Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

Abstract

המכשיר פיזור ביולוגי ניוטרון זווית קטנה במעבדה גבוהה השטף איזוטופ הכור של אלון רכס הלאומי מוקדש החקירה של חומרים ביולוגיים, biofuel עיבוד וחומרים בהשראה ביו כיסוי ננומטר ל מיקרומטר פיסיקליות. השיטות המובאות כאן על חקירת תכונות פיזיקליות (קרי, גודל וצורה) של קרום חלבונים (כאן, MmIAP, פרוטאז aspartyl intramembrane מן Methanoculleus marisnigri) בפתרונות של יוצרי מיצלה חומרי ניקוי? מתאים היטב לכלי פיזור זה זווית קטנה ניוטרון, בין היתר. טכניקות אחרות אפיון biophysical הם מוגבל בשל חוסר היכולת שלהם כדי לטפל דטרגנט סיועה של מבנה מורכב אבקת חלבון. בנוסף, גישה למעבדה ביו-Deuteration מספק יכולות ייחודיות הכנת cultivations בקנה מידה גדול ולבטא את התווית על-ידי דאוטריום חלבונים לאות פיזור משופר של החלבון. בזמן זה טכניקה אינו מספק פרטים מבניים ברזולוציה, הפער בידע מבניים קרום חלבונים מכיל הרבה תחומי המחקר למיעון ללא צורך ברזולוציה ליד-אטומית. לדוגמה, אזורים אלה לכלול נחישות של מדינות oligomeric, היווצרות מורכבות, שינויים הסתגלותי במהלך ההפרעות, קיפול/התגלגלות אירועים. חקירות אלה ניתן להשיג בקלות באמצעות יישומים של שיטה זו.

Introduction

קרום חלבונים מקודדים של % 30 המשוערת של גנים כל1 , מייצגים את רוב מטרות עבור תרופות מרפא מודרניים חזקים. 2 חלבונים אלה לבצע מגוון רחב של פונקציות חיוני הסלולר,3 אך למרות שפע וחשיבות שלהם – מייצג רק כ 1% של מבנים הכולל שהופקדו Collaboratory המחקר עבור חלבון ביואינפורמטיקה מבנית (RCSB) בנק מידע. 4 בשל טבעם הידרופובי חלקית, נחישות מבנית של חלבוני ממברנה מכורך כבר מאוד מאתגר. 5 , 6 , 7

טכניקות רבות biophysical דרוש monodisperse חלקיקים בתמיסה למדידה, בידוד מהחלבונים ממברנה מקורית ממברנות וייצוב חלבונים אלה ב לחקות מסיסים של הממברנות מקורי היה שטח פעיל של מחקר האחרונים עשורים. 8 , 9 , 10 חקירות אלה הובילו לפיתוח של הרכבות amphiphilic הרומן רבים solubilize קרום חלבונים, כגון nanodiscs,11,12,bicelles13 ,14,15 , amphipols. 16 , 17 . עם זאת, השימוש הקזאין דטרגנט נשאר לאחת הגישות הנפוצות ביותר וברור מספק את הדרישות מסיסות של חלבון נתון. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . למרבה הצער, אין סבון יחיד או תערובת הקסם של דטרגנטים כיום קיימת המקיים את כל החלבונים ממברנה; לפיכך, התנאים האלה בטח מדעית שיוקרנו הדרישות הייחודיות של כל חלבון. 26 , 27

חומרי ניקוי עצמי להרכיב בפתרון מעל שלהם ריכוז קריטי מיצלה למבנים צבירה טופס שנקרא הקזאין. הקזאין המורכבות הרבה מונומרים דטרגנט (בדרך כלל בטווח שבין 20-200) עם שרשראות הידרופוביות אלקיל ויוצרים גרעין מיצלה וקבוצות ראש הידרופילית מסודרים בשכבה מעטפת מיצלה מול הממס מימית. ההתנהגות של חומרי ניקוי, היווצרות מיצלה שתיארנו בסגנון קלאסי על ידי צ'ארלס Tanford אפקט הידרופובי,28 , גדלים, צורות של הקזאין של דטרגנטים נפוץ במחקרים חלבון ממברנה היה מאופיין באמצעות פיזור זווית קטנה. 29 , 30 דטרגנט הארגון על קרום חלבונים גם נחקר, וצפויה היווצרות של חלבונים-דטרגנט מתחמי (שיתפקדו) עם מולקולות דטרגנט המקיפים את החלבון בהסדר הדומה הנוזל מסודר הקזאין. 31

אחד הוסיף היתרון בשימוש חומרי ניקוי היא כי ניתן לטפל המאפיינים מיצלה הנוצרת על-ידי שילוב חומרי ניקוי אחרות. חומרי ניקוי רבים שהפגינו ערבוב אידיאלי, אפילו ניתן לחזות בחר מאפייני הקזאין מעורבות מן הרכיבים ואת יחס של ערבוב. 22 . עם זאת, הנוכחות של דטרגנט יכול עדיין להציג אתגרים אפיוני biophysical בתרומה לחברה האות הכללית. לדוגמה, עם צילום רנטגן וטכניקות פיזור אור, האיתות דטרגנט ב PDC הוא כמעט להבחין מגניחותיה חלבון. 32 חקירות עם מיקרוסקופ יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרונים (הקפאה-EM) בדרך כלל לסמוך על לכוד חלקיקים (קפואים); פרטים מבניים של החלבון מעורפלים. עדיין דטרגנטים מסוימים או ריכוז גבוה של חומרי ניקוי המוסיף הרקע. 33 גישות חלופיות לקראת פענוח המבנה PDC מלאה (כולל הנוזל) נעשו באמצעות שיטות אשר מבקשים לשחזר הנוזל סביב חלבון ממברנה נתון. 34

במקרה של פיזור ניוטרון, הסידור ליבה-קליפה של דטרגנט בתוך מיצלה מייצרת גורם טופס אשר תורמת פיזור התצפיות. למרבה המזל, ניתן לשנות רכיבי פתרון כזה כי הם לא תורמים פיזור התצפיות נטו. תהליך זה "חדות התאמת" מושגת על ידי החלפת דאוטריום מימן להשיג צפיפות אורך פיזור המתאים של הרקע (מאגר). יש לקחת בחשבון בחירה הביוספירה של דטרגנט (עם עמיתיהם deuterated זמין) ואת היחס של ערבוב. עבור הקזאין דטרגנט, החלפה זו יכולה להתבצע באמצעות חומר ניקוי עם אותה הקבוצה בראש אבל העובדה שרשרת אלקיל deuterated (d-הזנב במקום h-הזנב). מאז חומרי ניקוי היטב מעורבת,35 אגרגטים שלהם יש צפיפות אורך פיזור זה השבר-השומה משוקלל ממוצע של שני הרכיבים (h-פלי ו d-פלי). כאשר זה הניגוד הממוצע של ראש הקבוצה, המבנים צבירה במדים ניתן להתאים באופן מלא כדי להסיר את כל התרומות כדי פיזור התצפיות.

אנו מציגים כאן פרוטוקול לתמרן את הניגוד ניוטרון של דטרגנט הקזאין על-ידי שילוב מולקולות דטרגנט מבחינה כימית זהה עם התווית על-ידי דאוטריום אלקיל שרשראות. 19 , 36 , 37 זה מתיר מהניגודים סימולטני התאמת מיצלה core ו- shell, אשר היא יכולת ייחודית של פיזור ניוטרון. 35 , 38 עם רמת פירוט מעודן באופן משמעותי, התאמת ניגודיות יכול לאפשר לימודים אחרת ישים מבני חלבון ממברנה. בנוסף, גישה זו התאמת ניגודיות אפשרות להאריך למערכות אחרות הקשורות דטרגנט, כגון פולימר חילופי תגובות39 ו שמן מים dispersants,40 או אפילו סוכנים אחרים, solubilizing, כגון bicelles,41 copolymers nanodiscs,42 או לחסום. גישה דומה 43 א כמתואר כתב יד זה, אבל העסקת זן דטרגנט יחיד עם החלפות חלקיות דאוטריום-אלקיל שרשרת ו/או ראש הקבוצה, יצא לאור לאחרונה. 37 בזמן זה צפויים לשפר את התפלגות אקראית של מימן, דאוטריום בכל רחבי הנוזל לעומת הגישה המובאת כאן, מספר מוגבל של משרות פתוחות על החומר ניקוי עבור החלפת ושני שלבים סינתזה דטרגנט נדרש מציבה אתגרים נוספים בתמורה.

שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול שיפורטו להלן לעתים קרובות חופפים מאז תכנון הניסוי הראשוני חייב להיעשות להגיש הצעה איכות. עם זאת, הצעת הגשה נחשב כאן בתור הצעד הראשון כדי להדגיש כי תהליך זה אמורה להתחיל הרבה לפני ניסוי ניוטרון. יש גם לציין כי צעד דרישה מוקדמת, אשר צריך ניתן להדגים על ידי ההצעה, הוא שתהיה הביוכימי ופיזית אפיון (כולל טוהר ויציבות) הדגימה התומכים בצורך לימודי ניוטרון. דיון כללי של זווית קטנה ניוטרון פיזור (SAN) חורג מהיקף מאמר זה. הקדמה קצרה אך יסודי זמין העבודה הפניה ואפיון של חומרים על ידי קאופמן,44 וספר לימוד ממוקד ביולוגי זווית קטנה פתרון מקיף פיזור שפורסם לאחרונה. 45 עוד המלצה לקריאה ניתנת במקטע דיון. זווית קטנה פיזור משתמש הווקטור פיזור שנקרא Q הכמות המרכזי המתאר את תהליך פיזור. מאמר זה משתמש בהגדרת נפוצה ומקובלת Q = חטא 4π (θ באמצעות) / λ, איפה θ באמצעות חצי הזווית בין קרן פזורים ונכנסות λ הוא אורך הגל של הקרינה ניוטרון ב אנגסטרום. הגדרות אחרות קיים שימוש שונה סמלים כגון של ' עבור וקטור פיזור, וכי עשויים להשתנות על ידי 2π פקטור או באמצעות ננומטר במקום אנגסטרום (ראה גם הדיון איור 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. להכין ולהגיש ניוטרון מתקן קרן ושעה כלי הצעה

