Summary
Målet med denne protokollen er å utføre i situ hybridisering på voksen coral prøver som er innebygd i parafin og delt på glass lysbilder. Dette er en kvalitativ metode som brukes til å visualisere romlige uttrykk for en RNA anti-følelse sonde i parafin-embedded vev.
Abstract
Korallene er viktig hav dyr som er kritiske for havet helse samt helse. Men på grunn av menneskelig virkninger som stigende hav temperaturer og ocean forsuring er koraller stadig under trussel. For å håndtere disse utfordringene, fremskritt i cellen og molekylærbiologi har vist seg for å være avgjørende for å diagnostisere helse koraller. Endre noen av teknikkene som vanligvis brukes i human medisin kan forbedre forskernes evne til å behandle og lagre koraller. For å løse dette, er en protokoll for i situ hybridisering brukt hovedsakelig i human medisin og evolusjonær utviklingsbiologi tilpasset for bruk i voksen koraller under stress.
Formålet med denne metoden er å visualisere romlige uttrykk for en RNA sonde i voksen coral vev som er innebygd i parafin og delt på glass lysbilder. Denne metoden fokuserer på fjerning av parafin og utvanning av utvalget, forbehandling av utvalget slik permeabilitet av prøven, før hybridisering inkubering, blanding av RNA sonden og visualisering av RNA sonden. Dette er en kraftig metode ved ikke-modellen organismer for å oppdage hvor bestemte gener som er uttrykt, og protokollen kan lett tilpasses for andre ikke-modellen organismer. Men er metoden begrenset i at det er primært kvalitative, fordi uttrykket intensitet kan variere avhengig av hvor mye tid brukt under visualisering trinnet og konsentrasjonen av sonden. Videre er tålmodighet nødvendig, som denne protokollen kan ta opptil 5 dager (og i mange tilfeller lengre) avhengig av proben som brukes. Til slutt, ikke-spesifikke bakgrunnen flekker er vanlig, men denne begrensningen kan overvinnes.
Introduction
Koraller er kritisk økosystem byggherrer og viktig for biologisk mangfold i havet og helse1,2,3. De er truet klimaendringer og andre menneskeskapte stressfaktorer, og mange korallrev er betraktet som kritisk truet. Dermed er det et betydelig behov for mobilnettet og molekylære verktøy å diagnostisere koraller under stress. Også er det lite forstått om hvor gener som er uttrykt i voksen coral vev og derfor liten forståelse av funksjonene til disse genene. For å løse dette problemet, har vi tilpasset i situ hybridisering (ISH) protokollen, vanligvis brukes i human medisin og evolusjonær utviklingsbiologi, for bruk på parafin-embedded vevsprøver av voksen koraller. Denne teknikken er mest effektive når de brukes på voksen koraller som har gjennomgått en trykk begivenhet som utsettes for varmestress. Men denne teknikken kan brukes på en rekke vev og stadier i koraller og er ikke begrenset til bare varme-stresset koraller4,6,7. I tillegg, kan denne teknikken brukes på vev eller celler av noen metazoan så lenge det finnes cDNA oppstartsrekkefølgen.
Formålet med denne metoden er å visualisere RNA sonder i voksen coral vev som har blitt bevart og innebygd i parafin og delt på lysbilder. Denne metoden er en kraftig diagnoseverktøy som gir visualisering av nukleinsyrer i voksen coral vev. Utgangspunktet denne metoden ble utviklet for medisinsk diagnostikk, og det har siden blitt et populært verktøy i områder som utviklingsbiologi og evolusjonær utviklingsbiologi8,9,10. ISH er også en viktig metode, spesielt i ikke-modellen systemer, når genomisk og transcriptomic sekvens data finnes men romlige gene expression mønstre er ukjent. Diagnostiske arbeid i ikke-modellen systemer er denne teknikken kraftig fordi indikere hvilke celler og vev express en genet av interesse og kan føre til mer målrettet terapeutiske metoder8,9,10, 11,12. Endelig er denne teknikken kvalitativ og kraftigere når sammenkoblet med kvantitativ gene expression data11.
Framgangsmåte som er skissert i denne utredningen vil være av interesse for forskere som har allerede utformet en digoxigenin (graver)-merket RNA sonde (både fornuftig og antisense sonder) og er nå klar til å utføre i situ blanding av sonder et utvalg. For å utføre denne metoden, trengs to serielle deler av en parafin coral vev for hver probe testes. En del vil bli brukt for følelse sonden og den andre for antisense sonden. Følelse sonden vil være en kontroll for å angi ikke-spesifikk bindende. Hvis flekker er observert i følelse sonden, så er antisense sonden ikke spesifikke for RNA rundt. Sonder kan være konstruert for noen genet uttrykt. I denne protokollen, flere eksempler brukes som fantes tidligere til uttrykk under varmestress i koraller: FBJ murint osteosarcoma viral oncogene homolog B (Fos-B), aktivator protein (AP1), og Tumor nekrose faktor reseptor 41 (TNFR 41)11. ISH bruker grave-merket RNA sonder er foretrukket over bruker radioaktivt sonder fordi deres er mye tryggere10. Dessuten, denne teknikken er svært følsom og kan utføres på et bredt spekter av vev og embryo utover varme-stresset voksen koraller13,14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fjerning av parafin
FORHOLDSREGEL: Utføre følgende under avtrekksvifte.
- Dewax tynn-delt parafin-embedded lysbildene med 100% xylen under panseret i glass Coplin glass i 10 min. Ikke bruk plast Coplin krukker, som xylen smelter plast. Sterilisere Coplin glassene i en autoklav før bruk.
- Forberede fire sterilt glass Coplin krukker med følgende: 100% etanol, 80% etanol, 70% etanol og 60% etanol. Fortynne etanol med RNase-fritt vann.
- Overføre lysbildene til sterilt Coplin glasskrukke med 100% etanol og suge dem i 10 min. Etter 10 min, tomme Coplin glasskrukke og erstatte med ny 100% etanol. Nyt lysbildene for 10 min.
- Overføre lysbildene til sterilt Coplin glasskrukke med 80% etanol for 1 min.
- Overføre lysbildene til sterilt Coplin glasskrukke med 70% etanol for 1 min.
- Overføre lysbildene til sterilt Coplin glasskrukke med 60% etanol for 1 min.
2. forbehandling lysbilder for utarbeidelse av RNA sonde hybridisering
- Utføre de følgende vasker i romtemperatur, hvis angitt. Utføre romtemperatur vasker på en orbital shaker i sakte fart. Bruk sterilt lysbildet postkort med plass til opptil fem lysbilder for vask av lysbildene.
- Overføre lysbilder til en steril lysbildet mailer med 18 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS). Vask for 5 min ved romtemperatur.
- Hell av 1 x PBS, og umiddelbart behandle vev på lysbildene med proteinasen K aktivere sonde penetrasjon av vev. Legge til ca 18 mL av proteinasen K løsning i lysbildet mailer (se tabell 1 for arbeider løsning konsentrasjon). Ruge på 37 ° C i 15 min. Ikke riste.
- Mens lysbildene er incubating, forberede prehybridization bufferen (Prehybe Buffer). Plasser Prehybe bufferen i kokende vannbad for 10 min, deretter avkjøles på en isbadet i 5 min. En oppskrift på Prehybe Buffer, se tabell 1.
- Stopp fordøyelsen av proteinasen K reaksjonen ved å helle proteinasen K løsningen, og umiddelbart legge 18 mL 0,2% glycine-PBS løsning til lysbildet mailer. La lysbildet mailer sitte ved romtemperatur i 5 minutter.
- Hell 0,2% glycine-PBS løsningen og legge til 18 mL av 2 x saltvann natriumsitrat (SSC) løsning i hvert lysbilde mailer. Vask lysbildene i 2 x SSC i 10 min i romtemperatur, med skjelvende på 100-150 rpm.
3. prehybridization lysbilder i forberedelse til RNA sonde hybridisering
- Mens lysbildene blir skylt med 2 x SSC, få en ny sterilt lysbildet mailer og ca 18 mL Prehybe Buffer inn lysbildet mailer. Plass slide mailer i hybridisering ovnen hybridisering temperatur.
Merk: Hybridisering temperaturen vil avhenge proben som brukes men vanligvis varierer fra 50-60 ° C. - Når 2 x SSC vask er fullført, helle ut 2 x SSC og sted lysbildene i lysbildet mailer i Prehybe Buffer i hybridisering ovnen i 1 time.
4. hybridisering av RNA sonde
- Mens lysbildene er incubating med Prehybe bufferen i hybridisering ovnen, forberede hybridisering-sonden løsning.
- Fortynn hver probe hybridisering buffer (0,5 µL av sonde med 24,5 µL av hybridisering buffer).
Merk: Oppskriften på hybridisering buffer finnes i tabell 1. Et eksempel på sonde forberedelse og konsentrasjoner finnes i Traylor-Knowles et al. 11. - Plassere utvannet sonden på en 86-90 ° C varme blokk i 12 minutter, deretter avkjøles i 1 min på is.
- Fortynn hver probe hybridisering buffer (0,5 µL av sonde med 24,5 µL av hybridisering buffer).
- Fjern lysbildet mailer fra hybridisering ovnen og individuelt fjerne lysbilder fra lysbildet mailer ved hjelp av sterile pinsett. Legg lysbildene flatt på et papirhåndkle og nøye tørke av overflødig Prehybe Buffer rundt vevsprøver. Være forsiktig med å ta prøvene, og arbeider raskt for å hindre tørking av de.
- Omslutter vev med en PAP. Bruke 25 µL av utvannet sonde løsning med en pipette, og dekker utvalget med en plast dekkglassvæske.
- Sett prøvene i lysbildet fuktighet kammeret med 4 x SSC + 50% formamide løsning i bunnen av kammeret.
- Når sonder har lagt til alle lysbildene, plasser lysbildet fuktighet kammeret i hybridisering ovnen i minst 24 timer på en hybridisering temperatur på 50-60 ° C. Inkubasjon tiden kan variere avhengig av konsentrasjonen av sonden, men bør være i minst 24 timer.
- Etter natten inkubasjon med fortynnet sonder, fjerne lysbilde fuktighet kammeret av hybridisering ovnen.
- Fjern coverslips fra hvert av lysbildene, være forsiktig med å fortrenge vevet. I en 1000 µL pipette, legge til 1000 µL av 2 x SSC løsning og forsiktig vaske lysbildet.
- Sett lysbildet i en steril lysbildet mailer med 18 mL 2 x SSC i 5 minutter ved romtemperatur. Hell løsningen og erstatte den med 18 mL av fersk 2 x SSC. Gjenta inkubering igjen for 5 min ved romtemperatur med mild risting.
- Hell 2 x SSC løsningen. Legge til 18 mL 1 x SSC løsning og vask for 5 min ved romtemperatur. Hell 1 x SSC løsningen og erstatte den med 18 mL frisk 1 x SSC. Gjenta inkubasjonstiden for 5 min ved romtemperatur med mild risting.
- Utøse 1 x SSC. Legge til 18 mL 0.5 x SSC og vask for 10 min på 42 ° C uten risting. Utøse 0.5 x SSC og erstatte den med 18 mL frisk 0,5 x SSC. Vask igjen for 10 min på 42 ° C uten å riste.
5. visualisering av RNA sonde
Merk: For å visualisere sonden, BM lilla brukes under utviklingsprosessen. Men før dette trinnet er flere vasker nødvendig for å forberede prøvene flekker.
- Vask lysbildene med 18 mL alkalisk fosfatase buffer (AP-buffer) uten MgCl2 i 1 utøse AP-Buffer uten MgCl2, og legge til 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim blokkerer bufferen fortynnet med maleic syre buffer. Inkuber minst 1t ved romtemperatur i en lysbilde-mailer med mild risting.
Merk: Boehringer-Mannheim blokkerer buffer og maleic syre buffer brukt var tidlig og kjøpt i grave vask og blokk Buffer angitt (tilgjengelig kommersielt).- Alternativt kan inkubasjon overnatting på 4 ° C utføres. En lenger blokkerer periode vil redusere fremkomsten av ikke-spesifikk bindende.
- Forberede den 20 mL utvannet grave anti-digoxigenin-AP Fab fragmenter (anti-grave antistoff = 2 µL av anti-grave antistoff + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim blokkerer buffer). Dette er nok for bruk i 1 plast slide mailer. Mer av denne løsningen må være forberedt hvis mer enn ett lysbilde mailer som skal brukes.
- Legg anti-grave antistoffer til en ny sterilt lysbildet mailer, og overføre lysbildene til lysbildet mailer med anti-grave antistoff løsning. Inkuber ved romtemperatur for 3t med mild risting.
- Inkubasjon utøse anti-grave antistoffer og vaskes lysbildene i lysbildet mailer med 18 mL AP-Buffer uten MgCl2 i 5 min med mild risting.
- Utøse AP-Buffer uten MgCl2, og legge til 18 mL av AP-Buffer. Vask for 5 min med mild risting. Etter 5 min incubation, hell av AP-Buffer, erstatte den med 18 mL frisk AP-Buffer og vasker for 5 min med mild risting.
- I mørket, helle ut AP-bufferen og legge til 18 mL BM lilla lysbildet mailer. Inkuber lysbildene ved romtemperatur i mørket, søker etter lilla farge utvikling hver ½ h. reaksjonstid for visualisering vil variere basert på sonden som er utviklet.
Merk: I stedet for BM lilla visualisering, utviklingsløsning kan gjøres ved hjelp av 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) og nitro blå tetrazolium (NBT). Se tabell 1 for instruksjoner. - Avbryte ved å overføre lysbilder til en ny sterilt lysbildet mailer med 18 mL Tris-EDTA (TE) bufferen for 5 min i romtemperatur, i mørket.
- Hell av TE buffer og legge 18 mL RNase gratis vann til lysbildet mailer og vask for 1 min, i mørket.
- Fjern lysbildene fra vann, og tørk dem rundt kantene av vev. Legge til glyserol montering medium og plass i coverslips. Lagre lysbilder på 4 ° C før bildene er klar å bli tatt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du har fullført denne protokollen, vil identifikasjon av celler og vev som uttrykker RNA sonden av interesse oppnås. Representant resultatene for denne protokollen er for AP-1, FosB og TNFR41. Disse resultatene, tidligere utgitt av Traylor-Knowles et al. 11: Vis romlige uttrykk for RNA sonder på voksen koraller som var utsatt for varmestress. To eksempler på ulike flekker presenteres i figur 1. Figur 1A er et eksempel på diffus vev flekker. Flekken er funnet gjennom vevet, ikke bare i bestemte celler. Her finnes uttrykk for anti-følelse AP-1 gjennom overhuden og muntlig gastrodermis11 (figur 1A). Den flekker er diffus og ikke segregerte til en bestemt celle type. For denne typen flekker er det spesielt viktig å kjøre en følelse kontroll samtidig, som noen av resultatene kan skyldes ikke-spesifikk farging.
Den andre typen flekker er celle-spesifikk, der flekken finnes bare i spesifikke celletyper. Både FosB (figur 1B) og TNFR41 (figur 1 c) Vis denne typen flekker. Begge disse sonder ble brukt på vevsprøver av voksen koraller som hadde vært utsatt for en varme stress11. I panelet anti-følelse er lilla flekker observert. TNFR41 ble uttrykt i forskjellige typer cnidocytes, en familie celletyper som finnes bare i Trichoplax (figur 1). Spesielt farget det nematocytes som produserer microbasic mastigophore organelle (nematocysts) og spirocytes som produserer spirocysts, alle funnet i epidermis coral vev. Nematocytes finnes også i andre vev lag av koraller, som calicodermis; men på grunn av at snitteprosessen på denne spesiell prøve, kan informasjonen ikke samles. FosB også farget cnidocytes og ble bestemt til både spirocytes og nematocytes. For begge disse sonder viste kontrollen følelse ingen flekker, som indikerer at den flekker for anti-følelse sonden var faktisk bestemt. Dette er bare to typer representant resultater (diffus vev flekker og celle-spesifikk farging) av flekker teknikker som kan finnes med ulike typer prober. Fordi denne variasjon er det viktig å bruke en følelse kontroll for å avgjøre ikke-spesifikk farging.
Figur 1: representant utfallet av ISH farget bestemte celler. (A) i første panelet viser følelse kontroll for AP-1 sonden at små flekker er til stede i lysbildet. I det andre panelet viser anti-følelse sonden for AP-1 at flekker med denne sonde er diffus gjennom vevet. Flekken er spesifikk for muntlig gastrodermis og epidermis. Med denne typen flekker er det avgjørende å kjøre en følelse kontroll for å sikre at den observerte flekker er bestemt. (B) en følelse kontroll for FosB sonden i første panelet viser liten flekker stede. I det andre panelet, anti-følelse sonden for FosB viser flekker spesifikk for spirocytes og nematocytes, med diffus flekker gjennom overhuden og muntlig gastrodermis. (C) i den første panelet viser kontrollen følelse for TNFR 41 sonden at små flekker finnes på lysbildet. I det andre panelet viser anti-følelse sonden for TNFR 41 bestemte flekker i spirocytes, nematocytes og microblastic mastigophores. Forkortelser: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (MM), symbiont inneholder gastrodermal celle (SU). Dette tallet ble gjengitt med tillatelse11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Merk: Alle fortynninger bør gjøres med steril, RNase gratis vann i autoklaveres glass. | |||
| Prehybe Buffer (50 mL) | LEGG TIL | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12.5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL laks Sperm DNA (denature ør) | 2 mL | ||
| RNase gratis | 4.4 mL | ||
| Merk: Løsningen kan gjøres i en disposible 50 mL tube. Laks Sperm bør bli denaturert kokende på varme blokk i 5 minutter før du legger til løsning. | |||
| Hybridisering Buffer (47 mL) | LEGG TIL | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4.5) | 12.5 mL | ||
| 20 mg/mL heparin | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20% Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20% SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL laks Sperm DNA (denature ør) | 2 mL | ||
| RNase gratis | 1 mL | ||
| Merk: Løsningen kan gjøres i en disposible 50 mL tube. Laks Sperm bør bli denaturert kokende på varme blokk i 5 minutter før du legger til løsning. | |||
| 10 X PBS (1.0 L) | LEGG TIL | ||
| 18.6 mM NaH2PO4 | 2.56 g | ||
| 84.1 mM Na2HPO4 | 11.94 g | ||
| 1.750 mM NaCl | 102.2 g | ||
| Notater: Bland fosfater i ca 800 mL vann for en 1,0 L volum. Sjekk pH. Det bør være 7,4 ± 0.4. Ellers justere pH 7,4 med NaOH av HCl. Legg NaCl og resten av vann. Etter at pH er justert autoclave. | |||
| 20 X SSC (1.0 L) | LEGG TIL | ||
| 3 M NaCl | 175.3 g | ||
| 0,3 M Na Citrate | 88.2 g | ||
| Notater: Bland i ca 800 mL RNase gratis vann å bringe et 1.0 L volum. Justere pH 4.5 og autoclave. | |||
| Alkalisk fosfatase (AP)-buffer uten MgCl2 (50 mL) | LEGG TIL | ||
| 1 M NaCl | 5.0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5.0 mL | ||
| 20% Tween-20 | 1,25 mL | ||
| RNase gratis | 38.75 mL | ||
| Notater: Forberede bare før bruk i en 50 mL tube. | |||
| Alkalisk fosfatase (AP) buffer (100 mL) | LEGG TIL | ||
| 1 M NaCl | 10,0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| 20% Tween-20 | 2,5 mL | ||
| RNase gratis | sine 72.5 mL | ||
| Notater: forberede bare før bruk i en 50 mL tube. Løsningen blir skyet etter noen timer og vil ikke lenger fungerer for den enzymatiske reaksjonen. | |||
| AP substratløsningen | LEGG TIL | ||
| AP Buffer | 25 mL | ||
| NBT | 82,5 uL | ||
| BCIP | 82,5 uL | ||
| Notater: Dette kan brukes i stedet for BM lilla. Forberede bare før bruk i en 50 mL tube. Hold denne løsningen i mørket ved dekker rør i folie, og forbereder i dårlig lys. | |||
| Proteinasen K lagerløsning (10 mg/mL) | LEGG TIL | ||
| Proteinasen K | 10 mg | ||
| RNase gratis | 10 mL | ||
| Notater: Aliquot og butikk på 20 ° C. | |||
| Proteinasen K arbeider løsning | LEGG TIL | ||
| Proteinasen K lagerløsning | 90 ul | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Notater: Gjør like før å bruke de beste resultatene. | |||
| 0,2% glycine-PBS løsning | LEGG TIL | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| RNase gratis vann | 405 mL | ||
| Glysin | 1 g | ||
| Notater: forberede i autoklaveres glassbeholder. Bland ved romtemperatur på en stirer plate til glysin er fullstendig oppløst. | |||
| Boehringer-Mannheim blokkerer Buffer (30 mL) (del av grave vaske og blokk Buffer sett) | LEGG TIL | ||
| 10 x blokkerer løsning | 3 mL | ||
| 1 x maleic syre buffer | 27 mL | ||
| Notater: gjøre bare før å bruke de beste resultatene. Blokkerer lagerløsning og maleic syre buffer ble brukt fra den "grave vask og blokk-Buffer sett". | |||
| 4 X SSC-50% formamide (30 mL) | LEGG TIL | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50% formamide | 24 mL | ||
| Notater: Forberede bare før bruk i 50 mL tube. Forberede under laboratoriet panseret. | |||
| Glyserol monterer medier | LEGG TIL | ||
| 50 mM Tris, pH 8.4 | 80 ΜL | ||
| Glyserol | 20 ΜL | ||
Tabell 1: lager løsninger for å utføre i situ hybridisering. Tabellen er en oversikt over de ulike lager løsningene nødvendig for denne protokollen. Totalbeløp er beregnet for ytelse av ca 2 lysbildet postkort. Det anbefales å justere totalbeløp basert på beløpet som blir behandlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet i denne protokollen er endret fra tidligere arbeid i medisinske og evolusjonære utviklingsmessige forskning8,9,10,12,17. Denne protokollen fokuserer på nyansene av en i situ hybridisering med en grave-merket RNA anti-følelse sonde på voksen koraller, som har blitt bevart og innebygd i parafin. Denne metoden kan enkelt overføres til prøver av organismer utover koraller som også er parafin-embedded. Endelig, denne metoden kan utføres under ulike stadier av koraller (f.eks, larve) eller i cellekulturer, men den nøyaktige protokollen kan variere ettersom disse typer eksempler ikke er alltid parafin-embedded5,6 .
Det er flere viktige trinn i denne protokollen, inkludert proteinasen K behandling, blanding av sonden, og farge utvikling av sonden. I løpet av proteinasen K behandling er timing svært viktig. Hvis behandlingen er lengre enn foreslått, kan vev bli degradert og skadet. I tillegg skal stoppe av proteinasen K reaksjonen utføres på full tidspunktet angitt. Det er også viktig å holde prøven ved konstant hybridisering temperatur, som senking av temperatur kan føre til ikke-spesifikk binding av sonden og komplisere resultater. Når vasket av sonden, er det viktig å ta hvert lysbilde av hybridisering ovnen en på en tid, snarere enn alle samtidig, slik at lysbildene ikke hybridize med sonde på en lav temperatur. Også grundig vask lysbildene etter sonde hybridization vil forhindre ikke-spesifikk bindende. Endelig er farge utvikling av sonden en av de mest kritiske ennå subjektive trinnene av denne prosessen. Farge utviklingen kan lett overdrevet eller stoppet for tidlig. Dette trinnet krever tålmodighet og årvåkenhet slik at over flekker lysbildene oppstår ikke.
Feilsøke denne protokollen kan være en skremmende prosess på grunn av trinnene involvert. Hvis protokollen gir negative resultater, så det er best å begynne med å undersøke sonden å sørge for at det er anti-følelse (og ikke forstand) sonde. I tillegg hvis løsningene er gammel, er det verdt remaking eller erstatter dem slik at de er frisk når du utfører denne protokollen. Endringer, for eksempel lengdene av hybridisering og blokkering, kan implementeres for å øke sjansene for sonden hybridisering eller redusere bakgrunnen og ikke-spesifikk farging. Mange av trinnene i denne protokollen, kan det være lett å miste oversikten; Derfor er det viktig å holde orden og spore hvilke deler av protokollen er fullført. I tillegg er det avgjørende å sikre at ingen trinn er hoppet over, og den tiden er ikke kuttet ned på incubations og vasker. En god tommelfingerregel er å tillate lengre enn kortere vasker slik at alle lysbildene rengjøres grundig.
Den største begrensningen med denne metoden er at resultatene ikke er kvantifiserbare. Dette er en kvalitativ metode som, sammen med andre metoder som histology, transcriptomics og Proteomikk, er veldig informativ. På grunn av variasjoner i hybridisering ganger, samt de subjektive tidspunkter visualisering gjøres kvantifisere intensiteten av den flekker lett ikke. Det er fristende å si at en sonde uttrykkes mer hvis det viser større intensitet, men på grunn av variasjoner i denne protokollen (for eksempel hvor mye tid farge utvikling), gene expression beløp kan ikke fastslås.
Denne teknikken er ikke en ny metode i biologi; men er det en ikke utføres ofte på voksen koraller. Bruk av denne metoden på voksen koraller er veldig kraftig fordi det forankrer genuttrykk data til en vev eller en celle type11. Transcriptomics og genomics har blitt populære verktøy i coral biologi; men er disse metodene vanligvis gjort på homogenates av hele dyret. Dette gjør det utfordrende å identifisere hvilke deler av koraller uttrykker genene rundt, og dermed mer utfordrende å forstå den faktiske mekanismene. Ved hjelp av ISH sammen med genuttrykk data oppnås en mer helhetlig tilnærming til hvor og i hvilken grad gener som er uttrykt. Dette vil hjelpe i forståelsen av mekanismene ansvarlig for ulike stress respons stier i voksen koraller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av prisen ikke. OCÉ-1323652 gjennom de National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship og award no.1012629 fra Burroughs Wellcome fondet postdoktor berikelse programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
