Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو إجراء التهجين في الموقع على عينات المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. هذا أسلوب نوعية المستخدمة لتصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين.
Abstract
الشعاب المرجانية هي اللافقاريات المحيطات الهامة ذات الأهمية الحاسمة للصحة العامة في المحيطات، فضلا عن صحة الإنسان. ومع ذلك، بسبب التأثيرات البشرية مثل ارتفاع درجات حرارة المحيطات وتحمض المحيطات، الشعاب المرجانية يتزايد تحت التهديد. للتصدي لهذه التحديات، أثبتت التطورات في الخلية والبيولوجيا الجزيئية أن تكون حاسمة بالنسبة لتشخيص صحة الشعاب المرجانية. تعديل بعض التقنيات التي يشيع استخدامها في الطب البشري يمكن أن تحسن كثيرا من قدرة الباحثين على علاج وحفظ الشعاب المرجانية. لمعالجة هذا الوضع، قد وضع بروتوكول التهجين في الموقع تستخدم أساسا في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري تطويعها للاستخدام في الشعاب المرجانية الكبار تحت الضغط.
والغرض من هذا الأسلوب هو تصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق الجيش الملكي النيبالي في أنسجة المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. ويركز هذا الأسلوب على إزالة البارافين والاماهه للعينة، والمعالجة الأولية للعينة لضمان نفاذية العينة، التهجين ما قبل الحضانة، التهجين لمسبار الحمض النووي الريبي، والتصور لمسبار الحمض النووي الريبي. هذا أسلوب قوية عند استخدام الكائنات الحية غير نموذجية لاكتشاف حيث يتم التعبير عن الجينات محددة، والبروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لغيرها من الكائنات غير نموذجية. ومع ذلك، يقتصر الأسلوب في ذلك فإن النوعية في المقام الأول، نظراً لكثافة التعبير يمكن أن تختلف تبعاً لمقدار الوقت المستخدمة أثناء الخطوة التصور وتركيز التحقيق. وعلاوة على ذلك، الصبر مطلوب، كما هذا البروتوكول يمكن أن تصل إلى 5 أيام (وفي كثير من الحالات، أطول) استناداً إلى أن التحقيق يجري استخدامها. وأخيراً، تلوين الخلفية غير محددة أمر شائع، ولكن يمكن التغلب على هذا القيد.
Introduction
الشعاب المرجانية منشئي النظم الإيكولوجية الحرجة والهامة للتنوع البيولوجي في المحيطات وصحة الإنسان1،،من23. أنها تتعرض للتهديد بسبب تغير المناخ وغيرها من الضغوطات البشرية المنشأ، وتعتبر العديد من الأنواع المرجانية المهددة. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لأدوات الخلوية والجزيئية لتشخيص الشعاب المرجانية تحت الضغط. أيضا، هناك القليل من المعلوم حول حيث يتم التعبير عن الجينات داخل أنسجة المرجان الكبار، وذلك القليل فهم وظائف هذه الجينات. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد تكيفت في الموقع التهجين (العش) البروتوكول، يشيع استخدامها في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري، لاستخدامها في عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين المرجان الكبار. هذا الأسلوب أقوى عندما تستخدم على الشعاب المرجانية الكبار التي شهدت حدثاً ضاغطة مثل التعرض للإجهاد الحراري. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدامها على مجموعة واسعة من الأنسجة ومراحل الحياة في الشعاب المرجانية ولا يقتصر على فقط أكد الحرارة المرجان4،،من67. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب في أنسجة أو خلايا من أي تواليات طالما هناك كدنا تسلسل المعلومات المتاحة.
والغرض من هذا الأسلوب هو تصور تحقيقات الجيش الملكي النيبالي داخل أنسجة المرجان الكبار التي تم الحفاظ عليها وجزءاً لا يتجزأ من البارافين ومقطوع على الشرائح. هذا الأسلوب هو أداة تشخيصية قوية تسمح لتصور الأحماض النووية داخل أنسجة المرجان الكبار. وقد وضعت في البداية هذا الأسلوب للتشخيص الطبي، ومنذ ذلك الحين أصبح أداة شعبية في مجالات مثل علم الأحياء التنموي وعلم الأحياء التنموي التطوري8،،من910. ايش أيضا طريقة حاسمة، لا سيما في نظم غير نموذجية، عندما الجينوم وترانسكريبتوميك تسلسل البيانات متوفرة ولكن أنماط التعبير الجيني المكاني غير معروفة. للحصول على عمل التشخيص في نظم غير نموذجية، هذا الأسلوب قوية نظراً لأنه يمكن الإشارة إلى الخلايا والأنسجة التي التعبير عن جين للفائدة، ويمكن أن يؤدي إلى أكثر النهج العلاجية المستهدفة8،،من910، 11،12. وأخيراً، أن هذا الأسلوب النوعية وأكثر قوة عندما يقترن مع البيانات التعبير الجيني الكمي11.
النهج المبين في هذه الورقة سوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستطيعون مصممة بالفعل ديجوكسيجينين (حفر)-المسمى مسبار الحمض النووي الريبي (مجسات الإحساس وأنتيسينسي على السواء)، وهي الآن جاهزة لأداء التهجين في الموقع للتحقيقات بعينه. لتنفيذ هذا الأسلوب، سوف يلزم قسمين المسلسل من الأنسجة البارافين الشعاب المرجانية لكل التحقيقات التي يجري اختبارها. سيتم استخدام مقطع واحد للتحقيق المعني وأخرى للتحقيق العقاقير. التحقيق المعني سيكون عنصر تحكم للإشارة إلى الربط غير محددة. إذا تلطيخ الملاحظ في الإحساس بالتحقيق، ثم التحقيق العقاقير ليست محددة للجيش الملكي النيبالي للفائدة. يمكن تصميم المجسات للجينات أي أعرب. تستخدم العديد من الأمثلة في هذا البروتوكول، التي تم العثور عليها قبل أن يتم التعبير عنها من خلال الإجهاد الحراري في الشعاب المرجانية: فبج osteosarcoma مورين السرطاني الفيروسية هومولوج ب (المنحدر-ب)، البروتين المنشط (AP1)، وعامل نخر الورم مستقبلات 41 (41 تنفر)11. ايش استخدام المسابير المسمى حفر الجيش الملكي النيبالي المفضل على مدى استخدام المجسات الإشعاعية سبب تعاملها كثير أكثر أماناً من10. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هي حساسة للغاية ويمكن أن يؤديها على طائفة واسعة من الأنسجة والأجنة خارج الشعاب المرجانية الكبار أكد الحرارة13،14،،من1516.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إزالة البارافين
تحذير: الخطوات التالية تحت غطاء دخان.
- دو الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين رقيقة-مقطوع بنسبة 100% زيلين نفط تحت غطاء محرك السيارة في الزجاج كوبلين الجرار لمدة 10 دقائق. لا تستخدم البلاستيك كوبلين الجرار، كما زيلين نفط يذوب البلاستيك. تعقيم الزجاجات كوبلين في اﻷوتوكﻻف قبل الاستخدام.
- إعداد أربعة الجرار كوبلين زجاج معقمة بما يلي: الإيثانول 100%، الإيثانول 80%، 70% إيثانول والايثانول 60%. تمييع الإيثانول مع المياه خالية من رناسي.
- نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 100% ونقع عليها لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقيقة، إفراغ جرة كوبلين الزجاج واستبدالها جديدة 100% إيثانول. نقع الشرائح مرة أخرى لمدة 10 دقائق.
- نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 80% لمدة 1 دقيقة.
- نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 70% لمدة 1 دقيقة.
- نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 60% لمدة 1 دقيقة.
2-المعالجة المسبقة للشرائح لإعداد التهجين مسبار الحمض النووي الريبي
- أداء يغسل التالية في درجة حرارة الغرفة، ما لم يحدد خلاف ذلك. تنفيذ يغسل درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري بسرعة بطيئة. استخدام الشريحة العقيمة بريدية مع الغرفة لمدة تصل إلى خمس شرائح لغسل الشرائح.
- نقل الشرائح إلى الإرسال شريحة عقيمة مع 18 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- من أجل إيقاف برنامج تلفزيوني 1 x، وعلاج الأنسجة مباشرة على الشرائح مع بروتيناز ك لتمكين المسبار اختراق الأنسجة. إضافة حوالي 18 مل من محلول بروتيناز ك للإرسال الشريحة (انظر الجدول 1 للعمل تركيز الحل). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لا يهز.
- بينما هي تفرخ الشرائح، إعداد المخزن المؤقت بريهيبريديزيشن (بريهيبي المخزن المؤقت). وضع المخزن المؤقت بريهيبي في حمام مائي يغلي لمدة 10 دقائق، ثم تبرد في حمام الثلج لمدة 5 دقائق. لوصفه من المخزن المؤقت بريهيبي، انظر الجدول 1.
- وقف الهضم من رد فعل بروتيناز ك بصب حل بروتيناز ك، وفورا إضافة 18 مل من محلول جليكاين-برنامج تلفزيوني 0.2% للإرسال الشريحة. واسمحوا الإرسال الشريحة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- من أجل حل جليكاين-برنامج تلفزيوني 0.2% وإضافة مل 18 من محلول سترات الصوديوم المالحة (SSC) x 2 لكل مرسل بريد الشريحة. يغسل الشرائح في 2 x SSC لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع الهز 100-150 لفة في الدقيقة.
3-بريهيبريديزيشن شرائح استعدادا التهجين مسبار الحمض النووي الريبي
- في حين يجري غسلها الشرائح مع 2 x SSC، الحصول الإرسال عقيمة شريحة جديدة ووضع حوالي 18 مل بريهيبي المخزن المؤقت للإرسال الشريحة. مكان الإرسال الشريحة في الفرن التهجين في درجة حرارة التهجين.
ملاحظة: درجة حرارة التهجين سوف تعتمد على التحقيق يجري استخدامها ولكن عادة ما يتراوح بين 50-60 درجة مئوية. - وبمجرد الانتهاء من الغسيل x SSC 2، صب 2 × التعاون بين بلدان الجنوب، ووضع الشرائح داخل الإرسال الشريحة في المخزن المؤقت بريهيبي في الفرن التهجين ح 1.
4-التهجين لمسبار الحمض النووي الريبي
- بينما هي تفرخ الشرائح مع المخزن المؤقت بريهيبي في الفرن التهجين، إعداد الحل التهجين-التحقيق.
- تمييع التحقيق كل في التهجين المخزن المؤقت (0.5 ميليلتر للتحقيق مع 24.5 ميليلتر من التهجين المخزن المؤقت).
ملاحظة: يتم العثور على وصفه التهجين المخزن المؤقت في الجدول 1. يمكن العثور على مثال لإعداد التحقيق وتركيزات في نولز ترايلور et al. 11. - وضع المسبار المخفف على كتلة حرارة 86-90 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة، ثم يبرد لمدة 1 دقيقة على الجليد.
- تمييع التحقيق كل في التهجين المخزن المؤقت (0.5 ميليلتر للتحقيق مع 24.5 ميليلتر من التهجين المخزن المؤقت).
- قم بإزالة الإرسال الشرائح من الفرن التهجين وفردياً الشرائح من الإرسال الشريحة باستخدام ملاقط معقمة. وضع الشرائح منبسطة على منشفة ورقية، وتمحو بعناية زائدة بريهيبي العازلة حول عينات الأنسجة. يجب الحرص على عدم لمس العينات، والعمل بسرعة لمنع تجفيف عينات الأنسجة.
- تطويق الأنسجة بقلم PAP. تطبيق 25 ميليلتر الحل مسبار المخفف مع ماصة وتغطي العينة مع ساترة بلاستيك.
- وضع العينات في الدائرة الرطوبة الشريحة مع 4 × SSC + 50% ميثلامين الحل في الجزء السفلي من الدائرة.
- حالما تتم إضافة مجسات لكافة الشرائح، ضع دائرة الرطوبة الشريحة في الفرن التهجين لمالا يقل عن 24 ساعة عند درجة حرارة تهجين من 50-60 درجة مئوية. فترة حضانة المرض يمكن أن تختلف تبعاً لتركيز التحقيق ولكن يجب أن يكون لمدة 24 ساعة على الأقل.
- بعد الحصول على الحضانة بين عشية وضحاها مع تحقيقات المخفف، إزالة الدائرة رطوبة الشرائح من الفرن التهجين.
- إزالة كوفيرسليبس من كل الشرائح، مع الحرص على عدم تشريد الأنسجة. في ماصة 1000 ميليلتر، إضافة 1000 ميليلتر من 2 x SSC الحل ولطف يغسل الشريحة.
- ضع الشريحة في الإرسال شريحة عقيمة مع 18 من مل من محلول x SSC 2 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. من أجل الخروج الحل واستبدالها ب 18 مل 2 جديدة x SSC. كرر في الحضانة مرة أخرى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
- من أجل حل x SSC 2. إضافة مل 18 1 حل x SSC والمياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. من أجل حل x SSC 1 واستبدله 18 مل 1 جديدة x SSC. كرر في الحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
- صب 1 x SSC. إضافة 18 مل 0.5 × التعاون بين بلدان الجنوب، والمياه والصرف الصحي لمدة 10 دقائق في 42 درجة مئوية دون المصافحة. صب 0.5 x SSC واستبدال فإنه مع 18 مل 0.5 الطازجة x SSC. أغسل مرة أخرى لمدة 10 دقائق في 42 درجة مئوية دون المصافحة.
5-التصور من مسبار الحمض النووي الريبي
ملاحظة: لتصور التحقيق، سيتم استخدام الأرجواني BM خلال عملية التنمية. ومع ذلك، قبل هذه الخطوة، يغسل عدة مطلوبة لإعداد العينات لتلطيخ.
- يغسل الشرائح مع 18 مل من المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوي (AP-المخزن المؤقت) دون مجكل2 ل 1 دقيقة صب AP-المخزن المؤقت دون مجكل2، وإضافة 18 مل من س 1 بورينجر مانهايم حظر المخزن المخفف مع المخزن المؤقت لحمض الماليك. احتضانها لعلى الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الإرسال شريحة مع الهز لطيف.
ملاحظة: premade بورينجر مانهايم حظر المخزن المؤقت وحمض الماليك المخزن المؤقت المستخدم والتي تم شراؤها في حفر المياه والصرف الصحي وتعيين المخزن المؤقت كتلة (متاح تجارياً).- وبدلاً من ذلك، يمكن أن يؤديها الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. سوف يقلل من فترة أطول حظر ظهور الربط غير محددة.
- إعداد 20 مل المخفف حفر المضادة-ديجوكسيجينين-AP القوات المسلحة البوروندية الشظايا (الأجسام المضادة حفر = 2 ميليلتر من الأجسام المضادة حفر + 20 مل 1 × بورينجر مانهايم حظر المخزن المؤقت). وهذا ما يكفي لاستخدامها في 1 الشريحة البلاستيكية الإرسال. يجب أن يكون مستعدا أكثر من هذا الحل إذا كان يمكن استخدام الإرسال شريحة واحدة أو أكثر.
- إضافة الأجسام المضادة حفر الإرسال عقيمة شريحة جديدة، ونقل الشرائح إلى الإرسال الشريحة مع الحل حفر المضادة الأجسام المضادة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 3 مع الهز لطيف.
- وبعد الحضانة، صب الأجسام المضادة حفر ويغسل الشرائح في الإرسال الشريحة مع 18 مل من AP-المخزن المؤقت دون مجكل2 لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
- صب AP-المخزن المؤقت دون مجكل2، وإضافة 18 مل من AP-المخزن المؤقت. المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف. بعد الاحتضان 5 دقيقة، من أجل إيقاف AP-المخزن المؤقت واستبدله مع 18 مل الطازجة AP-المخزن المؤقت ويغسل لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
- في الظلام، وصب AP-المخزن المؤقت وإضافة 18 مل BM الأرجواني للإرسال الشريحة. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام، والتحقق من وضع اللون الأرجواني سوف تختلف كل مرة رد فعل ½ h. للتصور استناداً إلى التحقيق الذي يجري.
ملاحظة: بدلاً من التصور BM الأرجواني، وتطوير الحل يمكن باستخدام 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (بسب) وتيترازوليوم نيترو الأزرق (NBT). انظر الجدول 1 للحصول على إرشادات. - وقف التنمية اللون بنقل الشرائح إلى الإرسال عقيمة شريحة جديدة مع 18 مل من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
- من أجل إيقاف المخزن المؤقت الشركة المصرية للاتصالات وإضافة 18 مل مياه خالية من رناسي للإرسال الشريحة والغسيل لمدة 1 دقيقة، في الظلام.
- إزالة الشرائح من الماء، وتجف لهم حول حواف الأنسجة. إضافة والغليسيرول تصاعد المتوسطة ووضع في كوفيرسليبس. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية حتى الصور على استعداد لاتخاذها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد الانتهاء من هذا البروتوكول، وسيتم تحقيق تحديد الخلايا والأنسجة التي تعرب عن مسبار الحمض النووي الريبي للفائدة. نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول لوكالة اسوشييتد برس-1 وفوسب و TNFR41. هذه النتائج، التي نشرتها سابقا نولز ترايلور et al. 11، يسبر إظهار التعبير المكاني للجيش الملكي النيبالي على الكبار من الشعاب المرجانية التي تعرضت للإجهاد الحراري. وترد أمثلة اثنين من مختلف أنواع المصبوغة في الشكل 1. الشكل 1A مثال لتلطيخ الأنسجة منتشر. تم العثور على وصمة عار في جميع أنحاء الأنسجة، ليس فقط في خلايا معينة. هنا، هو العثور على التعبير عن معنى المضادة AP-1 في جميع أنحاء البشرة و الفم جاستروديرميس11 (الشكل 1A). تلطيخ منتشر ومعزولة لا إلى نوع واحد من الخلايا المحددة. لهذا النوع من تلطيخ، أنها حرجة بشكل خاص لتشغيل عنصر تحكم شعور في نفس الوقت، كما أن بعض النتائج قد يكون بسبب تلطيخ غير محددة.
أما النوع الثاني من تلطيخ هو خلية على حدة، الذي يوجد وصمة عار فقط في أنواع معينة من الخلايا. فوسب (الشكل 1B) و TNFR41 (الشكل 1) إظهار هذا النوع من تلطيخ. واستخدمت كل هذه التحقيقات على عينات الأنسجة من الكبار من الشعاب المرجانية التي تعرضت ل إجهاد حرارة11. في لوحة معنى المضادة، من الملاحظ تلطيخ الأرجواني. وأعرب TNFR41 في أنواع مختلفة من كنيدوسيتيس، عائلة من أنواع الخلايا التي توجد فقط داخل اللاسعات (الشكل 1). على وجه التحديد، فإنه الملون نيماتوسيتيس التي تنتج عضية ماستيجوفوري ميكروباسيك (nematocysts) وسبيروسيتيس التي تنتج سبيروسيستس، تم العثور على كل شيء داخل البشرة أنسجة المرجان. نيماتوسيتيس توجد أيضا في طبقات أنسجة أخرى من المرجان، مثل كاليكوديرميس؛ بيد سبب تمزيقها المنجز في هذه العينة معينة، يمكن أن لا جمع تلك المعلومات. كما فوسب الملون كنيدوسيتيس ومحددة لكل من سبيروسيتيس ونيماتوسيتيس. لكل من هذه التحقيقات، أظهر سيطرة الشعور لا تلطيخ، مما يبين أن تلطيخ للتحقيق معنى مكافحة محددة في الواقع. هذه هي مجرد نوعين من النتائج التمثيلية (تلطيخ الأنسجة منتشر وتلطيخ خلية على حدة) المصبوغة التقنيات التي قد تكون موجودة مع أنواع مختلفة من المجسات. بسبب هذا التغير، من المهم لاستخدام عنصر تحكم شعور لتحديد تلطيخ غير محددة.
رقم 1: نتائج الممثل ايش الملون خلايا معينة. (A) في اللوحة الأولى، يظهر الشعور بالتحكم للتحقيق AP-1 أن تلطيخ صغيرة موجودة داخل الشريحة. في اللوحة الثانية، يظهر التحقيق معنى المضادة لوكالة اسوشييتد برس-1 أن تلطيخ مع هذا التحقيق منتشر في جميع أنحاء الأنسجة. وصمة محددة إلى جاستروديرميس عن طريق الفم والبشرة. مع هذا النوع من تلطيخ، من المهم لتشغيل عنصر تحكم شعور التأكد من أن تلطيخ الملاحظة المحددة. (ب) عنصر تحكم شعور للتحقيق فوسب في الفريق الأول يبين تلطيخ قليلاً الحالية. في اللوحة الثانية، التحقيق معنى المضادة فوسب يبين تلطيخ الخاصة سبيروسيتيس ونيماتوسيتيس، مع تلطيخ منتشر في جميع أنحاء جاستروديرميس البشرة والفم. (ج) في اللوحة الأولى، يظهر سيطرة الشعور للتحقيق 41 تنفر أن تلطيخ صغيرة موجودة على الشريحة. في اللوحة الثانية، يظهر التحقيق معنى المضادة تنفر 41 محددة تلطيخ داخل سبيروسيتيس، ونيماتوسيتيس، وماستيجوفوريس ميكروبلاستيك. المختصرات: سبيروسيتيس (SP)، سيمبيوديوم (SY)، نيماتوسيتي (شمال شرق)، ميكروباسيك ماستيجوفوريس (ملم)، والخلية التي تحتوي على سيمبيونت جاستروديرمال (سو). واستنسخ هذا الرقم مع إذن11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ملاحظة: وينبغي أن يتم تخفيف جميع مع الماء المعقم، "رناسي مجاناً" في الأواني الزجاجية يعقم. | |||
| المخزن المؤقت بريهيبي (50 مل) | إضافة | ||
| ميثلامين | 25 مل | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | مل 12.5 | ||
| الهيبارين 20 ملغ/مل | 0.1 مل | ||
| 50 X Denhardts | 5 مل | ||
| 20 ٪ توين-20 | 0.5 مل | ||
| الحزب الديمقراطي الصربي 20% | 0.5 مل | ||
| 10 ملغ/مل الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي (تجريدها قبل إضافة) | 2 مل | ||
| المياه "مجاناً رناسي" | 4.4 مل | ||
| ملاحظة: ويمكن إجراء الحل في أنبوب 50 مل disposible. ينبغي أن تكون الحيوانات المنوية السلمون التشويه والتحريف من الغليان على كتلة حرارة لمدة 5 دقائق قبل إضافة إلى الحل. | |||
| المخزن المؤقت التهجين (47 مل) | إضافة | ||
| ميثلامين | 25 مل | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | مل 12.5 | ||
| الهيبارين 20 ملغ/مل | 0.1 مل | ||
| 50 X Denhardts | 5 مل | ||
| 20 ٪ توين-20 | 0.5 مل | ||
| الحزب الديمقراطي الصربي 20% | 0.5 مل | ||
| 10 ملغ/مل الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي (تجريدها قبل إضافة) | 2 مل | ||
| المياه "مجاناً رناسي" | 1 مل | ||
| ملاحظة: ويمكن إجراء الحل في أنبوب 50 مل disposible. ينبغي أن تكون الحيوانات المنوية السلمون التشويه والتحريف من الغليان على كتلة حرارة لمدة 5 دقائق قبل إضافة إلى الحل. | |||
| 10 X PBS (1.0 لتر) | إضافة | ||
| 18.6 مم نة2بو4 | ز 2.56 | ||
| مم 84.1 Na2هبو4 | ز 11.94 | ||
| مم 1,750 كلوريد الصوديوم | ز 102.2 | ||
| ملاحظات: مزيج من الفوسفات في حوالي 800 مل من الماء لوحدة تخزين ل 1.0. فحص درجة الحموضة. ينبغي أن يكون 7.4 ± 0.4. خلاف ذلك ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم من HCl. إضافة كلوريد الصوديوم وبقية المياه. وبعد الأس الهيدروجيني هو اﻷوتوكﻻف المعدلة. | |||
| 20 X SSC (1.0 لتر) | إضافة | ||
| م 3 كلوريد الصوديوم | ز 175.3 | ||
| 0.3 سترات نا M | ز 88.2 | ||
| ملاحظات: خلط في حوالي 800 مل رناسي المياه مجاناً لجعل وحدة تخزين ل 1.0. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 4.5 والاوتوكلاف. | |||
| القلوية الفوسفاتيز (AP) العازلة ث/س مجكل2 (50 مل) | إضافة | ||
| كلوريد الصوديوم م 1 | مل 5.0 | ||
| 1 "م تريس"، pH 9.5 | مل 5.0 | ||
| 20 ٪ توين-20 | 1.25 مل | ||
| المياه "مجاناً رناسي" | مل 38.75 | ||
| ملاحظات: إعداد عادل قبل استخدامها في أنبوب 50 مل. | |||
| القلوية الفوسفاتيز (AP) العازلة (100 مل) | إضافة | ||
| كلوريد الصوديوم م 1 | مل 10.0 | ||
| مجكل م 12 | 5 مل | ||
| 1 "م تريس"، pH 9.5 | 10 مل | ||
| 20 ٪ توين-20 | 2.5 مل | ||
| المياه "مجاناً رناسي" | مل 72.5 | ||
| الملاحظات: إعداد مسبق فقط لاستخدام في أنبوب 50 مل. ستصبح غائمة بعد ساعات قليلة من الحل ولن يعد العمل لرد الفعل الأنزيمي. | |||
| الحل الركازة AP | إضافة | ||
| المخزن المؤقت لوكالة اسوشييتد برس | 25 مل | ||
| NBT | ماي 82.5 | ||
| بسب | ماي 82.5 | ||
| ملاحظات: يمكن استخدامه بدلاً من BM الأرجواني. إعداد عادل قبل استخدامها في أنبوب 50 مل. يبقى هذا الحل في الظلام يغطي الأنبوب في إحباط، والتحضير في ضوء انخفاض. | |||
| حل الأسهم بروتيناز ك (10 مغ/مل) | إضافة | ||
| بروتيناز ك | 10 ملغ | ||
| المياه "مجاناً رناسي" | 10 مل | ||
| ملاحظات: قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية. | |||
| ك بروتيناز يعمل الحل | إضافة | ||
| حل الأسهم بروتيناز ك | ماي 90 | ||
| 1 X برنامج تلفزيوني | مل 18 | ||
| ملاحظات: تجعل فقط قبل استخدامها للحصول على أفضل النتائج. | |||
| 0.2 الحل جليكاين-برنامج تلفزيوني % | إضافة | ||
| برنامج تلفزيوني X 10 | 45 مل | ||
| رناسي المياه مجاناً | مل 405 | ||
| جليكاين | ز 1 | ||
| الملاحظات: تعد في حاوية الزجاج يعقم. خلط في درجة حرارة الغرفة على طبق من ستيرير حتى يذوب جليكاين تماما. | |||
| بورينجر مانهايم حجب المخزن المؤقت (30 مل) (جزء من حفر المياه والصرف الصحي ومجموعة المخزن المؤقت كتلة) | إضافة | ||
| 10 × عرقلة الحل | 3 مل | ||
| 1 × حمض الماليك المخزن المؤقت | مل 27 | ||
| الملاحظات: جعل فقط قبل استخدامها للحصول على أفضل النتائج. استخدم الأسهم Blocking الحل وحمض الماليك المخزن المؤقت من "حفر المياه والصرف الصحي وكتلة-مجموعة المخزن المؤقت". | |||
| 4 X SSC – 50% ميثلامين (30 مل) | إضافة | ||
| 20 X SSC | مل 6 | ||
| ميثلامين 50% | مل 24 | ||
| ملاحظات: إعداد عادل قبل استخدامها في أنبوب 50 مل. إعداد تحت غطاء محرك السيارة في المختبر. | |||
| والغليسيرول تركيب وسائل الإعلام | إضافة | ||
| 50 مم تريس، pH 8.4 | ميليلتر 80 | ||
| الجلسرين | 20 ميليلتر | ||
الجدول 1: حلول لأداء الأسهم في الموقع التهجين. الجدول قائمة بالحلول الأسهم المختلفة اللازمة لهذا البروتوكول. وتقدر المبالغ الإجمالية لأداء بريدية الشريحة حوالي 2. ينصح بتعديل المبالغ الإجمالية استناداً إلى كمية الشرائح التي يتم معالجتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد تم تعديل الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول من الأعمال السابقة في البحوث الطبية والتطوري التنموي8،9،10،،من1217. هذا البروتوكول يركز على الفروق الدقيقة في التهجين في الموقع مع تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي المسمى حفر على الشعاب المرجانية الكبار، التي تم الحفاظ عليها وجزءاً لا يتجزأ من البارافين. هذا الأسلوب يمكن نقلها بسهولة إلى عينات من الكائنات الحية خارج الشعاب المرجانية التي كانت أيضا جزءا لا يتجزأ من البارافين. وأخيراً، يمكن تنفيذ هذا الأسلوب من خلال مراحل الحياة المختلفة من الشعاب المرجانية (مثلاً، اليرقة) أو في إطار الثقافات الخلية، ولكن البروتوكول المحدد قد تختلف هذه الأنواع من العينات ليست دائماً جزءا لا يتجزأ من البارافين5،6 .
وهناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول، بما في ذلك العلاج بروتيناز ك والتهجين للتحقيق، ووضع اللون للتحقيق. أثناء فترة العلاج بروتيناز ك، التوقيت مهم جداً. إذا كان العلاج أطول مما اقترحت، يمكن أن تصبح المتدهورة الأنسجة وأضرار. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يجري وقف بروتيناز ك رد فعل عند نقطة كامل الوقت المحدد. من المهم أيضا إبقاء العينة عند درجة حرارة ثابتة تهجين، كخفض درجة الحرارة يمكن أن يسبب غير محددة ملزمة للتحقيق وتعقيد النتائج. عند غسل إيقاف التحقيق، من المهم أن تأخذ كل شريحة من الفرن التهجين واحدة في كل مرة، بدلاً من الجميع في وقت واحد، لضمان أن لا هجن الشرائح مع التحقيق في درجة حرارة منخفضة. أيضا، غسيل شامل للشرائح بعد التهجين التحقيق سيساعد على منع الربط غير محددة. وأخيراً، التنمية لون من التحقيق إحدى الخطوات الحاسمة بعد ذاتي أكثر من هذه العملية. يمكن وضع الألوان بسهولة مبالغا فيه أو توقف قريبا جداً. هذه الخطوة تتطلب الصبر واليقظة لضمان أن تلطيخ الإفراط من الشرائح لا يحدث.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذا البروتوكول يمكن أن يكون عملية شاقة بسبب عدد الخطوات التي تنطوي عليها. إذا كان البروتوكول يعطي نتائج سلبية، ثم فمن الأفضل أن تبدأ بدراسة التحقيق معه للتأكد من أنها بمعنى المضادة (وليس بمعنى) التحقيق. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت الحلول القديمة، أنها تستحق إعادة أو الاستعاضة عنها حتى تكون طازجة عند تنفيذ هذا البروتوكول. يمكن تنفيذ التعديلات، مثل أطوال التهجين وحظر، تزيد من فرص التهجين مسبار أو تقليل كميات من الخلفية وتلطيخ غير محددة. نظراً للعدد الكبير من الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول، قد يكون من السهل أن تفقد المسار؛ ولذلك، من المهم البقاء في المنظمة، وتتبع فيها أجزاء من البروتوكول قد اكتملت. بالإضافة إلى ذلك، من المهم لضمان أن يتم تخطي أية خطوات، ولا هو خفض ذلك الوقت أثناء إينكوبيشنز ويغسل. هناك قاعدة جيدة من التجربة هو السماح لأطول بدلاً من يغسل أقصر التأكد من أن كافة الشرائح يتم تنظيفها جيدا.
الحد الأكبر من هذا الأسلوب أن النتائج ليست قابلة للقياس الكمي. هذا هو أسلوب نوعي، بالتضافر مع الأساليب الأخرى مثل الأنسجة، وترانسكريبتوميكس، والبروتينات، مفيدة للغاية. بسبب الاختلافات في أوقات التهجين، فضلا عن أوقات التصور الذاتي، قياس كثافة تلطيخ هو لم يتحقق بسهولة. ومن المغري أن أقول أن تحقيق يتم التعبير عن أكثر شدة إذا تبين كثافة أكبر، ولكن بسبب الاختلافات في هذا البروتوكول (مثل مقدار الوقت المسموح به لوضع اللون)، لا يمكن تحديد كميات التعبير الجيني.
هذا الأسلوب ليس أسلوب جديد في علم الأحياء؛ ومع ذلك، أنها واحدة لا تؤدي في كثير من الأحيان على الشعاب المرجانية الكبار. استخدام هذا الأسلوب على الشعاب المرجانية الكبار قوية جداً نظراً لأنها المراسي البيانات التعبير الجيني لانسجة أو خلية اكتب11. ترانسكريبتوميكس وعلم الجينوم وقد أصبحت أدوات قوية وشعبية في بيولوجيا الشعاب المرجانية؛ ومع ذلك، هذه الأساليب تتم عموما على homogenates الحيوان كله. وهذا يجعلها صعبة لتحديد أي أجزاء من المرجان يعبرون عن الجينات التي تهم، وهكذا أكثر تحديا لفهم الآليات الفعلية. يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام العش جنبا إلى جنب مع البيانات التعبير الجيني، اتباع نهج أكثر شمولاً لاين، وإلى أي مدى يتم التعبير عن الجينات. وهذا سوف يساعد كثيرا في فهم الآليات المسؤولة عن مسارات استجابة الإجهاد المختلفة في الشعاب المرجانية الكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل بجائزة لا. أوس-1323652 من خلال no.1012629 "الوطنية علوم المحيطات العلم ما بعد الدكتوراه زمالة مؤسسة" وجائزة من "مؤسسة ويلكوم بوروز برنامج تخصيب صندوق ما بعد الدكتوراه".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