  1. התייעץ עם משאבים מקוונים לזיהוי ניוטרון פיזור מתקנים המאפשרים כללי למשתמש ניוטרון קרן זמן גישה, כגון אוק רידג הלאומית מעבדה (ORNL). מפה של נייטרונים מתקני ומידע אודות ניוטרון מחקר ברחבי העולם זמין באינטרנט. 46 להיות מודע כי מתקנים אלה יש בדרך כלל קבוע קול קורא להגשת הצעות; זה קובע מתי בפעם הבאה קרן יהיה זמין. נייטרונים משמשים למגוון רחב של יישומים; חיפוש לכלי פיזור (SAN) זווית קטנה ניוטרון, במיוחד אלה עם יכולות על דגימות ביולוגיות.
  2. השתמש במשאבים המסופקים על ידי המתקנים ניוטרון לעזור נווט תהליך המסירה ניוטרון הצעת הזמן קרן. התייעץ עם נייטרונים פיזור מדען (NSS) המשויך המכשיר שעבורו אתה יחול. סקירה של המתקן ניוטרון מידע עדכני לגבי ההצעה שיחות, מועדים, וייעוץ להגשת; אלון רכס זה זמין באינטרנט. 47 להגיש את ההצעה זמן קרן בעקבות הנחיות כל כניעה מוצלח.
  3. אם החלבון deuterated הינה נדרשת (ראו 2.2), נייטרון פיזור מתקנים נתמכים לעתים קרובות על ידי מעבדות ומומחיות ייעודי לייצור של חומרים deuterated. כדי לבקש גישה ביו-Deuteration מעבדה (BDL) ב ORNL, בחר את BDL ככלי השני במערכת ההצעה. אמנם ההצעה SANS הוא סקר היתכנות, על-ידי ועדה סקירה מדעית, בקשות BDL מוקרנים רק עבור היתכנות. כדי לעזור עם הסקירה היתכנות BDL, להגיש מידע הושלמה בקשה טופס48 המתאר את הפרוטוקול ביטוי חלבון ואת התשואה המשוערת (זמין באינטרנט).
  4. לאחר מוצלחת-ביקורת עמיתים של ההצעה זמן קרן, לאשר את התאריך זכו של קרן זמן לפני הניסוי. ודא כל מדגם ומאגר פרטים ונוסחאות המפורטים כהלכה בהצעה לבדיקה תקין. שינויים בתכנית ניסיונית המוצע, לרבות שינויים בהרכב מדגם ומאגר, מחייבים הודעה על המתקן.
    הערה: שינויים ידונו בהקדם האפשרי עם תוכנית השירות NSS שהוקצו.

2. לקבוע נקודות משחק ניוטרון חדות וניגודיות הדרושים למדידה חלבון

  1. לאסוף מידע (מתוך פרטי המוצר של הספק, מאגרי מידע מקוונים, ערכים שפורסמו, וכו ') הנוגעים יצירות אטומי ואמצעי אחסון עבור רכיבי מערכת דטרגנט חדות-להתאמה. מידע זה משמש כדי לקבוע ניוטרון פיזור אורך צפיפויות (Sld) וחדות ובכך נקודות משחק (CMPs) בתמיסה, אשר חיוני להשגת איכות נטול מידע נתונים מבניים חלבון ממברנלי עניין בהקשר של PDC. טבלה המסכמת מאפייני והניגודיות התאמה נקודות פיזי עבור חומרי ניקוי נפוץ במחקרים ביופיזיקלי של קרום חלבונים הוא כלל (טבלה 1).
  2. לקבוע Sld ניוטרון באמצעות יישום האינטרנט גבבה: מודולים עבור ניתוח של ניגודיות וריאציה נתונים49 (זמין באינטרנט50 חינם of-אחראי). קישור למדריך ממוקם בדף הבית. הגישה שלך לאתר, קרא את התיעוד הנלווה. איור 1 ו- 2 איור מספקים סקירה של ניגודיות מודול הקלט והפלט עבור שתי דוגמאות הקשורות.
    הערה: אתרי אינטרנט אחרים לחישוב Sld הינם זמינים, כמו האחד מתוחזק על ידי המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) מרכז למחקר ניוטרון. 51
    1. לפתוח את המודול החדות על-ידי לחיצה על 'ניגוד' הממוקם בחלונית הניווט השמאלי. לספק טקסט עבור כותרת פרוייקט ולהזין פרטים להלן עבור שני מרכיבים (למשל, דטרגנט קבוצה ראש וזנב) כמו ' יחידת משנה 1', ' יחידה משנית 2'.
    2. הזן את הנוסחה המולקולרית של כל רכיב בתיבת הטקסט 'נוסחה'.
      הערה: לחצן רדיו אני "חייבת להיעשות תחת 'סוג חומר' כדי להזין נוסחה מולקולרית. בנוסף, להשתמש האות 'X' בנוסחה כדי לציין אטומי המימן להחלפה בקלות. ניתן להזין רצפי חלבונים, RNA או DNA אם המקביל 'P', 'R', או היה ' לחצני האפשרויות ייבחרו. אם עותקים מרובים של רכיב קיימים בתוך יחידת משנה הערך עבור 'Nmolecules' יכול להשתנות בהתאם. דוגמה מעשית כאן מתייחס השומנים דמוי דטרגנטים המכיל שני זנבות זהים, המאפשר את הנוסחה עבור אחד זנב שיוזן עם Nmolecules שווה ל- 2.
    3. הזן את אמצעי האחסון אנגסטרום מעוקב עבור כל רכיב בתיבה שמתחת '' עוצמה' (Å3). להשתמש בנוסחה של Tanford28 אלקיל שרשראות של אורך n, Vזנב = 27.4 + n * 26.9, כדי לחשב נפח הזנב משוער, או להשיג מולקולרית אמצעי אחסון של מידע על המוצר שסופק או לאור הערכים הספרות.
    4. הזן פרטים עבור מאגר הרכיבים. לשנות 'מינים של הממס התפרקה מס' באמצעות התפריט הנפתח כדי להוסיף או להסיר שורות עבור כל אחד מהרכיבים מאגר. במקרה של יוצרי מיצלה דטרגנטים, כוללים את מונומרים דטרגנט חינם כרכיבים נפרדים מאגר-ריכוז קריטי מיצלה של הנוזל (CMC).
    5. לחץ על 'שלח' כדי לבצע את החישובים ניגודיות ניוטרון ולהפיק דף תוצאות המספק טבלה של פיזור אורך צפיפות וחדות נקודות משחק, כמו גם נוסחות לקביעת פרמטרים אלה על כל אחוז נתון D2O ב- המאגר. סקור את הפרמטרים פיזור עם תשומת לב מיוחדת רכיב CMPs. הנקודות התאמה דומים (במרחק של-10% D2O), הריכוז מיצלה חינם הוא נמוך, אם הממוצע CMP ניתן להשתמש עבור התאמת ניגודיות התרומות דטרגנט. ברוב המקרים, CMP של דטרגנט קבוצה הראש, הזנב יהיו שונים על ידי יותר מ 10-15%, בהפקת גורם ליבה-קליפה טופס הנתונים SANS obfuscates ישירה אוסף של האות פיזור של החלבון לבד.
  3. להעריך את הניגוד בין דטרגנט קבוצה ראש וזנב. כאשר דטרגנט ראש קבוצה, אלקיל שרשרת הזנב CMPs אינם מתאימים, הזמינות ואת התאגדות של חומר ניקוי שהוחלפו דאוטריום יכולים להרשות פיזור אורך צפיפויות של רכיבים בחר להיות מתומרן. ברוב המקרים, זה ידרוש ויוצרים מיצלה מעורבת באמצעות דטרגנט זהה עם אלקיל שהוחלפו דאוטריום שרשראות. התוספת של דאוטריום מעלה הצפיפות אורך פיזור של הגרעין שהקים את זנבות השרשרת אלקיל. נקודת הקצה הרצוי, במקרה הזה, הוא כזה ראש קבוצה מעטפת CMP, אלקיל רשת הליבה CMP יש כ ערכים שווים.
    1. העלאת CMP גרעין מיצלה דטרגנט להיות כ שווה CMP של המעטפת ראש קבוצה על-ידי קביעת היחס המתאים של ערבוב בין h-פלי d-פלי משיג מהניגודים תואמים עם ראשי הקבוצות. תנאי הכרחי קביעה זו היא הידע CMP עבור זנב שרשרת אלקיל דאוטריום שהוחלפו. מקבילה זמין מסחרית כדי n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) הינו זמין עם כל מימן שרשרת אלקיל הוחלף דאוטריום (d25-DDM). חזור על החישובים ניגודיות המתוארים בשלב 2.1 עבור זנב היה ' במקום "h-הזנב".
    2. חישוב היחס השומה של h-הזנב עד d-זנב הדרושים עבור התאמת ניגודיות עם הקבוצה ראש CMP. הנוסחה הבאה יכול לסייע עם קביעה זו:
      CMPהראש = CMPh-פלי * χזנב h + CMPd-פלי * χd-פלי
      איפה CMP הוא פיזור אורך צפיפות וχ הוא השבר אמצעי האחסון עבור הרכיב הראש דטרגנט, h-פלי, או d-פלי. פתרונות במאגר של DDM, התאגדות של 44% לפי משקל (43% לפי השומה) של החומר ניקוי מוחלט כמו d25-DDM עם שרשראות אלקיל שהוחלפו דאוטריום מייצרת של CMP יחיד ב- 48.5% D2O עבור רכיבי הראש והן זנב.
  4. לשקול את מידת דאוטריום החלפת עבור החלבון ממברנה. למדידת פיזור מספיק, האיתות החלבון, CMP עבור החלבון צריך להיות לפחות 15% D2O בפתרון מן הנוזל CMP ותנאים מדידה. האות עולה עם הריבוע של ההבדל הזה %. מאז CMP החלבון ללא תווית מתרחשת בדרך כלל עם ~ 42% D2O בתמיסה (CMP דומה לקבוצות רבות ראש דטרגנט), דאוטריום תיוג של החלבון היא כמעט תמיד הכרח. 52

3. אקספרס ולטהר את חלבון ממברנלי עניין

  1. להכין ליברות (מרק lysogeny) בינוני ולגדול Escherichia coli (e. coli) תאים מחסה וקטור ביטוי inducible את הרצף חלבון המטרה.
    1. להכין תקשורתי מזערי. H2O או D2O, להמיס 7.0 g/L (NH4)2אז4, ו 5.25 g/L נה2HPO4, 1.6 g/L ח'2PO4, 0.50 g/L דיאמוניום מימן ציטראט, גליצרול 5.0 g/L, 1.0 מ"ל/L של 20% w/v MgSO 4·7H2O ו- 1.0 מ"ל/L של Holme במתכות (0.50 g/L CaCl2·2H2O 0.098 g/L CoCl2, CuSO 0.102 g/L4, 16.7 g/L FeCl3·6H2O, 0.114 g/L MnSO4· H2O, 22.3 g/L נה2EDTA·2H2O ו 0.112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. להכין פתרונות מתאימים לאנטיביוטיקה מניות באמצעות H2O או D2O.
    3. להכין פתרון איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside מניות באמצעות H2O או D2O.
    4. מסנן סטרילי כל הפתרונות לתוך יבשה, סטרילי מכולות באמצעות ואקום בקבוק-העליון, מזרק מסננים עם גודל הנקבוביות 0.22 מיקרון.
  2. להתאים את החיידק לתאים התווית על-ידי דאוטריום בינונית לפני הסולם על ביטוי של חלבון deuterated.
    1. לחסן 3 מ"ל של מדיום ליברות של המושבה מבודד מן צלחת אגר Lysogeny מרק (LB) או תאים מניה גליצרול קפוא. לגדל תאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 250 סל"ד או לצמצם את הטמפרטורה עד 30 ° C או להלן כדי למנוע גידול יתר של התרבות בעת המקננת בן לילה.
      הערה: הליך עיבוד יכולים להיות מגוונים. 55 , 56 , 57
    2. ברגע התרבות LB גדלה צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) ~ 1, למהול אותו 1:20 ב- 3 מ"ל של מדיום מינימלי של2O H ולגדול יתר600 ~ 1. אני חוזר על 1:20 דילולים באמצעות בינונית מזערי המכיל 50, 75 ו- 100% D2O (או עד את האחוז הרצוי של2O D).
      הערה: כמו D2O תוכן הוא גדל, שיעורי צמיחה יקטן. היחסים בין האחוז2O D בצמיחה דאוטריום ומדיה החלפה חלבון דווח בספרות. 58 , 59 , 60
    3. המשך גידול התרבות במגיב ביולוגי כדי להגדיל את התשואה של תא deuterated המסה (איור 3).
      הערה: הליכים מפורטים לניתוח ביוריאקטור שנסקרו במקום אחר. 61 , 62 , 63 , 64
  3. הקציר ואת lyse e. coli תאים עבור חילוץ ממברנה וטיהור חלבונים
    1. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה-g x ~ 6,000 עבור ~ 30-45 דקות ב 4 º C.
    2. להמיס, בגדר תא למסמס במאגר על קרח ~ 30 דקות. ואז, בעדינות resuspend בגדר תא במאגר על ידי בעדינות pipetting עם pipet סרולוגית, או עדין נדנדה על כיסא נדנדה 2D, כדי ריכוז הסופי של מאגר מסה/10 mL רטובים ~ 1 g.
      הערה: מאגר דוגמה הוא 50 מ מ HEPES (-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 חומצה), pH 7.5, 200 מ"מ NaCl שיושלם עם לוח מעכב פרוטאז.
    3. Lyse תאים resuspended עם שלושה מעברים דרך מהמגן בלחץ גבוה ב- 10,000 psi בעודכם נרגעים זרימה החוצה.
      הערה: בהתאם קנה המידה הנדרשות, שיטות אחרות פירוק עשוי להיות בשימוש (לדוגמה, על-ידי העיתונות הצרפתית או sonication).
    4. צניפה שאריות תאים על ידי צנטריפוגה ב g x ~ 4,000-5,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. חזור על שלב זה עד תגובת שיקוע מובהר.
    5. Ultracentrifuge (~ 150,000 x g למשך 30-45 דקות) תגובת שיקוע צעד קודם, אשר מכיל את מסיסים, ממברנה שברים. בגדר לאחר ultracentrifugation מכיל את השבר ממברנה.
    6. Resuspend בגדר ממברנה ב מהמגן גדול דאונס, לבודד את השבר ממברנה שוב על-ידי ultracentrifugation (שלב 3.3.5). חזור על שלב זה לפחות פעם אחת כדי להסיר חלבונים מאוגדים באופן רופף.
    7. Solubilize ממברנות במוזיקת עדין ~ 30 דקות ב 4 ° C במאגר המכיל חומרי ניקוי מתאים טיהור. Solubilization בולטת כאשר המתלה הופך מ מעונן לשקוף. להסיר חומרים לא מסיסים על ידי ultracentrifugation (~ 150,000 x g למשך 30-45 דקות).
      הערה: מאגר דוגמה הוא 50 מ מ HEPES, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 20 מ מ imidazole ו- 4% (w/v) DDM לטיהור מאת ני2 + כרומטוגרפיית זיקה.
  4. לטהר את החלבון בעקבות פרוטוקול שפותחו בעבר עבור טפסים protonated.
    הערה: ר' דוד זטלמן et al. עבור פרוטוקול טיהור דוגמה עבור פרוטאז aspartyl (d-MmIAP) intramembrane marisnigri מ JR1 hexahistidine מתויגים. 65 התשואה הסופית היתה ~ 1 מ ג של deuterated מ- 5 L deuterated צמיחת תאים תרבות, אשר שימשה לניסוי SANS (איור 4).
  5. להחליף את חלבון מטוהרים למאגר"הסופי Exchange" להתאמת החדות.
    1. להכין 200 מ"ל"הסופי Exchange מאגר"המכיל את התערובת הנכונה לקבלת ניגודיות תואמים, למשל,20 מ מ HEPES, pH 7.5, 250 מ מ NaCl ו 0.05% סה כ DDM (0.028% DDM ו 0.022% d25-DDM) ב-49% D2O.
    2. Equilibrate אי-הכללה של גודל עמודה עם > 2 עמודות (CV) "מאגר Exchange הסופי" בשני כרכים 3.5.1 באמצעות מערכת מהר חלבון נוזלי כרומטוגרפיה (FPLC).
    3. לאחר הזרקת המדגם, להפעיל את העמודה, לבודד שברים המייצגים החלבון עניין.
    4. רכז החלבון לריכוז הסופי הרצוי (2-5 מ"ג/מ"ל).
      הערה: נפח של μL ~ 300 הוא נדרש למלא cuvette קוורץ גלילי של 1 מ מ המשמש SANS.
    5. שומרים על aliquot של מאגר מתאימים עבור SANS רקע חיסור.
      הערה: ניתן לקחת את aliquot ישירות מתוך המאגר מוכן, או באופן אידיאלי שבר נקי • תנאי בסוף המרוץ FPLC.

4. להפוך את ההכנות האחרונות עבור קרן זמן לאסוף SANS נתונים

  1. לאחר ההצעה התקבלה גישה לאתרי אושרה, להשלים כל האימונים מועד קרן שהוקצו. זה כולל prearrival, הדרכה מעבדה רדיואקטיבית, באתר, ואת כלי הדרכה מבוססת אינטרנט.
    הערה: דרישות ההכשרה עשויה להכתיב ההגעה מראש עבור משתמשים בפעם הראשונה. מידע נוסף זמין באינטרנט. 66
  2. לטעון מאגרים עבור איסוף נתונים ודוגמאות.
    הערה: סקירה כללית של פיזור ניוטרון זווית קטנה ביולוגי (ביו-SANS) מכשיר מדגם סביבת האזור מוצג באיור5.
    1. לטעון מאגרי ודוגמאות לתאים קוורץ. קוורץ תאים זמינים מדען מכשיר או מתקן. השתמש בעצות העמסה ג'ל כדי לגשת הפתח הצר של רוב התאים הדגימה.
    2. להבטיח כי התריס קרן סגורה, לאחר מכן להתקרב לאזור הסביבה לדוגמה, במקום התאים קוורץ במחליף מדגם. לתעד את המיקום מחלף לדוגמה עבור כל תא הדגימה.
    3. . תבדוק את האזור להבטיח הנתיב בים ללא חסימה, ואז לעזוב את האזור סביבה מדגם, פתח את התריס קרן.
      הערה: בזהירות בצע כל מתקן חוקים ותקנות, לציית כל מה שנכתב, לשים לב עצתו של המדען כלי. דוגמאות עשוי להיות לא להסיר מן הקורה, מניפולציות לאחר חשיפה על הקורה ללא אמצעי הזהירות המיוחדים הבאים. התייעץ עם רדיולוגי שליטה טכנאי (RCT) לפני הליכים אלה.
  3. ביצוע סריקה טבלה עבור איסוף נתונים אוטומטיים
    1. להפעיל את המכשיר באמצעות פקד מותאם אישית LabVIEW מבוסס תוכנה, ספקטרומטר כלי בקרת הסביבה (SpICE). בצע את ההוראות עבור כלי פעולה המסופקים על ידי המדען פיזור ניוטרון. סקירה כללית של windows מבצע סריקה שולחן מסופק ב איור 6.
    2. לאחר הזנת המידע הנדרש בתחומים המתאימים, להפעיל את הסריקה טבלה ויתחיל תהליך איסוף נתונים אוטומטיים. עקוב אחר התקדמות דרך הכרטיסיה 'מצב סריקה טבלה'.

5. להפחית SANS לנתונים מתמונת 2D לחלקה 1 י

  1. לזהות כל קובץ נתוני מאגר ולדגום מן המספרים סריקה המוקלט. כל אחת מהמידות יוקצה מספר ייחודי הסריקה. מידע זה שימושי במהלך הפחתה בנתונים כדי לזהות כל זוג מאגר ולדגום המתאימים.
  2. שימוש MantidPlot תוכנה ו- script פיתון להפחתת
    1. נייטרון פיזור המשתמשים מסופקים עם פרטי החשבון לגישה לנתונים שלהם באשכול ניתוח מרוחק. 67 . היכנס לאשכול ניתוח מרוחק ובצע "MantidPlot" מתוך שורת הפקודה. איור 7 איור 8 ניתנים כדי לסייע שלבים אלה.
    2. להשיג הפחתה משתמש ב- Script של המדען פיזור ניוטרון (שזה בדרך כלל יקרה במהלך הניסוי); התסריט הזה הוא מבוסס-Python, יכיל כל צורך בכיול והתאמות קנה מידה כדי להקטין את התמונה פיזור 2D לתוך מגרש 1 י של עוצמות פזורים כפונקציה של פיזור זווית, I(Q).
    3. פתח את התסריט הפחתת למשתמש שסופקו ב MantidPlot ומניחים את מספרי הסריקה המתאימה או זיהוי עבור זוגות מדגם ומאגר ברשימה המתאימה.
    4. ביצוע ה-script ליצור נתוני מופחתת כקובץ טקסט ארבעה טורים (סדר העמודות הוא Q, I(Q), I(Q) שגיאה, Q שגיאה) במיקום שצוין. סביבת העבודה המתאימה ב- MantidPlot קליק ימני ובחר "על מגרש עם שגיאות." בחינה ראשונית של הפרופילים פיזור.

6. לנתח את הנתונים עבור הפרמטרים מבנית של החלקיק פיזור

  1. העבר את קובץ הנתונים מופחת מהשרת ניתוח מחשב מקומי באמצעות העברה מאובטחת של קבצים FTP. זה יכול להתבצע עם השימוש של תוכנות כמו FileZilla או CyberDuck. הוראות נוספות ופרטים עבור חיבור מערכת הקבצים של השרת ניתוח ניתנים בעמוד הכניסה analysis.sns.gov.
  2. הורד את ATSAS תוכנה סוויטת65,68 (כל סוויטה ATSAS). 69 תוכניות בודדות70 הינם גם זמינים באינטרנט לניתוח הנתונים SANS, כלומר קביעת פרמטרים מבניים ומודלים ab initio .
    הערה: אפשרויות רבות זמינות עבור SANS ניתוח נתונים של ובמקרו-מולקולות ביולוגיות. 45
  3. השתמש פרימוס71 על התוויית נתונים, מאגר שינוי קנה מידה, חיסור, וניתוח Guinier.
    1. להפעיל את ATSAS 'ניתוח נתונים מסוג SAS' יישום, לטעון הנתונים מופחת קבצים התואמים זוג מאגר ולדגום.
      1. לשינוי גודל המאגר כראוי, בחר טווח נתונים-Q גבוה (Q > 0.5 Å-1) שבו שני פרופילים דומה ושטוחים, לחץ על לחצן 'סולם' ממוקם תחת 'פעולות' טאב. גורם קנה המידה יחולו על המאגר כזה כי אלה שני אזורים שטוח צריך לחפוף. שימוש באזהרה: צריך להיות סיבה גופנית סבירה שמצדיקה דרוג עוצמתו מאגר כך שתתאים לדוגמה. אם הפער הוא גדול, להתייעץ עם מדען כלי עבור גישות חוקי רקע חיסור. 44 , 45 , 72
      2. להגדיל את טווח הנתונים כדי להציג את כל הנקודות. לחץ על 'החסר' לביצוע פעולה זו. קליק ימני על קובץ נתונים המופחת-מאגר במקרא ולשמור קובץ זה לצורך ניתוח מאוחר יותר. איור 9 מתאר את השימוש הכרטיסיה 'פעולות'.
    2. לבצע ניתוח Guinier של הנתונים לדוגמה המופחת-מאגר באמצעות הכרטיסיה 'ניתוח' של היישום 'ניתוח נתונים מסוג SAS'.
      1. ודא שהקובץ תקין נבחר ברשימה ולחצו על 'רדיוס של רגע'. ניסיון אוטומטית לבצע Guinier מתאים יינתן על-ידי לחיצה על לחצן 'Autorg'.
      2. להרחיב את טווח נתונים המשמשים כדי לכלול את כל הנתונים נמוכים-Q ולהתחיל לצמצם את טווח הנתונים על ידי לקיחת high-Q נקודות עד Qmax * Rg המותרת היא מתחת 1.3. להשתמש העלילה של תמלוגים כדי לוודא כי הנתונים הם ליניאריים בטווח מתאים. Guinier מתאים התשואות משוער Rg ואני0 עבור החלקיקים פיזור.
      3. לעשות שינויים קטנים באזור מתאים ונטר את הרגישות של ערכים אלה טווח נתונים המשמשים את ההתאמה. איור 10A מדגים את השימוש בכלי 'רדיוס של רגע'.
  4. להשיג את פונקציית ההתפלגות של הסתברות (P(r)) ב GNOM. 73 בקובץ הפלט שנוצר כאן ישמש כקלט עבור ab initio מידול תהליך.
    1. התחל באשף הפצת מרחק בתוך הכרטיסיה 'ניתוח' קבלת מתאים לנתונים חיוני להשגת איכות מודל. לקבלת מידע נוסף על קבלת מתאים מדויק, ראה את הסקירה74 מאת פאטנם, et al.
      הערה: GNOM התוכנית מספקת מידע נוסף אודות התאם מעבר באשף הפצת מרחק. איור 10 ב' מדגים שימוש נכון בכלי "מרחק הפצה", איור 11 מדגים חלק השגיאות הנפוצות נתקל.
    2. לקבוע Dmax, interatomic המרחק המקסימלי בתוך המולקולה.
      1. הערכת ערך עבור Dmax על ידי ביטול הסימון בתיבה כדי לכפות Rmax = 0, הזנת ערך גדול עבור Dmax (150, לדוגמה). X-החיתוך הראשון של העלילה של P(r) מניב מהערכה זו.
      2. לבצע שינויים הדרגתיים ערך Dmax זה לבין טווח הנתונים המשמשים או מספר נקודות בשימוש התאם כדי למטב את GNOM שיתאים את הנתונים ואת העקומה המתקבלת P(r).
    3. ממשיכים לחדד את התאמת GNOM לשמור קבצי הפלט GNOM עם פרמטרים בכושר טוב עבור הבאים ab initio דוגמנות צעדים.
  5. לדמות SANS פרופילים של מודלים PDB ברזולוציה גבוהה באמצעות תוכנית CRYSON. 75
    1. פתח את התוכנית, בחר באפשרות '0'. בחר את שם הקובץ PDB הדפדפן קובץ מוקפץ. הקש enter כדי לקבל את הגדרות ברירת המחדל, למעט ציון הרשת deuteration שברים ומספרים את חלק D2O בהממס כדי להשיג את הפרמטרים ניגודיות נאותה.
    2. מתאים למודל ערכת נתונים ניסיוני על-ידי הזנת ה-Y' ובחירה בקובץ הנתונים של הדפדפן קובץ מוקפץ. לקבל את ערכי ברירת המחדל הנותרים, ואת קבצי פלט ייכתבו תוך מיקום הקובץ PDB. הקובץ '.fit' מכיל מידע עבור הפרופיל החזוי פיזור של דגם התלת-ממד ברזולוציה גבוהה.

7. ליצור מודלים אלב Initio מ נטול נתונים.

הערה: DAMMIF76 ו DAMMIN77 בתוך חבילת התוכנות ATSAS משמש לבנייה מחדש של מודלים אטום דמה (סכרים) באמצעות תהליך מחזק מדומה מ GNOM פלט, אשר מכיל P(r) נתונים או מידע אודות ההסתברות או תדירות של מרחקים interatomic בתוך החלקיק פיזור. ניתן להפעיל תוכניות אלה במצב אצווה או בשרת האינטרנט ATSAS-Online.

  1. הפעל את אשף צורה פרימוס מלחצן 'Dammif' בכרטיסיה 'ניתוח' 'ניתוח נתונים מסוג SAS', והשתמש בחירה ידנית של פרמטרים. הקלט עבור האשף מודגם באיור12.
    1. להגדיר את הטווח Guinier של התאם (שלב 6.3.2) והמשך לשלב הבא באמצעות לחצני הניווט. הגדרת הערכים בכושר מן העלילה P(r) (שלב 6.4) והמשך לשלב הבא.
    2. לספק את הפרמטרים עבור ab initio מידול תהליך. הזינו קידומת לשמות הקבצים דגם פלט (לדוגמה, SANSEnvelope), לבחור או דוגמנות במצב 'מהיר' או 'איטי', הזן ערך עבור מספר דגמים (17 מומלצת מובהקות סטטיסטית), בחר מתוך האפשרויות הזמינות עבור חלקיקים סימטריה, anisometry, גודל זוויתי (אם ידוע). ודא התיבות נבדקים מודלים ממוצע עם DAMAVER לחדד את הדגם הסופי עם DAMMIN.
    3. ליזום את התהליך באמצעות לחצן 'בצע'. לאחר השלמת התהליך, להציג ולשמור על ספריית העבודה.
      הערה: תהליך דוגמנות טיפוסי בודד, חלבון קטנה עשויה להימשך עד מספר שעות עם מחשב אישי טיפוסי. תיקיות זמניות עד לשמירת מאוחסנים הקבצים.
  2. כיסוי ו להרכיב הסופי SANS מעטפה עם דוגמנית ברזולוציה גבוהה קשורים באמצעות SUPCOMB בתוך ATSAS. הצבת עותק של המודל PDB ברזולוציה גבוהה שתתאים למעטפה SANS ב ספריית העבודה. ביצוע SUPCOMB משורת הפקודה באמצעות שמות קבצים PDB כמו שני ארגומנטים עם מבנה תבנית ראשון ברשימה: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    הערה: הקובץ השני ברשימה, הערך ייכתב כקובץ חדש עם "ר" מצורף לשם סוף וקבלת הציון החדשות עבור superimposition על מבנה תבנית.
  3. דמיינו את ab initio דגם התוצאות תוך שימוש PyMOL (pymol.org), תוכנית צפייה 3D גרפיקה מולקולרית. איור 13 מספק סקירה של פעולות PyMOL.
    הערה: ישנן הנחיות פרסום דוגמנות מבנית של זווית קטנה פיזור נתונים מולקולות בפתרון. 78
    1. להפעיל את היישום PyMOL ופתח את קבצי .pdb המקביל 3D SANS המעטפה ואת המבנה ברזולוציה גבוהה מיושר לימין SUPCOMB להצגה.
    2. דמיינו את המעטפה SANS על ידי המייצג את המודל הזה כמו משטח. לחץ של ' לחצן מודל, בחר ' הצג: כמו: משטח '.
    3. דמיינו את המבנה המרכזי (backbone) של חלבונים ברזולוציה גבוהה על ידי המייצג את המודל הזה כמו קריקטורה. בחר של ' לחצן ליד מודל זה ובחר ' הצג: כמו: קריקטורה '. להציג את השרשרת כמו קשת בענן של N - כדי קרבוקסילי על-ידי בחירת לחצן 'C', ' על ידי שרשרת: Chainbows'.
    4. לשנות את השקיפות של ייצוג פני שטח עבור בהירות. שורת התפריטים 'הגדרה', בחר באפשרות ' שקיפות» משטח» 40% '.
    5. להפוך את הרקע לבן שאינו אטום. שורת התפריט 'תצוגה', בחר באפשרות ' רקע»' ובחר 'אטום' בטל זה והאפשרות 'לבן' כדי לסמן את צבע הרקע.
      הערה: פעולות נוספות ואת שימושים PyMOL ניתן למצוא ב- PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצעה וזמן מכשיר קרן ברור צריך להעביר את כל המידע הדרוש לוועדה סקירה כך הערכה חוקית של הניסוי המוצע יכול להתבצע. תקשורת עם תוכנית השירות NSS הוא הציע מאוד עבור משתמשים לא מנוסים. תוכנית השירות NSS יכול להעריך היתכנות ראשונית ואת מדריך הקרן כדי להדגיש היתכנות, בטיחות, ואת הפוטנציאל למדע high-השפעה. במידע הנמסר ההצעה צריכה לכלול מידע רקע ולהקשר את המשמעות של המחקר; ידע זה צפוי להיות מושגת, איך זה משפיע על ההבנה הנוכחית בתחום הקשור למדע; תיאור של עבודה, דוגמאות, שיטות, נהלים המעולים; וכן, אם רלוונטי, הפרודוקטיביות הקודם של הקבוצה במתקן, לרבות פרסומים רלוונטיים ותוצאות. משאבים שימושיים, כגון תבניות ההצעה וטיפים להכנת ההצעה, יהיו זמינות למשתמשים באמצעות הפורטל משתמש המדע ניוטרון (neutrons.ornl.gov/users).

תכנון ניסוי הוא תהליך דינמי, כי לעתים קרובות מתחילה במהלך בשלבים הראשונים של הקרן, אך עשוי לא להיות מלא הגה עד רק לפני הניסוי. עם זאת, זכור כי שינויים כלשהם תסטה באופן משמעותי תיאור ההצעה (כולל שינויים מאגר תנאים או מדגם הרכב) תאושר ע י המתקן לפני תחילת הניסוי.

פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי שיטה להביע וטיהור של חלבון ממברנלי עניין לתוך הקזאין דטרגנט בפתרון הוכח בהצלחה. במקרה זה, חלבון ממברנלי עניין הוא פרוטאז aspartyl intramembrane (חוג ידידי הפקולטה), אשר כולל פרוטוקול טיהור הוקמה, נקבע בעבר להיות מסיסים, ופעיל מאגר המכיל DDM הקזאין.

כאן, נדגים ניוטרון ניגודיות חישובים באמצעות השורשים: ניגודיות מודול עבור פתרון של חוג ידידי הפקולטה חלבון מתאימים ניגודיות מעורב DDM / d25-DDM הקזאין. האסטרטגיה המתוארים במסמך זה היה קודם לקבוע את מידת ערבוב בין צורך להשיג התאמה מהניגודים של מיצלה חומרי ניקוי שני. התוצאה הסופית היתה כדי לקבוע את הניגוד היחסי של כל רכיב ואת הרקע (H2O/D2O יחס) צורך חדות-התאמה של הפיזור של חומר ניקוי על מנת לצפות רק חלבון הפיזור.

איור 1 מדגים קלט נכונה עבור המודול מולק ניגודיות, הפלט המתקבל לחישובי ניגודיות של קבוצה ראש דטרגנט DDM, זנב כמו subunits 1 ו- 2, בהתאמה. הנוסחה המשמשת עבור הקבוצה בראש הוא C12H14X7או11 עם נפח של 348 Å3והנוסחה הזנב של שרשרת אלקיל ניתנת כמו C12H25 עם נפח של 3503.

זה לכאורה מהפלט מודול חדות כי DDM קבוצה ראש וזנב יש צפיפות אורך פיזור שונה, וכך הניגוד בין שני מרכיביה יתקיימו. עבור DDM, הקבוצות ראש יש CMP 49% D2O בזמן זנבות השרשרת אלקיל CMP ב- 2% D2O, עם CMP הממוצע שלהם המתרחשים 22% D2O. לכן, מטרת הצעד הבא יהיה לעצב מיצלה מעורבת המשלבת אלקיל שהוחלפו דאוטריום שרשראות כדי להגדיל את CMP הממוצע של זנבות דטרגנט כדי להתאים את CMP של הקבוצות בראש. בחישוב חדות היה חוזר על עצמו עבור חומר ניקוי שהוחלפו, DDM עם deuterated באופן מלא זנב (d25-DDM), אשר בדומה תוצאות לעומת זאת בין קבוצה ראש זנב. עם זאת, בניגוד לערכים של h-הזנבות, d-פלי שונה באופן משמעותי. זוכר דטרגנט תערובות ידועים כדי לייצר הקזאין היטב מעורבת בפתרון,22 ובכך תערובת של אלה h - ו d-פלי בתוך ליבת מיצלה צריך לייצר כשווה SLD הממוצע לראש הקבוצה מעטפת, מניב מיצלה עם CMP יחיד. מאז הקבוצה ראש נפוץ DDM והן d25-DDM, האסטרטגיה היא למצוא תערובת של חומרי ניקוי אלה מייצרת ערך הניגודיות הממוצע של זנבות מעורב התואמת את הניגוד בין הקבוצות ראש.

הממוצע היעד CMP עבור זנבות דטרגנט הוא זה של קבוצות ראש maltoside או 49% D2O. כדי להעריך את היחס של ערבוב של CMP הממוצע של כל רכיב h-פלי ו d-פלי חייב להיות ידוע. אלה הערכים עבור כמה חומרי ניקוי נפוצים, זמין מסחרית דאוטריום מתויג עמיתיהם הינם מסופקים בכל טבלה 1. באמצעות ערכים אלה CMP עבור DDM d25-DDM, השבר השומה של h-פלי, d-פלי המקיים את המשוואה סיפקה בשלב 2.2 הוא χd-פלי = 0.43.

איור 2 מדגים קלט מתקדמים יותר במודול מולק ניגוד זה יכול לשמש כדי לאשר את התנאים התאמה ניגודיות מיצלה מעורב הסופי ולקבוע את מידת deuteration הכרחי על החלבון. . הנה, יחידת משנה 1 מתייחס חדות-מתאימים מיצלה מעורבת עם 2 רכיבים, DDM d25-DDM, בעוד יחידת משנה 2 מתייחס מ marisnigri JR1 intramembrane aspartyl פרוטאז (MmIAP) ניתנה על ידי רצף חומצות אמיניות שלו. הגיע עד את SLD של החלבון על ידי ביטוי בתקשורת צמיחה deuterated להניב תשואה של CMP עבור החלבון של מאגר המכיל ~ 92% D2O. מידת ההפרדה בין נקודת הכרעה של החלבון ב- 92% D2O התנאי מדידה (48.5% D2O) מציע שאת האות פיזור מספיק לזכייה של החלבון.

הייצור של d-MmIAP בוצע עם רוזטה 2 e. coli תאים מחסה וקטור pET22b-MmIAP. בינונית מזערי עם גליצרול ללא תווית ב- 90% D2O נבחר בתור מדיום הגידול. לאחר הסתגלות למדיום מינימלי 90% D2O, האחסון התרבות היה קנה המידה עד 400 מ"ל, נהגה לחסן L 3.6 מינימלית-בינוני טריים של 90% D2O, מגרגרי ביוריאקטור 5.5 L.

איור 3 מספק מעקב של הערכים תהליך במהלך הטיפוח האכיל-אצווה. בזמנו של חיסון, שנקבעה מראש טמפרטורת היה 30 מעלות צלזיוס, נקודת ערכת חמצן מומס (DO) היתה 100%, נקודת קבע עצבנות היתה 200 סל ד, קצב הזרימה של אוויר דחוס היה 4 L/min. ה-pH נערך מעל נקודה ערכה של 6.9 באמצעות w/v 10% הפתרון של נתרן הידרוקסידי ב- 90% D2O. פעם אחת עושים בדקר אותת דלדול של גליצרול הראשונית 5 g/L, האכלה (30% w/v גליצרול, 0.2% MgSO,4 , ב 90% D2O) היה יזם, אשר נמשך אל תוך הטיפוח. לאחר כ- 7 שעות של האכלה, הטמפרטורה תרבות צומצם עד 18 ° C, איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside נוספה ריכוז סופי של 1 מ מ. על לקצור את התרבות, כ 145 g משקל רטוב של הדבק תא נאסף באמצעות צנטריפוגה (6,000 x g למשך 45 דקות)

טיהור של d-MmIAP המשיך באשר האנזים protonated חוץ מזה אנזים התשואה היה נמוך באופן משמעותי, טוהר הסופי היה נמוך במקצת טיפוסי. מ- 5 L, ~ 20 g של ממברנות רטוב היה מבודד, אשר היה solubilized ב DDM לטיהור, מועמסים על Ni2 + זיקה העמודה הראשונה. כדי למקסם את התשואה טיהור, השבר זרימה דרך היה מדולל והפעל מחדש ני2 + זיקה בעמודה. ההליך היה חוזר על עצמו פעם שלישית לפני ליטוש מדגם d-MmIAP מרוכז על ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (איור 4).

איור 5 מתאר תא הדגימה קוורץ וההתקנה המחליף שלו קשורים לדוגמה. לדוגמה בסביבות מנוהלות על ידי הצלת חיים-SANS צוות התפעול של תוכנית השירות NSS. ניתן לארגן מגוון רחב של סביבות שונות כדי לבצע מדידות עם בקרת טמפרטורה, בקרת לחות, ליטוש מכני, טמפרטורה גבוהה של לחץ ממושך, בין היתר.

איור 6 מדגים ביו-SANS תפעול וביצוע של הטבלה אוטומטי סורק. הסריקה טבלה מוגדר להיות אינטואיטיבית וידידותית. בכרטיסיה הראשונה (טען דוגמאות), המידע מסופק על מחלף לדוגמה, התקנה, כגון זיהוי של דגימות במיקום כל מדגם מחליף, עוביים תא, וכן סוג הדגימה (קרן פתוחה, דוגמאות, רקע, וכו '). תגיות מטא-נתונים נוספים ניתן להחיל כאן גם. בכרטיסיה הבאה (תוכנית הניסוי), תצורת המכשיר ובפרמטרים משויכים (כגון בקרת טמפרטורה) מוגדרים. שלב זה מסודר על פי תוכנית השירות NSS בתחילת הניסוי. המשתמש חייב פשוט קלט את זמני המדידה עבור כל דגימה (בשניות). הכרטיסיה הסופי (לבצע סריקות) מספקת סיכום של נתוני הסריקה הטבלה ומאפשרת את הסריקה האוטומטית להורג.

לאחר התמונות פיזור 2D נרשמות, נתונים אלה צריך להיות מופחת כדי מגרש 1 י של עוצמת לעומת Q - פונקציה של זווית פיזור. במהלך הפחתה בנתונים, מוחלים גם תיקוני תמונה כגון פיקסל רגישות מסכות וגריעות רקע כהה. תוכנה MantidPlot תוכנן כדי לפרש את הביוגרפיה raw-נטול כלי נתונים. תוכנית השירות NSS יסייעו באופן כללי צמצום ואני אחזור הנתונים הסופי בסוף הניסוי.

איור 7 מספק סקירה של הגישה אשכול ניתוח מרוחק כדי MantidPlot את חלון ה-Script המשמש להפחתת נתונים. הנתונים הגולמיים נגישים-האשכול ניתוח מרחוק (analysis.sns.gov) באמצעות אימות משתמש UCAMS/XCAMS. לאחר הכניסה לתוך שולחן העבודה המרוחק, ניתן להפעיל את התוכנה MantidPlot מתוך חלון מסוף על ידי הפעלת פשוט 'MantidPlot' תחת כל נתיב. לפתוח את חלון ה-Script ב- MantidPlot ולערוך את התסריט הפחתה של המשתמש כפי שיורה את תוכנית השירות NSS. הפעלת קובץ script זה יפיק את קבצי הנתונים מופחת, אשר אז יועבר למחשב המקומי עבור ניתוח באמצעות FTP המאובטח.

איור 8 מדגים התוויית והצגת הנתונים לאחר ביצוע את נתוני המשתמש הפחתת Script. מופחת יופיעו בחלון סביבות עבודה. כברירת מחדל, הנתונים הממוזגים הסופי יהיה את _f סיומת מצורף. לחץ לחיצה ימנית יאפשר להתוות ספקטרום עם שגיאות שייבחר, נתונים להתוויה. העדפות תצוגה מתבצעת על ידי בחירת העדפות שורת התפריט 'תצוגה'. העיצוב של צירים, התוויית טווח הינו נגיש בקלות על-ידי לחיצה כפולה על הצירים. פיזור פרופילים של מאגרים, אשר מכילים אין פיזור חלקיקי של גודל משמעותיים אמור להופיע כקו שטוחה יחסית (בעוצמה קבועה). לקבלת דוגמאות, עוצמת להתייחס בזוויות פיזור נמוך (Q) עם דעיכה מעריכית לרקע שטוח לא ברורים.

איור 9 מספק מבט כולל על מאגר ראוי חיסור באמצעות חבילת התוכנה ניתוח נתונים SAS (או primusqt) בעקבות הפחתה בנתונים. לעתים קרובות רקע לא ברורים (עוצמת ב high-Q) היא מעט לא תואמת בין מדגם לבין מאגר. עבור חיסור מתאים, לנתונים באזור זה כדאי חופפים. סולם התיקון חל גורם קנה המידה בעוצמה על הנתונים שתוצאתה נתונים חופפים, החיסור יכול להתבצע. אם הגורם סולם תוצאות מאגר נקודות נתונים בעוצמה גדולה יותר מאשר נקודות מתאימות במדגם, נקודות אלה יהיה שלילי ומעובד לא מגרש יומן. אם ערכים שליליים בקובץ המופחת-מאגר שופע, לגרום לירידה משנית ב גורם קנה המידה של מאגר ולבצע חיסור שוב.

איור 10 מספק דוגמה שימושים של פרימוס Guinier, מרחק הפצה אשפים. ניתוח Guinier מספק הערכה ראשונית של הרדיוס חלקיקים עומדים מתוך נתוני הפיזור המתאים. נתונים מתקרבות לאפס, אזור ליניארי צריך להיות נוכח הנתונים. ההתאמה של קו באזור זה מאפשר Rg כדי להיות נחוש בדעתך מן המדרון ו0 להיות אומדן של החיתוך העוצמה ב- Q = 0. המגמה הנתונים Q מתקרב אפס מציין צבירת במדגם, בעוד מגמות כלפי מטה מעידים בדרך כלל על interparticle repulsions. מגמות אלה ניכרים ביותר כאשר חלוקת תמלוגים שאינם סטוכסטיים. הגבול העליון של Guinier מתאים החלקיקים הכדוריים מוגבלת על ידי Q * Rg < 1.3 ('s' משמש במקום Q בתוכנת ATSAS).

Rg נחוש d-MmIAP מ Guinier ראוי היה 15.4 ± 1.1 Å עם שכ אני0 כטווחי 0.580 ± 0.001.

אשף הפצה המרחק מאפשר שיטתית שינויים בפרמטרים של P(r) מתאים. העקומה P(r) הוא התמרת פורייה עקיף של העקומה מתאימה המידע מהניסוי. לכן, זה חיוני כדי לוודא התאמת בחלונית השמאלית משקף באופן מדויק את נתוני הניסוי. להתאמה המוצגים בדוגמה זו, Dmax 46 Å הושג.

איור 11 מתארת שגיאות נפוצות בבחירה Dmax. Dmax כי היא וגבוהים לעיתים קרובות גורמת P(r) ערכים להיות שליליים כמו הפונקציה P(r) מתנדנד על ציר ה-x. Dmax באופן מלאכותי קטן מוביל לעקומה P(r) קטום עם מעבר פתאומי כדי Rmax = 0.

הצעדים הראשונים של אשף צורה פרימוס זהים Guinier ומכשפים הפצה למרחק. ברגע מידע זה סופק להשיג טוב מתאים לנתונים ניסיוני, הגדרת דגם ab initio מוגדר.

איור 12 מדגים קלט נכונה עבור אשף צורה פרימוס. כאן, ניסיוני SANS נתונים עבור חוג ידידי הפקולטה סופק עם קנה מידה באנגסטרום ולאחר ניתנה הקידומת קובץ הצפוי של "SANSEnvelope". ערכה של מודלים אטום דמה הראשוני 17 התבקשו להיווצר באמצעות שימוש במצב "מהיר" מודל עם אין סימטריה (P1) חלה, אין anisometry שנבחר. קבוצת מודלים 17 להיות מיושרים, בממוצע, מסונן עם DAMAVER, המודל הממוצע מעודן באמצעות DAMMIN. בדיקה של קידומת-מסמך טקסט damsel.log מספק תקציר של קריטריון הבחירה ומודלים כלשהם שנמחקו מסידרת. המודל מעודן הסופי נכתב בשם SANSEnvelope-1.pdb.

התוכנית SUPCOMB משמש לביצוע של superimposition של המעטפה SANS מודל במודל ברזולוציה גבוהה, עם רק שתי PDB מבנה הקבצים כקלט. כברירת מחדל, "r" מצורף לשם הקובץ reoriented, גבי.

פעם SANS המעטפה ומבנה ברזולוציה גבוהה יש כבר נקודות המגע המוצגים, מודלים אלה ניתן לאבחן באמצעות כל הגרפיקה מולקולרית תוכנית הצגת. התוצאות של PyMOL מתאימים עבור תמונות באיכות פרסום והוא יכול לשמש כדי להדגיש תוצאות הביו-פיסיקלי הקשור החקירה מבנית. . הנה, נדגים כמה פעולות בסיסיות PyMOL להשתמש כדי לספק ייצוגים תלת-ממד ונופים של המבנים-גבי וכתוצאה מכך...

איור 13 מספק סקירה של תהליך הדמיית PyMOL. ברגע קובצי המבנה PDB נפתחו ב- PyMOL, הדוגמניות אמור להיות גלויים בחלון הצופה PyMOL. לשנות את הייצוגים של כל מודל שימוש של ' לחצן לצד כל שם קובץ. השתמש ייצוג פני שטח עבור המעטפה SANS וייצוג קריקטורה של עמוד השדרה חלבון מהמודל ברזולוציה גבוהה. בחר ערכת צבעים מתאימים מתוך האפשרויות הזמינות תחת לחצן 'C'. שרשראות חלבון, צביעה "chainbow" מספק צבע מדורג מ- N - כדי קרבוקסילי לסייע פרשנות. שקיפות מוחל על ייצוג פני שטח כדי לאפשר כדי שתראי טוב יותר של מבנה חלבונים בתוך המעטפה. פרסום תמונות, מומלץ רקע לבן. ברגע תורים ויזואליזציה אלה הוחלו, המבנים 3D יכול להיבדק. ניתן לבצע מניפולציות של פרספקטיבה, מולקולה הסיבוב/התרגום על ידי לחיצה וגרירה של המבנה.

Figure 1
איור 1. השימוש של המודול מולק ניגודיות לקביעת חדות פרמטרים עבור רכיבים של dodecyl maltoside (DDM). ערכי קלט מוצגים על המסך בצד השמאל עם הפלט לאחר מכן ימינה. ניגודיות מודול קלט הדף מתבצעת על ידי לחיצה על 'ניגוד' (עיגול ירוק) בתפריט הניווט בצד שמאל של כל מסך. אזורי קלט כותרת פרוייקט, מאגר הרכיבים של subunits 1 ו-2 הם מתויג ככזה. פלט עמודים מכילים מידע חשוב חלקיקים ומאפייני ניגודיות של המערכת המתוארת. יש כבר סגורים נקודות משחק מחושב וטבלאות הרלוונטיות כתום על בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. השימוש של המודול מולק ניגודיות לקבוע פרמטרים הניגודיות עבור רכיבים של המתחם אבקת חלבון ממברנה. במקרה זה, ניתנה קלט כדי לתאר את המערכת PDC בפתרון במאגר. יחידת משנה 1 מתאר מתאימים את לעומת זאת מעורב מורכב DDM עם 43% לפי השומה כמו d25-DDM מיצלה. יחידת משנה 2 מתאר את חלבון ממברנלי, עם רצף חומצות אמיניות לקלט MmIAP לנוסחה. רמת deuteration (עיגול ירוק) מתאר של החלבון בדרגת ההחלפה דאוטריום, יש השפעה ישירה על SLD ועל התאמה-נקודת מחושב זה להיות המשוער החלבון. תוצאות (קופסה כתומה) מצביעים על ההתאמה-הנקודה עבור הנוזל מעורב תתרחש ב- 48.5% D2O, בעת התרחשותה במגרשי של החלבון הטניס-~ 90% D2O. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. הכנת הדוגמא – ביוריאקטור מעקב. הערכים תהליך המוצגים הינם בטמפרטורה שנקבעה מראש (קו כתום), חמצן מומס (DO) שנקבעה מראש (קו כחול), עצבנות שנקבעה מראש (הקו האדום), קצב זרימת אוויר דחוס (קו ורוד). משאבה 1 (קו ירוק) שימש לשליטה pH. הדקר לעשות בשעה אותת דלדול גליצרול intial, שימש ליזום האכלה של גליצרול פתרון באמצעות משאבה 2 (קו שחור). ציר ה-x מסמל שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. לטעום הכנה – אפיון FPLC ושל מרחביות-דף של המדגם. Chromatogram אי-הכללה של הגודל הסופי עבור d- MmIAP equilibrated עם 20 מ מ HEPES, pH 7.5, 250 מ מ NaCl, 48.5% D2O ו- 0.05% סה כ DDM, מתוכם 44% (w/v) הוא deuterated-זנב d25-DDM. שיבוץ: ניתוח מרחביות-דף עם Coomassie מכתים. שברים במאגר מסומנים באותיות A, B, וג אזור "B" שימשה לניסוי SANS. סמן המבואר משקל מולקולרי הוא kDa. התמונה לשכפל באישור דוד זטלמן. et al. 65 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 5
איור 5. איסוף נתונים – בנג'ו קוורץ לדגום תא, תעשיה ההתקנה. (א) תא בנג'ו קוורץ ריק מוצג נח נגד הרחוב תעשיה. תאים עם דוגמת מילוי, מוכנס לתוך באחד המיקומים הזמינים 15. (B) הרחוב דגימה נטענה מאחורי בורר הצמצם (לא מוצג) בין סיליקון חלון בכניסה למיכל גלאי קרן צינור מאריך. צינורות חיבור אמבט מים מבוקרי טמפרטורה, ערוצי לאורך הרחוב דגימה מספקים לוויסות טמפרטורת-מיקומי הדגימה. החץ מצביע על הכיוון של קרן ניוטרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. איסוף נתונים – סקירה של פעולות ספייס וסריקה טבלה. פעולות הסריקה טבלה נגישים מלחצן 'סרוק טבלה' בתפריט השמאלי של התוכנה בקרת מכשיר ספייס. החצים הירוקים מציינות הכרטיסיה הפעילה בחלק העליון של המסך באזורי האור והצל תיבות תפוזים בטבלה לקלט משתמש פעיל. (א) הכרטיסיה הראשונה של הסריקה טבלה משמש כדי לספק מידע אודות מדגם מחלף ועמדות תא הדגימה. מספקים תוויות, עוביים לדוגמה וסוגי מדגם לכל תפקיד להשתמש במחליף הדגימה. סימון התיבה 'לעשות סריקה' יוסיף את השורה המתאימה תור סריקה של הטבלה. (B) בכרטיסיה השניה, פרטים אודות כלי מדידה וקביעת תצורה של הזמן עבור כל דגימה (בשניות) נרשמים. תצורות מכשיר על-ידי המדען פיזור ניוטרון וקבעו הניתנים למשתמשי בהתבסס על פרטי ההתקשרות בהצעה המכשיר וזמן קרן. ניתן להוסיף פרמטרים נוספים הפקד כלי נגינה, כגון היכולת להגדיר טמפרטורה setpoints והחזק פעמים, לאורך התור מדידה. (ג) הכרטיסיה האחרונה מספק סקירה של המדידות ייעשו עבור כל שורה בטבלה. אם אין שינויים נדרשים, הסריקה האוטומטית מאותחלת באמצעות לחיצה על לחצן 'לבצע סריקות'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7. הפחתת נתונים – סקירה של הפחתת ה-script והפעולות MantidPlot. MantidPlot התוכנה נגיש באשכול ניתוח על-ידי הקלדת "mantidplot" בשורת הפקודה מסוף-כל של active directory (עיגול צהוב על החצים נוספות לצורך הדגשה). לאחר פתיחת התוכנה, לגשת לחלון script (לחוץ על ידי כפתור מסומן בירוק) ופתח את התסריט שסופקו על-ידי המדען פיזור ניוטרון. בצע את ההוראות המופיעות בקובץ ה-script, אשר רק צריך לדרוש את המספרים סריקה לכל דגימה או מאגר כדי להזין רשימה להפחתת אוטומטיות, כמו גם לסרוק מספרים עבור התא ריק עבור חיסור, קרן ריק עבור שידור, קרן מרכז נחישות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8. ניתוח נתונים – Plotting של נתונים באמצעות MantidPlot. נתונים מוזכרים בתור 'מרחבי עבודה' ב- MantidPlot. האזור סביבת יאוכלסו עם שמות קבצים מיוצר על ידי סקריפט הפחתת המשתמש. נתוני סביבת העבודה עבור ערכות הנתונים 1 י יכולים להיות מותווים על-ידי לחיצה ימנית על סביבת העבודה ובחירת "מגרש ספקטרום עם שגיאות...". ניתן להוסיף נתונים נוספים העלילה הנוכחית פשוט בגרירה ושחרור סביבות עבודה. עיצוב של מגרש חלון (כגון עבור יומן רישום החלקות) יכולה להתבצע על-ידי בחירת 'העדפות' שורת התפריטים 'תצוגה', או לחיצה כפולה על תוויות הציר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9. ניתוח נתונים – תוכנה ATSAS: פעולות בסיסיות וחיסור מאגר. היישום primusqt (ניתוח נתונים מסוג SAS) מספק הדמיה עבור חיסור רקע נכון (מאגר). קובץ המאגר יותאם עבור חיסור כך נתונים חופפים ב high-Q (כאשר הפיזור הוא שטוח כתוצאה אות הנותרים מרקע לא ברורים). כשבוחרים high-Q מגוון נתונים, פעולת מידה יחול על גורם קנה המידה קובץ הנתונים נמוכים יותר בטבלה שיוצר החפיפה באזור מוגדר. לאחר שינוי קנה מידה, ניתן להפחית את קובץ מאגר להניב לפרופיל פיזור נטו של החלקיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10. ניתוח נתונים – נחישות (מרחק חלוקה) Guinier ו- P(r). (א) אשף Guinier פרימוס משמש לביצוע ניתוח Guinier, מתן הערכה ראשונית של אני0 Rg. סוג החלקיקים ואת טווח הנתונים כדי להתאים משמשות כדי להגדיר את ההתאמה. חלקת ההתאמה ואת שאריות המתאימים מוצגים משמאל, בעוד Guinier תנאי (אני0 ו- Rg), Q * Rg גבולות, ואיכות התאמה לינארית מסופקים כפלט באזור המסומן באמצעות תיבת כתום. (B) מערך הפצה מרחק פרימוס אשף משמש לביצוע ניתוח והפצה של מרחק, מתן העקומה P(r) מגדיר את ההסתברות של מרחקים interatomic בתוך החלקיק פיזור וכולל את Dmax או מקסימום מרחק interatomic. הפרמטרים שציין את הקופסה הכתומה יכול לחקור באופן שיטתי כדי לקבוע פונקציה הפצה מרחק נכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11. תוצאות נאות מניתוח הפצה מרחק. Dmax שנבחרו כראוי צריך לייצר עקומה P(r) זה פיקס עם דעיכה הדרגתית לאפס. Dmax ערכים גדולים מדי ככל הנראה יהיה לייצר ערכים שליליים P(r) או תנודות ליד ציר ה-x-ערכים גבוהים של ערכים Dmax רבי אשר באופן מלאכותי קטן לעיתים קרובות לגרום עקומות P(r) שבו הגבול העליון מופיע קטום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12. מידול – Ab initio ההתקנה מודל באמצעות אשף צורה פרימוס. Ab initio דוגמנות פרמטרים ניתנים בחלון קלט יחיד. קידומת מסופק עבור שמות קובץ פלט עם אפשרויות אחרות עבור עיבוד זמין. חישול ההליך יכול להיות מהיר (חרוזים גדול עם קירור מהיר יותר) או איטי (קטן יותר חרוזים עם קירור איטי יותר). מספר החזרות צריך להיות בגודל מתאים לבחון הפארמצבטית של התכונות של מודל. חלקיק סימטריה, anisometry יכולים לספק, אם ידוע. גודל זוויתי צריכה להתאים את היחידות של הנתונים נמדדו. DAMAVER בממוצע ליישר, ממוצע של כל הדגמים אטום דמה, ולאחר מכן החל קריטריון הבחירה אשר אינו כולל דוגמניות חריג חשוד טעות. גרעין של אטומים קבוע מהמודל בממוצע יהיה יותר מעודן באמצעות DAMMIN, אם אפשרות זו נבחרה. מודל מעודן זה אמור לייצג את המעטפה תלת-ממד ברזולוציה נמוכה של הניסוי SANS פרופיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 13
איור 13. ויזואליזציה SANS ניסיוני המעטפה ואת כיסוי במודל ברזולוציה גבוהה באמצעות PyMOL. לאחר פתיחת את קובצי המבנה PDB ב PyMOL, מודלים מופיעים במציג ה-PyMOL. פעיל מודלים מפורטים בטבלה מימין, יחד עם לחצני פעולה אשר יכול לשמש כדי לבצע את המודל של הייצוג שלו. פעולות בסיסיות ניתנים גם להמחיש מודלים אלה המאפשרים אזורים של מבנה ההסכם (או אי התאמה) בין המעטפה SANS וברזולוציה להיות מזוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1. תכונות פיזיקליות של דטרגנטים נפוץ בחקירות חלבון ממברנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החוקרים בביולוגיה מבנית לנצל משלימים טכניקות מבניים כמו פתרון פיזור להשיג פרטים הביוכימי ומבניים (כגון הכולל גודל וצורה) של מולקולות בפתרון. SANS הוא טכניקה אטרקטיביים במיוחד לצורך קביעת מבנים ברזולוציה נמוכה של קרום חלבונים, מוקד הליבה של ביולוגיה מבנית מודרנית וביוכימיה. SANS דורשת כמויות חלבונים מטוהרים דומות לאלה של ניסויים לחקר הגבישים (מ ג 1/דוגמה). הזמינות המסחרית לאחרונה מתרחבת של טוהר גבוהה דטרגנטים deuterated הרלוונטיים ללימודים חלבון ממברנה הופך נגיש אמצעי לתמרן הזה המימן/דאוטריום תוכן עבור SANS ניסויים של מכלולי אבקת חלבון ממברנה המאפשר לאות חלבון שיירשמו ישירות. כאשר הוא מוצלח, ab initio דגם מולקולרית מעטפה יכול להיות מחושב מנתונים שנאספו במשך רק כמה שעות. לפיכך, כימאים חלבון הממברנה, biophysicists וביולוגים מבניים יכולים בקלות לנצל SANS להשיג הנחשק דגמי תלת-ממד הראשונית של קרום חלבונים בתמיסה, מבנים במתחם עם האיגוד שותפים או מצעים, מודלים להשיג מאת SANS יכול לשמש עבור בהדרגה עקיפה נתונים. שימוש שגרתי SANS לאפיין קרום חלבונים להיות טרנספורמטיבי עבור השדה ביוכימיה של חלבונים ממברנה ויש תוצאות הלואי מפונקציה המבנה הבסיסי גילוי תרופות ופיתוח. יתרון נוסף של ניגודיות ניוטרון תואמים עם החלפת דאוטריום הופך SANS טכניקה יקר ללמוד חלבון, חלבון-DNA או קומפלקסים למערכות ביולוגיות אחרות, אשר ניתן לטפל בקלות בתוכן מימן/דאוטריום שלהם.

לקבלת פרטים נוספים אודות זווית קטנה פיזור כלי עיצוב ותיאוריה, מומלץ הביקורות הבאות: הצלת חיים-SANS מכשיר במעבדה גבוהה השטף איזוטופ הכור של אלון רכס הלאומית, פיזור79 זווית קטנה עבור ביולוגיה מבנית – הרחבת החזית האלקטרונית תוך הימנעות את החסרונות,72 וזווית קטנה מחקרים פיזור של מקרומולקולות ביולוגיות בפתרון. 80 המדען פיזור נויטרון יכול גם לדון הנוכחי כלי תצורות פרמטרים אופטימליים עבור מערכת נתונה. למשל, נתונים-Q נמוך (שהוא פונקציה של הגל ניוטרון תיווזמ פיזור) רצוי בדרך כלל עבור מערכות גדולות יותר. התצורה כלי הנגינה הנפוצה ביותר-ביו-SANS מספק Qמינימום של 0.003-1 ומתאים לכל מתחמי חלבון גדול עד מאות kDa. פתרון המכיל ~ 3 מ ג מ ל-1 של חלבון ממברנלי גודל משוער 30 kDa (מונומר) במתאימים ניגודיות הקזאין ב- 48.5% D2O בפתרון דורש זמן מדידה טיפוסית בסביבות 8 שעות כל אחד לדוגמה, מאגר של תא ריק (24 שעות = סה כ 1 יום). כלי מדידה פעמים בכל מצב נתון ניגודיות וניתן לשנותם כ בהתאם למוצר של מסה מולקולרית של החלקיק פיזור ריכוז. עם זאת, פיזור חלקיקי חייב להימדד בתנאים שאינם אינטראקציה, לרבות כל מצבור חלבונים שאינם ספציפיים, אשר מציב גבול עליון מעשית על הריכוז של המדגם. מדידות להעברתו המקום מגבלות על יציבותו של חלבונים מסוימים. למרבה המזל, SANS מדידות יכול להיעשות באופן שגרתי בטמפרטורות בקירור כדי לשפר את זמן החיים של חלבון, קרן מועסקים של נייטרונים אנרגיה נמוכה אינו גורם כל נזק הקרינה במהלך המדידה.

סקירה כללית של תהליך זה ונחישות של גורמים מרכזיים רבים לקראת ההקלטה מוצלחת פיזור ניוטרון מתוך מדגם נמדד בנקודת התאמה ניגודיות של הנוזל מוצגים בכתב היד. זה כולל השלב הקריטי לקראת קבלת התאמה מלאה של הנוזל צבירה על-ידי עיצוב תערובת דטרגנט עם ניגודיות ניוטרון אחיד בין קבוצה ראש דטרגנט אלקיל שרשרת רכיבים. מדידות בנקודה זו-התאמה דטרגנט יחיד לספק פרופיל פיזור לייחס רק חלבון ממברנלי עניין מותר ab initio מעטפה המייצג את חלבון ממברנלי מחדש של הנתונים. ניתוח נתונים של ab initio מידול פרוטוקולים גם מדגימים את המידע הפוטנציאלי המתקבל חקירות, אשר יכול להתייחס המבנה הכללי, שינויים הסתגלותי, מדינות oligomeric, בין היתר. מגבלה אחת היא כי עד כה רק מאוד דטרגנטים כמה זמינים מסחרית עם דאוטריום החלפות. 19

בעוד perdeuteration לא יהיה נחוץ, המטרה במקרה זה צריך להיות כדי להשיג חלבון עם > 65% דאוטריום תיוג של החלבון. לחלופין, אם סבון עם באופן סלקטיבי-deuterated קבוצות ראש וזנבות זמין, CMP של מיצלה דטרגנט מתרחשת בסמוך 100% D2O ואז חדות מספקת של החלבון יכולה להיות מושגת ללא צורך דאוטריום תיוג. לקבוע את רמת deuteration המתאים של החלבון כדי להשיג פיזור מספיק כאשר נמדד בנקודת חדות-התאמה של הנוזל. ישנם אתגרים רבים הקשורים ביטוי חלבון ממברנה-טיהור,81 שנותרו מעבר להיקף של מאמר זה. למרבה הצער, רמות גבוהות של deuteration נמצאים כרגע (עדיין) אפשרי עבור מערכות האיקריוטים. אמנם, אנו מבינים שזאת מגבלה על כמה חלבונים האיקריוטים רוב חלבוני ממברנה יש חיידקי orthologs עבורו, שיטה זו מתאימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים וולקר ס עירוני, סאי ונקאטש Pingali, קווין ל' וייס, ראיין ג אוליבר כשהשרירים מכווצים דרך UT-Battelle עם אותנו DOE כדי לתמוך את תוכנית משתמש המדע ניוטרון וביו -נטול כלי-אוק רידג המעבדה הלאומית להשתמש במאמר זה.

כתב יד זה יש כבר במשותף על ידי UT-Battelle, LLC, תחת חוזה דה-AC05-00OR22725 עם לנו מחלקת האנרגיה (DOE). ממשלת ארה ב שומר ובהיותו המו ל, על-ידי קבלת המאמר לפרסום, כי ממשלת ארצות הברית שומרת על רישיון בלעדיות, הספקות, לעצמם, ברחבי העולם כדי לפרסם או לשחזר את הטופס שפורסם של כתב יד זה, או לאפשר אחרים לעשות כן, למטרות ממשלת ארה ב. DOE תספק גישה ציבורית אלה תוצאות של מחקר ממומן פדרלי על פי תוכנית גישה ציבורית של DOE. 82

Acknowledgments

המשרד של ביולוגי, המחקר הסביבתי נתמכת מחקר במרכז של ORNL ביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB), ביו-SANS באמצעות מתקני נתמך על ידי מדעי משתמש מתקני החלוקה, Office Basic אנרגיה למדעים, מחלקת אותנו של אנרגיה. עבודה מבניים על קרום חלבונים במעבדה ליברמן בתמיכתם NIH (DK091357, GM095638), ה-NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Tags

ביוכימיה בעיה 140 פיזור זווית קטנה פיזור ניוטרון ביופיזיקה חלבון ממברנלי ניגודיות וריאציה חומרים פעילי שטח מיצלה פרוטאז aspartyl intramembrane presenilin אות פפטיד peptidase
התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים <em>Initio אלב</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss,… More

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter