Summary
Bulk gen expression målinger cloud individuelle celle forskelle i heterogene cellepopulationer. Her, vi beskriver en protokol for hvordan encellede gen expression analyse og indeks sortering af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) kan kombineres for at afgrænse heterogenitet og immunophenotypically karakteriserer molekylemæssigt forskellige cellepopulationer.
Abstract
Immunophenotypic karakterisering og molekylær analyse har længe været anvendt til at afgrænse heterogenitet og definere forskellige cellepopulationer. FACS er i sagens natur en enkelt celle, analyse, men forud for Molekylær analyse, target-cellerne er ofte fremadrettet isoleret i bulk, derved mister encellede opløsning. Encellede gen expression analyse giver et middel til at forstå molekylære forskelle mellem individuelle celler i heterogene cellepopulationer. I bulk celle analyse medfører en overrepræsentation af en særskilt celletype bias og tillukning af signaler fra sjældne celler med biologiske betydning. Ved at udnytte FACS indeks sortering koblet til én celle gen expression analyse, populationer kan undersøges uden tab af encellede opløsning, mens celler med mellemliggende celle overflade markør udtryk der også fanges, gør det muligt for evaluering af relevansen af kontinuerlig overflade markør udtryk. Her beskriver vi en tilgang, der kombinerer enkelt celle reverse transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) og FACS indeks sortering for at samtidig karakterisere de molekylære og immunophenotypic forskelligartethed inden for cellepopulationer.
I modsætning til én celle RNA sekventering metoder, anvendelsen af qPCR med specifikke mål forstærkning giver mulighed for robust målinger af lav-overflod udskrifter med færre udfald, mens det ikke er forvirret af problemer relateret til celle til celle variationer i Læs dybde. Derudover ved direkte indeks-sortering single-celler i lysis buffer denne metode, giver mulighed for cDNA syntese og specifikke mål før forstærkning skal udføres i ét trin såvel som for korrelation af efterfølgende afledte molekylære signaturer med cellens overflade markør udtryk. Den beskrevne fremgangsmåde er blevet udviklet for at undersøge hæmatopoietisk single-celler, men har også været anvendt med succes på andre celletyper.
Afslutningsvis den metode beskrevet heri giver mulighed for følsomme måling af mRNA udtryk for et panel af forudvalgte gener med mulighed for at udvikle protokoller for efterfølgende potentielle isolering af molekylemæssigt forskellige delpopulationer.
Introduction
Hver enkelt blod celle menes at opholde sig i et cellulære hierarki, hvor stamceller danner apex oven på en række stadig mere engageret mellemliggende stamfaderen, der i sidste ende uhelbredeligt differentiere i de endelige effektor celler transporterer særlige biologiske funktioner1. Meget af viden om hvordan stamceller systemer er organiseret er blevet genereret i hæmatopoietisk systemet, hovedsagelig på grund af evnen til at fremadrettet isolere særskilte hæmatopoietisk populationer højt beriget til stamceller eller forskellige stamfaderen2 af FACS sortering. Dette har tilladt for mange af disse befolkningsgrupper der skal analyseres funktionelt eller molekylært, overvejende via genekspression profilering3,4. Men når analysere genekspression af bulk populationer individuelle forskelle mellem celler er i gennemsnit og tabte5. Således, manglende evne til at detektere celle til celle variationer inden for heterogen celle fraktioner kan forvirre vores forståelse af kritiske biologiske processer, hvis lille undersæt af celler tegner sig for den afledte biologiske funktion af at befolkningen6, 7. Omvendt, undersøgelsen af genet udtryk signaturer på én celle opløsning tilbyder en mulighed for at afgrænse heterogenitet og omgå overskygger påvirkninger fra overrepræsenteret delmængder af celler8.
Til dato har været udviklet mange protokoller for encellede gen expression analyse; hver tilgang har sine egne begrænsninger. De tidligste metode var RNA fluorescerende i situ hybridisering (RNA-fisk), der måler et begrænset antal udskrifter på et tidspunkt, men er unik, idet det giver mulighed for undersøgelse af RNA lokalisering9,11. Tidlige metoder ved hjælp af PCR og qPCR for at opdage en enkelt eller meget få afskrifter blev også udviklet12. Men disse sidst er blevet erstattet af mikrofluidik-baserede metoder, som kan samtidig analysere udtryk for hundredvis af udskrifter pr. celle i hundredvis af celler gennem qPCR og dermed giver mulighed for høj-dimensionelle heterogenitet analyse ved hjælp af forudbestemt gen paneler10,13. Seneste RNA sekventering-baserede teknologier har blive udbredt til enkelt celle analyse, da disse teoretisk kan måle den hele transkriptom af en celle og dermed tilføje en sonderende dimension til heterogenitet analyse10, 14. Multiplexed qPCR analyse og encellede RNA sekventering har forskellige funktioner, begrundelse for at anvende en af metoder afhænger således spørgsmål samt antallet af celler i målgruppen. Høj overførselshastighed og lave omkostninger pr. celle sammen med upartiske, sonderende Karakteristik af encellede RNA sekventering er ønskværdige, når ukendt celle eller store befolkningsgrupper er undersøgt. Dog er encellede RNA sekventering også forudindtaget mod sekventering høj rigelige udskrifter oftere, mens udskrifter med lav overflod er tilbøjelige til frafald. Dette kan føre til betydeligt komplekse data, der stiller høje krav bioinformatic analyse afsløre vigtige molekylære signaler, der er ofte subtile eller skjult i teknisk støj15. Således, for godt karakteriseret væv, encellede qPCR analyse ved hjælp af forudbestemt primer paneler valgt for funktionelt vigtige gener eller molekylære markører kan tjene som en følsom, ligetil tilgang til at bestemme heterogenitet af en befolkning. Dog skal det bemærkes, i forhold til én celle RNA-FF., omkostningen pr. celle er generelt højere for encellede qPCR metoder. Her beskriver vi en tilgang, der kombinerer encellede RT-qPCR (modificeret fra Teles J. et al. 16), til FACS indeks sortering17 og bioinformatik analyse18 for at samtidig karakterisere de molekylære og immunophenotypic heterogenitet i populationer.
I denne tilgang, celle population af interesse er plettet og single-celler er sorteret efter FACS direkte i lysisbuffer i 96-brønd PCR plader. Samtidig registreres udtryk niveauer i et ekstra sæt af celle-overflade markører for hver enkelt celle i FACS-sortering, en metode, der er nævnt som indeks-sortering. Mængden cellestof forstærkes efterfølgende og genekspression af et udvalgt sæt af gener analyseret med RT-qPCR, ved hjælp af en mikrofluid platform. Denne strategi muliggør Molekylær analyse af sorterede encellede samt samtidige karakterisering af hver enkelt celle celle-overflade markør udtryk. Ved direkte kortlægning molekylemæssigt særskilt undersæt af celler til ekspression af de indekserede sorterede markører, kan delpopulationer knyttes til en bestemt immunophenotype, der kan bruges til deres potentielle isolation. Metoden er beskrevet trin for trin i figur 1. Forudbestemte gen panel yderligere bidrager til en højere opløsning af den målrettede genekspression, da det omgår måling af irrelevante rigelige gener, der kan ellers occlude subtile gen expression signaler. Derudover specifikke mål forstærkning, ét trin reverse transkription og forstærkning giver mulighed for robust måling af lav udtrykt afskrifter, som transskriptionsfaktorer eller ikke-poly-adenylated RNA'er. Vigtigere, mulighed qPCR metoder for måling af mRNA fra fusion proteiner, som er vigtige, når undersøge visse maligne sygdomme19. Endelig fokuserede antallet af gener undersøges, lavt frafald, og begrænset tekniske forskelle mellem celler gør denne metode let analyseres i forhold til højere dimensionale metoder, såsom encellede RNA-FF. Ved at følge protokollen, kan en hele eksperimentet udføres, fra sorteringen celler til analyseret resultaterne, inden for tre dage, hvilket gør dette til en ukompliceret og hurtig metode for følsomme, høj overførselshastighed encellede gen expression analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af Lysis plader
- Bruger et RNA/DNA gratis bænk, forberede nok lysisbuffer for 96 brønde, med 10% ekstra, ved at blande 390 µL nukleasen gratis vand, 17 µL af 10% NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT og 5,3 µL RNAse inhibitor (Se Tabel af materialer). Vortex og spin-ned.
- Distribuere 4 µL af lysisbuffer til hver brønd med en 96 godt PCR plade og forsegle plader med selvklæbende film. Spin ned rør til at indsamle flydende i bunden af pladerne. Holde pladerne på is indtil cellen sortering (maksimalt 24 h).
2. forberedelse af celler til celle sortering
- Tø passende antal celler (her, CD34 beriget hæmatopoietisk stamceller og stamceller) for forsøget. 1 x 106 celler er passende for sortering ca tre 96-brønd plader af single-celler med kontrol.
- Overføre optøede celler til en 15 mL konisk slange og tilsættes 1 mL FBS hver 30 s indtil en samlet maengde paa 8 mL er nået. Spin celler i en centrifuge på 350 x g i 10 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
- Resuspend celler i 8 mL farvning buffer (PBS med 2% FBS) og centrifugeres ved 350 x g i 10 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
- Resuspend celler i 200 µL farvning buffer og fjerne celler for kontrol pletter.
- Gøre fluorescens minus én kontrol (FMO'er) for hver fluorophore, ved farvning en brøkdel af celler i 50 µL farvning buffer. I dette eksempel bruges 6 microcentrifuge rør med 20.000 celler som FMOSs. Bemærk, at antallet af celler skal justeres afhængigt af befolkningens undersøgt. Tilføje alle antistoffer i den samme koncentration som i prøven pletten med undtagelse af en til hvert rør.
- Gøre enkelt pletter for hver fluorophore af farvning en brøkdel af celler i 50 µL buffer for hver fluorophore anvendes. I dette eksempel bruges 6 microcentrifuge rør med 20.000 celler. Bemærk, at målet for hver antistoffer skal udtrykkes ved de celler til kontrolelementer. Tilføje hver antistof på den samme koncentration som i prøven pletten i enkelte rør. Desuden holde 20.000 unstained celler i 50 µL som en unstained kontrol.
- Eksemplet celle tilføje antistoffer i deres passende koncentration. Brugte her er CD34-FITC i en koncentration på 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 og afstamning Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, og CD235a-PECy5 1/1000.
- Inkuber celler med antistoffer i 30 min på is i mørke.
- Vaske cellerne med 3 mL farvning buffer. Centrifugeres celler ved 350 x g i 10 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
- Resuspend celler og Gentag trin 2.9.
- Resuspend prøven i 500 µL og FMO'er i 100 µL farvning buffer med 1/100 7AAD og filter celler gennem en 50 µm filter for at få en enkelt celle suspension.
3. celle sortering
- Sørg for, at FACS maskine er sat op korrekt med drop forsinkelse og forskellige setup og tracking (CST) der er for nylig blevet udført efter producentens anvisninger, at sikre, at de relevante celler er sorteret. For hæmatopoietisk celler anbefales brugen af 85 micron dyse og maksimal hastighed af 4, mens den optimale begivenhed er mellem 800 og 2000 begivenheder/s.
- Korrigere for spektrale overlapning ved at udføre fluorescens kompensation og sat låger FMO kontrolelementer eller indre negative kontroller.
- Udføre reanalyse af målgruppen ved at sortere mindst 100 målceller ind i en ny microcentrifuge rør med 100 µL af pletten buffer. FACS analysere de sorterede celler ved at optage den sorterede prøve og sørg for, at de ender i slags gate.
- Set-up enkelt celle plade sortering af centrering drop i godt A1 i en 96 godt plade. Når den er centreret, sortere 50 – 100 6 µm partikler i alle brønde rundt i kanten af en tom 96 godt plade til at sikre, at alle brønde vil få en celle i midten af hver brønd.
- Hvis det er muligt, kan en yderligere kontrol for at sikre, at levedygtige celler er sorteret tilføjes ved at sortere single-celler for in vitro- vækst. Hæmatopoietiske celler kan dyrkes i U-bunden 96 godt plader i 100 µl SFEM med 1% penicillin streptomycin, 100 ng/mL, FLT3L, TPO og SCF. Analysere hver brønd efter 3 dage i kultur for celle kolonier ved hjælp af et mikroskop.
- Fjerne selvklæbende film fra plader. Sortere en enkelt celle af interesse (her Lin-CD34 + CD38-celler) i 92 ud af de 96 brønde, aktivere indeks-sortering i FACS sortering software til at gemme immunophenotypic profil for andre markører af interesse (her CD45RA, CD49f og CD90) for hver enkelt celle.
- Sortere to brønde med 10 og 20 celler henholdsvis for linearitet kontrolelementer i PCR-amplifikation. Brønde H1 og H2 bruges normalt.
- Holde to brønde uden nogen celler som no-skabelonen styrer normalt wells H3 og H4.
- Forsegle plader med klar selvklæbende film og spin plader på 300 x g i 1 minut før snap indefrysning på tøris.
- Gemme frosne plader ved-80 ° C.
Bemærk: Safe stop punkt. Sorterede og mængden celler kan opbevares ved-80 ° C til langtidsopbevaring.
4. reverse transkription og specifikke mål forstærkning
- Forbered primer mix for alle 96 gen mål ved at tilføje 2 µL af hver primer par, herunder rengøring gen primere og primere for spidse i kontrol RNA, i en 1,5 mL RNAse gratis tube på en RNA/DNA gratis bænk. Hvis du bruger mindre end 96 primere, tilsættes en tilsvarende mængde nukleasen gratis vand til de manglende primere. Primere er bestilt separat til at matche det ønskede gen panel.
- Foretage reverse transkription og specifikke mål forstærkning mix ved at tilføje 632.5 µL 2 x mastermix, 101.2 µL Taq/SuperscriptIII, 151.8 µL Primer mix og 0,7 µL spiked kontrol RNA. Preform dette trin på en DNA gratis bænk. Blanding af vortexing og spin-ned for at indsamle væske i bunden af røret. Holde på is indtil tilføjelse til prøven.
- Make no-reverse transkription kontrol mix for fire brønde ved at blande 27,5 µL af 2 x mastermix, 1.76 µL af Taq enzym, 6,6 µL af primer mix og 2,64 µL nukleasen gratis vand. Spike i kontrol RNA. Udføre dette trin på en DNA gratis bænk. Vortex og spin-ned for at indsamle væske i bunden af røret og holde på is indtil tilføjelsen til prøven.
- Optø lysate plader på is. Tilføje 8,75 µL af tidligere forberedt reverse transkription og specifikke mål forstærkning mix 92 brønde, herunder kontrolelementerne linearitet og no-skabelon. Tilføje 8,75 µL af no-reverse transkription kontrol mix til de fire resterende brønde. Forsegle plader med klar selvklæbende film og spin-ned for at indsamle væske i bunden af pladerne.
- Preform reverse transkription og specifikke mål forstærkning ved at køre pladen i en PCR-maskine efter preamp program; trin 1:50 ° C til 60 min, trin 2: 95 ° C i 2 min., trin 3: 95 ° C i 15 s, trin 4: 60 ° C i 4 min, Gentag trin 3-4 24 gange og endelig trin 5: 8 ° C for evigt.
- Efter PCR er færdig, skal du holde pladen på 8 ° C til kortvarig lagring og -20 ° C til langtidsopbevaring.
Bemærk: Safe stop punkt. Forstærket materiale kan opbevares ved 8 ° C for kortvarig oplagring og ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
5. forberedelse af prøven og Assay plader til Multiplex mikrofluid gen Expression analyse
- Forberede assay lastning plade af pipettering 3 µL Assay lastning reagens til hver brønd med en 96 godt plade. Tilføje 3 µL af hver primer til individuelle brønde i analysen lastning plade.
- Forsegle pladen med selvklæbende film og spin-ned for at indsamle væske i bunden af pladerne.
- Forberede fortynding plade af pipettering 8 µL af nukleasen gratis vand ind i alle huller af en 96 godt plade. Tilføj 2 µL af forstærkede prøven til fortynding plade, hvilket gør en endelig fortynding på 1:5.
- Forsegle pladen med selvklæbende folie, mix af vortexing plade for 10 s, og endelig spin ned til indsamle væske i bunden af pladerne.
- Forberede prøve lastning mix af omhyggeligt blande 352 µL af master mix med 35,2 µL af prøven lastning reagens. Forberede prøve lastning plade af aliquoting 3.3 µL af lastning mix til hver brønd med en 96 godt plade.
- Tilføje 2,7 µL af de fortyndede prøve i hver brønd i eksemplet lastning plade.
- Forsegle pladen med selvklæbende film og spin-ned for at indsamle væske i bunden af pladerne.
6. læsning af mikrofluid Chip
- Tegne en ny 96 x 96 mikrofluid chip. Forbered fjorde ved at stikke dem med en sprøjte med fælles landbrugspolitik på at sikre, at de kan flyttes.
- Fjerne bobler fra sprøjter. Tilføje fuld volumen af sprøjter til hver ventil mens vippe chippen 45 grader og trykker ned ventilen. Prime chip med IFC-controller.
- Indlæse Hvert assay indløb med 4,25 µL fra hver af brønde i analysen lastning plade. Undgå boblerne. Hvis bobler vises i brønden, fjerne dem med en pipette spids.
- Fortsætte læsning hver prøve indløb med 4,25 µL fra hver af brønde i stikprøven lastning plade, undgå boblerne, og hvis bobler vises, skal du fjerne dem med pipette spids.
- Indlæse chip med IFC-controller.
- Kontroller, at chippen ser selv og at alle kamre er blevet indlæst. Fjerne støv fra chip overflade ved at røre den med tape. Kør chippen i multiplex mikrofluid gen expression platform.
7. løb Chip på Multiplex mikrofluid gen Expression Platform
- Efter ilægning chip i multiplex mikrofluid gen expression platform, navn prøven.
- Indstille ROX som passiv farvestof. Angiv enkelt sonde og FAM-MGB som fluorescens. Bruge 96 x 96 standard v2 som protokol. Begynd at køre.
- Fjern chip når kører er fuldført.
8. indledende analyse af Chip Run
- Indlæse data i Real-Time PCR analyse software.
- Indlæse gen navne og cellenavne ved at indsætte cellen og gen layouts fra en tabulatorsepareret fil.
- Åbn billede view og vælg ROX som farvestof. Tjek om alle brønde har ROX passiv farvestof.
- Undersøge hvis alle forstærkning parceller ser ok, med en glat forstærkning kurve med ingen pigge (svarende til figur 3E).
- Sikre, at alle single-celler har udtryk for spidse i kontrol RNA for at sikre, at alle er blevet indlæst korrekt.
- Sikre, at alle celler har husholdning genekspression og dermed er blevet sorteret korrekt.
- Sikre, at 10-20 celle linearitet kontrol har ca 1 CT forskel at validere lineær forstærkning.
- Kontrollere, om der er udtrykket i noRT kontrolprøver. Hvis udtryk er opdaget i noRT overveje at ændre sonder til sonder, som ikke registrerer genomisk DNA til efterfølgende kører.
- Eksportere data i CSV-filer til yderligere analyse.
9. enkelt-celle analyse ved hjælp af SCExV
Bemærk: En indledende film er nuværende20 at indfører værktøjet. Her præsenteres et kort anbefaling af hvordan man gør analyse ved hjælp af kontrolelementerne indført i protokollen.
- Tilsluttes SCexV hjemmeside20.
- Upload eksporterede CSV-filer.
- Valgte kontrolelementet spidse i RNA som positiv kontrol. Fjerne en celle, der har en styring RNA CT over 25. Normalisere dataene til median udtryk for kontrol RNA.
- Klik på "her -> Analyze". Fjerne noRT, notemplate, 10 og 20 celle kontrol i indstillingen Udelad celle.
- Klynge celler med klyngedannelse tilgangen i valg med det forventede antal af klynger. Eksportere analyserede værdier.
10. Index-sortering analyse
- Åbn FACS analyse software og indlæse de indekserede prøver.
- Åbne Scripteditor og køre scriptet tilgængelige fra Quinn J. et al. 21
- Nu, FACS analyse software skal have lavet en gate for hver enkelt celle, åbne Layouteditor og farve celler efter gruppering fra SCexV (findes i filen med navnet "Sample_complete_Data.xls").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrev er hurtig, let udføres og meget pålidelige. Overblik over den eksperimentelle set-up er præsenteret i figur 1. Hele protokollen fra sortering af single-celler, at specifikke mål forstærkning, gene expression målinger og foreløbig analyse kan udføres i tre dage. Et eksempel på analyseret resultaterne i form af en zonekort, der repræsenterer indledende analyseret data fra én celle gen expression analyse ved hjælp af 96 primere og 96 celler fra enten en kronisk myeloid leukæmi (CML) patienten eller 96 celler fra en ældre-matchede raske kontrol er præsenteret i figur 2. Ved hjælp af hierarkisk klyngedannelse, kan de analyserede celler opdeles i fire undergrupper baseret på deres gen expression signaturer. Varme kort visualisering er en nem måde at få et overblik over data samt med hensyn til kontrol for brønde, der skal udelades fra analyse (f.eks. kontrolhullerne). Figur 2B er en principal komponent analyse (PCA) visualisere, hvordan ens celler af hver gruppe er til hinanden ved hjælp af dimension reduktion. Her, kan outliers let adskilles fra resten af cellerne. Til at analysere hvordan enkelte gener er fordelt blandt klyngerne samt varierer mellem dem, violin parceller er nyttige. I figur 2 c, udtryk for fire repræsentative gener er vist: fusion genet BCR-ABL1, som markerer alle leukemic celler; cellecyklus markør mKI67, som er udtrykt i et aktivt dividere gruppe; myeloid differentiering markør MPO, som er begrænset til cykling undergruppen; og endelig huset holde genet RPS18, som er udtrykt i alle celler. Endelig, i figur 2D molekylære signaturer har været korreleret til immunophenotyped, som identiteten af hver celle i hver klynge er anvendes til at farve de enkelte celler i en FACS plot genereret fra indeks-sortering. Vist er celle overflade markør udtryk for hæmatopoietisk stamcelle markører CD90 og CD45RA, der i dette tilfælde kunne bruges til at skelne mellem nogle af klyngerne og fremadrettet isolere dem i funktionelle analyse.
Mikrofluidik bruges til at udføre den encellede qPCR er meget følsomme over for indførelsen af luft eller partikler ind i systemet. Derfor er det afgørende at gøre en post køre kvalitetskontrol af data. Figur 3 viser repræsentant data og kontrast mellem en vellykket og et mislykket kører på grund af dårlig prøve lastning. Figur 3A viser, hvordan Rox niveauer efter en vellykket køre spredes jævnt over alle brønde beroligende, at lastning har været vellykket. Derimod illustrerer figur 3B , hvordan prøven og assay lastning har undladt som angivet af manglen ROX i store dele af chippen. Når kvaliteten af Rox er blevet vurderet, kan kvaliteten af rå gen expression signaler evalueres. I figur 3 c, en zonekort af en vellykket køre præsenteres, hvor udtrykket er jævnt fordelt i hele prøver med stærkt signal for omkring 7-25 Ct:s. i kontrast, finde 3D viser en zonekort af en mislykket køre hvor mange prøver har ingen signal eller udtryk for en meget begrænset mængde af gener. Resultaterne i figur 3D er sandsynligvis på grund af en fejl i den FACS sortering forud encellede gen expression analyse, da mange celler har klart udtryk signaler, mens andre mangler udtryk helt. Endelig viser figur 3E forventede forstærkning kurve af spidse i kontrol RNA med alle brønde har klart udtryk for omkring 10 CT med lidt at ingen variation. Denne positive kontrol måler effektiviteten af alle trin i en enkelt celle qPCR analyse. For at sikre, at forstærkning inden for dynamikområde, er forskellige celle numre inkluderet som linearitet kontrol; her, bruges 10 - og 20-celle kontrolelementer. CT forskelle mellem linearitet kontrol bør afspejle forskelle i celle antal. Endelig, ingen reverse transkription (noRT) og de ingen skabelon negative kontroller sikrer, at ingen falsk positive signaler opdages fra genomisk DNA eller forureninger, henholdsvis.
Figur 1: skematisk oversigt over protokollen. Celler farves, sorteret med index-form ansøgning aktiveret for at optage overflade markør udtryk, og mængden til at frigive mRNA. mRNA er efterfølgende omvendt transskriberet til cDNA og forstærkes ved hjælp af specifikke mål forstærkning. Næste, prøverne er indlæst sammen med individuelle primere i en mikrofluid chip, hvor gen expression profil af hver celle er analyseret ved hjælp af RT-qPCR. Efter indsamling af data, data er pre forarbejdet til at fjerne lav kvalitet celler og klyngedannelse udføres for at definere molekylemæssigt forskellige cellepopulationer. Endelig molekylemæssigt definerede delpopulationer er korreleret til overflade markør udtryk fra FACS indeks sortering data til immunophenotypically karakteriserer heterogenitet af befolkningerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater af tre vellykkede encellede genekspression analyserer af normale og leukemic hæmatopoietisk stamceller. (A) varme kort der viser encellede gen expression målinger af 270 enkelt celler fra en kronisk myeloid leukæmi patient samt en alder-matchede raske kontrol analyseret af hierarkisk klyngedannelse bruger SCExV 18, et analyseværktøj designet for denne type data. Rød repræsenterer høje udtryk, blå lav udtryk og grå intet udtryk. Cellerne var opdelt i fire forskellige klynger baseret på deres gen expression signaturer. Det fremgår klart af de data, at befolkningens leukemic stamceller fra denne patienten kan opdeles i en inaktiv befolkning (klynge 3), med udtryk for kun et par differentiering markører, og et aktivt dividere befolkning, der har indledt udtryk for gener forbundet med myeloide differentiering (klynge 4). De data, der anvendes her er fra en valgte patient inkluderet i tidligere udgivne arbejde af Warfvinge et al. 22 (B) Principal komponent analyse (PCA) af dataene i A, hvor fire adskilte grupper kan blive vist. (C) Violin parceller af fire gener med klynge specifikke udtryk, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 og MPO. Hver violin plot repræsenterer udtrykket i hver klynge og den stiplede linje på tværs af repræsenterer middelværdien af udtryk for alle celler. (D) indeks-sortering analyse af en af patientprøver repræsenteret i zonekort, hvor hver enkelt celle er markeret med farven på dens molekylære delpopulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvalitetskontrol af multiplex qPCR i real-time PCR software. (A) Rox indlæsningsbillede vellykket prøve og assay lastning. (B) Rox indlæsningsbillede forgæves prøve og assay lastning, hvor mislykket belastning af prøver er vist af manglende ROX i vandrette streger. Mislykkede lastning af assays ville blive vist i lodrette linjer. (C) eksempel på en vellykket køre i varmen kortoversigt, hvor single-cellerne repræsenterer rækker og gener repræsenterer kolonner. Høj genekspression angives i gul, lav udtryk i blå og ikke fundet udtryk i sort. (D) eksempel på en mislykket køre i varmen kortoversigt, hvor single-cellerne repræsenterer rækker og gener repræsenterer kolonner. Høj genekspression er repræsenteret af gul, lav udtryk er repræsenteret af blå, og ingen fundne udtryk som sort. (E) normaliseret intensitet (venstre) og forstærkning plot (til højre) af en spidse RNA-kontrol. CT-værdier af ca 10 og kurver med begrænset variation tyder vellykket og robust omvendt transskription, før forstærkning og qPCR analyse inden for alle brønde. (F) normaliseret intensitet (venstre) og forstærkning plot (til højre) af et mislykket gen. De normaliserede intensiteter udgør ikke en kurve og forstærkning plot viser store pigge i fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de seneste år, er encellede gen expression analyse blevet et værdifuldt supplement til at definere heterogenitet af forskellige celle populationer23. Fremkomsten af RNA sekventering teknologier teoretisk giver mulighed for at måle den hele transkriptom af en celle, men disse metoder er kompliceret af variationer i celle til celle sekventering dybder og drop-outs. Encellede qPCR tilbyder en følsom og robust analyse af udtryk for hundredvis af kritiske gener hvor alle celler behandles tilsvarende tekniske støjdæmpning. En målrettet analyse af et begrænset antal udskrifter desuden giver mulighed for forenklet analyse uden indblanding fra stærkt udtrykte gener.
Da metoden kun undersøger et undersæt af gener udtrykt i cellerne er det meget vigtigt at vælge det korrekte sæt af gener, når designe panelet gen. Valget af gener kan gøres på flere måder; gennem litteratur, tidligere resultater af bulk analyse, og bioinformatik analyse af offentligt tilgængelige data. Dette er ikke en bagatel; dog med det korrekte sæt af gener kan tilgangen være meget kraftfuld. Når panelet genet er blevet designet, er det vigtigt at validere, at primere ikke at gribe ind under multiplexing. Her anbefaler vi analysere hvis primere er lineære ved du udfører en fortyndingsrække med rigelig materiale; en fortynding serie af primere, der anvendes i denne undersøgelse er vist i supplerende figur 2D i Warfvinge et al. 22
De to vigtigste begrænsninger af protokollen præsenteres her er det begrænsede antal celler og gener undersøges. Men selvom kun 96 celler er undersøgt i hver analyseserie, denne forholdsvis enkel protokol kan gennemføres på en dag og dermed hundredvis af celler kan analyseres i en uge. Antallet af gener undersøges kunne Derudover øges, hvis flere primere er inkluderet i target-specifikke pre forstærkning trin. I dette tilfælde flere chips er nødvendige for at undersøge hver sæt af 96 primere.
Hvis meget udtrykte gener eller celler med høj RNA-indhold er ved at blive analyseret, antallet af cyklusser optimeret til hæmatopoietisk stamceller med lave samlede gen expression23 bør ændres. Ændre forstærkning cyklusser er også vigtigt, når undersøger bulk populationer. Vi anbefaler til bulk analyse af hæmatopoietisk stamceller (100 celler) reducerer mængden af pre forstærkning cykler fra 25 til 18.
De mest almindelige årsager for ikke kører er på grund af mislykket sortering af single-celler i brønden af lysis plade, sortering af ikke-levedygtige celler, suboptimal pre forstærkning eller chip lastning fiasko. Rox-niveau i hver reaktionskammeret er en indikator for indlæsning af enten prøve eller analyse, og hvis disse er lav, anbefales det, at prøverne igen kører på en ny chip, siden lav Rox niveauer er sandsynligvis forårsaget af indførelsen af bobler under lastning. Manglende spidse i kontrol RNA udtryk er en indikator for at pre-amps har undladt, sandsynligvis på grund af problemer med pre forstærkning- eller reverse transkription reagenser. I dette tilfælde anbefales det, at en ny chip drives med nyligt sorteret celler og nye reaktanter. Påvisning af kontrol RNA men ingen indikation af andre genekspression signaler er en indikation af mislykket encellede FACS sortering forud gen expression analyse. At undgå fejl under FACS sortering, det er vigtigt at sikre, at single-celler er sorteret i midten af hver brønd. Dette kan gøres ved at sortere perler ind i en tom plade og visuelt inspicere hvor slipværktøjet lander. Sørg for, at test-form i alle pladens huller i kanten af pladen til at sikre, at opsætning ikke er kun korrekt for de første par brønde. Når det er relevant, single-celler kan samtidig være sorteret for in vitro vækst og analyseret forud for qPCR analyse til kontrol for vellykket sortering protokoller. Indeks-sortering oplysninger tillader ikke kun for at undersøge immunophenotyped af en molekylemæssigt særskilte delpopulation men kan også give nyttig indsigt, når fejlfinding, hvis du sortering en udefineret befolkning og mange lav kvalitet celler er stede i encellede gen expression analyse. Indeks-sortering oplysninger kan bruges til at optimere den gating strategi og undgå fremtidig sortering af lav kvalitet celler.
Encellede gen expression analyse revolutionerende, hvordan heterogene celle populationer er undersøgt og baner vejen for yderligere forståelse af Celledifferentiering. I haematopoiesis, encellede gen expression analyse er blevet brugt til at forfine sortering strategier for delmængder af HSCs7, for at løse heterogenitet af Multipotente stamceller populationer6,24,25 , og at identificere terapi ufølsomme leukemic stamcelle populationer22,26. Kombination af indeks sortering med både encellede gen expression- og funktionel analyse har tidligere vist sig at være pålidelig og effektiv, når undersøger immunophenotype og heterogenitet af forskellige populationer27, 28,29. Her, en tilgang til undersøgelse af molekylære og immunophenotypic heterogenitet af celle populationer har været beskrevet hvor kombinerer encellede qPCR med indeks sortering muliggør hurtig og reproducerbare resultater uden kompliceret analyse i en kort tidsramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra den svenske Cancer Society, det svenske Forskningsråd, det svenske selskab for medicinalforskning, den svenske Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, og The Knut og Alice Wallenberg Foundation
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
