Summary
L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.
Abstract
Les coraux sont des invertébrés océan important qui sont essentiels pour la santé globale de l’océan, mais aussi la santé humaine. Toutefois, en raison des impacts anthropiques tels que la hausse des températures de l’océan et l’acidification des Océans, les coraux sont plus en plus sous la menace. Pour relever ces défis, les progrès en biologie cellulaire et moléculaire ont prouvé très importante pour le diagnostic de la santé des coraux. Modifiant certaines des techniques couramment utilisés en médecine humaine pourrait améliorer considérablement la capacité des chercheurs pour traiter et sauver les coraux. Pour y remédier, un protocole pour l’hybridation in situ , utilisé principalement pour la médecine humaine et biologie évolutive du développement a été adapté pour une utilisation chez les adultes coraux sous contrainte.
Le but de cette méthode est de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN dans le tissu corail adulte qui a été incorporé à la paraffine et sectionné sur lames de verre. Cette méthode met l’accent sur l’élimination de la paraffine et la réhydratation de l’échantillon, le prétraitement de l’échantillon afin d’assurer la perméabilité de l’échantillon, hybridation pré incubation, hybridation de la sonde d’ARN et la visualisation de la sonde d’ARN. Il s’agit d’une méthode puissante lors de l’utilisation des organismes non-modèles à découvrir où certains gènes sont exprimés, et le protocole peut être facilement adapté pour d’autres organismes non-modèle. Toutefois, la méthode est limitée car il s’agit avant tout qualitative, parce que l’intensité de l’expression peut varier selon la quantité de temps utilisé lors de l’étape de visualisation et de la concentration de la sonde. En outre, la patience est nécessaire, comme ce protocole peut prendre jusqu'à 5 jours (et dans bien des cas, plus longtemps), selon la sonde utilisée. Enfin, la coloration de fond non spécifique est commune, mais cette limitation peut être surmontée.
Introduction
Les coraux sont des bâtisseurs de l’écosystème critique et important pour la biodiversité dans l’océan et la santé humaine1,2,3. Ils sont menacés en raison des changements climatiques et autres facteurs de stress anthropiques, et nombreuses espèces de coraux sont considérés comme en danger critique d’extinction. Ainsi, il y a un besoin important pour des outils moléculaires et cellulaires diagnostiquer les coraux sous contrainte. En outre, il est peu compris sur où sont expriment des gènes dans le tissu corail adulte et donc peu de compréhension des fonctions de ces gènes. Pour résoudre ce problème, nous avons adapté le protocole de hybridation (ISH) in situ , couramment utilisé en médecine humaine et biologie évolutive du développement, pour une utilisation sur des échantillons de tissus inclus en paraffine de coraux adultes. Cette technique est plus performant lorsqu’il est utilisé sur des coraux adultes ayant subi un événement stressant, comme l’exposition au stress thermique. Cependant, cette technique peut être utilisée sur une large gamme de tissus et les étapes de la vie chez les coraux et n’est pas limitée à la seule chaleur coraux4,6,7. En outre, cette technique peut servir sur des tissus ou des cellules de n’importe quel métazoaires tant que les informations de séquence d’ADNc est disponible.
Le but de cette méthode consiste à visualiser les sondes d’ARN au sein du tissu corail adulte qui a été préservé et incorporé à la paraffine et sectionné sur glissières. Cette méthode est un outil de diagnostic puissant qui permet la visualisation des acides nucléiques dans le tissu corail adult. Initialement, cette méthode a été développée pour le diagnostic médical, et c’est désormais un outil populaire dans des domaines comme la biologie du développement et de la biologie évolutive du développement8,9,10. ISH est également une méthode critique, particulièrement dans les systèmes non-modèle, lorsque génomique et transcriptomique séquence des données sont disponibles, mais profils d’expression génique spatiale sont inconnus. Pour le travail de diagnostic dans les systèmes non-modèle, cette technique est puissante car il peut indiquer quelles cellules et des tissus exprimant un gène d’intérêt et peuvent conduire à plusieurs approches thérapeutiques ciblées8,9,10, 11,12. Enfin, cette technique est qualitative et plus puissant lorsqu’il est associé avec quantitative gene expression données11.
L’approche décrite dans cet article seront d’intérêt pour les chercheurs qui ont déjà conçu un digoxigénine (DIG)-étiqueté sonde d’ARN (les sens et antisens sondes) et sont maintenant prêts à effectuer l’hybridation in situ des sondes à un échantillon. Pour exécuter cette méthode, deux coupes sériées d’un tissu de paraffine corail seront nécessaire pour chaque sonde mis à l’essai. Une section servira pour la sonde de sens et l’autre pour la sonde antisense. La sonde de sens sera un contrôle pour indiquer les liaisons non spécifiques. Si la coloration est observée au niveau de la sonde de sens, puis la sonde antisense n’est pas spécifique à l’ARN d’intérêt. Sondes peuvent être conçus pour n’importe quel gène exprimé. Dans ce protocole, plusieurs exemples sont utilisés qui ont été précédemment trouvés à s’exprimer au cours d’un stress thermique chez les coraux : FBJ ostéosarcome murine homologue viral oncogene B (Fos-B), protéine activatrice (AP1) et le Tumor necrosis factor receptor 41 (41 TNFR)11. ISH, à l’aide de sondes d’ARN creuser-étiquetée est préférable à l’aide de sondes radioactives, parce que leur manipulation est beaucoup plus sûr10. En outre, cette technique est très sensible et peut être réalisée sur une large gamme de tissus et d’embryons au-delà de chaleur des coraux adultes13,14,15,16.
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Protocol
1. enlèvement de paraffine
ATTENTION : Effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante.
- Déparaffinage les coupes minces paraffine diapositives avec 100 % de xylène sous le capot en bocaux de verre Coplin pendant 10 min. Ne pas utiliser de pots Coplin, que xylène fond plastique. Stériliser les bocaux de Coplin dans un autoclave avant utilisation.
- Préparer quatre pots de Coplin de verre stériles par ce qui suit : 100 % éthanol, éthanol à 80 %, éthanol à 70 % et 60 % d’éthanol. Diluer l’éthanol avec de l’eau exempte de RNase.
- Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec 100 % d’éthanol et trempez-les pendant 10 min. Après 10 min, vider la coloration du verre et remplacer par la nouvelle 100 % d’éthanol. Faire tremper les diapositives à nouveau pendant 10 min.
- Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec l’éthanol à 80 % pendant 1 min.
- Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec l’éthanol à 70 % pendant 1 min.
- Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec l’éthanol à 60 % pendant 1 min.
2. un pré-traitement des diapositives pour la préparation de l’hybridation de la sonde d’ARN
- Effectuer les lavages suivants à température ambiante, sauf indication contraire. Effectuer des lavages de la température ambiante dans un agitateur orbital à une vitesse lente. Utilisez les expéditeurs lame stérile avec la pièce pour jusqu'à cinq diapositives pour le lavage des diapositives.
- Transférer les lames à un expéditeur de lame stérile avec 18 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laver pendant 5 min à température ambiante.
- Décanter la solution de PBS 1 x et immédiatement traiter le tissu sur les diapositives avec la protéinase K pour permettre la pénétration de la sonde du tissu. Ajouter environ 18 mL de solution de protéinase K à l’expéditeur de diapositive (voir le tableau 1 pour travailler la concentration de la solution). Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Ne secouez pas.
- Pendant ce temps les diapositives sont en incubation, préparez le pré-hybridation buffer (tampon de Prehybe). Placer le tampon Prehybe dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min, puis laissez refroidir sur un bain de glace pendant 5 min. Pour une recette de Prehybe tampon, voir le tableau 1.
- Arrêter la digestion de la réaction de la protéinase K en versant la solution de protéinase K et ajouter immédiatement 18 mL de solution de glycine-PBS de 0,2 % à l’expéditeur de la diapositive. Laisser le mailer diapositive à température ambiante pendant 5 min.
- Versez la solution de glycine-PBS de 0,2 %, ajouter 18 mL de solution de citrate de sodium salin (SSC) x 2 à chaque expéditeur de diapositive. Laver les diapositives dans les 2 x SSC pendant 10 min à température ambiante, en agitant à 100-150 tr/min.
3. prehybridization de diapositives en préparation pour l’hybridation de la sonde d’ARN
- Alors que les diapositives sont à laver avec 2 x SSC, obtenir un nouveau mailer Lame stérile et mettre environ 18 mL de tampon de Prehybe dans l’enveloppe de la diapositive. Placez l’enveloppe à glisser dans le four à hybridation à température d’hybridation.
Remarque : La température d’hybridation dépendra de la sonde utilisée habituellement varie entre 50-60 ° C. - Une fois le lavage x SSC 2 est terminée, versez le 2 x SSC et place la glisse dans l’enveloppe à glissière dans le tampon de Prehybe dans le four à hybridation pendant 1 h.
4. l’hybridation de la sonde de l’ARN
- Tandis que les lames sont en incubation avec le tampon de Prehybe dans le four de l’hybridation, préparer la solution d’hybridation-sonde.
- Diluer chaque sonde dans un tampon d’hybridation (0,5 µL de sonde avec 24,5 µL de tampon d’hybridation).
NOTE : La recette du tampon d’hybridation se trouve dans le tableau 1. On trouvera un exemple de préparation de la sonde et des concentrations en Traylor-Knowles et coll. 11. - Placez la sonde diluée sur un bloc de chaleur 86-90 ° C pendant 12 min, puis laisser refroidir pendant 1 min sur la glace.
- Diluer chaque sonde dans un tampon d’hybridation (0,5 µL de sonde avec 24,5 µL de tampon d’hybridation).
- Retirer l’enveloppe à glissière du four hybridation et supprimer individuellement diapositives de la mailer de diapositive à l’aide de pinces stériles. Posez les lames plat sur une serviette en papier et essuyez soigneusement Prehybe excès de tampon dans les échantillons de tissus. Veillez à ne pas toucher les échantillons et le travail rapidement pour éviter le dessèchement des échantillons de tissus.
- Encercler le tissu avec un stylo PAP. Appliquer 25 µL de solution diluée de sonde avec une pipette et couvrir l’échantillon avec une lamelle en plastique.
- Placer les échantillons dans la chambre de l’humidité de diapositive avec 4 x SSC + 50 % formamide solution dans le fond de la chambre.
- Une fois que les sondes ont été ajoutés à toutes les diapositives, placer la chambre de l’humidité de glisser dans le four à hybridation pendant au moins 24 h à une température d’hybridation de 50-60 ° C. Le temps d’incubation peut varier en fonction de la concentration de la sonde, mais doit être pendant au moins 24 heures.
- Après une nuit d’incubation avec les sondes dilués, retirer la chambre de l’humidité de diapositive du four de l’hybridation.
- Supprimer des lamelles couvre-objet de chacune des diapositives, en veillant à ne pas déplacer le tissu. Dans une pipette de 1000 µL, ajouter 1000 µL de solution de 2 x SSC et laver doucement la lame.
- Placez la diapositive dans une enveloppe de lame stérile avec 18 mL de solution de x SSC 2 pendant 5 min à température ambiante. Versez la solution et le remplacer par 18 mL de fresh 2 x SSC. Répéter l’incubation pendant 5 min à température ambiante avec agitant doucement.
- Versez la solution de x SSC 2. Ajouter 18 mL de solution x SSC 1et lavage pendant 5 min à température ambiante. Versez la solution de x SSC 1 et remplacez-le par 18 mL de frais 1 x SSC. Répétez l’incubation pendant 5 min à température ambiante avec agitant doucement.
- Versez le 1 x SSC. Ajouter 18 mL de 0,5 x SSC et lavage pendant 10 min à 42 ° C sans agitation. Versez le 0.5 x SSC et remplacer avec 18 mL de frais 0,5 x SSC. Lavez à nouveau pendant 10 min à 42 ° C sans agitation.
5. visualisation de la sonde de l’ARN
Remarque : Pour la visualisation de la sonde, purple BM sera utilisé au cours du processus de développement. Cependant, avant cette étape, plusieurs lavages sont nécessaires pour préparer les échantillons pour la coloration.
- Laver les lames avec 18 mL de tampon de la phosphatase alcaline (AP-tampon) sans MgCl2 pendant 1 min. Versez le tampon sans MgCl2AP et ajouter 18 mL de tampon de blocage 1 x Boehringer-Mannheim dilué avec de l’acide maléique tampon. Incuber pendant au moins 1 h à température ambiante dans une enveloppe de diapositive avec agitant doucement.
NOTE : Le buffer blocage Boehringer-Mannheim et l’acide maléique utilisés ont été prédéfinis et achetés dans le lavage de la fouille et le bloc Buffer Set (disponible dans le commerce).- Alternativement, l’incubation durant la nuit à 4 ° C peut être effectuée. Une période de plus de blocage permettent de réduire l’apparition de liaisons non spécifiques.
- Préparer le 20 mL de fragments Fab d’anti-digoxigénine-AP DIG dilués (anticorps anti-DIG = 2 µL d’anticorps anti-DIG + 20 mL 1 x tampon de blocage de Boehringer-Mannheim). C’est assez pour une utilisation dans 1 mailer de lame en plastique. Plus de cette solution doivent être préparée si plus d’un expéditeur de diapositive doit être utilisé.
- Ajouter l’anticorps anti-creuser à un nouvel expéditeur lame stérile et transférer les lames à l’expéditeur de la diapositive avec la solution d’anticorps anti-DIG. Incuber à température ambiante pendant 3 h avec agitant doucement.
- Après incubation, versez l’anticorps anti-creuser, laver la glisse dans l’enveloppe à glissière avec 18 mL de tampon de AP sans MgCl2 pendant 5 min avec agitant doucement.
- Versez le tampon sans MgCl2, AP, ajouter 18 mL de tampon de AP. Laver pendant 5 min avec agitant doucement. Après l’incubation de 5 min, videz la mémoire tampon d’AP, remplacez-le par 18 mL de tampon AP frais et laver pendant 5 min avec agitant doucement.
- Dans l’obscurité, videz la mémoire tampon d’AP et ajouter 18 mL de BM pourpre à l’expéditeur de la diapositive. Incuber les lames dans l’obscurité à température ambiante, recherchant les développement de couleur pourpre que variera chaque ½ h. des temps de réaction pour la visualisation basées sur la sonde qui est en cours d’élaboration.
NOTE : Au lieu de visualisation BM pourpre, solution de développement peut être faite à l’aide de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (CBPI) et nitrobleu de tétrazolium (NBT). Pour obtenir des instructions, voir le tableau 1 . - Arrêter le développement de la couleur en transférant les diapositives à un nouvel expéditeur lame stérile avec 18 mL de tampon Tris-EDTA (TE) pendant 5 min à température ambiante, dans l’obscurité.
- Videz la mémoire tampon TE et ajouter 18 mL d’eau exempte de RNase au mailer diapositive et lavage pendant 1 min, dans l’obscurité.
- Enlever les lames de l’eau et les faire sécher sur les bords du tissu. Ajouter glycérol Montage support et placez les lamelles. Entreposer les lames à 4 ° C jusqu'à ce que les photos sont prêts à prendre.
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Representative Results
À l’issue de ce protocole, l’identification des cellules et des tissus qui expriment la sonde de l’ARN d’intérêt se réalisera. Les résultats représentatifs de ce protocole sont pour AP-1, OSF et TNFR41. Ces résultats, publiés précédemment par Traylor-Knowles et coll. 11, spectacle expression spatiale de l’ARN sondes sur des coraux adultes qui ont été exposés au stress thermique. Deux exemples de différents types de coloration sont présentés dans la Figure 1. Figure 1 a est un exemple de coloration des tissus diffuse. La tache se trouve dans le tissu, non seulement à des cellules spécifiques. Ici, l’expression du anti-sentiment AP-1 se trouve tout au long de l’épiderme et l’oral gastroderme11 (Figure 1 a). La coloration est diffus et non distincts à un seul type de cellule spécifique. Pour ce type de coloration, il est particulièrement critique pour exécuter un contrôle de sens dans le même temps, comme certains des résultats peuvent être due à une coloration non spécifique.
Le deuxième type de coloration est spécifique des cellules, dans lesquelles la tache ne se trouve dans les types spécifiques de cellules. Les OSF (Figure 1 b) et TNFR41 (Figure 1) présentent ce type de coloration. Deux de ces sondes ont été utilisés sur des échantillons de tissus des coraux adultes qui avaient été exposés à un stress de chaleur11. Dans le panneau anti-sens, une coloration pourpre est observée. TNFR41 s’exprime dans différents types de cnidocytes, une famille de types de cellules que l'on trouve uniquement dans les cnidaires (Figure 1). Plus précisément, il teint nématocystes qui produisent le microbasiques mastigophore organelle (nématocystes) et spirocytes qui produisent spirocysts, tous se trouvant dans l’épiderme du tissu corail. Nématocytes sont trouvent également dans les autres couches de tissus des coraux, tels que le calicodermis ; Cependant, en raison de la découpe effectuée sur cet exemple particulier, cette information ne pourrait pas être recueillie. OSF aussi teinté cnidocytes et était spécifique à la fois spirocytes et nématocystes. Pour deux de ces sondes, le contrôle des sens ont montré aucune coloration, indiquant qu’il était en effet spécifique de la souillure pour la sonde anti-sens. Voici les deux types de résultats représentatifs (coloration de tissu diffus et une coloration spécifique des cellules), des techniques de coloration qui peuvent être présentes avec différents types de sondes. En raison de cette variabilité, il est essentiel d’utiliser un contrôle de sens pour déterminer une coloration non spécifique.
Figure 1 : résultats représentatifs de ISH qui maculait cellules spécifiques. (A) dans le premier panel, contrôle de sens pour la sonde de l’AP-1 montre que peu de coloration est présente dans la diapositive. Dans le second, la sonde anti-sens pour AP-1 montre que la coloration avec cette sonde est diffuse dans le tissu. La tache est spécifique à l’oral gastroderme et l’épiderme. Avec ce type de coloration, il est essentiel d’exécuter un contrôle de sens afin que la coloration observée soit spécifique. (B) un contrôle de sens pour la sonde d’OSF dans le premier panneau montre une coloration peu présents. Dans le deuxième panneau, la sonde anti-sens pour OSF montre une coloration spécifique pour les spirocytes et les nématocystes, avec coloration diffuse tout au long de l’épiderme et oral gastroderme. (C) dans le premier panneau, le contrôle de sens pour la sonde TNFR 41 montre que peu de coloration est présente sur la diapositive. Dans le second, la sonde anti-sens TNFR 41 montre coloration dans le spirocytes, les nématocystes et microblastic microbasiques spécifique. Abréviations : spirocytes (SP), symbiodium (SY), nématocytes (NE), mastigophores microbasiques (MM), contenant du symbiote gastrodermal cellule (SU). Ce chiffre a été reproduit avec la permission de11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Remarque : Toutes les dilutions devraient être faites avec de l’eau stérile, de RNase en verrerie autoclavé. | |||
| Tampon de Prehybe (50 mL) | AJOUTER | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4,5) | 12,5 mL | ||
| héparine de 20 mg/mL | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20 % SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL de sperme de saumon ADN (dénaturer avant d’ajouter) | 2 mL | ||
| Eau de RNase | 4,4 mL | ||
| Remarque : Solution peut être faite dans un tube autodestruction 50 mL. Sperme de saumon doit être dénaturé en la faisant bouillir sur un bloc chauffant pendant 5 minutes avant d’ajouter à la solution. | |||
| Tampon d’hybridation (47 mL) | AJOUTER | ||
| Formamide | 25 mL | ||
| 20 X SSC (pH 4,5) | 12,5 mL | ||
| héparine de 20 mg/mL | 0,1 mL | ||
| 50 X Denhardts | 5 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 0,5 mL | ||
| 20 % SDS | 0,5 mL | ||
| 10 mg/mL de sperme de saumon ADN (dénaturer avant d’ajouter) | 2 mL | ||
| Eau de RNase | 1 mL | ||
| Remarque : Solution peut être faite dans un tube autodestruction 50 mL. Sperme de saumon doit être dénaturé en la faisant bouillir sur un bloc chauffant pendant 5 minutes avant d’ajouter à la solution. | |||
| 10 X PBS (1,0 L) | AJOUTER | ||
| 18,6 mM NaH2PO4 | 2,56 g | ||
| 84,1 mM Na2HPO4 | 11,94 g | ||
| 1 750 mM NaCl | 102,2 g | ||
| Notes : Mélanger les phosphates dans environ 800 mL d’eau pour un volume de 1,0 L. Vérifier le pH. Il devrait être de 7,4 ± 0,4. Sinon ajuster le pH à 7,4 avec NaOH de HCl. Ajouter NaCl et le reste de l’eau. Après que le pH est ajusté autoclave. | |||
| 20 X SSC (1,0 L) | AJOUTER | ||
| 3 M NaCl | 175,3 g | ||
| 0,3 Citrate de Na de M | 88,2 g | ||
| Notes : Mélanger dans environ 800 mL d’eau libre de RNase pour porter à un volume de 1,0 L. Ajuster le pH à 4,5 et stériliser. | |||
| Tampon d’alcaline Phosphatase (AP) w/o MgCl2 (50 mL) | AJOUTER | ||
| 1 M NaCl | 5,0 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 5,0 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 1,25 mL | ||
| Eau de RNase | 38,75 mL | ||
| Notes : Préparer just avant de l’utiliser dans un tube de 50 mL. | |||
| Tampon d’alcaline Phosphatase (AP) (100 mL) | AJOUTER | ||
| 1 M NaCl | 10,0 mL | ||
| 1 M MgCl2 | 5 mL | ||
| 1 M Tris, pH 9,5 | 10 mL | ||
| 20 % Tween-20 | 2,5 mL | ||
| Eau de RNase | 72,5 mL | ||
| Notes: préparer just avant de l’utiliser dans un tube de 50 mL. La solution deviendra nuageuse après quelques heures et ne sera plus de travail pour la réaction enzymatique. | |||
| Solution de substrat AP | AJOUTER | ||
| Tampon de AP | 25 mL | ||
| NBT | uL 82,5 | ||
| CBIP | uL 82,5 | ||
| Note: Ceci peut être utilisé au lieu de BM violet. Préparer just avant de l’utiliser dans un tube de 50 mL. Conserver cette solution dans l’obscurité en couvrant le tube en aluminium et en préparant en basse lumière. | |||
| Solution mère de protéinase K (10 mg/mL) | AJOUTER | ||
| Protéinase K | 10 mg | ||
| Eau de RNase | 10 mL | ||
| Notes : Aliquote et conserver à-20 ° C. | |||
| Protéinase K Solution de travail | AJOUTER | ||
| Solution mère de protéinase K | ul 90 | ||
| 1 X PBS | 18 mL | ||
| Notes : Faire juste avant de les utiliser pour obtenir les meilleurs résultats. | |||
| 0,2 solution de glycine-PBS de % | AJOUTER | ||
| 10 X PBS | 45 mL | ||
| Eau libre de RNase | 405 mL | ||
| Glycine | 1 g | ||
| Notes: préparer dans le récipient en verre stérilisés à l’autoclave. Mélanger à la température ambiante dans une assiette de provocateur jusqu'à ce que la glycine est entièrement dissous. | |||
| Tampon de blocage de Boehringer-Mannheim (30 mL) (partie du lavage de creuser et ensemble de tampons de bloc) | AJOUTER | ||
| 10 x bloquant la solution | 3 mL | ||
| 1 x tampon de l’acide maléique | 27 mL | ||
| Notes: faire juste avant de les utiliser pour obtenir les meilleurs résultats. Solution mère de blocage et tampon de l’acide maléique servaient de la « DIG lavage et bloc-Set de tampons ». | |||
| 4 X SSC — 50 % formamide (30 mL) | AJOUTER | ||
| 20 X SSC | 6 mL | ||
| 50 % formamide | 24 mL | ||
| Notes : Préparer just avant de l’utiliser en tube de 50 mL. Préparer sous hotte de laboratoire. | |||
| Supports de montage de glycérol | AJOUTER | ||
| 50 mM Tris, pH 8,4 | 80 ΜL | ||
| Glycérol | 20 ΜL | ||
Tableau 1 : solutions pour effectuer en Stock in situ hybridation. Le tableau est une liste des différentes solutions stocks nécessaire pour ce protocole. Montants totaux sont estimés pour une performance d’environ 2 enveloppes de diapositive. Il est conseillé d’ajuster les montants totaux selon la quantité de diapositives qui sont en cours de traitement.
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Discussion
La méthode décrite dans le présent protocole a été modifiée à partir de travaux antérieurs dans la recherche médicale et évolutive du développement8,9,10,12,17. Ce protocole met l’accent sur les nuances d’une hybridation in situ avec une sonde d’anti-sens RNA creuser-étiquetés sur les coraux adultes, qui ont été préservés et intégrés à la paraffine. Cette méthode peut être facilement transférée aux échantillons d’organismes au-delà de coraux qui ont également été inclus en paraffine. Enfin, cette méthode peut être effectuée au cours des différents stades de coraux (p. ex., larve) ou dans les cultures de cellules, mais le protocole exact peut varier car ces types d’échantillons ne sont pas toujours inclus en paraffine5,6 .
Il y a plusieurs étapes cruciales dans le présent protocole, y compris le traitement de la protéinase K, hybridation de la sonde et le développement de la couleur de la sonde. Pendant le traitement de la protéinase K, le timing est très important. Si le traitement est plus long que ne l’indiquaient, tissus peuvent devenir dégradées et endommagés. En outre, l’arrêt de la réaction de la protéinase K doit être effectuée à temps plein point spécifié. Il est également essentiel de conserver l’échantillon à une température constante de l’hybridation, comme l’abaissement de la température peut entraîner des liaisons non spécifiques de la sonde et compliquer les résultats. Lors du lavage de la sonde, il est important de prendre chaque diapositive sorti du four à hybridation un à la fois, plutôt pas tous en même temps, pour s’assurer que les lames ne s’hybrident pas avec la sonde à basse température. En outre, lavage complet des lames après que l’hybridation de la sonde permettra d’éviter les liaisons non spécifiques. Enfin, le développement de la couleur de la sonde est une des étapes plus critiques pourtant subjectifs de ce processus. Le développement de la couleur peut être facilement exagéré ou s’est arrêté trop tôt. Cette étape nécessite de la patience et de vigilance pour s’assurer que trop de coloration des lames ne se produit pas.
Ce protocole de dépannage peut être un processus intimidant en raison du nombre d’étapes impliquées. Si le protocole donne des résultats négatifs, il est préférable de commencer par examiner la sonde pour s’assurer que c’est le anti-sens (et non pas le sens) sonde. En outre, si les solutions sont vieux, il vaut refaire ou leur remplacement pour qu’ils soient frais, lors de l’exécution de ce protocole. Modifications, telles que les longueurs d’hybridation et de blocage, peuvent être implémentées pour augmenter les chances de l’hybridation de la sonde ou la réduction des quantités de fond et une coloration non spécifique. En raison du nombre élevé d’étapes dans le présent protocole, il peut être facile de perdre la trace ; par conséquent, il est important de rester organisé et de suivre quelles parties du protocole sont terminées. En outre, il est essentiel de s’assurer qu’aucune mesure n’est ignorées, et ce moment n’est pas coupé pendant les incubations et lavages. Une bonne règle de base doit permettre plus longtemps plutôt que des lavages plus courts pour s’assurer que toutes les lames sont nettoyés.
La plus grande limitation de cette méthode est que les résultats ne sont pas quantifiables. Il s’agit d’une méthode qualitative qui, de concert avec d’autres méthodes telles que l’histologie, transcriptomique et protéomique, est très instructive. En raison des variations dans l’hybridation temps ainsi que les temps subjectifs au cours de visualisation, quantifier l’intensité de la coloration n'est pas facile à faire. Il est tentant de dire qu’une sonde est plus fortement exprimée si elle montre une plus grande intensité, mais en raison des variations dans le présent protocole (par exemple la quantité de temps alloué pour le développement de la couleur), les montants d’expression de gène ne peuvent être déterminées.
Cette technique n’est pas une nouvelle méthode en biologie ; Cependant, c’est un ne pas effectué très souvent sur les coraux adultes. L’utilisation de cette méthode sur les coraux adultes est très puissante car il ancre données d’expression de gène à un tissu ou une cellule de type11. Transcriptomique et génomique est devenus des outils puissants et populaires en biologie corail ; Cependant, ces méthodes sont généralement effectués sur des homogénats de l’animal entier. Ce qui rend difficile à identifier quelles parties du corail expriment des gènes d’intérêt et donc plus difficile de comprendre les mécanismes réels. Grâce à l’utilisation de ISH ainsi que de données d’expression de gène, une approche plus holistique où et dans quelle mesure les gènes sont exprimés est possible. Cela va grandement aider dans la compréhension des mécanismes responsables des voies de réponse différents stress chez les coraux adultes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par indemnité aucune. OCE-1323652 par le biais de la National Science Foundation Ocean Science bourse postdoctorale et prix no.1012629 provenant du programme d’enrichissement postdoctorales Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
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