Bulk gen expression målinger cloud individuelle celle forskelle i heterogene cellepopulationer. Her, vi beskriver en protokol for hvordan encellede gen expression analyse og indeks sortering af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) kan kombineres for at afgrænse heterogenitet og immunophenotypically karakteriserer molekylemæssigt forskellige cellepopulationer.
Immunophenotypic karakterisering og molekylær analyse har længe været anvendt til at afgrænse heterogenitet og definere forskellige cellepopulationer. FACS er i sagens natur en enkelt celle, analyse, men forud for Molekylær analyse, target-cellerne er ofte fremadrettet isoleret i bulk, derved mister encellede opløsning. Encellede gen expression analyse giver et middel til at forstå molekylære forskelle mellem individuelle celler i heterogene cellepopulationer. I bulk celle analyse medfører en overrepræsentation af en særskilt celletype bias og tillukning af signaler fra sjældne celler med biologiske betydning. Ved at udnytte FACS indeks sortering koblet til én celle gen expression analyse, populationer kan undersøges uden tab af encellede opløsning, mens celler med mellemliggende celle overflade markør udtryk der også fanges, gør det muligt for evaluering af relevansen af kontinuerlig overflade markør udtryk. Her beskriver vi en tilgang, der kombinerer enkelt celle reverse transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) og FACS indeks sortering for at samtidig karakterisere de molekylære og immunophenotypic forskelligartethed inden for cellepopulationer.
I modsætning til én celle RNA sekventering metoder, anvendelsen af qPCR med specifikke mål forstærkning giver mulighed for robust målinger af lav-overflod udskrifter med færre udfald, mens det ikke er forvirret af problemer relateret til celle til celle variationer i Læs dybde. Derudover ved direkte indeks-sortering single-celler i lysis buffer denne metode, giver mulighed for cDNA syntese og specifikke mål før forstærkning skal udføres i ét trin såvel som for korrelation af efterfølgende afledte molekylære signaturer med cellens overflade markør udtryk. Den beskrevne fremgangsmåde er blevet udviklet for at undersøge hæmatopoietisk single-celler, men har også været anvendt med succes på andre celletyper.
Afslutningsvis den metode beskrevet heri giver mulighed for følsomme måling af mRNA udtryk for et panel af forudvalgte gener med mulighed for at udvikle protokoller for efterfølgende potentielle isolering af molekylemæssigt forskellige delpopulationer.
Hver enkelt blod celle menes at opholde sig i et cellulære hierarki, hvor stamceller danner apex oven på en række stadig mere engageret mellemliggende stamfaderen, der i sidste ende uhelbredeligt differentiere i de endelige effektor celler transporterer særlige biologiske funktioner1. Meget af viden om hvordan stamceller systemer er organiseret er blevet genereret i hæmatopoietisk systemet, hovedsagelig på grund af evnen til at fremadrettet isolere særskilte hæmatopoietisk populationer højt beriget til stamceller eller forskellige stamfaderen2 af FACS sortering. Dette har tilladt for mange af disse befolkningsgrupper der skal analyseres funktionelt eller molekylært, overvejende via genekspression profilering3,4. Men når analysere genekspression af bulk populationer individuelle forskelle mellem celler er i gennemsnit og tabte5. Således, manglende evne til at detektere celle til celle variationer inden for heterogen celle fraktioner kan forvirre vores forståelse af kritiske biologiske processer, hvis lille undersæt af celler tegner sig for den afledte biologiske funktion af at befolkningen6, 7. Omvendt, undersøgelsen af genet udtryk signaturer på én celle opløsning tilbyder en mulighed for at afgrænse heterogenitet og omgå overskygger påvirkninger fra overrepræsenteret delmængder af celler8.
