Bulk gen uttryck mätningar molnet enskild cell skillnader i heterogena cellpopulationer. Här beskriver vi ett protokoll för hur encelliga gen uttryck analys och index sortering av flourescens aktiverad Cell sortering (FACS) kan kombineras för att avgränsa heterogenitet och immunophenotypically karakterisera molekylärt distinkta cellpopulationer.
Immunophenotypic karakterisering och molekylär analys har länge använts för att beskriva heterogenitet och definiera olika cellpopulationer. FACS är till sin natur en encellig analysen, men före molekylär analys, målceller isoleras ofta prospektivt i bulk, därmed förlora encelliga upplösning. Enskild cell gene expression analys ger ett sätt att förstå molekylära skillnader mellan enskilda celler i heterogena cellpopulationer. I cell massanalys resulterar en överrepresentation av en distinkt celltyp i fördomar och ocklusioner av signaler från sällsynta celler med biologisk betydelse. Genom att utnyttja FACS index sortering kopplat till enskild cell gene expression analys, populationer kan undersökas utan förlust av encelliga upplösning medan celler med mellanliggande cell surface markör uttryck fångas också, möjliggör utvärdering av betydelsen av kontinuerlig yta markör uttryck. Här, vi beskriver en strategi som kombinerar encelliga omvänd Transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) och FACS index sortering för att samtidigt karaktärisera molekylära och immunophenotypic heterogenitet inom cellpopulationer.
Till skillnad från encelliga RNA-sekvenseringsmetoder tillåter användning av qPCR med specifik amplifiering robust mätningar av låg-överflöd avskrifter med färre avbrott, medan det inte försvåras av frågor som rör cell till cell variationer i Läs djup. Dessutom möjliggör av direkt index-sortering singel-celler i Lys buffert denna metod, cDNA syntes och specifika mål före förstärkning ska utföras i ett steg samt när det gäller sambandet mellan därefter härledda molekylära signaturer med cellytan markör-uttryck. Den beskrivna metoden har utvecklats för att utreda hematopoetiska singel-celler, men har även använts framgångsrikt på andra celltyper.
Sammanfattningsvis kan det tillvägagångssätt som beskrivs häri för känsliga mätning av mRNA uttryck för en panel av förvalda gener med möjlighet att utveckla protokoll för efterföljande blivande isolering av molekylärt skilda subpopulationer.
Varje enskild blodkroppar tros uppehålla sig i en cellulär hierarki, där stamceller bildar apexen ovanpå en rad allt mer engagerad mellanliggande stamfäder som så småningom obotligt differentieras till de slutliga effektor celler bära särskilda biologiska funktioner1. Mycket av kunskapen om hur stamceller är organiserade har genererats i det hematopoetiska systemet, mycket på grund av förmågan att prospektivt isolera distinkta hematopoetiska populationer höganrikat för stamceller eller olika föräldraparets2 av FACS sortering. Detta har möjliggjort för många av dessa populationer ska analyseras funktionellt eller molekylärt, huvudsakligen genom genuttryck profilering3,4. Men när analysera genuttryck av bulk populationer individuella skillnader mellan celler är i genomsnitt och förlorade5. Således, oförmåga att upptäcka cell till cell variationer inom heterogen cell fraktioner kan blanda ihop vår förståelse av viktiga biologiska processer om små grupper av celler svarar för den antagna biologiska funktionen av att befolkningen6, 7. Omvänt, utredning av gen uttryck signaturer på encelliga upplösning erbjuda en möjlighet att avgränsa heterogenitet och kringgå överskuggande influenser från överrepresenterade grupper av celler8.
Hittills har det utvecklats många protokoll för enskild cell gene expression analys; med varje metod har sina egna varningar. Den tidigaste metoden var RNA fluorescerande i situ hybridisering (RNA-fisk), som mäter ett begränsat antal avskrifter i taget men är unik genom att den tillåter för utredning av RNA lokalisering9,11. Tidiga metoder med PCR och qPCR för att upptäcka en enda eller mycket få utskrifter var också utvecklat12. Dessa har dock nyligen ersatts av mikrofluidik-baserade metoder som kan samtidigt analysera uttrycket av hundratals avskrifter per cell i hundratals celler genom qPCR och således möjliggör högdimensionella heterogenitet analys med förutbestämd gen paneler10,13. Nyligen RNA-sekvensering-baserade tekniker har blivit allmänt används för enstaka cell analys, eftersom dessa teoretiskt kan mäta det hela transkriptom i en cell och därmed lägger en förberedande dimension till heterogenitet analys10, 14. multiplexöverförde qPCR analys och encelliga RNA-sekvensering har olika funktioner, motiven för att använda någon av metoderna beror alltså på den frågan samt antalet celler i målpopulationen. Den stora dataflöden och låg kostnad per cell tillsammans med opartisk, undersökande egenskaper hos encelliga RNA-sekvensering är önskvärda vid okänd cell eller stora populationer utforskas. Encelliga RNA-sekvensering är dock också vinklad mot sekvensering hög riklig avskrifter oftare medan avskrifter med låg överflöd är benägna att avhopp. Detta kan leda till betydligt komplexa data som sätter hög-krav på bioinformatiska analyser att avslöja viktiga molekylära signaler som ofta subtila eller dolda i teknisk buller15. Således för välkarakteriserad vävnader, encelliga qPCR analys använder förutbestämda primer paneler valts för funktionellt viktiga gener eller molekylära markörer kan fungera som en känslig, okomplicerad metod att bestämma heterogenitet en befolkningen. Det bör dock noteras som jämfört till encelliga RNA-seq, kostnaden per cell är generellt högre för encelliga qPCR metoder. Här, beskriver vi en strategi som kombinerar encelliga RTqPCR (modifierad från Teles J. et al. ( 16), FACS index sortering17 och bioinformatik analys18 för att samtidigt karaktärisera molekylära och immunophenotypic heterogenitet inom populationer.
I denna strategi, cell befolkningen av intresse är målat och singel-celler är sorterade efter FACS direkt i lyseringsbuffert i 96 brunnar PCR-plattor. Samtidigt, registreras uttrycksnivåerna för ytterligare en uppsättning cellytan markörer för varje enskild cell under FACS-sortering, en metod som kallas för index-sortering. Lyserat cell materialet förstärks efterhand och genuttrycket av en vald uppsättning gener analyseras med RT-qPCR, använder en mikroflödessystem plattform. Denna strategi möjliggör molekylär analys av sorterade encelliga liksom samtidiga karakterisering av varje enskild cell cellytan markör uttryck. Genom att mappa direkt molekylärt distinkta undergrupper av celler till uttrycket av indexerade sorterade markörer, kan subpopulationsna kopplas till en särskild immunophenotype som kan användas för deras blivande isolering. Metoden beskrivs steg för steg i figur 1. En förutbestämd gen-panel ytterligare bidrar till en högre upplösning av det riktade genuttrycket, eftersom det kringgår mätning av irrelevanta riklig gener som kan annars täppa subtila gen uttryck signaler. Dessutom tillåter den specifik amplifiering, ett steg omvänd Transkription och förstärkning för robust mätning av låga uttryckt avskrifter, som transkriptionsfaktorer eller icke-poly-adenylated RNAs. Ännu viktigare, tillåta qPCR metoder för mätning av mRNA från fusionsproteiner, som är viktigt när du undersöker vissa maligna sjukdomar19. Slutligen, fokuserad antalet gener undersökas, låg i förtid, och begränsade tekniska skillnader mellan cellerna gör denna metod analyseras enkelt jämfört med högre dimensionell metoder, såsom encelliga RNA-följande punkter Genom att följa protokollet, kan ett hela experiment utföras, från sortering celler till analyserade resultat, inom tre dagar, vilket gör detta till en okomplicerad och snabb metod för känslig, hög genomströmning encelliga gen uttryck analys.
Under de senaste åren har enskild cell gene expression analys blivit ett värdefullt tillskott till definiera olika cell populationer23heterogenitet. Tillkomsten av RNA-sekvensering teknik ger teoretiskt en möjlighet för att mäta den hela transkriptom till en cell, men dessa metoder är kompliceras av variationer i cell-till-cell sekvensering djup och drop-outs. Encelliga qPCR erbjuder en känslig och robust analys av uttrycket av hundratals kritiska gener där alla celler behandlas på samma …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från Cancerfonden, Vetenskapsrådet, Svenska Sällskapet för medicinsk forskning, The Barncancerfonden, The Ragnar Söderbergs stiftelse, och från Knut och Alice Wallenbergs stiftelse
CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
FBS | HyClone | SV30160.3 | |
PBS | HyClone | SH30028.02 | |
96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
TPO | Peprotech | 300-18 | |
SCF | Peprotech | 300-07 | |
FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
CST beads | BD | 642412 | |
Accudrop Beads | BD | 345249 | 6-µm particles |
Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
10mM dNTP | Takara | 4030 | |
0.1M DTT | Invitrogen | P2325 | |
RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
2X Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
20X Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
20X GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
Excel | Microsoft | Microsoft | |
FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |