
Bu yaklaşımda, faiz hücre nüfusu lekeli ve tek hücre lizis arabellekte 96-şey PCR tabak içine doğrudan FACS tarafından sıralanır. Aynı anda, hücre yüzey işaretleyicileri ek kümesi ifade düzeyde FACS-sıralama, Dizin sıralama olarak adlandırılan bir yöntemi sırasında tek her hücre için kaydedilir. Lysed hücre malzemesi daha sonra güçlendirilmiş ve genler seçili bir dizi gen ekspresyonu RT-qPCR bir mikrosıvısal platformu kullanarak analiz. Bu strateji bireysel her hücrenin hücre yüzeyine marker ifade sıralanmış tek hücreli hem de aynı anda karakterizasyonu moleküler analizi sağlar. Dizin oluşturulmuş sıralı veri işaretleyicilerini ifade için hücre tatlı farklı alt kümelerini doğrudan eşleme tarafından altgrupları onların potansiyel yalıtımı için kullanılan belirli bir immunophenotype bağlanabilir. Yöntem özetlenen Şekil 1' deki adım adım. Aksi takdirde ince gen ifade sinyalleri tıkamanın alakasız bol genlerin ölçüm kaçınmanızı sağlar beri bir önceden belirlenmiş gen panel daha fazla hedeflenen gen ekspresyonu, daha yüksek bir çözünürlük için katkıda bulunur. Ayrıca, belirli hedef amplifikasyon, bir adım geriye doğru transkripsiyon ve amplifikasyon transkripsiyon faktörleri ya da non-poli-adenylated RNA'ların gibi düşük ifade edilen tutanaklar, sağlam ölçüm için sağlar. Önemlisi, qPCR yöntemler belirli malign hastalıklar19araştırılması önemlidir füzyon protein mRNA ölçüm için olanak sağlar. Son olarak, genler odaklı sayısı incelenmiş, düşük bırakma oranları, ve tek hücreli RNA-devamı gibi daha yüksek boyutlu yöntemleri arasındaki hücreleri yapmak bu yöntem kolayca analiz sınırlı teknik farklar kıyasla Protokolü takip ederek, tüm deney, hücreleri analiz sonuçları, üç gün içinde bu hassas, yüksek-den geçerek tek hücreli gen ifade analizi için basit ve hızlı bir yöntem yapım sıralama üzerinden gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lizis plakaları hazırlanması
- Bir RNA/DNA ücretsiz Bank kullanarak hazırlamak yeterli lizis arabellek % 10 ilave, 96 kuyuları için 390 µL nükleaz boş su, % 10 17 µL karıştırılarak NP-40, 2.8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0.1 M DTT ve 5.3 µL RNAse inhibitörü (bkz: Malzemeler tablo). Girdap ve spin aşağı.
- Her şey 96 iyi PCR plaka lizis arabelleğe 4 µL dağıtmak ve yapıştırıcı film ile plakalarının. Spin aşağı tüplere sıvı alt plakaların toplamak. Buz tabakalarına (maksimum 24 h) sıralama hücre kadar tutun.
2. hücre sıralama için hazırlık hücre
- Hücreleri (burada, CD34 zenginleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre) deney için uygun sayıda çözülme. 1 x 106 yaklaşık üç 96-şey plakaları tek-hücre kontrolleri ile sıralamak için uygun hücrelerdir.
- Çözdürülen hücreleri 15 mL konik tüp nakletmek ve 1 mL FBS her 30 eklemek 8 mL toplam hacmi ulaşılana kadar s. 4 ° C'de 10 dakika için 350 x g de bir santrifüj hücrelerde spin ve süpernatant kaldırın.
- 8 mL arabellek boyama hücrelerde resuspend (% 2 ile PBS FBS) ve santrifüj kapasitesi 350 x g 4 ° C'de 10 dakika ve süpernatant kaldırın.
- 200 µL boyama resuspend hücreler tampon ve hücre kontrol lekeler için kaldırma.
- Floresan bir denetimler (FMOs) her fluorophore için eksi 50 hücrelerde bir kısmını boyama yapmak arabellek boyama µL. Bu örnekte, 6 microcentrifuge tüpleri 20.000 hücreleri ile FMOSs kullanılır. Hücre sayısı araştırıldı nüfus bağlı olarak ayarlanması gerektiğini unutmayın. Tüm antikorlar örnek leke bir her tüp dışında olduğu gibi aynı konsantrasyonu ekleyin.
- Her fluorophore için tek lekeleri 50 µL arabellek için kullanılan her fluorophore hücrelerde bir kısmını boyama yapmak. Bu örnekte 6 microcentrifuge tüpleri 20.000 hücreleri ile kullanılır. Hedef her antikor için denetimler için kullanılan hücre tarafından ifade edilmesi gerektiğini unutmayınız. Her antikor olduğu gibi örnek leke bireysel tüpler aynı konsantrasyonu ekleyin. Ayrıca 20.000 günahı hücreler içinde 50 µL bir günahı denetimi olarak tutmak.
- Hücre örneğe uygun onların konsantrasyonu antikorlar ekleyin. Kullanılan bir 1/100 konsantrasyonu, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 ve Lineage Mix CD34-FITC Buradasınız: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, ve CD235a-PECy5 1/1000.
- Karanlıkta buzda 30 dk antikor içeren hücreleri kuluçkaya.
- Hücreleri 3 mL arabellek boyama ile yıkayın. Hücreleri, 350 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- Hücreleri resuspend ve 2,9 arasındaki adımları yineleyin.
- Resuspend 500 µL örnek ve FMOs 100 µL arabellek ile 1/100 7AAD ve Filtre hücreleri tek hücre süspansiyon almak için 50 µm filtreden boyama.
3. hücre sıralama
- FACS makine ayarlandığından emin olun yukarı doğru açılan gecikme ve sitometresi kurulum ve ile (CST) izleme uygun hücre sıralanır emin olmak için üreticinin talimatlarına göre son zamanlarda gerçekleştirilmiş. En iyi olay hızı 800 ila 2000 olaylar/s arasında ise hematopoetik hücreler için 4 85 mikron meme ve maksimum hızı kullanılması, önerilir.
- Floresans tazminat gerçekleştirerek için spektral örtüşme düzeltin ve gates FMO denetimleri veya iç negatif kontrol göre ayarla.
- Reanalysis hedef nüfusunun 100 µL leke arabelleği ile yeni bir microcentrifuge tüp içine en az 100 hedef hücreleri sıralayarak gerçekleştirin. FACS sıralanmış örnek kaydı tarafından sıralanmış hücreleri analiz ve onlar sıralama geçit sonunda emin olun.
- Kurulum tek hücre plaka 96 iyi plaka iyi A1 düşüş merkezleme tarafından sıralama. Merkezli değil, Bütün wells her şey merkezi bir hücrede alacaksınız emin olmak için boş bir 96 iyi levha kenarındaki tüm kuyu içine 50-100 6 µm parçacıklar sıralamak.
- Mümkünse, hücrelerin sıralanır emin olmak için ek bir denetim tek-hücreleri vitro büyüme için sıralama tarafından eklenebilir. Hematopoetik hücrelerin içinde 100 µl SFEM % 1 penisilin streptomisin, 100 ng/mL ile U-alt 96 iyi levha FLT3L, TPO ve SCF yetiştirilir. Bir mikroskop kullanarak hücre colonies için kültür 3 gün sonra her şey analiz.
- Yapıştırıcı film plakalar kaldırın. Faiz (burada Lin CD34 + CD38-hücreleri) 92 96 wells, dışarı içine tek bir hücre tür etkinleştirmek Dizin-faiz (burada CD45RA, CD49f ve CD90) diğer işaretler tek her hücre için immunophenotypic profili kaydetmek için yazılım sıralama FACS ayırma.
- PCR güçlendirme doğrusallık denetimleri için sırasıyla 10 ve 20 hücreler iki kuyu sıralayın. Wells H1 ve H2 genellikle kullanılır.
- Hayır-şablon kontrol eder, genellikle kuyu H3 ve H4 olmadan herhangi bir hücre iki kuyu tutun.
- NET yapıştırıcı film ile plakalarının ve 300 x g kuru buza buz gibi ek önce 1 dk. için de tabak spin.
- -80 ° C'de donmuş plakaları depolamak
Not: Güvenli durdurma noktası. Sıralanmış ve lysed hücreleri uzun süreli depolama için-80 ° C'de tutulabilir.
4. Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon
- Astar mix temizlik gen astar ve astar çivili-kontrol için RNA, 1,5 mL RNAse ücretsiz tüp bir RNA/DNA ücretsiz banka dahil olmak üzere her astar çiftinin 2 µL ekleyerek tüm 96 gen hedefler için hazır olun. Daha az 96 primerler kullanılarak, nükleaz boş su eksik astar için eşdeğer hacmi ekleyin. Astar ayrı olarak istenilen gen paneli maç emredildi.
- Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon 632.5 µL 2 x reaksiyon mix, 101,2 µL ekleyerek karıştırın Taq/SuperscriptIII, 151.8 µL astar mix ve 0.7 µL denetim RNA çivili. Bu adım bir DNA ücretsiz banka preform. Karıştırmak yanında vortexing ve toplamak sıvı tüp alt aşağı spin. Örnek için ek kadar buz üzerinde tutun.
- Yapmak Hayır-Ters transkripsiyon kontrolü mix karıştırma 2 reaksiyon mix x 27,5 µL, 1.76 µL Taq enzim, 6.6 µL astar mix ve nükleaz boş su 2.64 µL tarafından dört kuyuları için. Denetim RNA spike. Bir DNA ücretsiz bankta bu adımı gerçekleştirin. Girdap ve spin toplamak sıvı tüp ve buz kadar ek devam dibinde örnek aşağı.
- Lysate buz tabakalarına çözülme. Önceden hazırlanmış Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon mix 8,75 µL doğrusallık ve no-şablonu denetimler de dahil olmak üzere 92 wells için ekleyin. Hayır-Ters transkripsiyon kontrolü Mix 8,75 µL dört kalan wells için ekleyin. NET yapıştırıcı film ve alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin ile plakalarının.
- Ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyon PCR makinesi preamp programı göre plaka çalıştırarak preform; Adım 1:50 ° C 60 dk için adım 2: 95 ° C 2 min için adım 3: 95 ° C 15 s, adım 4: 60 ° C 4 dk, yineleme için adım 3-4 24 kez ve nihayet sonsuza kadar adım 5: 8 ° C.
- PCR tamamlandıktan sonra plaka kısa süreli depolama için 8 ° C ile -20 ° C uzun süreli depolama için tutun.
Not: Güvenli durdurma noktası. Güçlendirilmiş malzeme kısa süreli depolama için 8 ° C'de ve uzun süreli depolama için-20 ° C'de tutulabilir.
5. örnek ve tahlil plakaları için hazırlanması Multiplex mikrosıvısal gen ifade Analizi
- Pipetting 3 tarafından plaka yükleme tahlil hazırlamak µL tahlil yükleme reaktif 96 iyi plaka her şey için. 3 µL her astar plaka yükleme tahlil bireysel wells ekleyin.
- Yapıştırıcı film ve alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin ile plaka mühür.
- Seyreltme plaka nükleaz pipetting 8 µL tarafından ücretsiz su 96 iyi plaka tüm kuyu hazırlamak. 2 µL güçlendirilmiş örnek 1:5 son seyreltme yapma seyreltme plakasına ekleyin.
- Mühür plaka ile yapıştırıcı ince tabaka, mix 10 için vortexing levha tarafından s ve sonunda alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin.
- Örnek yükleme mix master Mix 352 µL dikkatle örnek yükleme reaktif 35.2 µL ile karıştırılarak hazır olun. Örnek yükleme plaka karıştırmak için her şey 96 iyi plaka yükleme aliquoting 3.3 µL hazırlayın.
- 2.7 µL seyreltilmiş örnekten plaka yükleme örnek her kuyunun içine ekleyin.
- Yapıştırıcı film ve alt plakaların toplamak sıvı aşağı spin ile plaka mühür.
6. yükleme mikrosıvısal çip
- Yeni 96 x 96 mikrosıvısal çip al. Alıcılar onları kapaklı bir şırınga üzerinde onlar hareket edebilir emin olmak için alay tarafından hazırlayın.
- Kabarcıklar şırınga kaldırın. Şırıngaların tam birim süre belgili tanımlık küçük parça 45 derece devirme ve Vana basarak her kapak için ekleyin. Çip IFC denetleyicisiyle Başbakan.
- Her plaka yükleme tahlil Wells her tahlil giriş 4.25 µL ile yükleyin. Bubbles kaçınmak. Kabarcıklar kuyuda görünüyorsa, bunları bir pipet ucu ile kaldırın.
- Her plaka yükleme örnek Wells her örnek giriş 4.25 µL ile yüklemeye devam, kabarcıklar önlemek ve kabarcıklar görünür, onları pipet ucu ile kaldırın.
- Çip ile IFC denetleyicisi yükleyin.
- Çip bile görünüyor ve tüm odaları yüklenmiş olan kontrol edin. Toz çip yüzeyden bant ile dokunarak kaldırın. Çip multiplex mikrosıvısal gen ifade platformu çalıştırın.
7. Chip Multiplex mikrosıvısal gen ifade platformu üzerinde çalışan
- Çip multiplex mikrosıvısal gen ifade platformu yükledikten sonra örnek adını verin.
- ROX pasif boya ayarlayın. Tek sonda ve FAM-MGB floresans ayarlayın. 96 x 96 Standart v2 iletişim kuralı olarak kullanın. Çalışma başlatmak.
- Ne zaman koşmak kaldır çip tamamlanmıştır.
8. ön Analizi çip Çalıştır
- Verileri gerçek zamanlı PCR analiz yazılımı yükle.
- Gen adlarını hem de hücre hücre ve gen düzenleri bir sekmeyle ayrılmış dosya yapıştırarak yük.
- Resim görünümü açın ve ROX boya seçin. Bütün wells ROX pasif boya var mı diye kontrol edin.
- Tüm amplifikasyon araziler ok, hiçbir sivri ( Şekil 3Eiçin benzer) ile pürüzsüz amplifikasyon eğrisi ile bakarsanız araştırmak.
- Tüm tek-hücreleri çivili denetimi tüm düzgün yüklenmiş emin olmak için RNA ifade olduğundan emin olun.
- Tüm hücreleri temizlik gen ifadesi var ve böylece düzgün sıralanmış emin olun.
- 10 ve 20 hücre doğrusallık denetimleri doğrusal amplifikasyon doğrulamak için yaklaşık 1 CT fark olduğundan emin olun.
- Kuzey kontrol örnekleri ifade olup olmadığını kontrol edin. İfade içinde Kuzey algılanırsa probları sonraki çalışmaları için genomik DNA algılamaz probları değiştirmeyi düşünün.
- Verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için csv dosyalarında verin.
9. tek hücreli analiz SCExV
Not: Bir aracı tanıtmak için mevcut20 tanıtım filmidir. Burada, protokol tanıttı denetimlerini kullanarak analiz yapmak nasıl kısa bir öneri sunulur.
- SCexV Web sitesi20' ye bağlayın.
- Dışa aktarılan CSV dosyaları yükleyin.
- Çivili bileşenini denetim RNA pozitif kontrol olarak seçti. Bir denetim RNA CT 25 yukarıda olan herhangi bir hücreyi kaldırın. Denetimin RNA medyan ifade verilerinize normalleştirmek.
- Tıklatın "burada analiz ->". Kuzey, notemplate, 10 ve 20 hücre denetimleri dışlama hücre seçeneğini kaldırın.
- Küme hücre kümeleri beklenen sayısı ile tercih kümeleme yaklaşımla. Analiz değerleri vermek.
10. Dizin sıralama Analizi
- FACS analiz yazılımı açın ve dizini oluşturulmuş örnekleri yükleyin.
- Komut dosyası Düzenleyicisi'ni açın ve kullanılabilir kod Çalıştır Quinn J. vd. 21
- FACS analiz yazılımı bir kapı her tek hücreler için yapılmış olmalıdır göre düzeni Düzenleyicisi'ni açın ve gruplandırma SCexV ("Sample_complete_Data.xls" adlı dosyayı kullanılabilir) üzerinden göre hücreleri renk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hızlı, kolay gerçekleştirilen ve son derece güvenilir açıklanan protokolüdür. Deneysel set-up bir bakış Şekil 1' de sunulmuştur. Tek-hücrelerin belirli hedef amplifikasyon, gen ifade ölçümleri ve ön analizler için sıralama gelen tüm iletişim kuralı, üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Bir örnek 96 astar ve ya bir kronik miyeloid lösemi (CML) hastadan 96 hücreleri veya 96 hücrelerden yaşlı eşlemeli sağlıklı kullanarak tek hücreli gen ifade analizi ön analiz verileri temsil eden bir ısı haritası şeklinde analiz sonuçları Denetim Şekil 2' de sunulmuştur. Hiyerarşik kümeleme kullanarak, analiz hücreleri kendi gen ifade imzaları dayalı dört alt gruplara ayrılabilir. Isı harita görselleştirmesi analiz (Örneğin, denetim wells) çıkarılmalıdır kuyuları için genel kontrol için de veri almak için uygun bir yoldur. Şekil 2B hücreleri her grubun her Boyut azaltma kullanarak diğer benzer görselleştirme bir asıl bileşen analizi (PCA) olduğunu. Burada, aykırı kolayca hücreleri diğerlerinden ayırt edilirler. Analiz etmek için bireysel gen kümeleri arasında dağıtılır yanı sıra nasıl aralarında farklılık, keman araziler yararlıdır. Şekil 2Ciçinde dört temsilcisi genlerin ifadesi gösterilir: lösemik hücrelerin tümünü; işaretler füzyon gen BCR-ABL1, aktif olarak bölen bir grubu ifade hücre döngüsü işaret mKI67; myeloid farklılaşma marker için Bisiklete binme alt grubu sınırlandırılır MPO; ve sonunda gene tüm hücrelerde ifade RPS18 ev tutmak. Son olarak, moleküler imzalar immunophenotyped için korelasyon Şekil 2B , her küme her hücrede kimlikleri olarak dizin sıralama oluşturulan bir FACS Arsa tek tek hücreleri renk için kullanılır. Hücre yüzey marker ifade CD90 ve bu durumda bazı kümeleri arasında ayırımcılık ve prospektif onları için fonksiyonel analiz yalıtmak için kullanılabilir CD45RA hematopoetik kök hücre işaretçileri için gösterilir.
Tek hücreli qPCR gerçekleştirmek için kullanılan Havacilik hava veya parçacıklar giriş içine belgili tanımlık sistem çok duyarlıdır. Bu nedenle, verilerin sonrası çalışma kalite kontrolü yapmak için önemlidir. Şekil 3 veri ve bir başarılı ve başarısız bir arasındaki kontrast kötü örnek yükleme nedeniyle çalıştırmak temsilcisi gösterir. Şekil 3A nasıl başarılı bir çalıştırdıktan sonra yayılma eşit olarak bu güven verici tüm wells üzerinde yükleme Rox düzeyleri başarılı olmuştur gösterir. Buna ek olarak, Şekil 3B nasıl örnek ve tahlil yükleme ROX çip büyük bölgelerinde eksikliği gösterildiği gibi başarısız oldu göstermektedir. Bir kez değerlendirilen Rox kalitesini, ham gen ifade sinyal kalitesini değerlendirilebilir. Şekil 3 ciçinde başarılı bir çalışma ısı haritası sunulur, nerede ifade eşit genelinde yayılmış örnekleri güçlü sinyali ile 7-25 Ct:s. aksine, 3D şekil bir ısı haritası başarısız bir çalışma pek çok örnekleri var burada çekmiyor gösterir veya genler çok sınırlı bir miktarda ifadesidir. Sonuçları Şekil 3D birçok hücreler diğerleri tamamen ifade eksikliği net ifade sinyalleri var bu yana FACS tek hücreli gen ifade analizi önce sıralama bir hata nedeniyle yüksektir. Son olarak, Şekil 3E yaklaşık 10 ct az hiçbir varyasyon ile net ifade sahip tüm wells ile çivili denetimi RNA beklenen amplifikasyon eğrisini görüntüler. Bu pozitif kontrol tüm adımları tek hücreli qPCR analizde verimliliği önlemleri. Amplifikasyon Dinamik Aralık içinde olduğundan emin olmak için farklı hücre sayıları doğrusallık denetimleri dahil edilir; burada, 10 ve 20 hücre denetimleri kullanılır. CT farklılıklar doğrusallık denetimler arasındaki hücre sayıları farklılıkları yansıtmaktadır. Son olarak, hiçbir ters Transkripsiyon (Kuzey) ve hiçbir şablon negatif kontrolleri yok yanlış pozitif sinyaller genomik DNA veya contaminations, anılan sıraya göre tespit edilir emin olun.
Şekil 1: şematik Protokolü'nün. Hücreleri, mRNA serbest bırakmak için yüzey marker ifade kaydetmek için aktif ve lysed Dizin-sıralama uygulamasıyla göre lekeli. mRNA cDNA için transkripsiyonu ve belirli hedef amplifikasyon kullanılarak güçlendirilmiş daha sonra ters. Ardından, örnekleri ile birlikte bireysel astar bir mikrosıvısal çip yüklenen gen ifade profil her hücrenin RT-qPCR kullanılarak analiz nerede. Veri toplama sonra verilerin düşük kaliteli hücreleri kaldırmak için önceden işlenmiş ve kümeleme tatlı ayrı hücre popülasyonlarının tanımlamak için gerçekleştirilir. Son olarak, tatlı tanımlanmış altgrupları Dizin FACS sıralama yüzey marker ifade için ilişkili veri immunophenotypically için karakterize nüfus heterojen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: üç başarılı tek hücreli gen ekspresyonu temsilcisi sonuçlarını analiz eder normal ve lösemik hematopoetik kök hücre. (A)ısı harita tek hücreli gen ifade ölçümleri bir kronik miyeloid lösemi hastası gibi bir yaş eşlemeli sağlıklı kontrol SCExV 18, bir çözümleme aracı kullanarak hiyerarşik kümeleme tarafından analiz 270 tek hücre gösterilen Bu veri türü için tasarlanmış. Kırmızı Yüksek ifadesini, mavi düşük ifade temsil eder ve herhangi bir ifade gri. Hücreleri kendi gen ifade imzaları dayalı dört farklı kümeler halinde ayrıldı. Bu hasta lösemik kök hücre popülasyondan bir durgun nüfus (küme 3), sadece birkaç ayırt etme belirteçleri ifade ile ve ifade başlatmış bir aktif bölme nüfus ayrılabilir verilerden açıktır myeloid farklılaşma (küme 4) ile ilişkili genler. Burada kullanılan tarafından Warfvinge vd. , daha önce yayımlanan eser dahil seçili bir hastadan veridir 22 (B) asıl bileşen analizi (PCA) A, burada dört ayrılmış gruplar görüntülenen veri gösterilir. (C) keman araziler ile küme belirli ifade, dört genlerin BCR-ABL1, mKI67, RPS18 ve MPO. Her keman arsa her küme deyimde ve noktalı çizgi üzerinde ifade tüm hücreler için ortalama değerini temsil eder. (D) dizin sıralama analizini nerede bireysel her hücre kendi moleküler subpopulation rengiyle işaretlenir ısı haritası temsil hasta numuneleri biri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: çok katmanlı qPCR gerçek zamanlı PCR yazılım kalite kontrollerinin. (A)Rox yükleme görüntüsünü başarılı örnek ve tahlil yükleme. (B) Rox yükleme görüntüsünü başarısız örnek ve tahlil yükleme, nerede örneklerinin başarısız yükleri tarafından ROX eksikliği yatay çizgiler olarak gösterilir. Başarısız yükleme deneyleri-cekti var olmak göstermek içinde dikey çizgiler. Başarılı bir örneği (C) nereye tek hücre satır temsil ve genler sütunları temsil ısı harita görünümünde, çalıştırın. Yüksek gen ekspresyonu sarı, düşük ifade mavi ve siyah algılanan hiçbir ifade belirtilir. Başarısız bir örneği (D) burada tek hücre satır temsil ve genler sütunları temsil ısı harita görünümünde, çalıştırın. Yüksek gen ekspresyonu temsil edilir sarı, mavi ve siyah olarak algılanan hiçbir ifade düşük ifadesi gösterilir. (E) normalleştirilmiş yoğunluğu (solda) ve bir çivili RNA denetimi amplifikasyon Arsa (sağda). CT-değerleri yaklaşık 10 ve eğrilerin sınırlı varyasyon ile başarılı ve sağlam Ters transkripsiyon, ön amplifikasyon ve qPCR içinde analiz bütün wells gösterir. (F) normalleştirilmiş yoğunluğu (solda) ve başarısız bir gen amplifikasyon Arsa (sağda). Normalleştirilmiş şiddetlerde bir eğri oluşturmaz ve amplifikasyon Arsa büyük sivri floresans içinde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, tek hücreli gen ifade analizi çeşitli hücre popülasyonları23heterojen tanımlamak için değerli bir ek haline gelmiştir. Ancak bu yöntemler hücre hücre sıralama derinlikleri ve damla-çıkışları tarafından karmaşık RNA sıralama teknolojileri gelişiyle teorik olarak bir olasılık bir hücrenin tüm transcriptome ölçmek için sağlar. Tek hücreli qPCR teklifler kritik genler nerede hücrelerin tümünü yüzlerce ifade hassas ve sağlam bir analizini kabul edilir benzer şekilde, teknik gürültü azaltma. Transkript sınırlı sayıda odaklı analiz Ayrıca son derece ifade genler müdahale olmadan Basitleştirilmiş analiz için sağlar.
Yaklaşım sadece genler hücrelerde ifade kümesini inceler beri gen paneli tasarlarken genler doğru kümesini seçmek son derece önemlidir. Genler seçiminde çeşitli şekillerde yapılabilir; Edebiyat, önceki bulgular tarafından toplu analiz ve kamuya veri Biyoinformatik analizi. Bu önemsiz değildir; Ancak, genler doğru kümesiyle yaklaşım çok güçlü olabilir. Gen panel iÖin astar çoğullama sırasında engel olmamasını doğrulamak önemlidir. Burada astar bol malzemeli bir seyreltme serisi preforming tarafından doğrusal iseniz analiz öneririz; Bu çalışmada kullanılan astar dizi tamamlayıcı olarak gösterilir bir seyreltme rakam 2D Warfvinge vd. 22
Burada sunulan Protokolü iki ana sınırlamaları hücreleri ve soruşturma genler sınırlı sayıda vardır. Ancak, sadece 96 hücreleri her vadede incelenmiştir rağmen bu nispeten basit iletişim kuralı bir gün içinde tamamlanabilir ve böylece hücreleri yüzlerce bir hafta içinde analiz edilebilir. Ayrıca, daha fazla astar içinde belgili tanımlık hedef özgü öncesi amplifikasyon adım dahil edilmesi araştırıldı genler sayısında artış. Bu durumda, birkaç fiş 96 astar kümelerine araştırmaya ihtiyaç vardır.
Eğer son derece genleri veya hücreleri ile ifade yüksek RNA-içeriği analiz, hematopoetik kök hücreleri düşük genel gen ifade23 ile en iyi şekilde döngü sayısı olarak buna olmalıdır. Amplifikasyon devir değiştirme Ayrıca toplu nüfus araştırılması önemlidir. Hematopoetik kök hücre (100 hücreleri) toplu analizi için 18-25 dan öncesi amplifikasyon döngüleri miktarını azaltarak öneririz.
En yaygın nedenleri için başarısız ishal olduğunu başarısız tek-hücrelerinin lizis kalıbının kuyuya sıralama nedeniyle uygun olmayan hücreleri, suboptimal öncesi amplifikasyon veya başarısızlık yükleme çip sıralama. Her reaksiyon odası Rox kademede örnek veya tahlil yüklenmesini bir göstergesidir ve bunlar düşükse, örnekleri yeni bir çip üzerinde düşük Rox düzeyleri kabarcıklar tanıtım yükleme sırasında büyük olasılıkla nedeni değildir beri yeniden çalıştırılır önerilir. Çivili denetimi RNA ifade olmaması bir göstergesidir öncesi amper, büyük olasılıkla öncesi güçlendirme ile ilgili sorunlar nedeniyle başarısız oldu-ya da ters transkripsiyon reaktifler. Bu durumda, bu yeni bir çip yeni sıralanmış hücreleri ve yeni Reaktanları çalıştırmanız tavsiye edilir. Denetim RNA tespiti ama diğer gen ekspresyonu belirtisi yok başarısız tek hücreli FACS belirtisi gen ifade analizi önce sıralama sinyalleri. Sıralama FACS sırasında hataları önlemek için tek hücreler her şey ortasına sıralanır emin olmak önemlidir. Bu boncuk boş bir levha sıralama ve görsel olarak nerede damlacığı toprakları teftiş yapılabilir. Test-sıralama için set-up sadece ilk birkaç kuyular için doğru değil emin olmak için plaka kenarlarını bütün wells içine emin olun. Uygun olduğunda, tek hücre içinde vitro büyümesine paralel olarak sıralanabilir ve rahip qPCR analiz başarılı sıralama iletişim kuralları için kontrol etmek için analiz edilebilir. Dizin sıralama bilgileri sadece tatlı ayrı bir subpopulation immunophenotyped soruşturma için izin vermez ancak, Eğer tanımlanmamış bir popülasyon sıralamak ve çok düşük kaliteli hücre sorun giderirken yararlı anlayışlar de sağlayabilir tek hücreli gen ifade analizi mevcut. Dizin sıralama bilgi gating strateji optimize etmek ve düşük kaliteli hücrelerinin gelecekte sıralama önlemek için kullanılabilir.
Tek hücreli gen ifade analizi ne kadar türdeş olmayan hücre popülasyonları incelenmiştir devrim ve daha fazla hücre farklılaşma anlamak için önünü. Haematopoiesis, tek hücreli gen ifade analizi kullanılmıştır multipotent progenitör nüfus6,24,25 heterojen gidermek için HSCs7, alt kümeleri için sıralama stratejileri geliştirmek için ve terapi duyarsız lösemik kök hücre nüfus22,26tanımlamak için. Tek hücreli gen ifade - hem de fonksiyonel analiz ile sıralama Dizin birleşimi araştırma immunophenotype ve heterojen farklı popülasyonlar27, güvenilir ve verimli olması için daha önce gösterildi 28,29. Burada, moleküler incelenmesi için bir yaklaşım ve immunophenotypic heterojenlik nüfus-si olmak be hücrenin açıklanan nerede tek hücreli qPCR Dizin sıralama ile birleştirerek kısa bir karmaşık analizde olmadan hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar süre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser tıbbi araştırma, İsveçli çocukluk kanseri Vakfı, Söderberg Vakfı Ragnar ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı için hibe İsveçli Kanser Derneği, İsveçli Araştırma Konseyi, İsveç toplum tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