Til dato har været udviklet mange protokoller for encellede gen expression analyse; hver tilgang har sine egne begrænsninger. De tidligste metode var RNA fluorescerende i situ hybridisering (RNA-fisk), der måler et begrænset antal udskrifter på et tidspunkt, men er unik, idet det giver mulighed for undersøgelse af RNA lokalisering9,11. Tidlige metoder ved hjælp af PCR og qPCR for at opdage en enkelt eller meget få afskrifter blev også udviklet12. Men disse sidst er blevet erstattet af mikrofluidik-baserede metoder, som kan samtidig analysere udtryk for hundredvis af udskrifter pr. celle i hundredvis af celler gennem qPCR og dermed giver mulighed for høj-dimensionelle heterogenitet analyse ved hjælp af forudbestemt gen paneler10,13. Seneste RNA sekventering-baserede teknologier har blive udbredt til enkelt celle analyse, da disse teoretisk kan måle den hele transkriptom af en celle og dermed tilføje en sonderende dimension til heterogenitet analyse10, 14. Multiplexed qPCR analyse og encellede RNA sekventering har forskellige funktioner, begrundelse for at anvende en af metoder afhænger således spørgsmål samt antallet af celler i målgruppen. Høj overførselshastighed og lave omkostninger pr. celle sammen med upartiske, sonderende Karakteristik af encellede RNA sekventering er ønskværdige, når ukendt celle eller store befolkningsgrupper er undersøgt. Dog er encellede RNA sekventering også forudindtaget mod sekventering høj rigelige udskrifter oftere, mens udskrifter med lav overflod er tilbøjelige til frafald. Dette kan føre til betydeligt komplekse data, der stiller høje krav bioinformatic analyse afsløre vigtige molekylære signaler, der er ofte subtile eller skjult i teknisk støj15. Således, for godt karakteriseret væv, encellede qPCR analyse ved hjælp af forudbestemt primer paneler valgt for funktionelt vigtige gener eller molekylære markører kan tjene som en følsom, ligetil tilgang til at bestemme heterogenitet af en befolkning. Dog skal det bemærkes, i forhold til én celle RNA-FF., omkostningen pr. celle er generelt højere for encellede qPCR metoder. Her beskriver vi en tilgang, der kombinerer encellede RT-qPCR (modificeret fra Teles J. et al. 16), til FACS indeks sortering17 og bioinformatik analyse18 for at samtidig karakterisere de molekylære og immunophenotypic heterogenitet i populationer.
I denne tilgang, celle population af interesse er plettet og single-celler er sorteret efter FACS direkte i lysisbuffer i 96-brønd PCR plader. Samtidig registreres udtryk niveauer i et ekstra sæt af celle-overflade markører for hver enkelt celle i FACS-sortering, en metode, der er nævnt som indeks-sortering. Mængden cellestof forstærkes efterfølgende og genekspression af et udvalgt sæt af gener analyseret med RT-qPCR, ved hjælp af en mikrofluid platform. Denne strategi muliggør Molekylær analyse af sorterede encellede samt samtidige karakterisering af hver enkelt celle celle-overflade markør udtryk. Ved direkte kortlægning molekylemæssigt særskilt undersæt af celler til ekspression af de indekserede sorterede markører, kan delpopulationer knyttes til en bestemt immunophenotype, der kan bruges til deres potentielle isolation. Metoden er beskrevet trin for trin i figur 1. Forudbestemte gen panel yderligere bidrager til en højere opløsning af den målrettede genekspression, da det omgår måling af irrelevante rigelige gener, der kan ellers occlude subtile gen expression signaler. Derudover specifikke mål forstærkning, ét trin reverse transkription og forstærkning giver mulighed for robust måling af lav udtrykt afskrifter, som transskriptionsfaktorer eller ikke-poly-adenylated RNA’er. Vigtigere, mulighed qPCR metoder for måling af mRNA fra fusion proteiner, som er vigtige, når undersøge visse maligne sygdomme19. Endelig fokuserede antallet af gener undersøges, lavt frafald, og begrænset tekniske forskelle mellem celler gør denne metode let analyseres i forhold til højere dimensionale metoder, såsom encellede RNA-FF. Ved at følge protokollen, kan en hele eksperimentet udføres, fra sorteringen celler til analyseret resultaterne, inden for tre dage, hvilket gør dette til en ukompliceret og hurtig metode for følsomme, høj overførselshastighed encellede gen expression analyse.
I de seneste år, er encellede gen expression analyse blevet et værdifuldt supplement til at definere heterogenitet af forskellige celle populationer23. Fremkomsten af RNA sekventering teknologier teoretisk giver mulighed for at måle den hele transkriptom af en celle, men disse metoder er kompliceret af variationer i celle til celle sekventering dybder og drop-outs. Encellede qPCR tilbyder en følsom og robust analyse af udtryk for hundredvis af kritiske gener hvor alle celler behandles tilsvare…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af tilskud fra den svenske Cancer Society, det svenske Forskningsråd, det svenske selskab for medicinalforskning, den svenske Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, og The Knut og Alice Wallenberg Foundation
CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
FBS | HyClone | SV30160.3 | |
PBS | HyClone | SH30028.02 | |
96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
TPO | Peprotech | 300-18 | |
SCF | Peprotech | 300-07 | |
FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
CST beads | BD | 642412 | |
Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
10mM dNTP | Takara | 4030 | |
0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
Excel | Microsoft | Microsoft | |
FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |