Summary
Este artigo descreve um protocolo detalhado e altamente eficaz para gravações de único sensillum do basiconica de sensilas sobre os palpos de peças bucais de insetos.
Abstract
Os palpos das peças bucais locust são considerados órgãos gustativos convencionais que desempenham um papel importante na seleção de alimentos de um gafanhoto, especialmente para a detecção de não-volátil sugestões químicas através de sensilas chaetica (anteriormente denominado terminais sensilas ou crista sensilas). Há crescente evidência de que estes palpos também têm uma função olfativa. Um receptor de odorante (LmigOR2) e uma proteína ligadora de odorante (LmigOBP1) foram localizadas nos neurônios e células de acessório, respectivamente, na basiconica de sensilas dos palpos. Sensillum única gravação (SSR) é usado para gravar as respostas dos neurônios receptores de odorante, que é um método eficaz para ligantes ativos sobre os receptores específicos odorante de triagem. SSR é usado em estudos funcionais de receptores de odorante no sensilas palpo. A estrutura do basiconica de sensilas localizado na cúpula dos palpos difere um pouco da estrutura das pessoas sobre as antenas. Portanto, ao realizar um SSR eliciado odorantes, alguns conselhos específicos podem ser útil para a obtenção de melhores resultados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo detalhado e altamente eficaz para um SSR de inseto palpo sensilas basiconica.
Introduction
Animais têm evoluído de uma gama de órgãos chemosensory que detetam sugestões químicas exógenas. Em insetos, os mais importantes órgãos de chemosensory são as antenas e os palpos. Nestes órgãos, diversos tipos de cabelos chemosensory, chamados chemosensory sensilas, são inervados pelos neurônios chemosensory (CSNs) dentro os pelos. CSNs em chemosensory sensilas reconhecem sugestões químicas específicas através de transdução de sinal de estímulos químicos para potenciais eléctricos que posteriormente são transferidos até o sistema nervoso central1,2,3 .
CSNs expressam vários receptores chemosensory [por exemplo, receptores de odorante (ORs)], geleificação receptores (IRs) e receptores gustativos (GRs) em suas membranas, que codificam exógenas sugestões químicas associadas com diferentes tipos de chemosensation 4,5,6. A caracterização da CSNs é a chave para a elucidação dos mecanismos celulares e moleculares de inseto quimiorecepção. Agora gravação única sensillum (SSR) é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização de insecto CSNs nos sensilas antenais de muitos insetos, incluindo moscas7, traça8, besouros9, pulgões10, gafanhotos,11, e formigas,12. No entanto, poucos estudos têm aplicado um SSR a inseto palpos13,14,15,16,17, porque as estruturas particulares da suas sensilas fazem um gravação eletrofisiológicas difícil18.
Enxames de gafanhotos (Orthoptera) muitas vezes causam danos à lavoura grave e perda econômica19. Os palpos são acreditados para jogar um papel importante na seleção alimentar de gafanhotos20,21,22,23,24. Dois tipos de sensilas chemosensory são investigados por um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Geralmente, chaetica 350 sensilas e 7-8 sensilas basiconica são observados em cada cúpula dos locust palpos18. Chaetica de sensilas são sensilas gustativas que detetam sugestões químicas não-volátil, enquanto sensilas basiconica têm uma função olfativa, sensoriamento sugestões químicas voláteis.
Em palpos de locust, os diâmetros das tomadas de cabelo da basiconica de sensilas (ca. 12 µm), são muito maiores do que aqueles de sensilas chaetica (ca. 8 µm)18,25. A parede cuticular do basiconica de sensilas sobre os palpos é muito mais espessa do que a de sensilas antenais18. Além disso, a cúpula do palpo tem conteúdo líquido dentro de uma cutícula altamente flexível. Estas características significam que uma penetração com um microeléctrodo e uma aquisição de sinais eletrofisiológicos boas é mais difícil do que para sensilas antenais. Neste trabalho, um protocolo SSR detalhado e altamente eficaz para locust palpo sensilas basiconica é apresentado com um vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação dos instrumentos e inseto
-
Preparando o tungstênio soluções eletrodos e estímulos
- Fixar um novo fio de tungstênio (diâmetro de 0,125 mm, comprimento de 75 mm) em um micromanipulador e apontá-lo em uma solução de nitrito (NaNO2) de sódio 10% (p/v) em uma seringa de 10 V fornecida por uma fonte de alimentação por cerca de 1 min sob um estereomicroscópio (ampliação de 40 X).
