Summary
Självlysande bakterier reglerar ljus produktion genom olika mekanismer, såsom quorum sensing. Denna nya metod kan i situ utredningen av Mareld och sambandet mellan den ljusa utsläppet till cell densiteten. En konstgjord självlysande Escherichia coli systemet tillåter karakterisering av lux operons, Lux proteiner och deras samspel.
Abstract
Det finns ett stort antal bakteriearter kan avge ljus. Alla delar samma gen kluster, nämligen de lux operon. Trots denna likhet visar dessa bakterier extrema variationer i egenskaper som tillväxt beteende, intensiteten i ljusöppningen eller reglering av Mareld. Metoden presenteras här är en nyutvecklad som kombinerar inspelning av celltillväxt och självlysande ljusöppningen intensitet över tid utnyttja en spektrofotometer. De resulterande tillväxt och ljusöppningen egenskaper kan kopplas till viktiga funktioner i respektive bakteriell stam, såsom quorum sensing förordning. Odling av ett spektrum av självlysande bakterier kräver ett specifikt medium (t.ex. konstgjorda havet vatten medium) och definierade temperaturer. Lätt att hantera, icke-självlysande standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli), däremot, kan odlas billigt i stora mängder i laboratorieskala. Att utnyttja E. coli genom att införa en plasmid som innehåller den hela lux operon kan förenkla experimentella förhållanden och öppnar dessutom upp många möjligheter för framtida tillämpningar. Uttrycket av alla lux gener utnyttja en E. coli uttryck stam uppnåddes genom byggandet av ett uttryck plasmid via Gibson kloning och införande av fyra fragment som innehåller sju lux gener och tre revben gener av de lux-rib operon i en pET28a vektor. E. coli baserat lux genuttryck kan inducerad och kontrolleras via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tillägg resulterar i självlysande E. coli celler. Fördelarna med detta system är att undvika quorum sensing förordning begränsningar och komplexa medium kompositioner tillsammans med icke-standardiserade tillväxt villkorar, som definierade temperaturer. Detta system möjliggör analys av lux gener och deras samspel, genom uteslutning av den respektiva genen från de lux operon, eller även tillägg av nya gener, utbyta de luxAB -generna från en bakterie stam av en annan, eller analysera proteinkomplex, såsom luxCDE.
Introduction
Utsläpp av ljus av levande organismer (Mareld) är en fascinerande process Funna i bakterier, svampar, insekter, nematoder, fiskar och bläckfiskar1. Självlysande ljusöppningen framgår en kemiluminiscent reaktion där kemisk energi (delvis) omvandlas ljusenergi (”kallt ljus”). I självlysande bakterier katalyserar de heterodimeriskt enzymet luciferas monooxygenation av långkedjiga, alifatiska aldehyder, såsom tetradecanal, till motsvarande syror åtföljs av ljusöppningen med ett maximum på 490 nm2, 3.
Figur 1 : Allmänna reaktionsformel av bakteriell luciferas. Den bakteriella luciferas (LuxAB) katalyserar monooxygenation av långkedjiga aldehyder (CH3(CH2)nCHO) genom att utnyttja minskat flavin mononucleotide (FMNH2) och molekylärt syre (O2), framställning av produkterna lång kedja syror (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), vatten (H2O) och utsläpp av ljuset centrerat på 490 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den energi som frigörs under denna oxidation orsakar ett exciterat tillstånd FMN-4a-hydroxid, som fungerar som den ljusavgivande luciferin4. Proteinerna som är involverade i bakteriell Mareld, nämligen LuxCDABEG, kodas av de lux operon och bevaras mycket över olika bakteriestammar2,5. De gener luxA och luxB koda för den heterodimeriskt luciferas; Luxc's, Luxd'soch luxE genprodukter är delar av en fettsyra reduktas komplex; och luxG kodar för en flavin reduktas6. Ett antal självlysande Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bär genen ytterligare luxF . Det rapporterades att LuxF är ett homodimeric protein som binder den ovanliga flavin derivat 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Ytterligare gener har identifierats som ansvariga för riboflavin syntes (t.ex. ribEBH) och dessutom regleringsgener har rapporterats, som spelar en roll i quorum sensing reglering av Mareld, särskilt för Vibrio fischeri och Vibrio harveyi6,13. Trots mycket gen beställa visar självlysande bakterier hög variationer i egenskaper som tillväxt beteende, intensiteten i ljusöppningen, eller förordning av Mareld2,5,14 .
Flera modifierade stammar eller plasmider innehåller delar eller hela lux operons är kända, att utnyttja Mareld som reporter system. Olika applikationer såsom fastställande av promotorn verksamhet, övervakning av bakteriella föroreningar i miljön eller mat prov, Mareld resonans energi överföring (BRET), in-vivo avbildning av infektioner i eukaryota organismer, pyrosekvensering, och så vidare var etablerade15,16,17. Intressant, vanligaste tre självlysande reporter system härleds från den nordamerikanska firefly (Photinus mottfjärilar), enteriska patogener av nematoder (Photorhabdus hjälp) och den havet pansy (Renilla reniformis). Ingen av dessa system har en bakterie-beskärningen, men användningen av lux gener och operons från bakteriell ursprung vinner mer intresse för tillämpad forskning16. Mindre riklig tillämpningen av Mareld proteiner från bakteriell källor beror främst på lägre stabilitet och livslängd av bakterier härrör självlysande proteiner som kan relateras till deras marina livsmiljöer. Självlysande bakterier av marina livsmiljöer är inte odlingsbara standard lab villkor. Dessa bakterier kräver specifika tillväxt medier och villkor, såsom konstgjorda havet vatten medium och lägre tillväxt/inkubation temperaturer (t.ex. 28 ° C).
För att förenkla jämförelse av lux operon egenskaper eller enda lux gener av en rad olika självlysande bakteriestammar, en metod för att standardisera lux operon uttryck och analys är en förutsättning. Således uppstod tanken på att integrera den hela lux-rib operon i standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli). För detta ändamål, Gibson församlingen visat sig vara ett användbart verktyg för att integrera flera linjära, överlappande fragment i ett uttryck i vektor utan behov av särskilda begränsningar platser. Denna metod är också lämplig när DNA skär är för stora (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon storlek) kan förstärkas via PCR. En lux operon kan delas in i flera överlappande fragment, sedan monteras till ett uttryck i plasmid och slutligen sekvensen verifierade församlingen produkt direkt kan omvandlas till en lämplig E. coli system för hög kapacitet protein uttryck18,19,20. Förutom den lätthanterlig E. coli baserat lux genuttryck, återstod en enkel metod som kombinerar inspelning av celltillväxt och självlysande ljusa utsläppet fastställas. Den metod som beskrivs här kan i situ mätning och korrelation mellan cell densiteten och ljusa utsläppet av självlysande bakterier.
Analysen av lux gener, lux operon ordning och reglering av olika självlysande bakterier med, å ena sidan, en konstgjord självlysande E. coli system som innehåller den hela lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 och, å andra hand, en nyutvecklad plattan läsaren analysen kombinerar i situ inspelning av cell densiteten och ljusöppningen, hjälper till att få mer information om de olika bakteriella lux -system. Denna grundläggande karakterisering och jämförelse av luciferases och relaterade enzymer kan leda till alternativ till de redan etablerade reporter system med förbättrad stabilitet och verksamhet.
Protocol
1. design, förberedelse och uttryck på lux Operon i Escherichia coli
Obs: Se Tabell av material för information om kommersiella Kit används i detta avsnitt.
- För att överföra de lux operon till E. coli välja en standard pET vektor med lämplig begränsning platser och antibiotikaresistensgen av intresse (t.ex., pET28a; NcoI, XhoI, kanamycin).
- Utforma fragment och överlappande primers för Gibson montering baserat på DNA-sekvensen av Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
- Ställa in en standard PCR-reaktion med designade primers och Photobacterium mandapamensis 27561 isolerat genomiskt DNA som mall (se Kompletterande Material för primers och villkor).
Obs: Isolering av genomisk DNA respektive bakteriell stam förbättrar PCR-effekt. - Rena PCR-produkten via spin-kolumn rening.
- Utföra en begränsning matsmältning vektorns isolerade pET28a med NcoI och XhoI vid 37 ° C i 45 min.
- Rena linearized vektorn och PCR-fragmenten via agaros gel elektrofores och efterföljande spin-kolumn rening.
- Att bestämma DNA koncentration varje fragment och linearized vektorn och beräkna de optimala mängder för montering enligt de protokoll20,21.
Obs: Effekten av församlingen beror på fragment storlek och antal och måste justeras enligt tillverkarens protokoll20,21. - Efter att kombinera alla fragment och bufferten i en PCR-röret, inkubera församlingen blandningen i en PCR-maskin vid 50 ° C för 1 h.
- Omvandla monterade vektor produkten enligt standard omvandling protokoll för E. coli bakterieplasmid omvandling till en lämplig E. coli system för hög kapacitet plasmid replikering (t.ex. E. coli TOP10 (eller XL-1).
- Plocka kolonier från omvandling plattan och strimma på nya plåtar för DNA isolering.
- Isolera plasmid DNA enligt standardprotokoll.
- Kontrollera rätt montering av Plasmiden inklusive alla fragment, först utföra en koloni PCR enligt standardprotokoll med primers som är specifika för varje sammansatta fragment.
- Dessutom till kolonin PCR och efterföljande agaros gel-elektrofores, förbereda alla isolerade församlingen vektorer för DNA-sekvensering att kontrollera den rätta församlingen och de rätta DNA-sekvenserna.
- Omvandla verifierade plasmiden enligt standard omvandling protokoll för E. coli bakterieplasmid omvandling till en lämplig E. coli system för hög kapacitet proteinproduktion (e.g.,E. coli BL21).
Obs: Fortsätt direkt med uttrycket protokoll nedan. För längre lagring rekommenderas beredning av en glycerol lager.
2. redovisning av modifierat E. coli stammar
- Förbereda en övernattning kultur (ONC) uttryck genom inympning av en lämplig volym av LB medium (t.ex. 100 mL) med tidigare beredda glycerol beståndet av E. coli BL21 cellerna omvandlas med monterade plasmiden eller direkt från en omvandling plattan. Tillsätt 100 µL av kanamycin (50 mg/mL; antibiotikaresistensgen av pET28a) och inkubera i ONC vid 37 ° C och 120 rpm i en inkubator shaker över natten.
- Inokulera huvuduttryck kulturen (t.ex. 800 mL LB medium) med 8 mL av ONC och tillsätt 800 µL av kanamycin (50 mg/mL).
- Inkubera huvudsakliga kulturen vid 37 ° C och 120 rpm i en inkubator shaker tills cell densiteten når en OD600 av 0,6 - 0,8 (ca 2,5 h).
- Minska inkubation temperaturen till 28 ° C.
- Inducera proteinuttryck genom att lägga till IPTG till en slutlig koncentration på 0,1 mM.
Obs: Empiriska tester visade att en minskning av temperaturen till 28 ° C gav högsta ljusintensiteten. - Iaktta celler tills de börjar lysande (ca 1 h).
Obs: Beroende på syftet med uttrycket, cellerna odlas tills nästa dag och sedan skördas eller cellerna kan vara höll skakar så länge de är lysande (maximalt 48 h). Skörd av celler och rening av några proteiner kan göras enligt standardförfaranden.
3. redovisning av självlysande bakteriestammar
Obs: Självlysande bakteriestammar kräver specifika medium/konstgjorda havet vatten odlingsmedium för tillväxt och lätt produktion.
- Förbereda konstgjorda havet vatten medium, består av två separat beredda medelstora komponenter.
Obs: Beredning av konstgjorda havet vatten medium anpassades från ursprungliga protokoll22. Följande belopp gäller för 1 L flytande medium eller 1 L agarsubstrat.- För konstgjorda havet vatten medium, väga in följande salter: 28.13 g NaCl, 0,77 g kaliumklorid, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4.80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3och 3.50 g MgSO4 · 7H2O.
- Tillsätt 1 L destillerat vatten och lös alla komponenter.
- För LB medium, väga in följande ingredienser: 10 g jästextrakt, 10 g pepton, och för en ytterligare 20 g agar agarplattor.
- Tillsätt 250 mL kranvatten och lös komponenter.
- Autoklav båda beredda media separat vid 121 ° C i 20 min.
- För agarplattor, kombinera 250 mL LB medium med 750 mL konstgjorda havet vatten medium direkt efter autoklav och förbereda plattor.
- För flytande medium, kombinera 250 mL LB medium med 750 mL konstgjorda havet vatten medium antingen direkt efter autoklavering eller när svalnat.
Obs: Konstgjorda havet vatten mediet kan få grumlig genom salt nederbörd.
- Strimma de självlysande bakteriestammar på konstgjorda havet vatten medium agarplattor och inkubera över natten vid 24-30 ° C.
Obs: Lång tid lagring av bakteriestammar är normalt uppnås genom frysning glycerol bestånd av den bakteriella kulturen. Stammar bör alltid vara strimmiga på agarplattor först för att säkerställa enhetliga start villkor för alla stammar, före användning för flytande kulturer, på grund av en eftersläpning fas i tillväxt efter upptining. - Förbereda en ONC genom ympning 100 mL konstgjorda havet vatten medium med en enda koloni från plattan. Inkubera i ONC vid 24-30 ° C och 120 rpm i en inkubator shaker över natten.
- Inokulera 800 mL av konstgjorda havet vatten medium med 8 mL ONC.
- Inkubera bakteriecellerna vid 24-30 ° C och 120 rpm i en inkubator shaker.
Obs: Ljusintensiteten profilen av självlysande bakterier varierar starkt beroende på temperatur. Beroende på regleringsmekanismer av ljus produktion av den respektive bakteriestam, kan ljusöppningen starta efter ca 1-6 h. - Iaktta bakteriecell kultur tills de börjar lysande (ca 1-6 h).
Obs: Beroende på syftet med uttrycket, cellerna odlas tills nästa dag och sedan skördas eller cellerna kan vara höll skakar så länge de är lysande. Skörd av celler och rening av några proteiner kan göras enligt standardförfaranden.
4. in Vivo aktivitet Assay för självlysande bakteriestammar och modifierat E. coli stammar
Obs: Lång tid lagring av stammar är normalt acieved genom frysning glycerol bestånd av den bakteriella kulturen. Stammar bör alltid vara strimmiga på agarplattor först för att säkerställa enhetliga start villkor för alla stammar, före användning för flytande kulturer, på grund av en eftersläpning fas i tillväxt efter upptining.
- Strimma i önskad självlysande bakteriestam eller modifierat E. coli stam på en agarplatta och inkubera vid 28 ° C över natten.
Obs: Inkubation temperaturen kan variera från stam till stam och måste utvärderas empiriskt. För att kunna jämföra självlysande bakteriestammar och modifierat måste E. coli -stammar, tillväxt villkorar vara identiska. - Inokulera 3 mL medium med respektive stam med en enda koloni från en agarplatta och inkubera cellerna vid 28 ° C och 180 rpm i en inkubator shaker för cirka 1-2 h.
- Mäta cell densiteten av en 1:10 utspädning av flytande kultur vid 650 nm. Beräkna baserat och volym för 1 mL kultur med en OD650 på 0,05.
Obs: Efterföljande plate reader analysen avgör cell densiteten vid 650 nm att undvika störningar av det ljusa utsläppet av stammar. - Pipettera över den beräknade volymen av kultur och medium till en 24-väl svart-walled tallrik med glas botten. För den modifierade E. coli stam, Lägg till 1 µL kanamycin (antibiotikaresistens av pET28a vector) och 1 µL IPTG (induktion av genuttryck) i proverna. Plats ett lock på plattan för att undvika avdunstning under mätningarna.
Obs: För att säkerställa att den pET28a vektor som innehåller den hela lux operon inte vilse av E. coli kultur, kanamycin måste läggas till varje E. coli prov i plattan brunnarna och försäkra att ljus produktionen av den E. coli celler kan mätas, genuttrycket måste induceras av IPTG. För att undvika överhörning och mätning störningar, svart-walled plattor med glas botten och transparent lock visade bäst resultat. Dock överhörning kan observeras och väl positioner måste väljas med omsorg. - Starta mätningen i en spektrofotometer.
Obs: Plattan läsaren protokollet är baserat på ett manus som speciellt utvecklad för denna analys (se Kompletterande Material) som kombinerar två mätningar, absorbans och Mareld. Datapunkter samlas varje 10 min med permanent skakar mellan mätningarna och en konstant temperatur på 28 ° C.
Representative Results
De lux operon - luxCDABFEG - gen ordning är mycket bevarad över olika stammar2,5,14. För utformningen av Plasmiden, sekvens informationen togs från den självlysande bakteriestam Photobacterium mandapamensis 27561 och dess gen ordning hölls samma, och dessutom kodande sekvenser mellan enskilda gener ansågs. En schematisk översikt av tillämpad Gibson kloning strategin avbildas i figur 2. Fyra fragment i totalt, luxCDAB, luxF, luxEG, och ribEBH, med 20-40 baspar överlappande sekvenser genererades. Efter alla stegen av Gibson församling20, bekräftade DNA sekvensering rätt montering av Plasmiden, inklusive alla fragment. Vektor karta över den slutmontering produkt pET28a som innehåller de lux-rib operon avbildas i figur 3. En betydande fördel med modifierad pET28a vektorn är utnyttjandet av standardiserade E. coli tillväxt villkorar och kontrollerade induktion med IPTG.
För att mäta ljusa utsläppet av självlysande bakterier och respektive cell densiteten, utvecklades en metod med platta i läsaren baserat. Metoden för plattan läsaren genererades kombinerar Enkelmätning skript för ljus intensitet och cell densiteten. Denna roman script aktiverat mätning av OD650 och ljusintensitet varje 10 min för en användare definierad tidsram, som måste anpassas till den generationstid av de bakterier som används för respektive analys (t.ex. 10 h). Mätning av optiska densitet utfördes vid 650 nm till undvika störningar med ljusöppningen. Som ett bevis på konceptet och att säkerställa hälsa och beteendet rätt tillväxt av E. coli celler, utfördes hänvisar till mätningar. I figur 4 jämförelse av E. coli BL21 celler, E. coli BL21 celler som innehåller en tom pET28a vektor och E. coli BL21 celler som innehåller pET28a vektorn med de lux-rib operon infoga presenteras. För sistnämnda stam lades ingen IPTG för att analysera det ljusa utsläppet på grund av leakiness av T7 promotorn. Alla tre referensmätningar visar en sigmoidal tillväxtkurvan med tre tillväxtfaser (eftersläpning, exponential, och stationära fasen). Endast E. coli BL21 celler som innehåller pET28a vektorn med lux-rib operon infoga starten att avge ljus, men i motsats till mätningarna utsänds där uttrycket är induceras genom tillsats av IPTG och ljus efter 30 min, de icke-inducerad cellerna bara börja lysa efter ca 5 h och visa en mycket lägre ljusöppningen (ca. 4-faldig) jämfört med inducerad systemet.
Figur 5 ger en jämförelse av tillväxtkurvor och ljus intensitet de lux operon uttryckt i E. coli och den självlysande bakteriestam P. mandapamensis 27561, antingen i LB medium eller i konstgjorda havet vatten medium, med romanen etablerade i situ -metoden. För att jämföra dessa bakterier, utfördes mätningarna en inkubation temperatur på 28 ° C. Denna temperatur minskar tillväxttakten i den modifierat E. coli -stam i LB medium samt konstgjorda havet vatten medium, men för självlysande bakteriestammar lägre temperaturer är avgörande. Detta temperaturberoende syns i figur 5A, P. mandapamensis 27561 visar en mycket högre cell densiteten än E. coli. Vidare, medan för E. coli -stammar, LB medium tillåter generation av högre cell densiteter, för naturligt självlysande bakteriestammar, konstgjorda havet vatten medium är rekommenderad och väsentliga för Mareld. De inspelade cell densiteterna korrelerar med de respektive ljus intensitet, som visas i figur 5B. Anmärkningsvärd, den självlysande E. coli celler nå liknande ljus utsläpp maxima i både LB medium samt konstgjorda havet vatten medium, även om de högsta stödnivåerna spelades in vid olika tidpunkter. I motsats till denna observation, P. mandapamensis 27561 är lönsamt med starkt minskad tillväxttakt i LB medium, men bakteriecellerna avger inte ljus vid alla (figur 5B). I konstgjorda havet vatten medium visar P. mandapamensis 27561 högst ljusöppningen på runt 1 x 104 räknas per sekund, vilket är nästan en faktor 200 lägre än E. coli. Figur 5 C representerar relativa ljus enheter där Mareld är normaliserat av OD. Dessa resultat bekräftar att inte bara var införandet av en plasmid som innehåller de lux operon i E. coli framgångsrika och funktionella, men också att detta modifierade E. coli stam är ett giltigt alternativ med ännu högre ljusöppningen avkastning och utan begränsning av bakteriell mareld i marina bakterier, såsom en komplex havsvatten medellång och lägre temperaturer.
Dessutom utfördes en långsiktig mätning av E. coli baserat lux-rib genuttrycket över 24 h för att analysera livslängden på ljusöppningen (figur 6). Ljusöppningen varade för 19,5 h, mycket längre än bakteriestammar (t.ex. P. mandapamensis 27561) där en gradvis minskning sågs vilket resulterar i mycket låg ljus strålning efter 10 h.
För att illustrera begränsningarna av utvecklade analysen, visar figur 7 mätresultaten tre självlysande bakteriestammar, nämligen Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 och Vibrio harveyi 14126. För den första stammen (S1), metoden fungerar mycket bra och visar en maximal Mareld intensitet av nästan 2 x 10-6. För de andra två stammar (TH1 och 14126), maximal ljusintensitet kan inte fastställas eftersom ljusintensiteten genereras av båda överskred gränsen för upptäckt av begagnade instrumentinställningar. Gain värdet som definierats för den utvecklade metoden (skript) för dessa två stammar var inställd för högt. Uppkomsten av Mareld aktivitet kan dock jämföras med varandra. P. mandapamensis TH1 och P. mandapamensis S1 starta skiner efter ca 1 h och en OD650 -värde på 0,1 - 0,2, respektive. Däremot börjar V. harveyi 14126 avge ljus efter cirka 5,5 h på en OD650 -värde på 1,0. Observerade uppkomsten av ljusöppningen åtföljs av en exponentiell ökning i OD samt Mareld. Det är känt att mareld i V. harveyi 14126 ligger bakom quorum sensing förordning och därför en specifik cell densiteten så att aktiveringen av de lux operon, som tydligt kan observeras i figur 713. Detta resultat visar att med denna roman i situ plate reader assay är det möjligt att enkelt jämföra självlysande bakterier och även ungefär definiera en reglerande mekanism av dessa stammar genom att avgöra om en quorum sensing förordning kan vara observerade eller inte.
Figur 8 visar ett exempel på ett uttryck kultur av E. coli BL21 celler hysa monterade pET28a plasmiden som innehåller de lux operon efter induktion med IPTG. Efter cirka en timme efter induktion, de E. coli cellerna börjar lysande med en blå-grön färg. Figur 8 A visar det E. coli uttrycket kultur fotograferad i ljuset och figur 8B ger samma kultur i mörkret. Figur 8 C skildrar en agarplatta konstgjorda havet vatten medium med P. mandapamensis S1 glödande i mörker i samma blå-grön färg kännetecken för bakteriell Mareld.
Figur 2 : Schematisk framställning av tillämpad Gibson kloning strategi. Steg (I): överlappning primers (färgade pilarna; ca. 20-40 baspar överlappar varandra) är utformade. Överlappande primers innehåller glödgning sekvenser bestående av regionen för respektive 5' och 3' i ett fragment och respektive 3' och 5' region av intilliggande segmentet. Steg (II): Designade fragment för montering genereras via standard PCR-reaktioner. Steg (III): Målet vektorn är linearized av begränsning matsmältning (t.ex. NcoI, XhoI). Steg (IV): DNA koncentrationerna av alla fragment och linearized vektorn måste vara fast beslutna att justera koncentration lämpliga för Gibson församling (enligt tillverkarens protokollet). Steg (V): Alla fragment och linearized vektorn med optimerad DNA koncentrationer kombineras med Gibson församlingen huvudmixen (T5 exonuclease, DNA-polymeras och DNA-ligase) och inkuberas vid 50 ° C för 1 h. steg (VI): församling produkten omvandlas enligt standardprotokoll i en lämplig E. coli stam för hög kapacitet plasmid replikering (t.ex. E. coli TOP10 eller XL-1). Steg (VII): För att kontrollera korrekt montering av Plasmiden, har DNA-sekvensering av monterade plasmiden som ska utföras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Vektor karta över pET28a som innehåller de lux-rib operon. De lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 infogas i flera kloning platsen av pET28a i den ursprungliga gen ordningen (luxCDABFEG-ribEBH). Begränsning platser används för kloning är NcoI och XhoI. Fragment som används för Gibson montering av operon är luxCDAB i orange, luxF i grönt, luxEG i blått och ribEBH i lavendel; gener inom ett fragment visas som en separat låda. Icke-kodande sekvenser mellan varje gen av operon ingår i strategin för tillämpad kloning. Den slutliga plasmid storleken på pET28a som innehåller den hela lux-rib operon är 14,625 baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Jämförelse av tillväxtkurvor och ljus intensitet referensstammar. OD på 650 nm och Mareld intensiteten i räknas per sekund mättes varje 10 min över 10 h vid 28 ° C. Alla mått är medelvärdena för tre biologiska replikat med fyra tekniska replikat varje. Felstaplar representera standardavvikelser. E. coli BL21 celler (grå rutor), E. coli BL21 celler som innehåller en tom pET28a vektor (grå cirklar), och E. coli BL21 celler som innehåller pET28a vektorn med lux-rib operon skäret (black diamond) analyserades till Försäkra rätt tillväxt beteendet hos våra E. coli -celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Jämförelse av tillväxtkurvor och ljus intensitet de lux operon uttryckt i E. coli (torg) och P. mandapamensis 27561 (cirklar) i LB medium (öppna symboler) eller konstgjorda havet vatten medium (fyllda symboler). Alla mått är medelvärdena för tre biologiska replikat med fyra tekniska replikat varje. Felstaplar representera standardavvikelser. Alla experimenten utfördes en inkubation temperatur på 28 ° C. (A) optiska densitet (OD) mätningar vid 650 nm utfördes varje 10 min för 10 h. E. coli lux operon uttryck (till vänster) jämförs med P. mandapamensis 27561 (höger panel) i LB medium och konstgjorda havet vatten medium. Cell tätheter bestäms vid 650 nm till undvika Mareld-störningar. (B) mätning av ljusintensitet (Mareld [räknas/s]) utfördes varje 10 min för 10 h. E. coli lux operon uttryck (till vänster) jämförs med P. mandapamensis 27561 (höger panel) i LB medium och konstgjorda hav vatten medium. (C) relativa ljus intensitet (RLU/OD) de lux operon uttryckt i E. coli (till vänster) och P. mandapamensis 27561 (högra panelen) bestäms av normalisera Mareld till cell densiteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Jämförelse av tillväxtkurvor och ljus intensitet av E. coli baserat lux genuttryck för 24 h. OD på 650 nm och Mareld intensiteten i räknas per sekund mättes varje 10 min över 24 h vid 28 ° C. Alla mått är medelvärdena för tre biologiska replikat med fyra tekniska replikat varje. Felstaplar representera standardavvikelser. Dessutom, är de relativa ljus intensitet (RLU/OD) där Mareld är normaliserat av cell densiteten representerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Jämförelse av självlysande bakterier att utvärdera potentiella quorum sensing förordning. Ljusöppningen och cell densiteten mäts varje 10 min för 10 h och representera medelvärdena för tre biologiska replikat med fyra tekniska replikat varje. Felstaplar representera standardavvikelser. Mätningar av Photobacterium mandapamensis TH1 (svarta fyrkanter), Vibrio harveyi 14126 (grå cirklar) och Photobacterium mandapamensis S1 (grå diamanter) jämfördes med varandra. (A) skildrar den optiska densiteten (OD) vid 650 nm, (B) ljus intensitet (Mareld [räknas/s]) och (C) relativa ljus intensitet (RLU/OD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Mareld i flytande media och på agarplattor. (A) 5 L kolv med 2 L LB medium inokuleras med E. coli BL21 celler som uttrycker pET28a lux operon plasmiden fotograferade i ljus. (B) samma kultur som i (A) fotograferad i mörkret. Bilder A och B togs ca 2 h efter induktion av uttryck. (C) konstgjorda havet vatten medium agarplatta med strimmiga kultur av P. mandapamensis S1 fotograferade i mörkret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Byggandet av ett uttryck plasmiden som innehåller fyra fragment komponera den hela lux-rib operon av P. mandapamensis 27561 uppnåddes via Gibson kloning. Detta E. coli baserat lux genuttryck kan E. coli celler att avge ljus. Undvika quorum sensing förordning och icke-standardiserade tillväxt villkorar är betydande fördelarna med detta system.
Fördelarna med att använda Gibson kloning strategi är lätt montering av flera linjära DNA-fragment, hög flexibilitet och inget behov av särskilda begränsningar platser18,19,20. Denna metod kan enkelt ändra en lux operon, exklusive enskilda gener eller gen kluster eller att införa nya gener eller utbyte av gener från en stam med en annan. En förutsättning för tillämpning av denna metod är tillgången på de respektive lux operon gensekvensen. Endast för ett litet antal av självlysande bakterier är den fullständiga DNA-sekvensen av den respektive lux operon känd eller tillgänglig. Många av dessa sekvenser är fragmenterade eftersom de genererades med hjälp av shotgun sekvensering. När det gäller de undersökta P. mandapamensis 27561 komplett DNA-sekvensen av de lux operon är kända och tillgängliga från NCBI gen databasen (GenBank: DQ988878.2).
Ett kritiskt steg i protokollet av den Gibson församlingen är beräkningen av DNA koncentrationen av de enda fragment. I protokollet montering av tillverkaren det var rekommenderat att använda 0,2 - 0,5 pmols och en total volym på 20 µL för 4-6 fragment20,21. I vårt fall, där luxCDABFEG-ribEBH består av 4 fragment, var de koncentrationer och totala volymer 0,1 pmol 45 µL, respektive, beroende på avkastningen av PCR-produkter. Dels, koncentrationen hade minskas och å andra volymen hade ökas. Dock församlingen fungerat mycket bra och DNA-sekvensering bekräftade den korrekt insättning vid första försöket. Detta konstaterande bekräftas Gibson församlingen som en robust och lämplig metod för våra undersökningar, som lätt kan modifierade18,19,20.
Nyinrättade plate reader analysen är en lätthanterlig metod. Det möjliggör en enkel primär analys av nya eller (un-) känd självlysande bakteriestammar och ger redan en första ledtråd på den reglerande mekanismen för lätt produktion (t.ex. eftersläpning i luminiscens vid lågt tätheter). Tillväxt villkorar i kombination med lätt produktion kan dessutom enkelt utvärderas genom att helt enkelt ändra odlingsmedium eller temperatur.
Mätningarna med plattan läsaren utfördes vid 28 ° C. Anledningen till denna ovanlig inställning är temperatur känslighet självlysande bakteriestammar, där temperaturer över 30 ° C leder till mindre eller ingen tillväxt eller ljusöppningen. Observera att plattan läsaren är kapabel att hålla en definierad temperatur över tiden med begränsning av en saknas aktiva kylsystem. Därför måste omgivningstemperaturen vara under temperaturen för mätningen.
Som ett proof of concept, en jämförelse av den E. coli konstruktionen med självlysande stam P. mandapamensis (figur 5) å ena sidan och de hänvisar till mätningarna (figur 4) å andra sidan utfördes och bekräfta tillförlitligheten i detta nystartade system. Dessutom säkra långsiktig mätning livslängden på ljusöppningen (figur 6). Men måste man överväga att OD-värdena inte är tillförlitliga ovan en vissa optiska densitet, beroende på egenskaperna hos den begagnade mätinstrument (ca 15 h i förevarande fall) där en lämplig utspädning skulle behövas för en mätning i den linjär utbud av detektorn. Dessa höga varians i OD-värdena göra dessa länge mätningar inte tillförlitlig. Därför rekommenderas kortare mätningar såsom 10 h med experimentella setup redovisas här.
Begränsningar av etablerade plate reader analysens kan ses i figur 7. Svårigheten är att hitta en lämplig inställning av mätningen. Den 'få värdet' justerar känsligheten av foto multiplikator röret (PMT). Vinsten är förstärkning av signalen till den betalning, vilket innebär att en högre vinst faktor kommer att öka signalen. Om vinsten är för lågt inställd, signal-brusförhållande blir större ljus intensitet av ”låg” lysande självlysande bakterier inte kan mätas någon mer (signaler nära noll, inga data anges). Utmaningen i en självlysande analysen är att ställa in känsligheten så mätresultaten för alla bakteriestammar bo inom spänna av instrumentet. Dessutom mätområdet för Luminiscens beror på mätning intervalltiden (t.ex. högst 2.000.000 för 1 s).
Vinsten var inställd på 2800, som empiriskt testades och valt för specifika plattan läsaren används för upprättandet av denna metod. Används känslighetsinställningen tillåter inspelning av maximala avgivna ljuset genom den självlysande E. coli system, P. mandapamensis 27561 och P. mandapamensis S1 utan ett överflöd, men för stammar P. mandapamensis TH1 och V. harveyi 14126 vinsten var för hög. Därför dessa sistnämnda stammar överstiger gränsen för upptäckt och den verkliga maximal ljusintensiteten kan inte mätas. Denna tekniska begränsning kan hindra jämförelse av självlysande bakterier, som visar hög variationer i maximal ljusöppningen, även om tillväxten villkorar och cell tätheter kan vara jämförbara.
Positionering av de analyserade bakteriestammar inom de används plattorna har utvärderas empiriskt. Även om svarta plattor med glas bottnar användes, observerades överhörning mellan proverna. Ljusintensiteten för särskilda stammar är så hög, att alla närliggande brunnar kommer att Visa falskt positivt ljus utsläpp (t.ex. tomt). Det är därför viktigt att mäta två olika stammar antingen separat eller med en viss rumsliga separation till varandra.
Det finns redan många modifierade E. coli -stammar känt som innehåller delar av de lux operon och är främst tillämpningsnära15,16,17. Metoderna som beskrivs här, sikta på grundforskning, till exempel möjligheten att analysera varje lux gen separat. Även om forskning av Mareld har en lång historia, finns det fortfarande många öppna frågor. Genom exklusive införa gener från de lux operon, utbyta de luxAB -generna med gener från en annan stam eller analysera protein komplex, inbäddade i den lätthanterlig E. coli systemet och ytterligare tillämpning av plattan läsaren assay, kan det vara möjligt att få mer information om rättsliga processer och funktioner i lux gener.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) för hans stöd i upprättandet av egenskrivna skriptet för plattan läsaren. Detta arbete stöds av österrikiskt ”Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) till PM (P24189) och forskarutbildningen ”DK molekylär Enzymologi” (W901) till PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
| Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
| GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
| GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
| 24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |
References
- Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
- Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
- Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
- Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
- Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
- Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
- Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
- Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
- Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
- Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
- Meighen, E.
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
- Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
- Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).
