Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.
Immunophenotypic karakterisering en moleculaire analyse hebben lange tijd gebruikt om af te bakenen heterogeniteit en definiëren van afzonderlijke cel populaties. FACS is inherent een eencellige assay, maar voorafgaand aan de moleculaire analyse, de doelcellen zijn vaak prospectief geïsoleerd in bulk vervoeren, eencellige resolutie waarbij u verliest. Eencellige gen expressie analyse biedt een manier om moleculaire verschillen tussen de afzonderlijke cellen in heterogene cel populaties te begrijpen. In bulk cel analyse resulteert een oververtegenwoordiging van een afzonderlijke celtype in vooroordelen en occlusie van de signalen van zeldzame cellen met biologische belang. Door gebruik te maken van FACS index Sorteren gekoppeld aan eencellige gen expressie analyse, populaties kunnen onderzocht worden zonder verlies van eencellige resolutie terwijl cellen met tussenliggende cel oppervlakte marker expressie worden ook vastgelegd, waardoor beoordeling van de relevantie van continu oppervlak marker expressie. Hier beschrijven we een aanpak die eencellige omgekeerde transcriptie combineert kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en FACS index Sorteren gelijktijdig karakteriseren de moleculaire en immunophenotypic heterogeniteit binnen cel populaties.
In tegenstelling tot de eencellige RNA sequencing methoden voorziet het gebruik van qPCR met specifieke doel versterking in robuuste metingen van lage-overvloed afschriften met minder uitvallers, terwijl het niet is verward door de kwesties in verband met cel-naar-cel variaties in lezen diepte. Bovendien, door rechtstreeks index-Sorteren single-cellen lysis buffer deze methode, voorziet cDNA synthese en specifieke doelgroep pre versterking moet worden uitgevoerd in één stap alsook wat betreft de correlatie van vervolgens afgeleide moleculaire signaturen met celoppervlak markering voor de expressie. De beschreven aanpak heeft ontwikkeld om te onderzoeken van hematopoietische single-cellen, maar hebben ook geweest tweedehands met vrucht voort andere celtypes.
Kortom, zorgt de hierin beschreven aanpak voor gevoelige meting van mRNA uitdrukking voor een panel van vooraf geselecteerde genen met de mogelijkheid tot het ontwikkelen van protocollen voor latere potentiële isolatie van moleculair verschillende subpopulaties.
Elke individuele bloedcel wordt verondersteld om te verblijven in een cellulaire hiërarchie, waar stamcellen vormen de apex op de top van een reeks van steeds meer begaan tussenliggende voorlopercellen, die uiteindelijk terminaal onderscheiden in de cellen van de definitieve effector specifieke uitvoering biologische functies1. Veel van de kennis over hoe de systemen van de cel van de stam worden georganiseerd is gegenereerd in het hematopoietische systeem, grotendeels als gevolg van de mogelijkheid om verschillende hematopoietische populaties hoogverrijkt voor stamcellen of verschillende progenitoren2 prospectief te isoleren door FACS sorteren. Hierdoor heeft voor veel van deze populaties te analyseren functioneel of moleculair, voornamelijk door middel van genexpressie profilering van3,4. Echter wanneer analyse van genexpressie van bulk populaties individuele verschillen tussen cellen zijn gemiddeld uit en5verloren. Dus kan arbeidsongeschiktheid te detecteren van cel naar cel variaties binnen heterogene cel breuken verwarren ons begrip van essentieel biologische processen als kleine deelverzamelingen van cellen de afgeleid biologische functie van die bevolking6, rekening 7. Omgekeerd, onderzoek van gen expressie handtekeningen bij eencellige resolutie bieden een mogelijkheid om af te bakenen heterogeniteit en omzeilen overschaduwt invloeden uit oververtegenwoordigd deelverzamelingen van cellen8.
Tot op heden zijn er vele protocollen voor eencellige gen expressie analyse ontwikkeld; met elke benadering heeft zijn eigen beperkingen. De vroegste methode was RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis), die een beperkt aantal afschriften maatregelen tegelijk maar is uniek in dat het mogelijk voor onderzoek van RNA lokalisatie9,11 maakt. Vroege methoden met behulp van PCR en qPCR dat één of zeer weinig transcripties werden ook ontwikkeld12. Echter zijn deze laatste tijd vervangen door microfluidics gebaseerde methoden die kunnen gelijktijdig analyseren de expressie van honderden afschriften per cel in honderden cellen tot en met qPCR en zo toestaan voor het gebruik van de analyse van de hoge-dimensionale heterogeniteit vooraf bepaald gen panelen10,13. Onlangs RNA sequencing gebaseerde technologieën zijn wijd gewend voor eencellige analyse, als dit theoretisch kunnen de hele transcriptome van een cel meten en daarmee een verkennend dimensie aan heterogeniteit analyse10, toevoegen 14. gemultiplext qPCR analyse en eencellige RNA sequencing hebben verschillende functies, dus de reden voor het gebruik van een van de manieren is afhankelijk van de vraag alsook het aantal cellen in de doelpopulatie. De hoge-doorvoer en lage kosten per cel samen met onbevooroordeelde, verkennende kenmerken van eencellige RNA sequencing zijn wenselijk wanneer onbekende cel of grote populaties worden onderzocht. Eencellige RNA sequencing is echter ook gericht op hoge overvloedige afschriften vaker sequencing terwijl chat-kopieën met lage overvloed gevoelig voor dropouts zijn. Dit kan leiden tot aanzienlijk complexe gegevens die hoge-eisen bioinformatic analyse oplegt te onthullen van belangrijke moleculaire signalen die vaak subtiele of verborgen in technische lawaai15. Dus, voor goed gekarakteriseerd weefsels, eencellige qPCR analyse met behulp van vooraf bepaalde primer panelen geselecteerd voor functioneel belangrijke genen of moleculaire merkers kunnen dienen als een gevoelige, ongecompliceerde benadering bepalen de heterogeniteit van een bevolking. Het dient echter te worden opgemerkt dat in vergelijking tot eencellige RNA-seq, de kosten per cel is over het algemeen hoger voor eencellige qPCR methoden. Hier beschrijven we een aanpak die eencellige RT-qPCR combineert (vanaf Teles J. et al. gewijzigd 16), FACS index Sorteren17 en bioinformatica analyse18 om gelijktijdig het karakteriseren van de moleculaire en immunophenotypic heterogeniteit binnen populaties.
In deze benadering, de cel bevolking van belang is gekleurd en single-cellen worden gesorteerd door FACS rechtstreeks in lysis-buffermengsel in 96-wells-platen voor PCR. Tegelijkertijd zijn de niveaus van de expressie van een extra set van celoppervlak markers opgenomen voor elke eencellige tijdens FACS-sorteren, een methode die wordt aangeduid als het index-Sorteren. Het materiaal van de cel lysed wordt vervolgens versterkt en de expressie van genen van een geselecteerde verzameling van genen geanalyseerd met RT-qPCR, met behulp van een microfluidic platform. Deze strategie maakt het mogelijk moleculaire analyse van de gesorteerde eencellige evenals gelijktijdige karakterisering van elke afzonderlijke cel celoppervlak marker expressie. Door het direct toewijzen van moleculair verschillende subsets van cellen aan de expressie van de geïndexeerde gesorteerde markers, kunnen de subpopulaties worden gekoppeld aan een specifieke immunophenotype die kan worden gebruikt voor hun potentiële isolatie. De methode wordt beschreven stap voor stap in Figuur 1. Een vooraf bepaald gen panel verder draagt bij aan een hogere resolutie van de gerichte genexpressie, aangezien het omzeilt meting van irrelevante overvloedige genen die anders subtiele gen expressie signalen kan occlude. Bovendien, de versterking van het specifieke doel, één stap omgekeerde transcriptie en versterking voorziet in robuuste meting van lage uitgedrukt afschriften, zoals transcriptiefactoren of non-poly-adenylated RNAs. Nog belangrijker is, toestaan qPCR methoden voor meting van mRNA uit fusie-eiwit, die belangrijk zijn bij het onderzoeken van bepaalde kwaadaardige ziekten19. Tot slot het gericht aantal genen onderzocht, lage drop-out rates, en beperkte technische verschillen tussen cellen maken deze methode eenvoudig geanalyseerd ten opzichte van hogere dimensionale methoden, zoals eencellige RNA-seq. Door het volgen van het protocol, kan een hele experiment worden uitgevoerd, dan het sorteren van cellen aan de resultaten van het geanalyseerde, binnen drie dagen, waardoor dit een eenvoudige en snelle methode voor gevoelige, hoge-doorvoer eencellige gen expressie analyse.
In de afgelopen jaren is de eencellige gen expressie analyse een waardevolle toevoeging aan het definiëren van de heterogeniteit van de verschillende cel populaties23geworden. De komst van RNA sequencing technologieën biedt theoretisch een mogelijkheid voor het meten van de gehele transcriptome van een cel, maar deze methoden worden bemoeilijkt door variaties in de cel-naar-cel sequencing diepten en drop-outs. Eencellige qPCR biedt een gevoelige en robuuste analyse van de expressie van honderden…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Zweedse Cancer Society, de Zweedse Onderzoeksraad, The Swedish Society voor medisch onderzoek, de Zweedse Childhood Cancer Foundation, The Ragnar Söderberg Foundation, en The Knut en Alice Wallenberg Foundation
CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
FBS | HyClone | SV30160.3 | |
PBS | HyClone | SH30028.02 | |
96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
TPO | Peprotech | 300-18 | |
SCF | Peprotech | 300-07 | |
FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
CST beads | BD | 642412 | |
Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
10mM dNTP | Takara | 4030 | |
0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
Excel | Microsoft | Microsoft | |
FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |