Summary
Her vil vi præsentere en ny tilgang for at identificere plant vira med dobbelt-strenget DNA genomer. Vi bruger standard metoder til at udtrække DNA og RNA fra inficerede blade og udføre næste generation sequencing. Bioinformatic værktøjer samle sekvenser til contigs, identificere contigs repræsenterer virus genomer og tildele taksonomiske grupper genomer.
Abstract
Denne metagenome fremgangsmåde bruges til at identificere plant vira med cirkulært DNA genomer og deres udskrifter. Ofte plante DNA virus at forekomme i lav titers i deres vært eller kan ikke være mekanisk podes til en anden vært er vanskelige at formere for at opnå en større titer af smitsomme materiale. Inficerede blade er jorden i en mild buffer med optimale pH og ioniske sammensætning anbefales til rensning af de fleste bacilliform Para retrovira. Urea bruges til at bryde op optagelse organer, at fælde virioner og til at opløse cellulære komponenter. Differential centrifugering giver yderligere adskillelse af virioner fra planten forurenende stoffer. Derefter fjerner proteinase K behandling capsids. Derefter er det virale DNA koncentreret og anvendes til next generation sequencing (NGS). NGS data bruges til at samle contigs, der er indsendt til NCBI-BLASTn til at identificere et undersæt af virus sekvenser i den genererede datasæt. I en parallel pipeline er RNA isoleret fra inficerede blade ved hjælp af en standard kolonne-baserede RNA ekstraktion metode. Derefter udføres ribosomet udtynding til at berige for en delmængde af mRNA og virus udskrifter. Samlet sekvenser afledt af RNA sekventering (RNA-FF.) blev forelagt NCBI-BLASTn til at identificere et undersæt af virus sekvenser i dette dataset. I vores undersøgelse identificeret vi to relaterede fuld længde badnavirus genomer i de to datasæt. Denne metode er den foretrukne til en anden fælles tilgang, der udtrækker den samlede befolkning i små RNA sekvenser for at rekonstruere plante virus genomiske sekvenser. Denne sidstnævnte metagenomic pipeline genopretter virus relateret sekvenser der indsættes retro-transskribere elementer i anlægget genom. Dette er koblet til biokemiske eller Molekylær assays til yderligere skelne de aktivt smitstoffer. Metoden er dokumenteret i denne undersøgelse, genopretter sekvenser repræsentant for replikering af vira, der sandsynligvis angiver active virusinfektion.
Introduction
Nye plantesygdomme drive forskere til at udvikle nye værktøjer til at identificere den korrekte kausale stof(fer). Første rapporter af nye eller tilbagevendende virussygdomme er baseret på almindeligt forekommende symptomer som mosaik og misdannelser af blade, vene clearing, dværgvækst, visnen, læsioner, nekrose eller andre symptomer. Standard for at rapportere en ny virus, som den kausale agent for en sygdom er at adskille det fra andre forurenende patogener, udbrede det i egnet vært og reproducere sygdommen ved at vaccinere i sunde planter af den oprindelige vært arter. Begrænsning i denne tilgang er, at mange slægter af plant vira afhænge af et insekt eller andre vektorer for transmission til en passende vært eller tilbage til den oprindelige vært arter. I dette tilfælde, Søg efter den relevante vektor kan forlænges, kan der være problemer med at etablere laboratorium kolonier af vektoren, og yderligere bestræbelser er nødvendige for at udarbejde en protokol for eksperimenterende transmission. Hvis betingelserne for vellykket laboratorium transmission undersøgelser ikke kan opnås, så ligger arbejdet under standarden for at rapportere en ny virus-sygdom. For vira, der opstår i deres naturlige værter på meget lav titers, skal forskerne identificere alternative værter for formering til at opretholde tilstrækkelig smitsomme lagre for at udføre forskning. For virus arter, der inficerer kun nogle få anlæg kan det også være en hindring for voksende bestand kulturer1.
I de seneste år, forskere mere ofte beskæftiger høj overførselshastighed NGS og metagenomic metoder til at afdække virus sekvenser, der er til stede i miljøet, som kan findes ikke-forretningsmæssigt forbundne til en kendt sygdom, men kan tildeles taksonomiske arter og slægter 2 , 3 , 4. sådan tilgange til opdagelsen og kategorisering af genetisk materiale i et særskilt miljø giver en måde at beskrive virus mangfoldighed i naturen eller deres tilstedeværelse i en bestemt økosystem, men ikke nødvendigvis bekræfte, at en ramme for at definere kausale agenter for en tilsyneladende sygdom.
Badnavirus slægten tilhører familien Caulimoviridae af pararetroviruses. Disse vira er bacilliform i figuren med cirkulær dobbeltstrenget DNA genomer af ca 7-9 kb. Alle pararetroviruses replikere gennem mellemprodukt RNA. Pararetroviruses findes som episomes og replikere uafhængigt af plante kromosomale DNA5,6. Feltstudier af virus populationer viser, at disse virus populationer er genetisk komplekse. Derudover oplysninger indhentet på tværs af en række plante genomer af høj overførselshastighed sekventering har afsløret talrige eksempler på badnavirus genom fragmenter indsat af uægte integration begivenheder i anlægget genomer. Disse endogene badnavirus sekvenser er ikke nødvendigvis forbundet med infektion7,8,9,10,11. Efterfølgende brug af NGS at identificere nye badnaviruses som den kausale agens af sygdom kompliceres af delpopulation mangfoldighed af episomal genomer samt forekomsten af endogene sekvenser12,13.
Mens der er ikke en optimal pipeline for opdagelsen af roman pararetrovirus genomer, er der to fælles tilgange til at identificere disse vira som kausale agenter for sygdom. Én metode er at berige for små RNA sekvenser fra inficerede blade og derefter samle disse sekvenser for at rekonstruere virus genome(s)14,15,16,17. En anden fremgangsmåde er den rullende cirkel forstærkning (RCA) til at forstærke cirkulære DNA virus genomer18. RCA succes afhænger af alder af bladet og virus titer i den valgte væv. RCA produkter er underkastet begrænsning fordøjelse og klonet i plasmids til direkte sekventering19,20,21.
Canna gule mottle virus (CaYMV) er en badnavirus og er beskrevet som den ætiologiske årsag til gul mottle sygdom i canna, selv om kun en 565 bp fragment af genomet har været tidligere isoleret fra inficerede cannas22. En moderne undersøgelse identificeret CaYMV i Alpinia purpurata (blomstrende ingefær; CaYMV-Ap)23. Målet med denne undersøgelse var at inddrive komplet badnavirus genom sekvenser fra inficerede canna liljer. Vi beskriver en protokol til rensning af virus fra planten forurenende stoffer, og derefter isolere viral DNA fra denne forberedelse, og forberede en DNA bibliotek til brug i NGS. Denne fremgangsmåde fjerner behovet for mellemliggende molekylære forstærkning trin. Vi også isolere mRNA fra inficerede planter for RNA-FF. NGS, som omfatter RNA-seq blev udført ved hjælp af hver nukleinsyre forberedelse. Samlet contigs blev anset for at vedrører Badnavirus systematisk enhed i begge datasæt ved hjælp af National Center for bioteknologi og Information (NCBI) grundlæggende lokale justering søgeværktøj til nukleinsyrer (BLASTn). Vi identificerede genomer af to badnavirus arter24.
Protocol
1. generelle Virus rensning af Differential centrifugering ved hjælp af Standard metode af Covey et al. 25
- Først, skære 80-100 g af blade fra syge planter og slibe i en waring blenderen ved 4 ° C ved hjælp af 200 mL slibning buffer (0,5 M NaH2PO4, 0,5 M Na2HPO4 (pH 7,2). og 0,5% (w/v) Na2SO3). Bære en laboratoriekittel og handsker for alle trin i denne procedure.
- Derefter, overføre homogenatet (300 mL) til en 1,0 L bægerglas. Tilføje 18 g urea og 25 mL 10% nonionisk detergent (t-okt-C6H4-(OCH2CH2)9OH) til homogenatet inde i en kemisk hætte.
Bemærk: For dette trin er det bedst at bære beskyttelsesbriller og en simpel vejrtrækning maske for personlig beskyttelse. - Omrøres med en magnetomrører kort i hætten og dække bægerglasset med folien. Derefter overføre folie dækket bægerglasset til et koldt rum og omrøres med en magnetomrører natten over ved 4 ° C.
- Overføre homogenatet til centrifugeres rotor flasker (250 mL beholdere), og der centrifugeres i en fast vinkel rotor på 4.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. I en kemisk stinkskab, genoprette supernatanten og filtreres gennem 4 lag af ostelærred.
- Opdele homogenatet blandt 38,5 mL polypropylen centrifugeglas, og der centrifugeres i 2,5 h på 40.000 x g ved 4 ° C. Typisk, check for tilstedeværelse af en grøn pellet i bunden af røret og en hvid pellet langs længden af røret. Hæld supernatanten og fastholde både pellets; Placer prøver på is.
Bemærk: Den grønne pellet indeholder grønkorn, stivelse og andre organeller. - Arbejder i en kemisk hætte, bruge en gummi politimand for at adskille pellets. Resuspenderes hvid i hver rotor flaske i 1 mL af Hedeselskabet2O i løbet af 1-2 h fastholdes suspensioner natten over ved 4 ° C at tillade materialer til fuldt opløses i løsning. Der centrifugeres suspension på 6.000 x g og 4 ° C i 10 min til at fjerne de resterende rester.
- Der centrifugeres koncentreret suspension på 136.000 x g i 2 timer ved 4 ° C og pellet virioner. Resuspend pellets i 1 mL buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2).
Bemærk: Et valgfrit trin er at behandle virioner med DNAse jeg (10 µg/mL) i 10 minutter ved 37 ° C at fjerne ikke-encapsidated DNA, dvs., forurener grønkorn og mitokondrie-DNA. Derefter, inaktivere DNAse jeg ved at tilføje EDTA til 1 mM. - Afbryde virioner med 40 µL af 2 µg/µL proteinase K ved 37 ° C i 15 min.
- Arbejde inde en kemisk hætten til at inddrive virion DNA af økologisk udvinding. Bære en ansigtsskærm, handsker og en laboratoriekittel under udvinding for beskyttelse mod potentielle akutte sundhedsvirkninger. Tilføje 1 mængden af fenol-chloroform-isoamyl alkohol (49:50:1) til prøven og omrystes med hånden i 20 s. centrifugeres ved stuetemperatur for 5 min på 16.000 x g. fjerne de øverste vandig fase og overførsel til en ny tube. Gentag denne udvinding to eller flere gange. Bortskaf den organiske fase ved at placere det i en affald glasflaske for passende institutionelle kemiske bortskaffelse26.
- Koncentrere DNA ved hjælp af ethanol nedbør. Brug 0.3 M endelige koncentration af natriumacetat (pH 5,2) og 2,5 mængder af 95% ethanol. Placer prøver ved-20 ° C i 30-60 min., og der centrifugeres ved 13.000 x g i 10-20 min at sammenpresse DNA26.
- Arbejder på et laboratoriebænk, resuspenderes DNA i 1 mL af 0,1 mM TE buffer (pH 8.0). Filer suspension via en kommerciel gel filtrering kolonnen (normalt bruges til Polymerasekædereaktionen (PCR) oprydning) at fjerne salte og lav molekylvægt materiale, der kunne vanskeliggøre NGS.
- Analysere prøverne ved 1% Agarosen gelelektroforese brug af ethidiumbromid farvning for at se kvaliteten af forberedelserne. Vurdere kvaliteten af DNA ved hjælp af et nanodrop Spektrofotometer.
Bemærk: Et forhold på prøve absorbans ved 260 λ og 280 λ mellem 1,85 og 2.0 typisk angiver at forberedelsen er "ren" af urenheder og er af den ønskede kvalitet. - Analysere kvalitet af DNA (bruge 5 pg 10 ng) ved hjælp af en chip baseret kapillær elektroforese instrument.
Bemærk: Output kvalitet viser ren toppe, der repræsenterer DNA fragmenter fordelt efter størrelse langs en x-aksen. Tophøjde angiver overflod af fragmentet. Forrevne tinder angive delvist nedbrudte fragmenter eller kemiske forureninger. Runde kurver repræsenterer et udstrygningspræparat af DNA med angivelse af dårlig kvalitet
2. bibliotek forberedelse ved hjælp af DNA og Emulsion-baseret klonede forstærkning (emPCR forstærkning)
Bemærk: Biblioteket er typisk udarbejdet en NGS anlæg, der udfører kundeorienterede arbejde.
- Forskyde en opløsning af DNA (> 200 ng) ved hjælp af en forstøver, der omdanner DNA til fragmenter. Ligate de kommercielle adaptere efter manualens anvisninger27.
- Udføre emPCR forstærkning af DNA-prøve ifølge producentens instruktioner28,29,30. Gentag trinnet vaskes tre gange, og efter hver vask, pellet perler i et minicentrifuge for 10 s. udsmid supernatanten efter hver vask.
Bemærk: Proceduren begynder med forberedelsen af capture perler ved vask i den kommercielle vaskebuffer leveres med kittet. emPCR er almindeligt anvendt til skabelon forstærkning for NGS. - Varme denaturere DNA eller RNA ved 95 ° C for 2 min og derefter 4 ° C indtil klar til brug. Brug 200 - millioner molekyler af DNA/RNA til 5 millioner capture perler i en endelige mængden af 30 µL. Forbered en mock prøve sammen med DNA/RNA prøve og udføre de følgende trin med eksemplet nukleinsyre samt mock prøven.
- Udføre emulgering af vortexing tube emulsion olie for 10 s ved maksimal hastighed, hæld derefter hele indholdet (4 mL) i en plast omrøring rør, der er kompatibel med en platform homogeniseringsapparat. Omrøring røret anbringes på platformen til at blande emulsion på 2.000 rpm i 5 min.
- Der afpipetteres 100 µL delprøver af emulsion i 8-strip cap rør eller i en 96-brønd plade. Cap rør eller forsegle pladen og udføre emPCR ved hjælp af den af fabrikanten anbefalede program28.
Bemærk: Efter PCR er komplet, tjek brøndene for at se, om emulsionen er intakt og derefter gå videre. Kassere det hele godt, hvis emulsionen er brudt. - Bære en lab coat og arbejde i en kemisk hætte til at indsamle de amplificerede DNA perler (ADB). Vakuum Aspirér emulsion fra brøndene og indsamle perler i en 50 mL tube. Skyl wells to gange med 100 µL af isopropanol og Opsug skyl til samme 50 mL tube.
- Vortex de indsamlede emulsioner og resuspend ADB med isopropanol til en endelige mængden af 35 mL. Pellet ADB på 930 x g i 5 min. Fjern supernatanten og der tilsættes 10 mL øge buffer. Vortex ADB og derefter vaske ved at tilføje isopropanol til 40 mL endelige rumfang Centrifuge og kassér supernatanten efter hver vask og Gentag trinnet vaskes to gange.
- Udføre en afsluttende vask med ethanol i stedet for isopropanol. Tilføje øge buffer til 35 mL endelige rumfang, vortex og pellet perler på 930 x g i 5 min. Fjern supernatanten men forlade 2 mL øge buffer.
- Overføre suspension til et microcentrifuge rør og kortvarigt centrifugeres for at pellet ADB. Efter kassering supernatanten, skyl ADB pellet to gange med 1 mL af øge buffer. Der centrifugeres og supernatanten efter hver vask.
- For at forberede DNA bibliotek perle berigelse, der tilsættes 1 mL 1 N NaOH til perlerne. Vortex ADB og derefter inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur. Der centrifugeres og supernatanten. Gentag trinnet vask en gang.
- Der tilsættes 1 mL af optimerende buffer, derefter vortex ADB og inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur. Kort centrifugeres og supernatanten. Gentag dette trin, igen ved hjælp af 100 µL af optimerende buffer.
- For at anneal sekventering primere til DNA, tilføje 15 µL af Seq Primer A og 15 µL af Seq Primer B findes i kit. Kort blandes ved vortexing og microcentrifuge røret anbringes i en varme blok på 65 ° C i 5 min. overførsel til is i 2 min.
- Vaskes tre gange med 1,0 mL af udglødning buffer. Vortex for 5 s og kassér supernatanten hver gang.
- Før sekventering, måle antallet af perler ved hjælp af en kommerciel perle counter. Der bør være mindst 500.000 beriget perler.
Bemærk: Tælleren perle er en særlig anordning, som måler perler i en medfølgende microcentrifuge tube.
3. generelle mRNA Isolation og dsDNA syntese begynder med inficeret Canna blade, Test af RT-PCR for CaYMV ved hjælp af rapporterede diagnostiske primere
- Bære en laboratoriekittel og latex handsker til personlig beskyttelse i alle efterfølgende trin. Arbejder på et laboratoriebænk, indsamle 12 prøver fra bladene og styrte prøverne i flydende kvælstof. Bruge en perle mill til homogenisering. Brug en kommerciel kit, der indeholder en standard kolonne-baseret metode til samlede anlæg RNA isolering. Tilføje guanidin-isothiocyanat lysisbuffer fastsat af kit til jorden prøve og ryste 20 s.
- Tilsættes ethanol og blandes grundigt, ifølge kit instruktioner. Tilføje hver homogenatet til en spin-kolonne, der binder RNA til membranen. Vaskes tre gange og elueres RNA i en recovery tube24.
- Kvantificere RNA bruger et spektrofotometer til at måle forholdet mellem absorbans ved 260 λ og 280 λ. Bekræft RNA integritet ved hjælp af 1% Agarosen gelelektroforese farves med ethidiumbromid.
Bemærk: En absorbans forholdet mellem 1,85 og 2.0 angiver, at udarbejdelsen af den ønskede kvalitet. Behandle RNA med DNase jeg (10 µg/mL) i 10 minutter ved 37 ° C. Brug en kommerciel spin kolonne til at koncentrere RNA i RNase-fri vand31. Pool RNA prøver, før du fortsætter. - Bruge en rRNA fjernelse kit til at fjerne planten ribosomale RNA. Alikvot magnetiske perler til microcentrifuge tube og vaskes to gange vand med RNase-fri. Vortex tube alikvot til resuspend, placere røret på en magnetisk stå og vente på væske til at klare. Supernatanten og erstatte med magnetisk bead resuspension løsning. Vortex resuspend og tilføje 1 µL af RNase hæmmer.
Bemærk: Sådanne kits bruge oligo-dT bundet til magnetiske perler, som krydse sig til mRNA. Metoden bruger standard magnet perle adskillelse teknologi hen til genoprette udskrifter24. - Kombiner 500 ng til 1,25 µg af RNA, RNase-fri vand og reaktion buffere forudsat af sættet. Placer blandingen i 10 min ved 50 ° C. Fjern fra varmen og tilsæt vasket magnetiske perler i RNAse gratis vand. Vortex kort og sæt ved stuetemperatur i 5 min.
- Sted på en magnetisk stå og vente på væske til at klare. Overføre supernatanten til en frisk microcentrifuge tube. Sæt på køl.
- Bruge en løsning-baseret capture metode til berigelse af exosomes og 200 ng af RNA til at forberede cDNA biblioteket.
Bemærk: Dobbeltstrenget cDNA bibliotek er typisk udarbejdet en NGS anlæg, der udfører kundeorienterede arbejde. - Fragment af RNA ved hjælp af en kommerciel RNA fragmentering løsning (0.136 g ZnCl2 og 100 mM Tris-HCl pH 7,0). Tilføje 2 µL af løsning til 18 µL af RNA (200 ng alt). Spin rør kort i microcentrifuge, placere prøverne ved 70 ° C i 30 s og overførsel til is. Stoppe reaktionen ved hjælp af 2 µL af 0,5 M EDTA pH 8.0 og 28 µL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5.
- Binde RNA til magnetiske perler ved at blande ved stuetemperatur i 10 min. Brug en magnetisk koncentrator at samle perler og supernatanten. Vaske perlerne tre gange med 200 µL af 70% ethanol. Kassér hver vask og derefter lufttørre pelleted perlerne ved stuetemperatur i 3 min. Resuspend i 19 µL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5.
- Anneal tilfældige primere til fragmenterede RNA ved opvarmning til 70 ° C i 10 min og derefter røret anbringes i isbad i 2 min. Forbered først strand og anden streng cDNA ved hjælp af en standard kommercielle cDNA syntese kit.
- Rense den dobbelt-strenget cDNA ved hjælp af en magnetisk bead koncentrator. Vask med 800 µL af 70% ethanol tre gange. Kassér hver vask og lufttørre pellets ved stuetemperatur i 3 min. Resuspend i 16 µL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Bruge magnetisk bead koncentrator for at skille perlerne fra dobbelt-strenget cDNA, som nu er i opløsning. Fjern cDNA når der afpipetteres i en ny 200 µL PCR rør.
- Udføre fragment ende reparation ved hjælp af Taq-polymerase og en blanding af dexyribonucleotider leveres af en kommerciel bibliotek forberedelse kit. Den kommercielle kit indeholder forud fortyndede adaptere til at tilføje til hver ende af den dobbelt-strenget cDNA ved hjælp af kommercielle ligase ved 25 ° C i 10 min.
4. NGS af DNA bibliotek tilberedt af rå Virus forberedelse og dsDNA bibliotek forberedt fra mRNA
- Brug en standard høj overførselshastighed pyrosequencing instrument og følg alle anbefalede producenter protokoller for at generere direkte aflæsning af DNA-sekvenser. Brug kommercielle sekventering reagenser, herunder fluorescently mærket nukleotider.
Bemærk: Informationer finder producentens anvisninger med instrumentet. - Udføre efter sekvensering analyse ved hjælp af genom forsamling software, der automatisk samler læser for at producere den første sæt af contigs med en gennemsnitlig længde på < 700 bp. bruger FastQC software på webstedet iPlant/CyVerse, som udfører kvalitetskontrol kontrol af rå sekvens data32. Vælg sekvenser med Jytte score ≥ 30 til fortsat at rekonstruere længere sekvenser fra mindre sekvens lyder24 ved hjælp af kortlægning og amplikon software.
Bemærk: Informationer finder fabrikantens anvisninger. - Indsende disse samlet contigs NCBI-BLASTn analyse ved hjælp af MEGABLAST standard modul samt Viridplantae (TaxID: 33090) og vira (TaxID: 10239) som den begrænser kropsligt navne33. Samle delpopulation af contigs, der viser stor lighed med rapporterede Badnavirus genomer i en rapport.
- Kontroller, at de joinforbundne stilladser, der repræsenterer en eller flere kandidat fuld længde virus genomer, korrekt producere i-frame sekvenser, der har den samme organisation som standard badnavirus genom. For at gøre dette, input kandidat fuld længde virusgenom i et plasmid tegning software. Bekræft derefter de første 15 nukleotider består af en tRNAmødte (TGGTATCAGAGCGAG) som er meget bevaret blandt badnaviruses. Find den potentielle polyadenylation signal nær 3'-enden af genomet. Anmærke det komplette genom for at identificere tilstedeværelsen af to små ORFs og en stor ORF kodning en polyprotein. Derefter bruge portalen ExPASy oversætte værktøj til at identificere badnavirus ORF1, ORF2 og ORF3 oversættelse produkter34.
Bemærk: Denne videnskabelige software er gratis og vil generere cirkulært DNA, identificere alle åbne reading frames, og giver en øjeblikkelig output for at bekræfte, at sekvensen repræsenterer fuld længde cirkulært DNA genom. - Brug open source flere sekvens sammenligning værktøjer, muskel- og CLUSTALW, til at sammenligne de virus genomer fra DNA og RNA analyser35,36.
- Søg NCBI nukleotid database for at opnå fuld genom sekvenser af 30 badnavirus arter og eksportere dem som et dokument i .fasta format. Uploade sekvenser til en software, der gennemfører evolutionære genetisk analyse af sekvenser sammen med virus genomet sekvenser fremstillet ved NGS. Generere flere sekvens linjeføringer og maksimum sandsynligheden træer ved hjælp af muskel37.
5. vurdering af De Novo sekventering af PCR-amplifikation af Virus genomer fra inficerede planter
- Input nyligt identificerede fuld længde badnavirus genom sekvenser (.fasta format) til den gratis online Primer3 værktøj til at udlede PCR primere38. Identificere primer sæt, der vil producere forskudt produkter af 1.000-1.500 bp langs hele længden af virus genome(s). Send sekvenser til en serviceforhandler, der syntetiserer og levere PCR primere.
Bemærk: Output identificerer acceptable primer par med fælles og acceptabel smeltende temperaturer og præcise primer steder langs introducerede sekvenser. - Arbejder på et laboratoriebænk og iført en lab coat og handsker, isolere 5 µg af DNA fra virus-inficerede og sund kontrol bladene ved hjælp af en automatiseret metode, der involverer standard Paramagnetiske cellulose partikler for at isolere DNA fra plante materiale39 . Fryse blad materiale (20-40 mg) i flydende kvælstof i et microcentrifuge rør og slibe bruge en perle mill. Kombinere prøven med lysisbuffer i et microcentrifuge rør og tilføje RNase A til hver prøve. Vortex prøve for 10-20 s og kortvarigt spin prøve at fjerne faste partikler.
Bemærk: Paramagnetiske cellulose partikler har høj DNA-bindende kapacitet og isolere høje udbytter af ren DNA. Standard kommercielle silica kolonne metoder til DNA isolation udtrække ikke effektivt DNA fra en lang række plantearter. Derfor findes snesevis af metoder, der er ændringer af disse procedurer for at forbedre effektiviteten for enkelte plantearter. Automatiseret Paramagnetiske cellulose partikel metode blev valgt, fordi det giver mere og højere kvalitet DNA fra mere end 25 urteagtige angiosperm arter40. - Bruge kommercielle reagens patroner til automatiseret Paramagnetiske DNA isolation. Tilføje 300 µL nukleasen gratis vand til hver kommercielle reagens patron og overførsel plante lysate til den samme patron. Placere patronen i patronen rack, placere en stemplet i godt tættest til eluering tube og placere eluering buffer ind i eluering rør. Indlæse patroner i automatiserede nukleinsyre isolering maskine og køre plante DNA isoleret protokol41,42.
- Udføre PCR at udlede et sæt af overlappende PCR produkter. Brug 5 µM hver frem og bak primer med 35 cyklusser af PCR-amplifikation. Brug følgende cykling betingelser: denaturering ved 95 ° C i 60 s, udglødning ved 50 ° C til 45 s, og udvidelse ved 72 ° C i 1-2 min. med en sidste udvidelse ved 72 ° C i 7-10 min. Brug en færdigpakket gel filtrering kolonne at fjerne salte og lav molekylvægt materiale som i trin 1.231.
- Beregn forholdet 3:1 molar af PCR produkt til vektor til at bestemme mængden af PCR produkt til ligate til 50 ng lineariseret pGEM plasmid43. Brug et kontrolelement indsætte DNA til at afgøre, om ligations fungerer effektivt. Udføre ligatur natten over ved hjælp af T4 DNA ligase (3 U/µL) ved 4 ° C. Derefter omdanne kommercielt tilberedt JM109 kompetente Escherichia coli celler. Brug kontrollere 100 pg af uslebne plasmid DNA som en positiv kontrol for effektiv transformation. Plade 100 µL af transformerede celler på LB-agar plader med antibiotika og blå/hvid markering til at inddrive sammenskrevne plasmider26. Inkuber plader i 16-24 timer ved 37 ° C.
Bemærk: PGEM vektor har en lacZ genet, som koder β-galactosidase. Transformeret bakterier dyrket på en plade vil med 100 µg/mL ampicillin, 0,5 mM IPTG, 80 µg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) blaat på grund af β-galactosidase aktivitet. PGEM plasmid er lineariseret på en måde, der forstyrrer lacZ genet. Kolonier, der indeholder PCR produkt skær forstyrre lacZ gen og metabolisere ikke X-gal. Disse kolonier er hvide. Således kan kolonier med et indstik skelnes fra dem uden et indstik af farven på koloni (hvide versus blå)26. - Isolere DNA fra tre kolonier ved hjælp af en standard kolonne-baserede plasmid isolering kit39. Sekvens tre plasmider transformation produkt. Sammenlign hver DNA-sekvens med de novo samlet virus genomer produceret af NGS. Brug CLUSTALW til at justere sekvenserne og at sikre, at de er korrekt sorteret.
Representative Results
Denne modificerede virus rensning metode forudsat en berigelse af virus DNAs nyttig til at identificere to virus arter af NGS og bioinformatik. Efter at homogenatet var centrifugeres ved 40.000 x g i 2,5 h, var der en grøn pellet i bunden af røret og en hvid pellet langs længden. Den grønne pellet var genopslemmes ind i et microcentrifuge rør og de hvide pellet var genopslemmes i to microcentrifuge rør. PCR blev udført ved hjælp af standard CaYMV PCR diagnostiske primere, og produkter blev opdaget i den solubilized hvid pellet og ikke den grønne pellet (fig. 1A). En prøve af den rå forberedelse blev undersøgt af transmissions Elektron Mikroskopi og vi observerede bacilliform partikler måling 124-133 nm længde (figur 1B). Det er inden for den forventede modal længden af de fleste badnaviruses. DNA blev udvundet fra de hvide og grønne pellets og genopslemmes separat. I figur 1C, vi læsset 5 µL DNA ekstraheret fra grønne og hvide pellet prøve (1,6 µg DNA for den grønne del) og 3,1 µg DNA for den hvide fraktion til 0,8% Agarosen gel elektroforese og analyseret DNA efter ethidiumbromid farvning. Den grønne brøkdel indeholdt lavmolekylære DNA, mens den hvide brøkdel produceret to bands af højere molekylvægt DNA, samt den lavere molekylvægt DNA (figur 1C). Gelen præsenteret i figur 1C blev kørt i 40 min. ved 100 V og smøre i lane 3 tyder på, at gel spændingen bør sænkes til at producere klarere bands. Disse data tyder på at den hvide pellet blev beriget til virioner. DNA (0,6 µg/mL) koncentration udvindes fra den hvide prøve var lav, men tilstrækkelig til NGS, som kræver et minimum af 10 ng af DNA til at fortsætte. Fragmenterede DNAs blev brugt til at forberede NGS et bibliotek.
Sideløbende blev RNA udvundet fra inficerede canna planter (fig. 1D) for høj overførselshastighed RNA-FF. En standard arbejdsprocessen blev gennemført for biblioteket forberedelse, NGS, oprettelse af contigs, og at identificere virale genom sekvenser (figur 1E). Outputresultater fra DNA og RNA som råvarer blev sammenlignet.
Vi opnåede 188,626 rå DNA læsninger af NGS ved hjælp af DNA isoleret fra rå virus forberedelse. Læser blev samlet i 13,269 contigs og BLASTn blev brugt til at søge NCBI datasæt af nukleotidsekvenser (ved hjælp af Viridplantae TaxID: 33090 og Virus TaxID: 10239 som de begrænsende organismer) (figur 1E). NCBI-BLASTn resultater viste, at 93% af de novo samlet contigs var cellulære sekvenser, 22% var ukendt, og 0,3% var virus contigs (figur 2A). Fleste af contigs kategoriseret som cellulære sekvenser blev identificeret som mitokondrier eller grønkorn DNA. I datasættet for virus contigs, 32% af virus contigs var relateret til medlemmer af Caulimoviridae (som ikke var Badnavirus sekvenser) og 58% af disse var relateret til Badnavirus. Af virus contigs, 29% var meget lignende (e < 1 x 10-30) til CaYMV isoleres V17 ORF3 gen (EF189148.1), sukkerrør bacilliform virus isolere Batavia D, komplet genom (FJ439817.1), og banan streak CA virus komplet genom ( KJ013511). Inden for denne befolkning var der lange contigs, der lignede to fuld længde genomer.
Høj overførselshastighed RNA-seq produceret 153,488 renset enkelte sekvens læser med et gennemsnit læse længde af < 500 bp. Contig forsamling reduceret dette til 8,243 contigs. Disse blev forelagt NCBI-BLASTn (ved hjælp af Viridplantae TaxID: 33090 og Virus TaxID: 10239 som de begrænsende organismer) og udgange placeret 76% af contigs i en kategori af plante cellulære sekvenser, 23% var ukendt, og 0,1% blev kategoriseret som virus () contigs Figur 2 B). nærmere undersøgelse af befolkningen i befolkningens 0,1% af virus contigs bestemmes, at 68% af disse var knyttet til Caulimoviridae (figur 2B). Tre store contigs inden for denne befolkning blev identificeret med høj lighed (e < 1 X 10-30) til CaYMV isoleres V17 ORF3 gen (EF189148.1), sukkerrør bacilliform virus isolere Batavia D, komplet genom (FJ439817.1) og Banana streak CA virus komplet genom (KJ013511). Behandlingen af de tre contigs, kom vi manuelt to af disse til at producere en fuld længde virusgenom.
Vi sammenlignede virus genomet længde contigs produceret af DNA og RNA sekventering som en gensidig stillads til at bekræfte tilstedeværelsen af to fuld længde virus genomer. En fuld længde virus genomet i 6,966 bp var tentativt kaldet Canna gule mottle associeret virus 1 (CaYMAV-1) (fig. 3A). Den anden genom blev 7,385 bp og en variant af CaYMV inficerer Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (fig. 3A).
Endelig, PCR-primere, som var designet til klon ~ 1000 bp fragment af hver virus, blev brugt til varierende opdager både genomer i en befolkning på 227 canna planter der repræsenterer ni kommercielle sorter. I mange tilfælde var enkelte planter smittet med både virus. Vi leverer et eksempel af RT-PCR påvisning af CaYMAV-1 og CaYMV-Ap01 i de 12 planter. Tre af disse var positiv kun for CaYMV-Ap01 og ni var positive for både virus (fig. 3B).
Figur 1 : Virus nukleinsyre præparater og NGS arbejdsproces. (A) Agarosen (1,0%) gel elektroforese af 565 bp PCR fragmenter af CaYMV genomer. To PCR produkter blev fundet i prøver forberedt fra den hvide pellet (baner 1, 2), men ikke i den grønne pellet prøve (lane 3). Positiv kontrol (+) repræsenterer en PCR produkt amplificeret fra inficerede plante DNA, der blev isoleret ved hjælp af en automatiseret metode med standard Paramagnetiske cellulose partikler. Lane L indeholder DNA ladder anvendes som en standard for måling af størrelsen af lineære DNA bands i stikprøven baner. (B) eksempel på virus partikel set af transmissions Elektron Mikroskopi i den hvide pellet inddrives af rå fraktionering af inficerede canna blade. (C) Agarosen (0,8%) gel elektroforese DNA inddrives fra green (lane 1) og hvid (lane 2) pellets at testet positiv ved PCR i panelet A. De røde og gule prikker ved siden af lane 2 identificere to høj molekylvægt DNA bands, der opstår i den hvide fraktion. (D) Agarosen (1%) gel elektroforese af total RNA inddrives af kolonne-baserede RNA oprensning. Lane L indeholder DNA ladder anvendes som en standard for måling af størrelsen af lineære bands i stikprøven baner. Lane 1-6 indeholder RNA isoleret fra inficerede canna blade der var samlet på en enkelt prøve for ribo-udtynding og RNA-FF. (E) skematisk pipeline af nukleinsyre isolering, bibliotek forberedelse, sekventering, contig forsamling og virusgenom Discovery. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Krone diagrammer visualisere de taksonomiske kategorier af contigs. (A) i diagrammet på den venstre viser overflod og taksonomisk fordeling af contigs samlet fra rå virus forberedelse. Den rigtige diagramtype skildrer proportioner af virus contigs forbundet med Caulimoviridae familien, Badnavirus slægt og tre nært beslægtede arter. (B) i panelet til venstre viser overfloden af contigs stammer fra RNA-seq baseret på deres taksonomisk fordeling. Til højre er grafen skildrer overfloden af contigs inden for befolkningen i virus contigs forbundet med Caulimoviridae familien, Badnavirus slægt og tre nært beslægtede arter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Karakterisering af CaYMAV-1 og CaYMV-Ap01 genomer. (A) skematisk repræsentation af Canna gule mottle knytte virus 1 (CaYMAV) og Canna gule mottle virus svarende til genomet isoleret fra Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid positioner 1-10 er identificeret som i starten af genomet og indeholder en tRNAmødte anticodon websted typisk for de fleste badnavirus genomer. Stop og start positioner for oversættelse af åben behandling ramme (ORF) 1 og 2 er tilstødende. Disse proteiner har ukendte funktioner. ORF3 er en polyprotein indeholdende zink finger (ZnF), protease (Pro), reverse transkriptase (RT) og RNAse H domæner. En 3' poly(A) signal sekvens bevares for både virus genomer. (B) RT-PCR analyse blev udført ved hjælp af RNA isoleret fra virus inficerede blade og primere, der registrerer CaYMAV og CaYMV-Ap01. I den samme befolkning på 12 planter, var tre inficeret med CaYMV-Ap01 kun, mens de resterende var smittet med både CaYMAV og CaYMV-Ap01. (+) angiver positiv kontrol og (-) angiver negativ kontrol. Denne figur er gengivet/ændret fra Wijayasekara et al. 24 med tilladelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I de seneste år har været ansat en række metoder til at studere plante virus biodiversitet i naturlige miljøer, som omfatter berigende for virus-lignende partikler (VLP) eller virus bestemt RNA eller DNA2,3,44, 45,46 . Disse metoder er efterfulgt af NGS og bioinformatic analyse. Målet med denne undersøgelse var at finde den kausale agens af en almindelig sygdom i en dyrket plante. Sygdommen blev rapporteret at være resultatet af en ukendt virus, som har ikke-kappeklædte bacilliform partikler, og som kun en 565 bp fragment er blevet klonet47. Disse oplysninger var tilstrækkelig for forudgående forskere hypotetisk tildele virus til slægten Badnavirus inden for familien Caulimoviridae. Mens forudgående rapporter en hypotese at canna mottle sygdom i canna liljer var resultatet af en enkelt badnavirus, brug af metagenomics tilgang skitseret i denne undersøgelse, vi har besluttet at sygdommen skyldtes to foreløbig badnavirus arter24. Styrken ved hjælp af en metagenome tilgang til at opdage den kausale agent for en sygdom er således, at vi nu kan identificere situationer hvor der kan være mere end én årsag.
Vores tilgang, der kombinerer DNA og RNA sequencing data er grundig og viser også, at resultaterne ved hjælp af to tilgange viste konsekvente resultater og bekræftet tilstedeværelsen af to beslægtet vira. Vi ansat en modificeret procedure for isolering af caulimoviruses og produceret en stikprøve, blev beriget for virus forbundet nukleinsyrer og der var beskyttet i virus kapsid. En service laboratorium var ansat til at udføre DNA-sekventering. Væsentlige konceptet for de novo sekventering er, at DNA polymerase indeholder fluorescerende mærket nukleotider i en DNA-skabelon strand under sekventiel cyklusser af DNA syntese. Contigs samlet efterfulgt af NGS blev indsendt til en bioinformatic arbejdsgang producerer et par contigs, der blev identificeret som virus contigs. Yderligere bekræftelse af to virus genomer10,24,48,49,50 er tilvejebragt ved bioinformatic analyse af RNA-seq data indhentet fra ribo-forarmet RNA præparater. Et interessant resultat var at lære, at befolkningerne i sekvenser inddrives af DNA og RNA sekventering fremlægges lignende fordelinger af ikke-virale og virale nukleinsyrer. Til DNA og RNA sekvensering var < 0.5% af sekvenser af virus oprindelse. Inden for befolkningen i virus sekvenser 78-82% tilhørte familien Caulimoviridae. Ved at sammenligne den forsamlede virus contigs fra DNA og RNA sekventering, bekræftede vi, at de to samlet genomer opstod i begge datasæt.
En bekymring for at bruge kun DNA-sekvensering til at identificere de nye virus genomer er badnavirus genom en åben cirkulære DNA. Vi anede, at sekvenser overlappende afbrydelser i genomet kan medføre hindringer for genom forsamling fra contigs. Indledende undersøgelse af DNA-sekventering resultater afslørede to lignende virus genomer. Vi den hypotese, at disse genomer enten repræsenteret genetiske mangfoldighed af arter, der ikke er blevet undersøgt, eller repræsenterede to arter Co inficere den samme plante24. Derfor, den kollektive bioinformatic analyse af datasæt fremstillet ved NGS DNA og RNA sekventering, aktiveret bekræftelse af tilstedeværelsen af to fuld længde genomer.
Der er en anden betænkning, som udviklede en alternativ metode til at udtrække VLP og nukleinsyrer fra planten homogeniseret for metagenomic undersøgelser, baseret på procedurer til at inddrive DNA fra blomkålsmosaikvirus (CaMV; en caulimovirus)3. Denne tilgang identificeret roman RNA og DNA virus sekvenser i ikke-dyrkede planter. De skridt, afledt af caulimovirus isolation procedure, der anvendes i denne undersøgelse for at opdage den kausale agent for en sygdom af dyrkede planter er i modsætning til trin stammer til at udtrække VLP fra naturligt inficerede planter24. Succes for både ændrede metoder antyder, at proceduren for caulimovirus isolation kan være et værdifuldt udgangspunkt for metagenomic undersøgelser af plant vira i almindelighed.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskning blev finansieret af Oklahoma Center for avancement of Science og Technology anvendes Research Program fase II AR 132-053-2; og af Oklahoma Institut for landbrug speciale afgrøder forskning Grant Program. Vi takker Dr. HongJin Hwang og OSU Bioinformatik Core facilitet, som blev støttet af tilskud fra NSF (EOS-0132534) og NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 og 5P20RR15564-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
| urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
| Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
| Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
| MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
| EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
| Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
| phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
| DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
| 95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
| Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
| Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
| Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
| Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
| Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
| 2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
| 2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| 2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
| RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
| RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
| rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
| RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
| pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
| pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
| dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
| PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
| Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
| PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
| pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
| MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
| Primer 3.0 | Simgene.com | ||
| Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
| GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
| GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
| GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
| IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
| IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
| GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
| GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
| GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
| Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
| GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
| GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |
References
- Dijkstra, J., Jager, C. P. Practical Plant Virology : Protocols and Exercises. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).
- Roossinck, M. J. Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology. Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).
- Melcher, U., et al. Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya. J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).
- Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay. Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).
- Borah, B. K., et al. Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group. Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).
- Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences. Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).
- Geering, A. D., et al. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).
- Kunii, M., et al. Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution. BMC Genomics. 5, 80 (2004).
- Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm. Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).
- Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species. Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).
- Gayral, P., et al. A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus. J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).
- Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora. AoB Plants. 2011, 008 (2011).
- Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).
- Singh, K., Talla, A., Qiu, W. Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs. Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).
- Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run. J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).
- Kreuze, J. F., et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388 (1), 1-7 (2009).
- Zheng, Y., et al. VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs. Virology. 500, 130-138 (2017).
- James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).
- Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India. Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).
- Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2. Virus Res. 238, 29-34 (2017).
- BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses. Viruses. 8 (7), (2016).
- Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida. Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).
- Zhang, J., et al. Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii. Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).
- Wijayasekara, D., et al. Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease. Virus Res. 243, 19-24 (2018).
- Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. Caulimovirus isolation and DNA extraction. Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).
- Kanagal-Shamanna, R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).
- Getts, D. R., et al. Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages. J Neuroinflammation. 9, 246 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
- Gel filtration principles and methods. GE Healthcare. , (2010).
- Goff, S., et al. The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology. Frontiers in Plant Science. 2, (2011).
- Lin, Z., et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets. J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5, 113 (2004).
- Hung, J. H., Weng, Z. Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).
- Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review. Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191 (2013).
- Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
- Moeller, J. R., et al. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
- Grooms, K. Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa. , (2015).
- Nishimori, A., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. PLoS One. 12 (4), 0174916 (2017).
- Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. Plant Virus Evolution. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).
- Roossinck, M. J. The big unknown: plant virus biodiversity. Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).
- Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).
- Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Plant Health Progress. , Online (2004).
- Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.). Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).
- Harper, G., et al. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).
- Muller, E., Sackey, S. Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences. Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).
