Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Situ Måling og korrelasjon av cellen og lys utslipp av Bioluminescent bakterier

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/57881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, Graz University of Technology

Summary

Bioluminescent bakterier regulere lys produksjon gjennom en rekke mekanismer som quorum sensing. Denne romanen metoden gjør i situ etterforskningen av bioluminescens og korrelasjon av lys utslipp til celle tetthet. En kunstig bioluminescent Escherichia coli systemet tillater karakterisering av lux operons Lux proteiner og deres samspill.

Abstract

Det er et betydelig antall bakteriell arter i stand til å slippe lys. Alle deler samme genet klyngen, nemlig de lux operon. Til tross for denne likheten viser disse bakteriene ekstreme variasjoner i egenskaper som vekst atferd, intensiteten av lys utslipp eller regulering av bioluminescens. Metoden som presenteres her er en nyutviklet analysen som kombinerer opptak av cellevekst og bioluminescent lys utslippsintensitet over tid utnytte en plate-leser. Det resulterende vekst og lys utslipp egenskaper kan være knyttet til viktige funksjoner av respektive bakterielle belastningen, som quorum sensing regulering. Dyrking av en rekke bioluminescent bakterier krever et bestemt medium (f.eks kunstig havet vann medium) og definert temperaturer. Den lett å håndtere, ikke-bioluminescent standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli), derimot, kan være dyrket billig i høye mengder i laboratoriet skala. Utnytte E. coli ved å innføre en plasmider som inneholder hele lux operon kan forenkle eksperimentelle forhold og i tillegg åpner opp mange muligheter for fremtidige anvendelser. Uttrykket av alle lux gener utnytte en E. coli uttrykk belastning ble oppnådd ved bygging av en uttrykk plasmider via Gibson kloning og innsetting av fire fragmenter som inneholder syv lux gener og tre vrbord gener av lux-rib operon i en pET28a vektor. E. coli basert lux genuttrykk kan indusert og styres via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tillegg resulterer i bioluminescent E. coli celler. Fordelene ved dette systemet er å unngå quorum sensing regulering restriksjoner og komplekse middels komposisjoner med ikke-standard vekst forhold, slik som definert temperaturer. Dette systemet muliggjør analyse av lux gener og deres samspill, utelukkelse av respektive genet fra lux operon, eller med tillegg av romanen gener, utveksle luxAB gener fra en bakteriell stamme av en annen, eller analysere protein komplekser, som luxCDE.

Introduction

Utslipp av lys av levende organismer (bioluminescens) er en fascinerende prosessen i bakterier, sopp, insekter, nematoder, fisk og blekksprut1. Bioluminescent lys utslipp kommer fra en chemiluminescent reaksjon som kjemisk energi er (delvis) forvandlet til lys energi ("kaldt lys"). I bioluminescent bakterier gir heterodimeric enzymet luciferase monooxygenation med langkjedete alifatisk aldehyder, som tetradecanal, til den tilsvarende syren ledsaget av lys utslipp med maksimalt 490 nm2, 3.

Figure 1
Figur 1 : Generelle reaksjonen ordningen med bakteriell luciferase. Det bakteriell luciferase (LuxAB) gir monooxygenation med langkjedete aldehyder (CH3(CH2)nCHO) ved å benytte redusert flavin mononucleotide (FMNH2) og molekylære oksygen (O2), gir produktene lang kjede syrer (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), vann (H2O) og utslipp av lys sentrert på 490 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Energien som frigjøres under denne oksidasjon forårsaker en glade tilstand FMN-4a-lut, som fungerer som lys emitting luciferin4. Proteiner involvert i bakteriell bioluminescens, nemlig LuxCDABEG, er kodet av lux operon og er svært bevart over ulike bakteriell stammer2,5. Gener luxA og luxB kode for heterodimeric luciferase; Luxc'sog Luxd's Luxe's gene produkter er en fettsyre reduktase sammensatt; og luxG koder for en flavin reduktase6. En rekke bioluminescent Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bærer ekstra luxF genet. Det ble rapportert at LuxF er et homodimeric protein som binder uvanlig flavin derivat 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Flere gener er identifisert som er ansvarlig for riboflavin syntese (f.eks ribEBH) og videre regulatory gener er rapportert, som spiller en rolle i quorum sansing regulering av bioluminescens, spesielt for Vibrio fischeri og Vibrio harveyi6,13. Til tross for høyt konservert genet orden viser bioluminescent bakterier høy variasjoner i egenskaper som vekst oppførsel, intensitet av lys utslipp eller regulering av bioluminescens2,5,14 .

Flere endret stammer eller plasmider inneholder deler eller hele lux operons er kjent, utnytte bioluminescens som reporter systemer. Programmer som bestemmer promoter aktivitet, overvåking av bakteriell forurensing i miljøet eller mat prøver, bioluminescens resonans energi overføring (BRET), i vivo bildebehandling av infeksjoner i eukaryote organismer, var etablert15,16,17pyrosequencing og så videre. Interessant, brukte tre mest bioluminescent reporter systemer er avledet fra den nordamerikanske firefly (Photinus pyralis), enteric patogen av nematoder (Photorhabdus luminescens) og havet stemorsblomst (Renilla reniformis). Ingen av disse systemene har en bakteriell opprinnelse, men bruk av lux gener og operons fra bakteriell opprinnelse er stadig mer interesse for anvendt forskning16. Mindre rikelig programmet bioluminescens proteiner bakteriell kilder skyldes hovedsakelig lavere stabilitet og lang levetid av bakterier avledet selvlysende proteiner som kan være relatert til deres marine habitater. Bioluminescent bakterier med marine habitater er ikke dyrket under standard lab forhold. Disse bakteriene krever bestemte vekst medier og forhold, som kunstig havet vann medium og lavere vekst/inkubasjon temperaturer (f.eks 28 ° C).

For å forenkle sammenligning av lux operon egenskaper eller enkelt lux gener av en rekke ulike bioluminescent bakteriell stammer, en metode for å standardisere lux operon uttrykk og analyse er en forutsetning. Dermed kom ideen om å integrere hele lux-rib operon i standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli). For dette formålet, Gibson forsamlingen viste seg for å være et nyttig verktøy å integrere flere lineær, overlappende fragmenter i et uttrykk vektor uten behov for spesifikk begrensning nettsteder. Denne metoden passer også når DNA setter er for stor (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH, ~ 9 kb operon størrelse) mikrofonfunksjon via PCR. En lux operon kan deles inn i flere overlappende fragmenter, og settes sammen til ett uttrykk plasmider og til slutt sekvensen bekreftet montering produktet kan omdannes til en passende E. coli systemet for høykapasitets protein uttrykk18,19,20. I tillegg til enkelt å håndtere E. coli basert lux genuttrykk, gjensto en enkel metode kombinere opptak av cellevekst og bioluminescent lys utslipp å bli etablert. Metoden beskrevet her kan i situ måling og korrelasjon av cellen og lys utslipp av bioluminescent bakterier.

Analyse av lux gener og lux operon orden og regulering av forskjellige bioluminescent bakterier, på den ene siden, en kunstig bioluminescent E. coli systemet med hele lux-rib operon av s. mandapamensis 27561, og på den andre hånden, en nyutviklet plate leser analysen kombinere i situ innspillingen cellen tetthet og lys utslipp, bidrar til å få mer informasjon om de ulike bakterielle lux -systemene. Denne grunnleggende karakterisering og sammenligning av luciferases og relaterte enzymer kan føre til alternativer til allerede etablerte reporter systemer med forbedret stabilitet og aktivitet.

Protocol

1. design, forberedelser og uttrykk for de lux Operon i Escherichia coli

Merk: Se Tabell for materiale på kommersielle kits i denne delen.

  1. For å overføre lux operon til E. coli velger du en standard pET vektor riktig begrensning områder og antibiotikaresistens genet av interesse (f.eks pET28a; NcoI, XhoI, kanamycin).
  2. Utforme fragmenter og overlappende primere for Gibson montering basert på DNA sekvensen av Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
  3. Sette opp en standard PCR reaksjon med designet primerne og isolert genomisk DNA av Photobacterium mandapamensis 27561 som mal (se Supplerende materiale for primere og betingelser).
    Merk: Isolering av genomisk DNA av respektive bakterielle belastningen øker PCR effekt.
  4. Rense PCR produktet via spin-kolonne rensing.
  5. Utføre en begrensning fordøyelsen av isolerte pET28a vektoren med NcoI og XhoI på 37 ° C for 45 min.
  6. Rens linearisert vektoren og PCR fragmenter via agarose gel gelelektroforese og påfølgende spin-kolonne rensing.
  7. Bestemme DNA konsentrasjonen av hver fragmentet og lineær vektoren og beregne de optimale mengdene for montering i henhold til protokollen20,21.
    Merk: Effekten av montering avhenger fragment størrelse og antall og justeres i henhold til produsentens protokollen20,21.
  8. Etter kombinere alle fragmenter og bufferen i et PCR-rør, ruge montering blandingen i en PCR maskin ved 50 ° C 1t.
  9. Transformere det sammensatte vektor produktet etter standard transformasjon protokoller for E. coli bakteriell plasmider transformasjon til en passende E. coli systemet for høy avkastning plasmider replikering (f.eks E. coli TOP10 eller XL-1).
  10. Velg kolonier fra transformasjon plate og stripe på nye plater for DNA isolasjon.
  11. Isolere plasmider DNA ifølge standardprotokoller.
  12. For å bekrefte riktig montering av plasmider inkludert alle fragmenter, må du først utføre en koloni PCR ifølge standardprotokoller bruker primere bestemt hver sammensatte fragmenter.
  13. I tillegg til koloni PCR og påfølgende agarose gel geleelektroforese, forberede alle isolerte montering vektorer for DNA sekvensering å bekrefte riktig forsamlingen og de riktige DNA-sekvensene.
  14. Transformere den bekreftet plasmider etter standard transformasjon protokoller for E. coli bakteriell plasmider transformasjon til en passende E. coli systemet for høy avkastning protein produksjon (e.g.,E. coli BL21).
    Merk: Fortsett direkte med uttrykket protokollen nedenfor. For lengre lagring anbefales utarbeidelse av en glyserol lager.

2. uttrykk for endret E. coli stammer

  1. Forberede en overnatting kultur (ONC) uttrykk ved vaksinasjon av et riktig volum av LB medium (f.eks, 100 mL) med tidligere utarbeidet glyserol lager av E. coli BL21 cellene forvandlet den sammensatte plasmider eller direkte fra et transformasjon plate. Legg 100 µL av kanamycin (50 mg/mL, antibiotikaresistens genet av pET28a) og ruge ONC på 37 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker over natten.
  2. Vaksinere viktigste uttrykket kultur (f.eks 800 mL av LB medium) med 8 mL av ONC og legge 800 µL av kanamycin (50 mg/mL).
  3. Inkuber viktigste kultur på 37 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker til celle tetthet når en OD600 på 0,6 - 0,8 (ca 2,5 timer).
  4. Redusere inkubasjon temperaturen til 28 ° C.
  5. Indusere protein uttrykk ved å legge IPTG til en siste konsentrasjon av 0,1 mM.
    Merk: Empirisk tester viste at reduksjon av temperaturen å 28 ° C ga høyeste lysintensiteten.
  6. Merke celler til de begynner skinner (ca 1 h).
    Merk: Avhengig av formålet av uttrykket, cellene dyrkes før neste dag og høstes deretter eller cellene kan holdes rister så lenge de er skinnende (maksimalt 48 h). Høsting celler og rensing av eventuelle proteiner kan gjøres i henhold til standard prosedyrer.

3. uttrykk for bakteriell Bioluminescent stammer

Merk: Bakteriell bioluminescent stammer krever bestemte oppblomstringen medium/kunstig havet vann medium for vekst og lys produksjon.

  1. Forberede kunstig havet vann medium, består av to separat forberedt mellomstore komponenter.
    Merk: Utarbeidelse av kunstige havet vann mediet ble tilpasset fra den opprinnelige protokollen22. Disse tallene er for 1 L flytende medium eller 1 L agar medium.
    1. For kunstig havet vann medium, veier i følgende salter: 28.13 g NaCl, 0.77 g KCl, 1.60 g CaCl2 · 2H2O, 4.80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3og 3,50 g MgSO4 · 7T2O.
    2. Legg 1 L destillert vann og oppløse alle komponenter.
    3. For LB medium, veier i følgende ingredienser: gjærekstrakt 10 g, 10 g pepton og for en ekstra 20 g agar agar platene.
    4. Legg til 250 mL vann fra springen og oppløse komponenter.
    5. Autoclave både forberedt media separat på 121 ° C for 20 min.
    6. Agar plater, kombinere 250 mL av LB medium med 750 mL av kunstige havet vann medium rett etter autoklavering og forberede plater.
    7. Flytende medium, kombinere 250 mL av LB medium med 750 mL av kunstige havet vann medium enten rett etter autoklavering eller når avkjølt.
      Merk: Kunstige havet vann mediet kan få grumset gjennom salt nedbør.
  2. Strek bakteriell bioluminescent påkjenninger på kunstig havet vann middels agar plater og ruge over natten på 24-30 ° C.
    Merk: Lenge lagring av bakteriell stammer er vanligvis oppnås gjennom frysing glyserol aksjer av bakteriell kultur. Stammer bør alltid være stripete på agar plater først for å sikre jevn Start forhold for alle belastninger, før bruk for flytende kulturer, på grunn av en lag fase i vekst etter tining.
  3. Forbered en ONC ved vaksinere 100 mL kunstig havet vann medium med en enkelt koloni fra platen. Inkuber ONC på 24-30 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker over natten.
  4. Vaksinere 800 mL av kunstige havet vann medium med 8 mL ONC.
  5. Inkuber bakterieceller på 24-30 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker.
    Merk: Lysintensiteten profilen bioluminescent bakterier sterkt varierer med temperatur. Avhengig av regulatoriske mekanismer av lys produksjonen av respektive bakterielle belastningen kan lys utslipp starte etter ca 1-6 timer.
  6. Observere bakteriell cellekultur til de begynner skinner (ca 1-6 h).
    Merk: Avhengig av formålet av uttrykket, cellene dyrkes før neste dag og høstes deretter eller cellene kan holdes rister så lenge de er skinnende. Høsting celler og rensing av eventuelle proteiner kan gjøres i henhold til standard prosedyrer.

4. i Vivo aktivitet analysen for bakteriell Bioluminescent stammer og endret E. coli stammer

Merk: Lenge lagring av stammer er normalt acieved gjennom frysing glyserol aksjer av bakteriell kultur. Stammer bør alltid være stripete på agar plater først for å sikre jevn Start forhold for alle belastninger, før bruk for flytende kulturer, på grunn av en lag fase i vekst etter tining.

  1. Strek ønsket bioluminescent bakterielle belastningen eller modifisert E. coli belastning på en agar plate og ruge på 28 ° C over natten.
    Merk: Inkubasjon temperaturen kan variere fra stamme til stamme og må vurderes empirisk. For å kunne sammenligne bioluminescent bakteriell stammer og endret må E. coli stammer, vekst betingelser være identiske.
  2. Vaksinere 3 mL medium med respektive belastningen med en enkelt koloni fra en agar plate og ruge cellene på 28 ° C og 180 rpm i en inkubator shaker ca 1-2 h.
  3. Måle celle tettheten av en 1:10 fortynning av flytende kultur på 650 nm. Beregn forhold og volum for 1 mL kultur med et OD650 av 0,05.
    Merk: Påfølgende plate leser analysen vil bestemme cellen tettheten på 650 nm å unngå forstyrrelser av lys utslipp av toner.
  4. Pipetter beregnet volumet av kultur og medium i en 24-vel svart vegger plate med glass bunn. For den endrede E. coli belastning, legge til 1 µL av kanamycin (antibiotikaresistens av pET28a vektor) og 1 µL av IPTG (induksjon av genuttrykk) i prøvene. Sett et lokk på tallerkenen å unngå fordampning under målinger.
    Merk: For å sikre at pET28a vektoren som inneholder hele lux operon ikke get lost av E. coli kulturen, kanamycin legges til hver E. coli prøve i plate brønnene og for å sikre at lyset produksjon av E. coli cellene kan måles, genuttrykk må være forårsaket av IPTG. Å unngå crosstalk og måler innblanding, svart vegger bra plater med glass bunn og gjennomsiktig lokk viste beste resultater. Likevel crosstalk kan observeres og godt stillinger har velges nøye.
  5. Start måling i en plate-leser.
    Merk: Plate leser protokollen er basert på et skript som er spesielt utviklet for denne analysen (se Supplerende materiale) som kombinerer to målinger, absorbansen og bioluminesens. Datapunkt blir samlet inn hvert 10 min med permanent skjelvende mellom målinger og en konstant temperatur på 28 ° C.

Representative Results

Gene rekkefølgen på lux operon - luxCDABFEG - er svært bevart over ulike stammer2,5,14. For design av plasmider, sekvens informasjonen ble tatt fra bioluminescent bakterielle belastningen Photobacterium mandapamensis 27561 og gene rekkefølgen ble holdt den samme, og også noncoding sekvenser mellom enkelt gener ble vurdert. En skjematisk oversikt over anvendt Gibson kloning strategien er avbildet i figur 2. Fire fragmenter totalt, luxCDAB, luxF, luxEG, og ribEBH, med 20-40 base par overlappende sekvenser ble generert. Etter å ha fulgt alle trinnene av Gibson montering20, bekreftet DNA sekvensering riktig montering av plasmider, inkludert alle fragmenter. Vektorkart over sluttmontering produkt pET28a som inneholder lux-rib operon er avbildet i Figur 3. En betydelig fordel av denne endrede pET28a vektor er bruken av standardiserte E. coli vekst forhold og kontrollert induksjon med IPTG.

For å måle lys utslipp av bioluminescent bakterier og respektive celle tetthet, ble en plate leser basert metoden utviklet. Metoden for plate leseren ble generert kombinere enkelt måling skript for lett intensitet og celle tetthet. Denne romanen skript aktivert måling av OD650 og lysintensiteten hvert 10 min for en bruker definert tidsrom, som justeres generasjon tidspunktet for bakterier brukes for respektive analyse (f.eks 10 h). Måling av optisk densitet ble fremført på 650 nm å unngå interferens med lys utslipp. Som et bevis på konseptet og for å sikre helsen og riktig vekst virkemåten til E. coli cellene, ble referanse målinger utført. I Figur 4 sammenligning av E. coli BL21 celler, E. coli BL21 cellene som inneholder en tom pET28a vektor og E. coli BL21 cellene som inneholder pET28a vektoren med lux-rib operon presenteres sett inn. For sistnevnte belastningen lagt ingen IPTG til analysere lys utslipp på grunn av leakiness til T7 promoter. Alle tre referanse målinger viser en sigmoidal vekstkurve med tre vekstfaser (lag, eksponentiell og stasjonære fase). Bare E. coli BL21 cellene som inneholder pET28a vektoren lux-rib operon sett inn starten på avgir lys, men i motsetning til målene slippes der uttrykk er indusert av IPTG og lys ut etter 30 min, ikke-indusert cellene bare begynne å skinne etter ca 5 h og Vis en mye lavere lys utslipp (ca. 4-fold) sammenlignet med indusert systemet.

Figur 5 gir en sammenligning av vekst kurver og lys intensiteter av lux operon uttrykt i E. coli og bioluminescent bakterielle belastningen P. mandapamensis 27561, i LB medium eller kunstig havet vann medium, bruke romanen etablert i situ metoden. Hvis du vil sammenligne disse bakteriene, ble målene utført på en inkubasjon temperatur på 28 ° C. Denne temperaturen reduseres veksten av den endrede E. coli belastning i LB medium og kunstig havet vann medium, men for bioluminescent bakteriell stammer lavere temperaturer er avgjørende. Denne temperaturen avhengighet vises i figur 5A, som P. mandapamensis 27561 viser en mye høyere celle tetthet enn E. coli. Videre mens for E. coli stammer, LB medium tillater generering av høyere celle tettheter, for naturlig bioluminescent bakteriell stammer, kunstige havet vann medium er foretrukket og avgjørende for bioluminescens. De innspilte celle tettheter korrelerer med respektive lyset intensiteten, som vist i figur 5B. Merke, bioluminescent E. coli celler nå lignende lys utslipp maxima i begge LB middels samt kunstige havet vann medium, men de høyeste intensiteter ble registrert på ulike tidspunkt. I motsetning til denne observasjonen, P. mandapamensis 27561 er levedyktig med svært redusert vekstrater i LB medium, men bakterieceller avgir ikke lys på alle (figur 5B). I kunstig havet vann medium viser P. mandapamensis 27561 maksimalt lys utslipp på rundt 1 x 104 teller per sekund, som er nesten en faktor på 200 lavere enn E. coli. Figur 5 C representerer relativ lyset enheter der bioluminesens er normalisert av OD. Disse resultatene bekrefter at ikke bare var innsetting av en plasmider som inneholder lux operon i E. coli vellykket og funksjonelle, men også at dette endret E. coli belastning er en gyldig alternativ med enda høyere lys utslipp gir og uten begrensning av bakteriell bioluminesens av marina bakterier, som en kompleks sjøvann medium og lavere temperaturer.

I tillegg ble et langsiktig mål av E. coli basert lux-rib genuttrykk over 24 h utført for å analysere lang av lys utslipp (figur 6). Lys utslipp varte i 19,5 h, mye lengre enn de bakterielle stammene (f.eks P. mandapamensis 27561) der en gradvis nedgang ble observert som resulterer i svært lav lys utslipp etter 10 h.

For å illustrere begrensningene for utviklet analysen, viser figur 7 måleresultatene av tre bioluminescent bakteriell stammer, nemlig Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 og Vibrio harveyi 14126. For første belastningen (S1), metoden fungerer veldig bra og viser en maksimal bioluminescens intensitet av nesten 2 x 106. For de andre to stammer (TH1 og 14126), maksimal lysintensiteten kan ikke fastslås fordi lysintensiteten generert av både overskredet gjenkjenning av brukte instrumentet innstillingene. Gevinst-verdien som er definert for utviklet metoden (script) for disse to stammer ble satt for høyt. Likevel kan utbruddet av bioluminescens aktivitet sammenliknes med hverandre. P. mandapamensis TH1 og P. mandapamensis S1 starte skinnende etter ca 1 h og en OD650 verdi på 0,1 - 0.2, henholdsvis. Derimot begynner V. harveyi 14126 å avgir lys etter ca 5,5 timer på en OD650 verdi på 1.0. Observerte utbruddet av lys utslipp er ledsaget av en eksponentielle økning i OD samt bioluminescens. Det er kjent at bioluminesens av V. harveyi 14126 ligger under quorum sensing regulering og derfor en bestemt celle tetthet tillater aktivering av lux operon, som tydelig kan observeres i figur 713. Dette resultatet viser at med denne romanen i situ plate leser analysen er det mulig å enkelt sammenligne bioluminescent bakterier og også omtrent definere en regulerende mekanisme av disse stammer ved å bestemme om et quorum sensing regulering kan være observerte eller ikke.

Figur 8 viser et eksempel på et uttrykk kultur av E. coli BL21 celler skjuler den sammensatte pET28a plasmider inneholder lux operon etter innledningen med IPTG. Etter ca en time etter induksjon, E. coli cellene starte skinner med en blå-grønn farge. Figur 8 En viser E. coli uttrykket kultur fotografert i lys og Figur 8B gir samme kulturen i mørket. Figur 8 C viser en agar plate av kunstige havet vann medium med P. mandapamensis S1 glødende i mørket i samme blå-grønne fargen karakteristisk for bakteriell bioluminescens.

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk fremstilling av anvendt Gibson kloning strategi. Trinn (I): Overlapping primere (fargede piler, ca. 20-40 base par overlapper) er utformet. Overlappende primere inneholder annealing sekvenser ene fragmentet respektive 5' og 3 regionen og tilstøtende segmentet respektive 3 og 5' regionen. Trinn (II): Designet fragmenter for samlingen genereres via standard PCR reaksjoner. Trinn (III): Målet vektoren er linearized av begrensning fordøyelse (f.eks NcoI, XhoI). Trinn (IV): DNA-konsentrasjoner av alle fragmenter og lineær vektoren må være fast bestemt på å justere konsentrasjon passer for Gibson montering (i henhold til produsentens protocol). Trinn (V): Alle fragmenter og lineær vektoren med optimalisert DNA konsentrasjoner er kombinert med Gibson montering master mix (T5 exonuclease DNA utvalg og DNA ligase) er ruges ved 50 ° C i 1 h. trinn (VI): omdannes montering produktet Ifølge standardprotokoller i en passende E. coli belastning for høy avkastning plasmider replikering (f.eks E. coli TOP10 eller XL-1). Trinn (VII): For å bekrefte riktig montering av plasmider, må DNA sekvensering av den sammensatte plasmider utføres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Vektorkart av pET28a som inneholder lux-rib operon. Lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 settes i flere kloning for pET28a i den originale gene for (luxCDABFEG-ribEBH). Begrensning områder brukes for kloning er NcoI og XhoI. Fragmenter brukes til Gibson montering av operon er luxCDAB i oransje, luxF i grønt, luxEG i blått og ribEBH i lavender; gener innenfor et fragment vises som en egen boks. Noncoding sekvenser mellom hver genet av operon er inkludert i den brukte kloning strategien. Siste plasmider størrelsen på pET28a som inneholder hele lux-rib operon er 14,625 base parene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Sammenligning av vekst kurver og lys intensiteter av referanse stammer. OD på 650 nm og bioluminesens intensiteten i antall per sekund ble målt hvert 10 min over 10 h på 28 ° C. Alle mål er mener verdier av tre biologiske replikat med fire tekniske gjentak hver. Feilfelt representerer standardavvik. E. coli BL21 celler (grå firkanter), E. coli BL21 cellene som inneholder en tom pET28a vektor (grå sirkler) og E. coli BL21 cellene som inneholder pET28a vektoren med lux-rib operon inn (black diamond) ble analysert til forsikre riktig vekst virkemåten til cellene våre E. coli . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 : Sammenligning av vekst kurver og lys intensiteter av lux operon uttrykt i E. coli (ruter) og P. mandapamensis 27561 (sirkler) i LB medium (åpne symboler) eller kunstig havet vann medium (fylt symboler). Alle mål er mener verdier av tre biologiske replikat med fire tekniske gjentak hver. Feilfelt representerer standardavvik. Alle eksperimentene ble utført på en inkubasjon temperatur på 28 ° C. (A) optisk tetthet (OD) målinger på 650 nm ble utført hvert 10 min for 10 h. E. coli lux operon uttrykk (venstre panel) er i forhold til P. mandapamensis 27561 (høyre panel) i LB medium og kunstig havet vann medium. Cellen tettheter avgjøres på 650 nm å unngå bioluminescens-forstyrrelser. (B) måling av lav intensitet (bioluminescens [teller/s]) ble utført hvert 10 min for 10 h. E. coli lux operon uttrykk (venstre panel) er i forhold til P. mandapamensis 27561 (høyre panel) i LB middels og kunstige vann medium. (C) Relative lys intensiteter (RLU/OD) av lux operon uttrykt i E. coli (venstre panel) og P. mandapamensis 27561 (høyre panel) bestemmes av normalisere bioluminescens celle tetthet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning av vekst kurver og lys intensiteter av E. coli basert lux genuttrykk for 24 h. OD på 650 nm og bioluminesens intensiteten i antall per sekund ble målt hvert 10 min over 24 h på 28 ° C. Alle mål er mener verdier av tre biologiske replikat med fire tekniske gjentak hver. Feilfelt representerer standardavvik. I tillegg vises de relative lett intensitet (RLU/OD) der bioluminescens er normalisert av cellen tetthet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Sammenligning av bioluminescent bakterier å vurdere mulige quorum sensing regulering. Lys utslipp og celle tetthet måles hvert 10 min 10 h og representerer mener verdier av tre biologiske replikat med fire tekniske gjentak hver. Feilfelt representerer standardavvik. Målinger av Photobacterium mandapamensis TH1 (svart ruter), Vibrio harveyi 14126 (grå sirkler) og Photobacterium mandapamensis S1 (grå diamanter) ble sammenlignet med hverandre; (A) viser optisk densitet (OD) på 650 nm, (B) lyset intensitet (bioluminescens [teller/s]) og (C) relativt lett intensitet (RLU/OD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Bioluminescens i flytende media og agar plater. (A) 5 L kolbe med 2 L LB medium inokulert med E. coli BL21 celler uttrykke pET28a lux operon plasmider fotografert i lys. (B) samme kulturen som (A) fotografert i mørket. Bildene A og B ble tatt ca 2 timer etter innledningen av uttrykk. (C) kunstig havet vann middels agar plate med stripete kultur P. mandapamensis S1 fotografert i mørket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Byggingen av et uttrykk plasmider inneholder fire fragmenter komponere hele lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 ble nådd via Gibson kloning. Denne E. coli basert lux genuttrykk kan E. coli cellene avgir lys. Unngå quorum sensing regulering og ikke-standard vekst forhold er betydelige fordeler av dette systemet.

Fordelene med å bruke Gibson kloning strategi er lett montering av flere lineær DNA fragmenter, høy fleksibilitet og nei nød for spesifikk begrensning nettsteder18,19,20. Denne metoden kan enkelt endre en lux operon, unntatt én gener eller genet klynger eller innføre nye gener eller utveksle gener fra en stamme med hverandre. En forutsetning for bruk av denne metoden er tilgjengeligheten av respektive lux operon genet sekvensen. Bare for et lite antall bioluminescent bakterier er fullstendig DNA sekvensen av respektive lux operon kjente og/eller tilgjengelig. Mange av disse sekvensene er fragmentert fordi de ble generert ved hjelp av hagle sekvensering. Den undersøkte P. mandapamensis 27561 komplett DNA sekvensen av lux operon er kjent og tilgjengelig fra NCBI gene databasen (GenBank: DQ988878.2).

En kritisk trinn i protokollen av Gibson er beregningen av DNA konsentrasjonen av enkelt fragmenter. I samlingen protokollen av produsenten det ble anbefalt å bruke 0.2 - 0,5 pmols og et totalvolum på 20 µL for 4-6 fragmenter20,21. I vårt tilfelle, der luxCDABFEG-ribEBH består av 4, var konsentrasjoner og totalt volum 0,1 pmol og 45 µL, henholdsvis avhengig av avkastningen av PCR produkter. På den ene siden, konsentrasjonen måtte reduseres og derimot, volumet måtte økes. Likevel forsamlingen fungerte veldig bra og DNA sekvensering bekreftet riktig innsetting på første forsøk. Dette funnet bekreftet Gibson montering som en robust og hensiktsmessig metode for våre undersøkelser, som lett kan modifisert18,19,20.

Nyetablerte plate leser analysen er lett å håndtere metoden. Muliggjør en enkel primær analyse av nye eller (un-) kjent bioluminescent bakteriell stammer og gir allerede en første hint på regulatoriske mekanismen av lyset produksjon (f.eks lag i luminescence på lav celle tettheter). I tillegg kan vekst forhold i kombinasjon med lys produksjon lett bli vurdert ved å endre oppblomstringen medium eller temperatur.

Målene med plate leseren ble utført på 28 ° C. Grunnen til dette uvanlig setting er temperatur følsomheten av bioluminescent bakteriell stammer, hvor temperaturer over 30 ° C føre til mindre eller ingen vekst og/eller lys utslipp. Oppmerksom på at platen leseren er i stand til å holde en definert temperatur over tid begrensningen av manglende aktive kjølesystem. Derfor har temperaturen lavere temperaturen på målingen.

Som et bevis på konseptet, sammenligning av E. coli Konstruer med bioluminescent belastningen P. mandapamensis (figur 5) på den ene siden og referanse målinger (Figur 4) derimot ble utført og Bekreft påliteligheten til nyopprettede systemet. I tillegg sikret langsiktige målet levetiden til lys utslipp (figur 6). Men man må vurdere at OD verdier ikke er pålitelig over en viss optisk tetthet, avhengig av egenskapene til bruker enheten (ca 15 h i den foreliggende sak) der en passende fortynning ville være nødvendig for en måling i den lineær rekke detektoren. Disse høye avvik i OD verdier gjøre disse lenge målingene ikke pålitelig. Derfor anbefales kortere mål som 10t bruk eksperimentelle rapporterte her.

Begrensninger av etablerte plate leser analysen kan ses i figur 7. Vanskeligheten er å finne en riktig innstilling for målingen. 'Få verdien' justererer følsomheten på Foto multiplikator røret (betaling). Gevinsten er forsterkningen på signalet i avdrag, betyr at en høyere gevinst faktor vil øke signalet. Hvis gevinsten er satt for lavt signal til støyforhold blir større og lys intensiteter av "lavt" skinnende bioluminescent bakterier ikke målt noen mer (signaler nær null, data ikke vist). Utfordringen i en bioluminescent analysen er å angi forsterkningen slik måleresultatene for alle bakteriell stammer innenfor rekkevidden av instrumentet. I tillegg Måleområde for luminescence avhenger intervalltiden måling (f.eks maksimalt 2.000.000 for 1 s).

Gevinsten ble satt til 2800, som var empirisk testet og valgt for bestemte plate leseren brukes for etablering av denne metoden. Innstillingen brukes gevinst gjør opptak av maksimal slippes ut lys av den bioluminescent E. coli system, P. mandapamensis 27561 og P. mandapamensis S1 uten overflyt, men for stammer P. mandapamensis TH1 og V. harveyi 14126 gevinsten var for høy. Derfor disse sistnevnte stammer overskrider grensen på gjenkjenning og ekte maksimal lysintensiteten ikke kan måles. Denne tekniske begrensningen kan hindre sammenligning av bioluminescent bakterier, som viser høy variasjoner i maksimal lys utslipp, selv om vekst forhold og celle tettheter kan være sammenlignbare.

Plassering av analysert bakteriell stammene i brukt godt platene må vurderes empirisk. Selv om svart bra plater med glassbunn ble brukt, ble crosstalk mellom prøvene observert. Lysintensiteten til spesifikke stammer er så høy, at alle nærliggende brønner vil vise false positiv lys utslipp (f.eks tomt). Derfor er det viktig å måle to ulike stammer enten separat eller sammen med en viss romlig separasjon til hverandre.

Det er allerede mange endret E. coli stammer kjent som inneholder deler av lux operon og er hovedsakelig program-orientert15,16,17. Metodene som er beskrevet her, sikte på grunnforskning, for eksempel muligheten til å analysere hver lux genet separat. Selv om forskning på bioluminescens har en lang historie, er det fortsatt mange åpne spørsmål. Unntatt eller introdusere gener fra lux operon, utveksle luxAB gener med genene fra en annen belastning eller analysere protein komplekser, innebygd i den lett å håndtere E. coli systemet og ytterligere anvendelse av platen leser analysen, kan det være mulig å få mer informasjon om regulatoriske prosesser og funksjonene til lux gener.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) for sin støtte i å etablere selv skrevet skriptet for plate leseren. Dette arbeidet ble støttet av østerrikske "Fonds zur Förderung der overvektig Forschung" (FWF) til PM (P24189) og PhD-programmet "DK molekylær Enzymology" (W901) til PM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs Inc. E2621S for 10 rxn
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymerase  Thermo Scientific F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs Inc. M0491S
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit Thermo Scientific K0721 for 50 rxn
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) New England Biolabs Inc. R3193S/R0146S
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit  Promega A9282 for 250 rxn
Monarch DNA Gel Extraction Kit  New England Biolabs Inc. #T1020S for 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit  Thermo Scientific K0503 for 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
24-well black sensoplate with glass bottom Greiner Bio One 662892
FLUOStar Omega plate reader  BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Software BMG Labtech Version 2.20
Microsoft Excel 2010 Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker Infors AG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
  2. Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
  3. Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
  4. Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
  5. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
  6. Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
  7. Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
  8. Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
  9. Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
  10. Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
  11. Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
  12. Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
  13. Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
  14. Meighen, E. Genetics of bacterial bioluminescence. Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).
  15. Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
  16. Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
  17. Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
  18. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  19. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  20. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  21. NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
  22. Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).

Tags

Biokjemi problemet 136 bioluminescens Escherichia coli Gibson kloning vekstkurve luciferase lux operon marine bakterier quorum sansing plate leser analysen
<em>In Situ</em> Måling og korrelasjon av cellen og lys utslipp av Bioluminescent bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brodl, E., Niederhauser, J.,… More

Brodl, E., Niederhauser, J., Macheroux, P. In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (136), e57881, doi:10.3791/57881 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter