Summary
昆虫の口器の palps で単一ゴキブリ触角 basiconica から録音の詳細と非常に効果的なプロトコルについて述べる。
Abstract
イナゴ口器の palps はローカストの食品の選択、特に非揮発性化学手がかり (旧称ターミナル ワモンゴキブリ触角 chaetica の検出のために重要な役割を果たして従来の味覚器官と見なされますまたは紋付き触角)。今増加するこれらの palps も嗅覚機能があること証拠があります。嗅覚受容体 (LmigOR2) と匂い物質結合蛋白質 (LmigOBP1) にローカライズされているニューロンおよびアクセサリー細胞でそれぞれ palps の触角 basiconica。単一のゴキブリ (SSR) の記録は、特定の嗅覚の受容器のアクティブな配位子をスクリーニングするための効果的な方法である嗅覚受容体ニューロンの応答を記録するため使用されます。SSR は palp 触角嗅覚受容体の機能解析に使用されます。Palps のドームにある触角 basiconica の構造は、これらのアンテナの構造からは多少異なります。したがって、匂いによって誘発される SSR を実行すると、いくつか具体的なアドバイスは最適な結果を得るために有用かもしれません。昆虫 palp 触角 basiconica から SSR の詳細と非常に効果的なプロトコルを導入する.
Introduction
動物には、外因性化学手掛かりを感じる嗅覚器官の範囲が進化してきました。昆虫で最も重要な嗅覚器官がアンテナと palps です。これらの臓器に嗅覚の触角と呼ばれる、化学感覚毛のいくつかの種類は、毛の嗅覚ニューロン (CSNs) によって支配されています。嗅覚の触角の CSNs 認識中枢神経系1,報2,3 まで転送されるその後の電位に化学的刺激に対するシグナル伝達を介して特定の化学手掛かり.
CSNs エクスプレス様々 な嗅覚受容 [例えば、嗅覚受容体 (ORs)]、イオン型受容体 (IRs) とそのの種類に関連付けられている外因性化学手掛かりをエンコード、膜上の味覚受容体 (GRs)4,5,6。CSNs の特性は、昆虫化学受容の分子・細胞メカニズムの解明への鍵です。蛾8、甲虫9、アブラムシ10, イナゴ11, 単一ゴキブリ記録 (SSR) など多くの昆虫の触角感覚の昆虫 CSNs のキャラクタリゼーション ハエ7のため広く使われている手法ですが、今とアリ12。その触角の特定の構造を作るのでただし、いくつかの研究、SSR 昆虫 palps13,14,15,16,17に適用が、電気生理学的記録困難18。
イナゴ (直翅目) は、しばしば深刻な農作物被害と経済的損失19を引き起こします。Palps はイナゴ20,21,22,23,24の食品の選択に重要な役割を果たすと考えられています。走査型電子顕微鏡 (SEM)、嗅覚の触角の 2 種類を調べた。通常、イナゴ palps18の各ドーム、350 触角 chaetica と 7-8 触角 basiconica を観察します。触角 chaetica が非揮発性化学手掛かりを感じる味覚のワモンゴキブリ触角 basiconica 揮発性化学手掛かりを感知、嗅覚機能があります。
イナゴ palps 触角 basiconica (ca. 12 μ m) の髪ソケットの直径は触角 chaetica のそれらよりはるかに大きい (ca. 8 μ m)18,25。Palps で触角 basiconica のクチクラの壁は触角感覚18のそれよりもはるかに厚いです。さらに、palp のドームは柔軟性の高いキューティクル内流体の内容です。これらの特性は、電極と良好な電気生理学的信号の集録と浸透が触角感覚のよりも難しいという意味します。本稿でビデオ イナゴ palp 触角 basiconica の詳細と非常に効果的な SSR のプロトコルが表示されます。
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Protocol
1. 楽器や昆虫の準備
-
タングステン電極と刺激のソリューションの準備
- マイクロマニピュレーターに新しいタングステン ワイヤ (0.125 mm の直径、長さ 75 mm) を修正し、10 V (40 倍) 顕微鏡の下で約 1 分の電源供給によって提供されるで注射器で 10% (w/v) ナトリウム亜硝酸塩 (ナノ2) ソリューションでそれを磨きます。
- 繰り返し 10% ナノ2ソリューション < 1 分 (図 1 a) で 5 V で約 4 mm に削ったタングステンワイヤーを浸しなさい。
- いいイナゴ palp 嗅覚ゴキブリ (図 1 b) のキューティクルに浸透するまで、実体顕微鏡下でよく尖ったタングステン先端の直径を確認します。
- 刺激ソリューションを準備します。各鉱物油の化学的刺激物質を希釈します。1-ノナノール、ノナン酸 10% 希釈液で希釈します。E 2 ヘキサナールと 10-510-410-310-2でヘキサナールを希釈します。
- パスツールの刺激を運ぶ管を準備: パスツール チューブ挿入濾紙片 (長さ 2 cm、幅 0.5 cm) 濾紙片に希薄刺激ソリューション (各 10 μ l) を追加して、パスツール ピペット チップ (1 ml) 管を接続します。
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虫を準備します。
- 60% の相対湿度、28-30 ° C の温度と 18:6 h (光: 暗い) の日長で混雑した条件の下で新鮮な小麦幼植物と後部イナゴ (トノサマバッタ)。選択 1-3 日古い 5thイナゴの幼虫の齢期し、いいハサミを記録するとき、任意の干渉を避けるためにアンテナを取り外します。
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イナゴ上顎 palp ホルダーを準備します。
- 上顎 palp ホルダー (MPH) の拠点として (25 mm × 75 mm) スライド ガラスを使用します。両面接着テープでスライド ガラスの隅にプラスチック片 (長さ 35 mm、幅 10 mm、高さ 1 mm) を添付し、最後に両面粘着テープでプラスチックの部分の上にカバーガラス (18 mm × 18 mm) を修正します。滑り止め層として、カバーガラスの上に赤いゴム製テープの小片を置きます。プラスチック部分とカバーガラスは、イナゴ palp のプラットフォームを構成します。プラットフォームの高さは約 1.5 mm です。
- 1.5 mm 内側に平行の距離でタングステン線 (0.125 mm の直径、長さ 36 mm) をインストール プラットフォームの端。両面粘着テープでプラットフォームにワイヤーの両端を固定します。
2. イナゴ上顎 Palps の準備
- 遠心分離機管 (1.5 ml) を垂直方向に半分にカットし、底を切り取り。準備管にイナゴを配置します。腹側領域と公開されているローカストの頭を残します。両面粘着テープ (図 2 a) でスライド ガラスにアセンブリを固定します。
- プラットフォームに右側上顎 palp を引き出します。
- Palp の 4 番目のセグメントにタングステン線を置きます。タングステン線、上顎 palp (図 2 aおよび2 b) から約 2 mm の両側に接着パテを配置します。
3. 単一ゴキブリ録音
- 低倍率 (100 X) に顕微鏡下でイナゴ上顎 palp 準備を配置します。Palp が記録電極 (図 3 a) に対して垂直になるまでの準備の位置を調整します。
- マニュピュレーターを使用してバッタ目に参照電極 (タングステン電極) を挿入します。マイクロマニピュレーター (図 3 b 3 C) を用いた上顎 palp に近い記録電極 (タングステン電極) を移動します。
- 上顎 palp (図 3 b) から約 1 cm に匂いの配信デバイスを調整します。
- 自動スパイク 32 記録ソフトウェアを開きます。録音パラメーターを次のように設定: 500 μ V; 記録スケール300 Hz、200 Hz の低カットオフ フィルターの高いカットオフ10 のプレトリガー s。
- 普遍的な ac/DC アンプ x 10 に記録電極を接続します。
- スイッチ (500 倍) の高倍率顕微鏡。上顎 palp の basiconic ゴキブリのベースに記録電極を挿入し、繊細な良い自発スパイク (図 3 D) を取得する記録電極を調整します。
- 20 ml で連続的なエアー ストリームを配信する刺激コント ローラーを開く/s. 10 1, 記録信号刺激時間を設定開始 10 の刺激パルスの発症前に s。
- 10 x の普遍的な ac/DC アンプを使用して、信号を増幅します。加齢医学研究 4 に信号を送ります。自動スパイク 32 ソフトウェア信号を分析します。AC 信号は、バンドパス フィルターの間 200 に 300 Hz。 使用自動スパイク 32 音からピーク ・ トラフ振幅を区別するためにです。自発頻度の活動電位の周波数 (1 秒あたりのスパイク) の増加としてニューロンの応答を計算します。グラフパッド プリズム 7 を使用して統計分析を実行します。
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Representative Results
イナゴ上顎 palp 上の 2 つの触角サブタイプ (pb1 ・ pb2) は、化学の匂い (10 %1-ノナノールと 10% ノナン酸) に異なる応答ダイナミクスに基づいて識別されます。Pb1 のニューロンは、1-ノナノール pb2 のニューロン中ノナン酸が大幅 1-ノナノール ノナン酸 (図 4) と比較して少ない活性化よりもはるかに大きなスパイクを生成します。ヘキサナールと E-ヘキサナール応答 (POR)26を開くイナゴ palp を呼び起こすことができます。ヘキサナールは、豊富なホスト植物緑葉揮発性食品ソース26にさらに確認に貢献するかもしれないです。最後 pb1 ニューロンのスパイク pb2 E-ヘキサナール (図 4) によって刺激される彼らの耳より長い。Pb1、pb2 のニューロンを表わす同様に堅牢なレスポンス ヘキサナール (図 4)。すべてのスパイクの前に期間 5 s と 5 の間の平均の変化を比較する刺激は、1-ノナノールへの応答、ノナン酸 pb1、pb2 が裏腹により有意に高いことを示しますの後に s (図 5)。触角のこれらの 2 つのサブタイプのニューロン応答 E 2 ヘキサナール、ヘキサナール、用量依存的にこれらの 2 つのアルデヒドの応答パターンが異なる (図 6Aおよび6B).
図 1。電極作製。(A) このパネル電極シャープ装置の一般的な見解を示しています。10% ナノ2 (左) の入った注射を使用して、(右) 電極をシャープにします。(B) このパネル (a: 適切な; b: 不適切な) 電極先端部の緊密なビューを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。イナゴ上顎 palp ホルダー (MPH).(A) のマイルおよびイナゴは顕微鏡の下に配置する前にスライド ガラスに取付けられます。(B) このパネルには、プラットフォームのタングステン ワイヤで固定、イナゴ上顎 palp のクローズ アップが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。単一のゴキブリ録音します。(A) このパネルは電気生理学のセットアップのビューを示しています。(B) このパネルは顕微鏡をマウント イナゴ準備の緊密なビューを示しています。(C) この画像は、100 倍の倍率でイナゴ上顎 palp を示しています。(D) この画像は、500 倍の倍率で、palp を示しています。Basiconic ゴキブリを矢印します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。イナゴ上顎 palp の単一ゴキブリ録音の応答トレースします。このパネルで、pb1 の略 palp 触角 basiconica; のサブタイプ 1pb2 のサブタイプ 2 palp 触角 basiconica の略です。トレース上バーを示す刺激持続時間 (1 秒)。これらの録音すべての悪臭を 1% に希釈され E 2 ヘキサナールとヘキサナールを除いて 10% 希釈で使用します。この図は、張らから変更されています。26.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。Pb1、pb2 ノナン酸、1-ノナノールによって刺激されるニューロンのスパイクの平均の数値を比較します。スパイクの平均数は、刺激の前後期間 5 s で計算されます。Pb1、平均 1-ノナノールへの応答ニューロンのスパイク数増加ノナン酸に応答ニューロンのスパイクのそれらよりかなり高い (n = 11 palps;アドホックの記事t-テストと分散分析p < 0.0001) pb2 と対照をなして (n = 10 palps;アドホックの記事t-テストと分散分析p = 0.0110)。エラー バーを表します SEM.この図は、張らから変更されています。26.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。Pb1、pb2 応答 E 2 ヘキサナールとヘキサナールで用量依存的に神経細胞のパターン。(A) このパネル pb1 でニューロンのパターンを示しています (± SEM;n = 12 palps)。(B) このパネルは pb2 にニューロンのパターンを示しています (± SEM;n = 10 palps)。この図は、張らから変更されています。26.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
昆虫は palps 食べ物のにおいを検出するために依存して、palps スペシエーション13,27で重要な役割を果たすと考えられています。Palps は単純な嗅覚器官であり、脳分子の探査のための魅力的なモデルは、基になるその28をネットワークとして注目を受けています。
昆虫昆虫および palp SSRs 正常に行った、キイロショウジョウバエ、に対する地域のネッタイイエカ13,14,,1516,17ビデオ プレゼンテーション16,29の形で報告されていることはほとんどありませんが。対照的に、触角の SSRs のビデオ ・ データ、ショウジョウバエ、おへそ orangeworm 蛾 (Amyeloistransitella)、サバクトビバッタ アメリカーナ、ベッドのバグ (トコジラミずつ)16,30,31,32,33。
イナゴ palp 触角 basiconica イナゴ触角感覚と他の多くの昆虫の触角とは異なる特定の構造があります。ここで説明した方法を使用して、イナゴ palp 触角 basiconica サブタイプ pb1 によって生成された活動電位、pb2 を記録できるし、差別 (図 4および図 5)。
記録電極の浸透の重要なステップです。記録電極は、ゴキブリのベースに挿入し、良好な信号を取得するまでを高度なする必要があります。さらに、palp のドームが、ゴキブリのベースに記録電極を挿入するときに崩壊するを防ぐために重要です。これを達成するために、我々 は特別なローカスト上顎 palp ホルダー (MPH) を含むプラットフォームを設定し、タングステン線、palp の 4 番目のセグメントを圧縮するために使用します。この手順の多くの繰り返しは、これが有効であることを示しています。いくつかの匂いに触角のニューロンの応答パターンに基づいて、最初に同定しました pb1、pb2 すなわちイナゴ上顎 palp の触角 basiconica の 2 つのサブタイプ。
この文書で説明されている技法の制限は、それが大きな昆虫 (例えば蛾、カブトムシ、バッタ) を記録に使用することができる小さな昆虫 (例えばハエや蚊)、独自のプラットフォームを持つを記録しないためしばらくの間、テクニック13,14,15,16,17。この手法は、既存の方法を補完するものです。
結論としては、昆虫 palp 触角 basiconica から SSR の非常に効果的なプロトコルで詳しく説明します。このプロトコルは、ブローピンの昆虫嗅覚の分子・細胞メカニズムの研究に有用な技術を持つ研究者を提供できます。ガスクロマトグラフィーとリンクされているこのメソッドは、天然生理活性有機配位子有利な食糧資源の抽出物を識別するために使用可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、中国の国家自然科学基金 (No.31472037) からの助成金によってサポートされます。商号またはこの資料の商用製品の一切の言及は特定の情報を提供する目的、勧告とは限りません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | ADVENT | W559504 | Used for making the electrode and fixing the palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Used for sharpening the tungsten wire |
| AC Power Supply | Syntech | A2-70 | Providing the voltage in sharpening the tungsten wire |
| Stereoscope | Motic | SMZ-163 | Used for observing the sharpening of tungsten wire |
| Microscope | Olympus | W-51 | Used for observing the sensilla on locust maxillary palp |
| Intelligent Data Acquisition Controller | Syntech | IDAC-4 | Real-time on screen display of all signals before and during recording |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 | Used for controlling the stimulus application |
| Electronic micromanipulator | C.M.D.T | CFT-8301D | Used for minor movement of the recording electrode |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Used for minor movement of the reference electrode |
| Speaker | EDIFIER | R101T06 | Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal |
| Magnetic base | PDOK | PD-101 | Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube |
| Vibration Isolation Table | TianHe | HAP-100-1208 | Used for isolating the vibration from the equipment |
| Glass slide | CITOGLAS | ZBP-407 | Used for making the base for the MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Fixing the tungsten wire |
| Pasteur tube | YARE | WITEG | Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions |
References
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