- Mergulhe o fio de tungstênio afiada repetidamente em solução 10% NaNO2 , cerca de 4 mm em 5 V em < 1 min (figura 1A).
- Examine o diâmetro da ponta afiada tungstênio frequentemente sob o microscópio estereoscópico até é fino o suficiente penetrar a cutícula de um sensillum de olfativo locust ao toque (figura 1B).
- Prepare as soluções de estímulo. Dilua cada um da substância química estímulo em óleo mineral. Dilua 1-nonanol e ácido nonanoico em diluições de 10%. Dilua E-2-hexenal e hexanal em 10-2, 10-3, 10-4e 10-5.
- Preparar Pasteur tubos carregando os estímulos: inserir as tiras de papel de filtro (de 2 cm de comprimento, largura de 0,5 cm) para os tubos de Pasteur, adicione as soluções diluídas de estímulo (cada 10 µ l) para as tiras de papel de filtro e em seguida, conecte os tubos de Pasteur com pontas de pipetas (1 ml).
-
Preparar o inseto
- Gafanhotos traseiros (Locusta migratoria) com mudas de trigo fresco sob condições de superlotação em um fotoperíodo de 18:6 h (luz: escuro), uma temperatura de 28-30 ° C e uma humidade relativa de 60%. Escolha 1 de 3-dias de idade 5th ínstar ninfas de gafanhoto e remover as antenas com uma tesoura bem para evitar qualquer interferência durante a gravação.
-
Preparando o titular do palpo maxilar locust
- Use uma lâmina de vidro (25 x 75 mm) como a base do titular do palpo maxilar (MPH). Prenda um pedaço de plástico (1 mm de altura, 10 mm de largura, 35 mm de comprimento) para um canto do vidro slide com fita adesiva dupla-face e finalmente corrigir um tampa de vidro (18 x 18 mm) em cima do pedaço de plástico com fita adesiva dupla-face. Coloque um pequeno pedaço de fita vermelha de borracha sobre o vidro de cobertura como uma camada anti-derrapante. A peça de plástico e o vidro de cobertura constituem a plataforma para o palpo locust. A altura da plataforma é de aproximadamente 1,5 mm.
- Instalar um fio de tungstênio (diâmetro de 0,125 mm, comprimento de 36 mm) a uma distância de 1,5 mm paralelo ao interior borda da plataforma. Fixe as duas extremidades do fio até a plataforma com fita adesiva dupla-face.
2. preparação de Locust palpos maxilares
- Corte um tubo de centrifugação (1,5 ml) verticalmente ao meio e corte o fundo. Coloque o gafanhoto dentro do tubo preparado. Deixe a região ventral e a cabeça dos locust exposto. Corrigi o assembly para a lâmina de vidro com fita adesiva de dupla face (Figura 2A).
- Puxe o maxilar bem palpável para a plataforma.
- Coloque o fio de tungstênio no segmento quarto do palpo. Coloque a massa adesiva em cada lado do fio de tungstênio, cerca de 2 mm do palpo maxilar (Figura 2A e 2B).
3. único Sensillum gravações
- Coloque a preparação de palpo maxilar locust sob um microscópio em um pequeno aumento (100 X). Ajuste a posição da preparação até o palpo é perpendicular ao eléctrodo de gravação (Figura 3A).
- Introduza o eléctrodo de referência (eletrodo de tungstênio) o olho de gafanhoto usando um micromanipulador. Mova o eletrodo de gravação (eletrodo de tungstênio) perto o palpo maxilar com o micromanipulador (Figura 3B e 3C).
- Ajuste o dispositivo de entrega de odor para cerca de 1 cm do palpo maxilar (Figura 3B).
- Abra o software de gravação automática Spike 32. Defina os parâmetros de gravação como segue: a escala de gravação em 500 mV; o alto corte do filtro em 300 Hz, o corte baixo em 200 Hz; e o pretrigger em 10 s.
- Conecte o eletrodo gravação um 10 x universal AC/DC amplificador.
- Alterne o microscópio para uma alta ampliação (500 X). Insira o eletrodo gravação na base de um sensillum de basiconic sobre o palpo maxilar e ajustar delicadamente o eléctrodo de gravação para obter boas picos espontâneos (Figura 3D).
- Abra o controlador de estímulo para fornecer um fluxo contínuo de ar a 20 ml/s. o tempo de estimulação para 1 s. sinais de registro por 10 s, começando 10 s antes do início do pulso estímulo.
- Use um amplificador de AC/DC 10 x universal para amplificar os sinais. Alimente os sinais em 4 o IDAC. Analise os sinais com o software Auto Spike 32. Sinais de AC são band-pass filtrado entre 200 a 300 Hz. uso Auto Spike 32 para distinguir amplitudes pico-de-cocho de ruídos. Calcule as respostas dos neurônios como os aumentos nas frequências do potencial de ação (picos por segundo) sobre as frequências espontâneas. Realizar uma análise estatística utilizando GraphPad Prism 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dois subtipos de sensilas (pb1 e pb2) sobre o palpo maxilar locust são identificados com base em dinâmica de resposta diferente de químicos odorantes (10% 1-nonanol e ácido nonanoico de 10%). Os neurônios no pb1 produzem significativamente mais picos de até 1-nonanol do ácido nonanoico enquanto os neurônios em pb2 são significativamente que menos ativado por 1-nonanol comparado com ácido nonanoico (Figura 4). Hexanal e E-2-Hexenal podem evocar um palpo locust abrindo a resposta (POR)26. Hexanal é uma planta verde folha anfitrião abundante voláteis que possam contribuir para uma mais uma confirmação para a fonte de alimento26. Os picos que suscitou nos neurônios pb1 última mais do que aqueles de pb2 quando eles são estimulados por E-2-hexenal (Figura 4). Os neurônios no pb1 e pb2 similarmente apresentam respostas robustas para hexanal (Figura 4). Comparando as alterações médios de todas as pontas entre os períodos 5 s antes e 5 s após a estimulação indica que a resposta a 1-nonanol é significativamente superior ao ácido nonanoico pb1, mas contrariamente em pb2 (Figura 5). Os neurônios nestes dois subtipos de sensilas respondem dose-dependente E-2-hexenal e hexanal, e seus padrões de resposta para estes dois aldeídos são diferentes (figura 6A e 6B).
Figura 1. Preparação do eléctrodo. (A), este painel mostra um general Ver os do aparato afiação do eletrodo. A seringa contendo 10% NaNO2 (à esquerda) é usada para afiar o eletrodo (à direita). (B), este painel mostra uma visão estreita da ponta do eletrodo (r: adequado; b: impróprios). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Titular de Locust palpo maxilar (MPH). (A) The MPH e um gafanhoto são montados sobre a lâmina de vidro antes de posicioná-lo no microscópio. (B) este painel mostra um close-up do palpo maxilar locust, fixado por fio de tungstênio na plataforma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Único gravações sensillum. (A), este painel mostra uma vista sobre a instalação de eletrofisiologia. (B) este painel mostra uma visão estreita da preparação gafanhoto montada no microscópio. (C), esta imagem mostra o palpo maxilar locust ampliação de 100 X. (D), esta imagem mostra o palpo ampliação de 500 X. A seta indica um sensillum basiconic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Vestígios de resposta de gravações de sensillum único do palpo maxilar locust. Neste painel, pb1 defende subtipo 1 do basiconica de sensilas palpável; PB2 defende subtipo 2 de basiconica de sensilas o palpo. As barras acima os vestígios indicam a duração do estímulo (1 s). Para estas gravações, todos os odores são usados em diluições de 10% exceto para E-2-hexenal e hexanal, que são diluídas a 1%. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 26. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Comparação de números médios de picos nos neurônios pb1 e pb2 estimulada pelo ácido nonanoico e 1-nonanol. Os números médios de espinhos são calculados no s períodos 5 antes e após a estimulação. No pb1, os números médios de espinhos nos neurônios respondendo a 1-nonanol aumentam significativamente mais altamente do que aqueles de espinhos nos neurônios respondendo ao ácido nonanoico (n = 11 palpos; ANOVA com t-testes post hoc ; p < 0,0001), em contraste com pb2 (n = 10 palpos; ANOVA com t-testes post hoc ; p = 0.0110). A barra de erro representa SEM. Esta figura foi modificada de Zhang et al . 26. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Os padrões de neurônios no pb1 e pb2 resposta dose-dependente para E-2-hexenal e hexanal. (A), este painel mostra os padrões dos neurônios no pb1 (± SEM; n = 12 palpos). (B), este painel mostra os padrões dos neurônios em pb2 (± SEM; n = 10 palpos). Esta figura foi modificada de Zhang et al . 26. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insetos dependem de palpos para detectar odores de comida, e seus palpos são acreditados para jogar um papel importante na especiação13,27. Os palpos são simples órgãos olfativos e estão recebendo crescente atenção como um atraente modelo de exploração da neuromolecular redes subjacente chemosensation28.
Inseto labellar e palpo SSRs foram realizados com sucesso em Drosophila melanogaster, Anopheles gambiaee Culex quinquefasciatus13,14,15,16 , 17 mas raramente têm sido relatados na forma de um vídeo de apresentação16,29. Em contrapartida, dados de vídeo em SSRs antenais estão disponíveis para a Drosophila, a traça do orangeworm umbigo (Amyeloistransitella), Schistocerca Americanae o percevejo (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.
Locust palpo sensilas basiconica têm uma estrutura especial que difere das sensilas antenais locust e muitos outras insetos sensilas. Usando o método descrito aqui, potenciais de ação gerados pelo gafanhoto palpo sensilas basiconica subtipos pb1 e pb2, pode ser gravado e discriminados (Figura 4 e Figura 5).
O passo crítico é a penetração do eletrodo gravação. O eletrodo de gravação deve ser inserido na base do sensillum e avançado até bons sinais são adquiridos. Além disso, é importante evitar que a cúpula do palpo em colapso quando o eletrodo de gravação é inserido na base do sensillum. Para conseguir isso, montamos uma plataforma incluindo um titular de palpo maxilar locust especial (MPH) e usado um fio de tungstênio para comprimir o quarto segmento do palpo. Muitas repetições deste procedimento demonstram que este é eficaz. Com base nos padrões de resposta dos neurônios nos sensilas para várias odorantes, nós, pela primeira vez, identificamos dois subtipos de sensilas basiconica sobre o palpo maxilar locust, nomeadamente pb1 e pb2.
A limitação da técnica descrita nesta publicação é que poderia ser usado para gravar os insetos grandes (por exemplo, mariposas, besouros e gafanhotos) tempo para não gravar pequenos insetos (por exemplo, moscas e mosquitos), que têm suas próprias plataformas e técnicas13,14,15,16,17. Esta técnica é complementar aos métodos existentes.
Em conclusão, um protocolo altamente eficaz de um SSR de inseto palpo sensilas basiconica é descrito em detalhes. Este protocolo poderia fornecer pesquisadores com uma técnica útil no estudo dos mecanismos moleculares e celulares da olfação inseto sobre o mouthpart. Esse método vinculado com cromatografia gasosa poderia ser usado para identificar os ligands naturais electrophysiologically-ativo em extratos de recursos alimentares favoráveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por uma concessão da Fundação Nacional de ciências naturais da China (No.31472037). Qualquer menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica uma recomendação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | ADVENT | W559504 | Used for making the electrode and fixing the palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Used for sharpening the tungsten wire |
| AC Power Supply | Syntech | A2-70 | Providing the voltage in sharpening the tungsten wire |
| Stereoscope | Motic | SMZ-163 | Used for observing the sharpening of tungsten wire |
| Microscope | Olympus | W-51 | Used for observing the sensilla on locust maxillary palp |
| Intelligent Data Acquisition Controller | Syntech | IDAC-4 | Real-time on screen display of all signals before and during recording |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 | Used for controlling the stimulus application |
| Electronic micromanipulator | C.M.D.T | CFT-8301D | Used for minor movement of the recording electrode |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Used for minor movement of the reference electrode |
| Speaker | EDIFIER | R101T06 | Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal |
| Magnetic base | PDOK | PD-101 | Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube |
| Vibration Isolation Table | TianHe | HAP-100-1208 | Used for isolating the vibration from the equipment |
| Glass slide | CITOGLAS | ZBP-407 | Used for making the base for the MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Fixing the tungsten wire |
| Pasteur tube | YARE | WITEG | Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions |
References
- Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
- Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
- Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
- Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
- Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
- Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
- Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
- Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
- de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
- Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
- Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725 (2010).
- Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
- Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
- Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
- Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
- Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
- Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
- Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
- Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
- Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
- Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
- Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925 (2016).
- Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355 (2014).
- Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147 (2017).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489 (2011).
- Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139 (2013).
- Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337 (2016).
