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Biochemistry

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/57901
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Summary

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Abstract

Das biologische Small-Angle Neutron Streuung Instrument in der High-Flux-Isotope Reaktor des Oak Ridge National Laboratory ist widmet sich der Erforschung der biologischen Materialien, Biokraftstoff, die Verarbeitung und Bioinspirierte Materialien für Nanometer Mikrometer Längenskalen. Für die Untersuchung der physikalischer Eigenschaften (z.B. Größe und Form) von Membranproteinen hier vorgestellten Methoden (hier, MmIAP, eine Intramembrane Aspartyl-Protease aus Methanoculleus Marisnigri) in Lösungen von Micelle bildenden Reinigungsmittel sind gut geeignet für dieses kleine Winkel Neutronen-Streuung Instrument, unter anderem. Ndere biophysikalische Charakterisierung sind durch ihre Unfähigkeit, die Waschmittel Beiträge in einer komplexen Struktur von Protein-Reinigungsmittel Adresse behindert. Darüber hinaus bietet Zugriff auf die Bio-Deuterierung Labor einzigartige Fähigkeiten für die Vorbereitung der großflächige Anbau und Deuterium-markierten Proteine für verbesserte streusignal aus dem Protein zum Ausdruck zu bringen. Während diese Technik bietet keine strukturelle Details in hoher Auflösung, die strukturelle Wissenslücke für Membranproteine enthält viele adressierbare Bereiche der Forschung ohne in der Nähe von atomarer Auflösung. Beispielsweise enthalten diese Bereiche Bestimmung der Oligomere Staaten, Komplexbildung, Konformationsänderungen bei Störung und Faltung/Entfaltung Ereignisse. Diese Untersuchungen können leicht durch Anwendungen dieser Methode erreicht werden.

Introduction

Membranproteine sind um schätzungsweise 30 % aller Gene1 codiert und repräsentieren eine deutliche Mehrheit der Ziele für die modernen Arzneimitteln. 2 diese Proteine führen eine Vielzahl von lebenswichtigen Zellfunktionen,3 aber trotz ihrer Fülle und ihrer Bedeutung – nur etwa 1 % der gesamten Strukturen hinterlegt in der Forschung Collaboratory für strukturelle Bioinformatik (RCSB) Protein darstellen Daten Bank. 4 aufgrund ihrer teilweise hydrophoben Natur, Strukturaufklärung von Proteinen, Membrane-springen überaus schwierig wurde. 5 , 6 , 7

Wie viele biophysikalische Techniken Monodisperse Partikel in Lösung für die Messung erforderlich, wurde Membranproteine von native Membranen zu isolieren und stabilisiert diese Proteine in eine lösliche Mimik der native Membranen ein aktives Gebiet der Forschung in den letzten Jahren Jahrzehnten. 8 , 9 , 10 diese Untersuchungen zur Entwicklung der vielen neuartigen AMPHIPHILE Baugruppen führten zu solubilisieren Membranproteine, wie Nanodiscs,11,12,13 Bicelles14,15 und Amphipols. 16 , 17 bleibt jedoch die Verwendung von Reinigungsmittel Micellen einer der am weitesten verbreitete und einfache Ansätze für die Erfüllung der Anforderungen der Löslichkeit eines gegebenen Proteins. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 leider gibt es kein einziges Reinigungsmittel oder magische Mischung von Reinigungsmitteln derzeit, die alle Membranproteine gerecht wird; Diese Bedingungen müssen daher empirisch für die individuellen Anforderungen jedes Protein kontrolliert werden. 26 , 27

Reinigungsmittel selbst-zusammenbauen in Lösung über ihre kritischen Micelle Konzentration zu aggregieren Strukturen Mizellen genannt. Mizellen bestehen aus vielen Waschmittel Monomere (in der Regel im Bereich von 20-200) mit hydrophoben Alkyl-Ketten bilden eine Micelle Kern- und hydrophilen Kopfgruppen angeordnet in einem Micelle Shell Layer mit Blick auf das wässrige Lösungsmittel. Das Verhalten von Waschmitteln und Micelle Bildung wurde von Charles Tanford in Der hydrophobe Effekt,28 und Größen klassisch beschrieben und Formen von Micellen aus häufig verwendeten Reinigungsmittel in Membran-Protein-Studien wurden mit kleinen Winkel Streuung charakterisiert. 29 , 30 Waschmittel Organisation über Membranproteine wurde ebenfalls untersucht, und die Bildung von Protein-Reinigungsmittel-komplexen (PDCs) dürfte mit Waschmittel Moleküle, die rund um das Protein in einer Anordnung, die das ordentliche Waschmittel ähnelt Mizellen. 31

Eine hinzugefügte Vorteil bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist, dass die resultierenden Micelle Eigenschaften bearbeitet werden können, durch die Integration von anderen Waschmitteln. Viele Waschmittel weisen ideale mischen, und wählen Sie Eigenschaften von gemischten Micellen können sogar vorhergesagt werden, von den Komponenten und Verhältnis zu mischen. 22 jedoch kann das Vorhandensein von Waschmittel noch für biophysikalische Charakterisierungen Herausforderungen beitragen, das gesamte Signal. Signal von Waschmittel in der PDC ist beispielsweise mit Röntgen- und Lichtstreuung Techniken, praktisch nicht von Protein. 32 Untersuchungen mit einzelnen Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verlassen in der Regel auf eingeschlossene Partikel (gefroren); strukturelle Details des Proteins sind noch verdeckt durch bestimmte Reinigungsmittel oder eine hohe Konzentration des Reinigungsmittels, der Hintergrund verleiht. 33 alternative Ansätze zur Interpretation der vollen PDC-Struktur (inklusive Waschmittel) durch Berechnungsmethoden wurden unternommen, die darauf abzielen, das Waschmittel um einen bestimmten Membranprotein zu rekonstruieren. 34

Für den Fall der Neutronenstreuung produziert die Kern-Schale-Anordnung der Reinigungsmittel in der Micelle einen Formfaktor die beobachtete Streuung beiträgt. Glücklicherweise können Lösungskomponenten geändert werden, so dass sie nicht zu den net beobachtete Streuung beitragen. Dabei "Kontrast passend" erfolgt durch Substitution von Deuterium für Wasserstoff, eine Streuung Länge Dichte zu erreichen, die den Hintergrund (Puffer) übereinstimmt. Eine vernünftige Auswahl an Reinigungsmittel (mit verfügbaren deuterierte Gegenstücke) und ihr Verhältnis zu mischen müssen berücksichtigt werden. Für Waschmittel Micellen kann diese Substitution mit einem Waschmittel mit der gleichen Kopf Gruppe aber eine deuterierte Alkyl Kette (d-Tail statt h-Tail) durchgeführt werden. Da das Waschmittel gut gemischt sind,35 ihrer Aggregate haben eine Streuung Länge Dichte, die Mole-Fraktion gewichtete Durchschnitt der beiden Komponenten (h-Schwänzen und d-Tails). Wenn diese durchschnittliche Kontrast mit derjenigen der Kopfgruppe konsistent ist, können einheitlichen aggregierten Strukturen voll abgestimmt werden, um alle Beiträge zu beobachtete Streuung zu entfernen.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um das Neutron Kontrast von Waschmittel Micellen zu manipulieren, durch den Einbau von chemisch identisch Waschmittel Moleküle mit Deuterium-Label Alkyl-Ketten. 19 , 36 , 37 das komplette Simultankontrast Anpassung der Micelle Kern und Schale, die eine einzigartige Fähigkeit der Neutronenstreuung ist erlaubt. 35 , 38 mit dieser deutlich verfeinert Detailebene, passender Kontrast aktivieren kann sonst nicht machbar Studien von Membran-Protein-Strukturen. Darüber hinaus könnte dieser Kontrast-matching-Ansatz auf andere Systeme mit Waschmittel wie Polymer Austausch Reaktionen39 und Öl-Wasser-Dispergiermittel,40 oder sogar andere solubilizing Mittel, wie Bicelles,41 ausgeweitet werden Nanodiscs,42 oder Block-Copolymere. 43 A ähnlicher Ansatz wie in dieser Handschrift, aber mit einer einzigen Waschmittel Spezies mit teilweise Deuterium Substitutionen auf die Alkylgruppe Kette und/oder Kopf wurde vor kurzem veröffentlicht. 37 während dies erwartet werden kann, um die zufällige Verteilung von Wasserstoff und Deuterium in das Waschmittel zu verbessern im Vergleich zu der hier vorgestellte Ansatz der begrenzten Anzahl der verfügbaren Positionen auf das Waschmittel für Substitution und in zwei Schritten Waschmittel Synthese benötigt zusätzliche Herausforderungen für die Prüfung.

Schritte 1 und 2 des Protokolls unten oft überschneiden sich da erstes Experiment Planung erfolgen muss, um eine Qualität Vorschlag zu unterbreiten. Antragstellung gilt jedoch hier als der erste Schritt zu betonen, dass dieser Prozess im Vorfeld ein Neutron-Experiment gestartet werden soll. Anzumerken ist, dass ein erforderlicher Schritt, der durch den Vorschlag nachgewiesen werden sollte, ist, biochemischen und physikalischen Charakterisierung (einschließlich Reinheit und Stabilität) der Probe die Notwendigkeit Neutron Untersuchungen zu unterstützen. Eine allgemeine Diskussion über kleine Winkel Neutronen-Streuung (SANS) sprengt den Rahmen dieses Artikels. Eine kurze, aber gründliche Einführung gibt es in der Referenzarbeit, die Charakterisierung der Materialien von Kaufmann,44 und eine umfassende Lehrbuch konzentrierte sich auf biologische kleine Winkel Lösung Streuung vor kurzem veröffentlicht worden. 45 weitere Buchempfehlungen ist im Abschnitt Diskussion gegeben. Kleine Winkel Streuung verwendet die so genannten Streuung Vektor Q als zentrale Menge, die die Streuung Prozess beschreibt. Dieser Artikel verwendet die allgemein akzeptierte Definition Q = 4π Sünde (θ) / λ, wo θ halbe Winkel zwischen eingehenden und verstreuten Strahl und λ ist ist die Wellenlänge der Neutronenstrahlung in Angström. Andere Definitionen existieren, verwenden Sie verschiedene wie z. Symbole b. die "für die Streuung Vektor, und dass durch einen Faktor 2π oder mithilfe von Nanometern anstelle von Angstrom abweichen kann (siehe auch Diskussion der Abbildung 10).

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Protocol

1. vorbereiten und ein Neutron Facility Strahlzeit und Instrument Vorschlag einreichen

  1. Finden Sie Online-Ressourcen zur Identifizierung von Neutronen-Streuung Einrichtungen, die allgemeine Neutron Lichtstrahl Zeit Benutzerzugriff, wie Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Eine Karte der Neutron-Einrichtungen und Informationen über Neutronenforschung weltweit ist online verfügbar. Beachten Sie 46 , dass diese Einrichtungen in der Regel regelmäßige Aufforderungen zur Einreichung von Vorschlägen haben; Dadurch wird bestimmt, wann die nächste Strahlzeit verfügbar sein wird. Neutronen sind für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Suchen Sie nach kleinen Winkel Neutron Streuung (SANS) Instrumente, insbesondere solche mit Funktionen für biologische Proben.
  2. Mithilfe von Neutron Einrichtungen bereitgestellten Mittel Neutron Lichtstrahl Zeit Vorschlag Vorlage Prozess zu navigieren. Wenden Sie sich an mit einem Neutron Streuung Wissenschaftler (NSS), die das Instrument zugeordnet ist, für die Sie gelten werden. Aktuelle Informationen der Neutron-Anlage zu Vorschlag Anrufe, Termine und Hinweise für die Einreichung zu überprüfen; für Oak Ridge ist dies online verfügbar. Vorlegen Sie 47 die Strahl-Zeit-Vorschlag nach allen Richtlinien für eine erfolgreiche Einreichung.
  3. Wenn deuterierte Protein erforderlich (siehe 2.2) ist, werden Neutron Scattering Einrichtungen oft von Labors und Kompetenz widmet sich der Herstellung von deuterierte Materialien unterstützt. Um Zugang zum Bio-Deuterierung Lab (BDL) im ORNL anzufordern, wählen Sie die BDL als das zweite Instrument im Vorschlag System. Während der SANS-Vorschlag auf Machbarkeit und von einem wissenschaftlichen Ausschuss überprüft wird, werden BDL Anfragen nur auf Machbarkeit überprüft. Hilfe für den BDL Machbarkeit Beitrag einreichen einer ausgefüllten Informationen Anfrage Form48 , die das Protein Ausdruck Protokoll und geschätzten Ertrag beschreibt (vorhanden online).
  4. Bestätigen Sie nach erfolgreicher Begutachtung des vorgeschlagenen Zeit Strahl die ausgezeichnete Strahlzeit im Voraus über das Experiment. Stellen Sie sicher, dass alle Muster und Puffer Daten und Formeln in den Vorschlag für die ordnungsgemäße Überprüfung korrekt aufgeführt sind. Änderungen an der vorgeschlagenen Versuchsplan, einschließlich Änderungen in der Probe und Puffer Zusammensetzung erfordern Benachrichtigung der Anlage.
    Hinweis: Änderungen sollten so bald wie möglich mit der zugewiesenen NSS besprochen werden.

2. bestimmen Sie Neutron Kontrast Matchbälle und nötigen Kontrast für Protein-Messung

  1. Informieren Sie sich (von Lieferanten Produktinformationen, Online-Datenbanken, veröffentlichten Werte, etc.) im Zusammenhang mit atomaren Kompositionen und Volumina für die Waschmittel Systemkomponenten Kontrast angepasst werden. Diese Informationen wird verwendet, um Neutronen-Streuung Länge dichten (SLDs) zu bestimmen und somit Kontrast Matchbälle (CMPs) in Lösung, die entscheidend für die Qualität SANS Daten und strukturelle Informationen für das Membranprotein von Interesse im Zusammenhang mit einer PDC. Eine Tabelle fasst die physikalischen Eigenschaften und Kontrast Matchbälle für Reinigungsmittel, die üblicherweise bei biophysikalischen Studien von Membranproteinen ist enthalten (Tabelle 1).
  2. Neutron SLDs verwenden die Webanwendung MULCh zu bestimmen: Module für die Analyse der Kontrast Variation Daten49 (verfügbare Online-50 free-of-Charge). Ein Link zu der Bedienungsanleitung befindet sich auf der Startseite. Zugriff auf die Website und lesen Sie die zugehörige Dokumentation. Abbildung 1 und Abbildung 2 geben einen Überblick über Kontrast-Modul ein- und Ausgang für zwei verwandte Beispiele.
    Hinweis: Andere Websites für die Berechnung von SLDs sind verfügbar, wie die durch das National Institute of Standards and Technology (NIST) Center für Neutronenforschung beibehalten. 51
    1. Öffnen Sie das Kontrast-Modul, indem Sie auf "Kontrast" befindet sich im linken Navigationsbereich. Geben Sie Text für einen Projekttitel und geben Sie weiter unten für zwei Komponenten (z. B. Waschmittel Kopfgruppe und Tail) als "Untereinheit 1' und ' Untereinheit 2'.
    2. Geben Sie die Summenformel für jede Komponente im Feld "Formel".
      Hinweis: das Optionsfeld bin "eine molekulare Formel geben unter"Art des Stoffes"ausgewählt werden muss. Darüber hinaus mithilfe der Buchstaben 'X' in der Formel leicht austauschbaren Wasserstoffatome an. Protein, RNA oder DNA-Sequenzen können eingegeben werden, wenn die entsprechenden 'P', 'R', oder hatte "Optionsfelder ausgewählt. Wenn mehrere Kopien einer Komponente innerhalb der Untereinheit vorhanden sind, kann der Wert für "Nmolecules" entsprechend geändert werden. Hier ein praktisches Beispiel bezieht sich auf Lipid-wie Reinigungsmittel, enthält zwei identische Schwänzen, so dass die Formel für eine Rute mit Nmolecules gleich 2 eingegeben werden.
    3. Geben Sie das Volumen in Kubikmeter Angström für jede Komponente in das Feld unter "Lautstärke (Å3)". Verwenden Sie Tanfords Formel28 für Alkyl-Ketten der Länge n, V-Tail = 27,4 + n * 26,9, ungefähre Heck Volumen berechnen, oder Molekulare Bände von Produktinformationen erhalten zur Verfügung gestellt oder Werte in veröffentlicht der Literatur.
    4. Geben Sie Details für Puffer-Komponenten. Ändern Sie die "Anzahl aufgelöst Arten in dem Lösungsmittel" mit dem Dropdown-Menü hinzufügen oder Entfernen von Zeilen für jede Komponente Puffer. Im Falle der Micelle bilden Reinigungsmittel, beinhalten die kostenlose Waschmittel Monomere als separaten Puffer Komponenten in das Waschmittel critical Micelle Konzentration (CMC).
    5. Klicken Sie auf "Absenden" um das Neutron Kontrast Berechnungen durchführen und eine Ergebnisseite, die Streuung Länge Dichte und Kontrast Matchbälle sowie Formeln zur Ermittlung dieser Parameter bei jedem bestimmten Prozentsatz der D2O in eine Tabelle zu erzeugen der Puffer. Überprüfen Sie die Streuung Parameter mit besonderem Augenmerk auf die Komponente CMPs. Wenn die Matchbälle ähneln (innerhalb 10 % D2O) und die kostenlose Micelle Konzentration ist niedrig, die durchschnittliche CMP kann verwendet für den Kontrast-Abgleich der Waschmittel Beiträge. In den meisten Fällen wird die CMP Waschmittel Kopfgruppe und Schwanz unterscheiden sich um mehr als 10-15 %, produzieren einen Kern-Schale-Formfaktor in den SANS-Daten die direkte Erhebung der streusignal aus dem Protein allein verschleiert.
  3. Bewerten Sie den Kontrast zwischen Waschmittel Kopfgruppe und Tail. Wenn das Waschmittel Kopf Gruppe und Alkyl Kette Heck CMPs sind nicht gut aufeinander abgestimmt, können die Verfügbarkeit und die Einbindung eines Waschmittels Deuterium ersetzt erlauben Streuung Länge dichten von ausgewählten Komponenten manipuliert zu werden. In den meisten Fällen erfordert dies eine gemischte Micelle durch den Einbau einer identischen Waschmittel mit Deuterium ersetzt Alkyl-Ketten bilden. Die Zugabe von Deuterium wirft die Streuung Länge Dichte des Kerns durch den Alkyl Kette Schwänzen gebildet. Der gewünschte Endpunkt ist in diesem Fall so, dass die Kopfgruppe Schale CMP und Alkyl Kette Kern CMP annähernd gleiche Werte haben.
    1. Heben Sie die CMP Waschmittel Micelle Kern zu ungefähr gleich der CMP der Kopfgruppe Schale durch die Bestimmung des geeigneten Verhältnis der Vermischung zwischen h-Schwänzen und d-Tails, die Abgleich mit den Kopfgruppen Gegensatz erzielt. Voraussetzung für diese Bestimmung ist die Kenntnis des CMP für eine Deuterium ersetzt Alkyl Kette Tail. Kommerziell erhältliche Pendant zum n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) steht mit allen Alkyl Kette Wasserstoff durch Deuterium (d25-DDM) ersetzt. Wiederholen Sie die Kontrast-Berechnungen gemäß Schritt 2.1 für eine hatte-Tail "anstelle von"h-Tail".
    2. Berechnen Sie das Maulwurf Verhältnis von h-Tail, d-Heck für den Kontrast-Abgleich mit der Kopfgruppe CMP erforderlich. Die folgende Formel kann mit dieser Entschlossenheit unterstützen:
      CMPKopf = CMPh-Tail * χh-Tail + CMPd-Heck * χd-Tail
      wo ist CMP die Streuung Länge Dichte und χ der Volumenanteil der Waschmittel Kopf, h-Tail oder d-Tail-Komponente. Für gepufferte Lösungen der DDM produziert Einbau von 44 GHT (43 % von Mole) das total Waschmittel als d25-DDM mit Deuterium ersetzt Alkyl-Ketten einen einzigen CMP in 48,5 % D2O für Kopf und Schweif Komponenten.
  4. Prüfen Sie den Grad der Deuterium-Ersatz für das Membranprotein. Um ausreichende streusignal aus dem Protein zu messen, sollte der CMP für das Protein mindestens 15 % D2O in Lösung abseits des Waschmittels CMP und Messbedingungen. Das Signal steigt mit dem Quadrat der % Unterschied. Da die CMP eine unbeschriftete Protein tritt in der Regel mit ~ 42 % D2O in Lösung (CMP ähnlich viele Waschmittel Kopfgruppen), ist Deuterium Kennzeichnung des Proteins fast immer eine Notwendigkeit. 52

(3) zum Ausdruck bringen und Reinigen der Membranprotein des Interesses

  1. LB (Lysogeny Brühe) Medium vorzubereiten und wachsen Escherichia coli (E. Coli) Zellen beherbergen einen induzierbaren Expressionsvektor für die Zielsequenz Protein.
    1. Minimale Medien vorbereiten. H2O oder D2O, auflösen 7,0 g/L (NH4)2SO4, 5,25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L Diammonium Wasserstoff Citrat, 5,0 g/L Glycerin, 1,0 mL/L von 20 % w/V MgSO 4·7H2O und 1,0 mL/L der Holme Spurenmetalle (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O und 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Bereiten Sie geeignete Antibiotika Stammlösungen mit H2O oder D2O.
    3. Bereiten Sie eine Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside-Stammlösung mit H2O oder D2O.
    4. Steril-Filter alle Lösungen in trockenen, sterilen Behälter mittels Vakuum Flaschenverschluss und Spritze Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikron.
  2. Anzupassen Sie E. Coli Zellen zu Deuterium-Label mittlere vor der Skalierung für Überexpression eines deuterierte Proteins.
    1. 3 mL LB-Medium mit einer isolierten Kolonie von einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte oder Zellen aus einem gefrorenen Glycerin bestand zu impfen. Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C in einem schütteln Inkubator bei 250 u/min oder reduzieren Sie die Temperatur auf 30 ° C oder darunter um Überwucherung der Kultur bei Inkubation über Nacht zu vermeiden.
      Hinweis: Das Verfahren der Anpassung kann variiert werden. 55 , 56 , 57
    2. Sobald die LB-Kultur zu einer optischen Dichte bei 600 gewachsen nm (OD600) von ~ 1, verdünnen Sie es 01:20 in 3 mL H2O minimaler Medium und wachsen zu einem OD-600 ~ 1. Wiederholen Sie die 01:20 Verdünnungen mit minimaler Medium, 50, 75 und 100 % D2O (oder bis zu dem gewünschten Prozentsatz der D-2O) enthalten.
      Hinweis: als die D-2O-Gehalt erhöht, Wachstumsraten sinkt. Die Beziehung zwischen der D2O Prozentsatz in der Wachstum Medien und Deuterium-Substitution im Protein wurde in der Literatur berichtet. 58 , 59 , 60
    3. Weiter wachsen die Kultur in einem Bioreaktor, erhöhen die Ausbeute an deuterierte Zellmasse (Abbildung 3).
      Hinweis: Schrittweise Anweisungen für den Betrieb der Bioreaktor wurden an anderer Stelle überprüft. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Ernte und lösen Sie E. Coli Zellen für Membran-Extraktion und Protein-Reinigung
    1. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei ~ 6.000 x g für ca. 30-45 min bei 4 ° C.
    2. Erweichen Sie die Zelle Pellet durch Einweichen in Puffer für ~ 30 min auf Eis. Dann sanft Aufschwemmen der Zelle Pellet in Puffer durch sanft Pipettieren mit einer serologischen pipettieren oder sanftes Schaukeln auf einem 2D Rocker, um eine Endkonzentration von ~ 1 g Nasszelle Masse/10 mL Puffer.
      Hinweis: ein Beispiel-Puffer ist 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure), pH 7,5, 200 mM NaCl ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Tablet.
    3. Lösen Sie die resuspendierte Zellen mit drei Durchläufe durch einen Hochdruck-Homogenisator bei 10.000 Psi beim Kühlen des Abfluss.
      Hinweis: Je nach der erforderlichen Größenordnung möglicherweise andere Lyse Methoden verwendet (z. B. durch die französische Presse oder Beschallung).
    4. Pellet-zellenrückstand durch Zentrifugation bei ~ 4.000-5.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der Überstand geklärt ist.
    5. Ultrazentrifuge (~ 150.000 x g für 30-45 min) der Überstand aus dem vorherigen Schritt, enthält die löslichen und Membran Brüche. Das Pellet nach Ultrazentrifugation enthält die Membran-Fraktion.
    6. Aufschwemmen Sie Membran-Pellets in einem großen Dounce-Homogenisator und isolieren Sie die Membran Bruchteil wieder durch Ultrazentrifugation (Schritt 3.3.5). Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens einmal um lose gebundenen Proteine zu entfernen.
    7. Solubilisieren Sie Membranen durch sanftes Schaukeln für ~ 30 min bei 4 ° C in einem Puffer mit Waschmittel für die Reinigung geeignet. Solubilisierung ergibt sich, wenn die Aussetzung von bewölkt nach transparent wechselt. Unlöslichen Material durch Ultrazentrifugation (~ 150.000 x g für 30-45 min) entfernen.
      Hinweis: Ein Beispiel-Puffer ist 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol und 4 % (w/V) DDM für die Reinigung von Ni2 + Affinitätschromatographie.
  4. Reinigen Sie das Protein nach einem Protokoll zuvor für protonierten Formen entwickelt.
    Hinweis: Naing Et Al. für ein Beispiel-Reinigung-Protokoll für einen Hexahistidine getaggt M. Marisnigri JR1 Intramembrane Aspartyl Protease (d-MmIAP) zu sehen. 65 die letzte Ausbeute war ~ 1 mg deuterierter aus 5 L deuterierter Zellwachstum Kultur, die diente in der SANS-Experiment (Abbildung 4).
  5. Tauschen Sie gereinigte Protein in den "letzten Exchange Puffer" nach passenden Kontrast.
    1. Bereiten Sie 200 mL "Endgültige Austausch Puffer", enthält die richtige Mischung für Kontrast Anpassung, z. B.20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl und 0,05 % insgesamt DDM (0,028 % DDM und 0,022 % d25-DDM) in 49 % D2O.
    2. Ausschluss einer Spalte "Größe", mit Equilibrate > 2 Spalte Volumen (CV) des "Letzten Exchange Puffer" in 3.5.1 mit einem schnellen Protein Liquid Chromatography (FPLC) System.
    3. Führen Sie nach der Injektion der Probenmaterials die Spalte und isolieren Sie Fraktionen entsprechend das Protein des Interesses zu.
    4. Das Protein auf die gewünschte Endkonzentration (2-5 mg/mL) zu konzentrieren.
      Hinweis: Ein Volumen von ca. 300 μL ist erforderlich, um ein 1 mm zylindrische Quarz Küvette für SANS verwendet füllen.
    5. Reservieren Sie ein Aliquot der übereinstimmenden Puffer für SANS Hintergrundabzug.
      Hinweis: Die aliquoten kann direkt aus dem vorbereiteten Puffer, oder im Idealfall von einem sauberen Elution Bruchteil am Ende des Laufs FPLC eingenommen werden.

4. nehmen Sie Letzte Vorbereitungen für die Strahlzeit und sammeln SANS Daten

  1. Nachdem der Vorschlag angenommen wurde und Zugriff auf die Website genehmigt wurde, füllen Sie alle erforderlichen Schulungen im Vorfeld zugewiesene Strahlzeit. Dazu gehören Prearrival, Web-basiertes training sowie vor-Ort-radiologische, Labor und Instrument-spezifische Ausbildung.
    Hinweis: Schulungsanforderungen kann voraus Ankunft zum ersten Mal Nutzer vorschreiben. Weitere Informationen sind online verfügbar. 66
  2. Laden Sie Proben und Puffer für die Datenerfassung.
    Hinweis: Einen Überblick über die biologischen kleine Winkel Neutronenstreuung (Bio-SANS) Instrument Probe Umweltbereich ist in Abbildung 5dargestellt.
    1. Laden Sie Proben und Puffer in Quarz-Zellen. Quarz-Zellen zur Verfügung aus dem Instrument Wissenschaftler oder Anlage. Verwenden Sie Gel-laden-Tipps, um die schmale Öffnung der meisten Sample-Zellen zuzugreifen.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Strahl Verschluss geschlossen ist, dann nähern Umgebung Aufnahmebereichs und legen Sie die Quarz-Zellen in den Probenwechsler. Probe-Wechsler Stellung für jede probenzelle aufnehmen.
    3. Überprüfen Sie den Bereich und sicherzustellen Sie, dass der Strahlengang ist frei von Verstopfung, dann verlassen Sie Bereich Beispiel Umwelt und öffnen Sie den Strahl-Verschluss zu.
      Hinweis: Sorgfältig folgen Sie alle Anlage Vorschriften und Regeln zu, gehorchen Sie alle Buchungen und beherzigen Sie die Ratschläge des Wissenschaftlers Instrument. Proben können nicht entfernt aus dem Strahl und manipuliert nach Exposition gegenüber den Lichtstrahl ohne folgende besondere Vorsichtsmaßnahmen. Mit einer radiologischen Kontrolle Techniker (RCT) vor diesen Verfahren zu konsultieren.
  3. Table-Scan für die automatisierte Datenerfassung ausführen
    1. Betreiben Sie das Gerät durch benutzerdefinierte Steuerelement LabVIEW basierende Software, Spektrometer Instrument Control Environment (Gewürz). Befolgen Sie die Anweisungen für die Bedienung des Geräts von der Neutron Scattering Wissenschaftler zur Verfügung gestellt. Ein Überblick über die Tabelle Scan Betrieb Fenster ist in Abbildung 6zur Verfügung gestellt.
    2. Nach Eingabe der Informationen in den entsprechenden Bereichen erforderlich, die Tabellenscan ausführen und eine automatisierte Datenerfassung beginnt. Überwachung der Fortschritte über den Reiter "Table Scan-Status".

(5) reduzieren Sie SANS Daten von 2D-Bild auf 1D Grundstück

  1. Jede Probe und Puffer Datendatei aus den aufgezeichneten Scan Zahlen zu identifizieren. Jede Messung wird eine einzigartige Scan-Nummer zugeteilt. Diese Informationen sind hilfreich bei Datenreduktion, jede entsprechende Probe und Puffer-paar zu identifizieren.
  2. Verwenden Sie MantidPlot Software und Python-Skript für Reduktion
    1. Neutron Scattering Benutzer sind mit Kontodaten Zugriff auf ihre Daten auf dem Remote-Analyse-Cluster zur Verfügung gestellt. 67 melden Sie sich bei der Remote-Analyse-Cluster und "MantidPlot" von der Befehlszeile aus ausführen. Abbildung 7 und Abbildung 8 zur Verfügung gestellt, um diese Schritte zu unterstützen.
    2. Erhalten Sie eine Benutzer-Reduktion-Skript aus dem Neutron Scattering Wissenschaftler (Dies geschieht in der Regel während des Experiments); Dieses Skript ist Python-basiert und enthält die notwendige Kalibrierung und Skalierung Anpassungen an das Bild 2D Streuung in einem 1D Grundstück von verstreuten Intensitäten als Funktion der Streuwinkel, I(Q) zu reduzieren.
    3. Öffnen Sie das bereitgestellte Benutzer Reduktion Skript in MantidPlot und platzieren Sie die entsprechenden Scan-Nummern oder die Kennung für die Probe und Puffer-Paare in der entsprechenden Liste.
    4. Führen Sie das Skript zum reduzierte Daten als vier-Säulen-Text-Datei zu generieren (die Reihenfolge der Spalten ist Q, I(Q), I(Q) Fehler "," Q-Fehler) in der angegebenen Position. Den entsprechenden Arbeitsbereich in MantidPlot einen Rechtsklick und wählen Sie "Plot mit Fehlern..." für eine erste Prüfung der Streuung Profile.

6. analysieren Sie Daten für Strukturparameter von Streuung Partikel

  1. Übertragen Sie die reduzierten Daten-Datei aus dem Analysis-Server auf einem lokalen Computer mit secure FTP-File-Transfer. Dies kann mit dem Einsatz von Software wie z.B. FileZilla oder CyberDuck durchgeführt werden. Zusätzliche Anleitungen und Informationen für den Anschluss an die Analyse-Server-Datei-System sind auf der analysis.sns.gov-Login-Seite zur Verfügung gestellt.
  2. Laden Sie die ATSAS Software Suite65,68 (ganze ATSAS Suite). 69 einzelne Programme70 sind auch online verfügbar für SANS Datenanalyse, nämlich Strukturparameter und ab-initio -Modelle bestimmen.
    Hinweis: Viele Optionen sind verfügbar für SANS Datenanalyse von biomakromoleküle. 45
  3. PRIMUS71 für Daten zu Plotten, Puffern Sie Skalierung und Subtraktion und Guinier Analyse zu.
    1. Starten Sie den ATSAS "SAS-Daten-Analyse" Anwendung und Belastung der reduzierten Daten Dateien entsprechend der Probe / Puffer-Paar.
      1. Um den Puffer richtig zu skalieren, wählen Sie einen Datenbereich bei hoher Q (Q > 0,5 Å-1) wo beide Profile sind ähnlich und flach, und klicken Sie auf "Skalierung" befindet sich unter "Vorgänge" Registerkarte. Ein Skalierungsfaktor wird in den Puffer angewendet werden, so dass diese zwei flachen Regionen überlappen sollten. Vorsicht: sollte eine plausible physikalische Ursache, die Skalierung der Puffer Intensität entsprechend die Probe rechtfertigt. Wenn die Abweichung groß ist, finden Sie einen Instrument Wissenschaftler gültigen Ansätze zur Hintergrundabzug. 44 , 45 , 72
      2. Erhöhen Sie den Datenbereich um alle Punkte zu sehen. Klicken Sie auf "Subtrahieren", um diesen Vorgang durchzuführen. Die Puffer subtrahiert Datendatei in der Legende einen Rechtsklick und speichern Sie diese Datei für die spätere Analyse. Abbildung 9 zeigt die Verwendung der Registerkarte "Operations".
    2. Führen Sie eine Guinier Analyse der Puffer subtrahiert Beispieldaten verwenden der Registerkarte "Analyse" des Programms "SAS-Daten-Analyse".
      1. Achten Sie darauf, dass die entsprechende Datei in der Liste ausgewählt ist und klicken Sie auf "Radius of Gyration". Automatisierte wurde versucht, eine Guinier passen auszuführen erhalten Sie durch Anklicken des Buttons "Autorg".
      2. Ausbau des Angebots an Daten umfassen alle Low-Q-Daten und beginnen, Verengung des Datenbereichs durch High-Q Punkte wegnehmen, bis die Qmax * Rg Grenze liegt unter 1.3. Verwenden Sie die Handlung der Residuen um zu überprüfen, ob Daten im Bereich von Fit linear sind. Die Guinier passen ergibt eine ungefähre Rg und I0 für die streuenden Partikeln.
      3. Kleine Anpassungen an der Fit Region und überwachen die Empfindlichkeit dieser Werte auf den Bereich der Daten in der Passform. Abbildung 10A veranschaulicht die Verwendung des Werkzeugs "Radius of Gyration".
  4. Erhalten Sie die Wahrscheinlichkeit Verteilungsfunktion (P(r)) in GNOM. 73 die Ausgabedatei erzeugt hier wird als Eingabe für die ab-initio Modellierungsprozess verwendet werden.
    1. Start der Entfernung Verteilungskonfigurations-Assistenten innerhalb der "Analyse" tab. erhalten eine gute Anpassung an die Daten ist wichtig, ein hochwertiges Modell zu erhalten. Weitere Informationen über Erhalt genau passt entnehmen Sie bitte den Beitrag74 von Putnam, Et al.
      Hinweis: der GNOM-Programm bietet zusätzliche Informationen über die Passung jenseits der Ferne Verteilungskonfigurations-Assistenten. Abbildung 10 zeigt korrekte Verwendung des Werkzeugs "Abstand Verteilung" und Abbildung 11 zeigt einige der auftretenden Fehler aufgetreten.
    2. Bestimmen Sie Dmax, der maximale interatomare Abstand innerhalb des Moleküls.
      1. Einen Wert für Dmax zu schätzen, indem Sie deaktivieren das Kontrollkästchen erzwingen Rmax = 0 und einen großen Wert für Dmax eingeben (150 Å, zum Beispiel). Der erste X-Schnittpunkt in der Handlung des P(r) ergibt diese Schätzung.
      2. Änderungen Sie inkrementelle an dieser Dmax Wert und der Datenbereich verwendet oder die Anzahl der Punkte in der Passform zur Optimierung der GNOM passen zu den Daten und der daraus resultierenden P(r) Kurve verwendet.
    3. Weiter verfeinern die GNOM-Passform und speichern die GNOM-Ausgabedateien mit guter Parameter für nachfolgende ab-initio Modellierung Schritte.
  5. SANS-Profile von hochauflösenden PDB-Modellen mit Hilfe des Programms CRYSON simulieren. 75
    1. Öffnen Sie das Programm und wählen Sie die Option "0". Wählen Sie den Namen der PDB-Datei im Datei-Browser Popup. Drücken Sie die Eingabetaste um die Standardeinstellungen, mit Ausnahme der Angabe Kette Deuterierung Brüche und der Anteil der D2O in dem Lösungsmittel zu den richtigen Kontrast-Parameter übernehmen.
    2. Passen Sie das Modell auf experimentellen Daten durch Eingabe von "Y" und Auswahl der Datendatei im Datei-Browser Popup. Übernehmen Sie die übrigen Standardwerte und Output-Dateien werden in den Speicherort der PDB-Datei geschrieben werden. Die '.fit'-Datei enthält Informationen für das vorhergesagte Streuung Profil aus dem hochauflösenden 3D Modell.

7. Erstellen Sie Ab-Initio -Modelle aus der SANS Daten.

Hinweis: DAMMIF76 und77 in der ATSAS-Software-Suite DAMMIN wird verwendet, um dummy Atom-Modelle (Dämmen) mit einem simulierten glühprozess aus dem GNOM ausgegeben, enthält P(r) Daten oder Informationen über die Wahrscheinlichkeit zu rekonstruieren oder Häufigkeit der interatomare Entfernungen innerhalb des Partikels Streuung. Diese Programme können im Batch-Modus oder auf dem ATSAS-online-Web-Server ausgeführt werden.

  1. Starten Sie den PRIMUS-Form-Assistenten von der 'Dammif'-Taste auf der Registerkarte "Analyse" des "SAS-Daten-Analyse", und verwenden Sie eine manuelle Auswahl der Parameter. Die Eingabe für den Assistenten ist in Abbildung 12dargestellt.
    1. Definieren Sie die Guinier reichen von der Passform (Schritt 6.3.2) und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, die mithilfe der Navigationsschaltflächen. Definieren Sie Fit-Werte aus dem P(r) Plot (Schritt 6.4) und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    2. Geben Sie Parameter für die ab-initio Modellierungsprozess. Geben Sie einen Präfix für die Modell-Ausgabe-Dateinamen (z. B. SANSEnvelope), wählen Sie entweder "schnell" oder "langsam" Modus-Modellierung, geben Sie einen Wert für die Anzahl der Modelle (17 empfohlen für statistische Signifikanz), wählen Sie aus den verfügbaren Optionen für Partikel Symmetrie, Anisometry und eckige Skala (falls bekannt). Stellen Sie sicher, dass die Boxen, um durchschnittliche Modelle mit DAMAVER überprüft werden und verfeinern das endgültige Modell mit DAMMIN.
    3. Starten Sie den Prozess mithilfe der Schaltfläche "Commit". Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, zeigen Sie an und speichern Sie das Arbeitsverzeichnis.
      Hinweis: die typischen Modellierungsprozess für ein einzelnes kleines Protein kann bis zu ein paar Stunden mit einem typischen PC dauern. Die Dateien werden in temporären Verzeichnissen bis gespeichert.
  2. Overlay und überlagern das Finale SANS Umschlag mit einem zugehörigen hochauflösenden Modell mit SUPCOMB im ATSAS. Legen Sie eine Kopie des Modells hochauflösende PDB SANS Umschlag im Arbeitsverzeichnis fit zu sein. SUPCOMB von der Befehlszeile aus ausführen mit der PDB-Dateinamen als zwei Argumente mit der Template-Struktur zuerst aufgeführt: $ Supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Hinweis: Der zweite Dateiname aufgeführt wird als eine neue Datei mit einem "R" zu Ende und mit neuen Koordinaten für die Überlagerung auf die Template-Struktur angehängt umgeschrieben werden.
  3. Visualisieren Sie die ab-initio Modellergebnisse mit PyMOL (pymol.org), eine molekulare 3D-Grafik anzeigen Programm. Abbildung 13 gibt einen Überblick über die PyMOL-Operationen.
    Hinweis: Es gibt Publikation Richtlinien für strukturelle Modellierung von kleinen Winkel Streuung von Biomolekülen in Lösung. 78
    1. Starten Sie die Anwendung von PyMOL und öffnen Sie die PDB-Dateien entsprechend der 3D SANS Umschlag und die SUPCOMB ausgerichteten hochauflösende Struktur betrachtet werden.
    2. Visualisieren Sie den SANS Umschlag durch die Darstellung dieses Modells als Oberfläche. Klicken Sie auf die "Button neben dem Modell und wählen Sie" zeigen: als: Oberfläche ".
    3. Visualisieren Sie die hochauflösenden Proteinstruktur Rückgrat durch die Darstellung dieses Modells als eine Karikatur. Wählen Sie die "neben diesem Modell und wählen Sie" zeigen: als: Cartoon ". Anzeigen die Kette wie ein Regenbogen aus N-C Terminus durch Klicken auf die Schaltfläche 'C' und ' durch Kette: Chainbows'.
    4. Ändern Sie die Transparenz der Oberfläche Darstellung aus Gründen der Übersichtlichkeit. Über das Menü "Einstellungen", wählen Sie "Transparenz» Oberfläche» 40 %".
    5. Machen Sie den Hintergrund weiß und nicht blickdicht. Wählen Sie aus der Menüleiste 'Display', ' Hintergrund» "und wählen Sie"Undurchsichtig", deaktivieren diese Option und"Weiße"markieren Sie diese Farbe für den Hintergrund.
      Hinweis: zusätzliche Vorgänge und Anwendungen für PyMOL finden Sie unter PyMolWiki.org.

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Representative Results

Ein Strahl Zeit und Instrument Vorschlag sollte eindeutig vermitteln alle Informationen benötigt, um die Review Committee, dass eine gültige vorgeschlagene Experiment beurteilt werden können. Kommunikation mit einem NSS ist für unerfahrene Anwender dringend empfohlen. Die NSS kann erste Machbarkeit und Führer Antragstellung, Machbarkeit, Sicherheit und das Potenzial für hohe Schlagzähigkeit Wissenschaft betonen beurteilen. Die Angaben in dem Vorschlag gehören Hintergrundinformationen und Kontext für die Bedeutung der Forschung; wissen, das voraussichtlich gewonnen werden und wie dies wirkt sich auf den Stand der Erkenntnisse in das zugehörige Feld der Wissenschaft; eine Beschreibung der Arbeit, Proben, Methoden und Verfahren, die eingesetzt werden; und, falls zutreffend, frühere Produktivität des Teams in der Einrichtung, einschließlich einschlägiger Publikationen und Ergebnisse. Nützliche Ressourcen, z. B. Vorschlag Vorlagen und Tipps für die Vorbereitung des Vorschlags stehen Benutzern über das Neutron Science User Portal (neutrons.ornl.gov/users).

Experiment zu planen, ist ein dynamischer Prozess, der oft in der Anfangsphase der Antragstellung beginnt, aber nicht vollständig bis kurz vor dem Experiment gedacht werden kann. Aber denken Sie daran, dass alle Änderungen, die erheblich von der Beschreibung des Vorschlags (einschließlich Änderungen an Pufferbedingungen oder Probenzusammensetzung) abweichen von der Anlage vor Beginn des Experiments genehmigt werden müssen.

Dieses Protokoll wird davon ausgegangen, dass eine Methode für den Ausdruck und Reinigung der Membranprotein des Interesses in Waschmittel Micellen in Lösung erfolgreich nachgewiesen wurde. In diesem Fall ist die Membranprotein des Interesses eine Intramembrane Aspartyl-Protease (IAP), die eine etabliertes Reinigung Protokoll und löslich und aktiv im Puffer mit DDM Micellen zuvor festgestellt wurde.

Hier zeigen wir Neutron Kontrast Berechnungen unter Verwendung des MULCh: Kontrast-Modul für eine Lösung des IAP-Proteins in Kontrast abgestimmt gemischt DDM / d25-DDM Micellen. Die hier beschriebenen Strategie war zuerst feststellen, der Grad der Vermischung zwischen den zwei Reinigungsmittel notwendig, eine vollständige Kontrast-Übereinstimmung der Micelle zu erreichen. Das Endergebnis war zu bestimmen, den relative Kontrast der einzelnen Komponenten und den Hintergrund (H2o2O-Verhältnis) notwendig, Kontrast-die Streuung von Waschmittel Match um nur die Protein-Streuung zu beobachten.

Abbildung 1 zeigt einen richtigen Input für die MULCh-Kontrast-Modul und die resultierende Ausgabe für Kontrast Berechnungen von DDM Waschmittel Kopfgruppe und Tail als Untereinheiten 1 und 2. Die Formel für die Kopfgruppe ist C12H14X7O11 mit einem Volumen von 348 Å3und Alkyl Kette Schweif Formel ist als C12H25 mit einem Volumen von 350 Å3gegeben.

Es ergibt sich aus dem Kontrast Modulleistung, dass DDM Kopfgruppe und Tail unterschiedliche Streuung Länge dichten haben und somit Kontrast zwischen den beiden Komponenten eingehalten werden. Für DDM haben die Kopfgruppen eine CMP 49 % D2O Alkyl Kette Schwänzen eine CMP 2 % D2O, mit ihrer durchschnittlichen CMP auftretenden 22 % D2O. Daher soll das Ziel des nächsten Schrittes eine gemischte Micelle zu entwerfen, das Deuterium ersetzt Alkyl-Ketten erhöhen die durchschnittliche CMP Waschmittel Tails entsprechend der CMP den Kopfgruppen beinhaltet. Die Kontrast-Berechnung wurde wiederholt für substituierte Reinigungsmittel, DDM mit voll deuterierter Schweif (d25-DDM), resultiert in ähnlicher Weise im Gegensatz zwischen der Kopfgruppe und Schweif. Vergleichen Sie jedoch Werte von h-Tails und d-Tails unterscheiden sich deutlich. Rückruf, die Waschmittel Mischungen bekannt sind, produzieren gut gemischte Mizellen in Lösung,22 erzeugen so eine Mischung dieser h und d-Tails in der Micelle Kern eine durchschnittliche SLD in Höhe der Leiter sollte gruppieren Schale, einer Micelle mit einzelnen CMP nachgeben. Da die Kopfgruppe DDM und d25-DDM gemeinsam ist, ist die Strategie, eine Mischung aus diesen Reinigungsmitteln zu finden, die einen durchschnittliche Kontrast-Wert aus den gemischten Schwänzen produziert, die den Kontrast der Kopfgruppen entspricht.

Der Ziel-Durchschnitt CMP für Waschmittel Schwänzen ist die maltosid Kopfgruppen oder 49 % D2O. Um das Verhältnis der durchschnittlichen CMP der einzelnen h-Tail und d-Tail Komponenten mischen schätzen müssen bekannt sein. Diese Werte für einige gemeinsame Wasch- und handelsüblichen Deuterium gekennzeichnet Gegenstücke in Tabelle 1zur Verfügung gestellt werden. Mithilfe dieser CMP-Werte für DDM und d25-DDM Maulwurf h-Schwänzen und d-Tails, die erfüllt die Gleichung, die in Schritt 2.2 bereitgestellt ist χd-Tails = 0,43.

Abbildung 2 zeigt eine erweiterte Eingabe für die MULCh-Kontrast-Modul, das verwendet werden kann, bestätigen die endgültige gemischt Micelle Kontrast Spiel Bedingungen und bestimmen den Grad der Deuterierung notwendig auf das Protein. Hier bezeichnet Untereinheit 1 Kontrast abgestimmt gemischte Micelle mit 2 Komponenten, DDM und d25-DDM, während Untereinheit 2 bezieht sich auf die M. Marisnigri JR1 Intramembrane Aspartyl Protease (MmIAP) durch die Aminosäure-Sequenz gegeben. Das SLD des Proteins hat durch Ausdruck im deuterierte Wachstumsmedien CMP für das Protein in den Puffer mit ~ 92 % D2O. Ausbeute erhöht worden Der Grad der Trennung zwischen dem Protein Matchball 92 % D2O und die Messbedingung (48,5 % D2O) legt nahe, dass ausreichende streusignal aus dem Protein gewonnen wird.

Produktion von d-MmIAP erfolgte mit Rosetta 2 E. Coli Zellen beherbergen die pET22b-MmIAP-Vektor. Minimaler Medium mit unbeschrifteten Glycerin in 90 % D2O wurde als das Wachstumsmedium ausgewählt. Nach Anpassung an die 90 % D2O minimaler Medium, das kulturvolumen war bis zu 400 mL zu skaliert und verwendet, um 3,6 L frische 90 % D2O minimaler Medium in einer 5,5 L-Bioreaktors zu impfen.

Abbildung 3 stellt eine Spur der Prozesswerte während der fed Batch-Anbau. Zum Zeitpunkt der Impfung der Temperatursollwert war 30 ° C, den gelösten Sauerstoff (DO) Sollwert war 100 %, den Sollwert Agitation war 200 u/min und der Durchfluss der Druckluft war 4 L/min. Der pH-Wert wurde über einen Sollwert von 6,9 mit einer 10 % w/V Lösung von Natriumhydroxid in 90 % D2O. statt. Einmal die Spitze signalisiert, dass die Erschöpfung der ersten 5 g/L Glycerin, Fütterung (30 % w/V Glycerin, 0,2 % MgSO4 in 90 % D2O) initiiert wurde, die während des Anbaus weiter. Nach rund 7 Stunden füttern die Kultur-Temperatur wurde auf 18 ° C reduziert und Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 mM. Bei der Ernte der Kulturkreis, war ca. 145 g Frischgewicht Zelle einfügen per Zentrifugation (6.000 X g 45 min) erhoben.

Reinigung von d-MmIAP verlief für das Enzym protonierten außer dass Enzym Ausbeute deutlich niedriger war und endgültige Reinheit etwas niedriger als typisch war. Von 5 L, ~ 20 g nass Membranen isoliert war, war die solubilisiert im DDM für Reinigung und verladen der ersten Ni2 + Affinität Spalte. Um Reinigung Ertrag zu maximieren, wurde der durchströmten Anteil verdünnt und wieder erneut auf Ni2 + Affinität Spalte. Das Verfahren wurde ein drittes Mal vor dem Polieren der konzentrierten d-MmIAP-Probe von Größe Ausgrenzung Chromatographie (Abbildung 4) wiederholt.

Abbildung 5 zeigt ein Quarz-Sample-Zelle und seine verwandten Beispiel Wechsler-Setup. Beispiel-Umgebungen werden verwaltet von der Bio-SANS Betriebsteam und NSS. Eine Vielzahl unterschiedlicher Umgebungen kann arrangiert werden, zur Durchführung von Messungen mit Temperaturkontrolle, Feuchtigkeitskontrolle, mechanische Tumbling, Hochtemperatur und anhaltenden Druck, unter anderem.

Abbildung 6 zeigt Bio-SANS Operationen und Ausführung der automatisierten Tabelle scannt. Der Table-Scan ist so konfiguriert, dass intuitiv und benutzerfreundlich sein. Auf der ersten Registerkarte (Last Proben) Informationen über die Probenwechsler und Setup, wie z. B. Identifizierung von Proben an jeder Position im Probenwechsler, Zelle stärken und Probenart (offene Balken, Muster, Hintergrund, etc.). Zusätzliche Metadaten-Tags können hier auch angewendet werden. Auf der nächsten Registerkarte (Experiment planen) sind die Gerätekonfiguration und zugehörigen Parameter (z. B. Temperaturkontrolle) definiert. Dieser Schritt ist von der NSS zu Beginn des Experiments angeordnet. Der Nutzer muss lediglich die Messzeiten für jede Probe (in Sekunden) eingeben. Die letzte Registerkarte (Scans ausführen) gibt einen Überblick über die Tisch-Scan-Daten und ermöglicht den automatischen Scan ausgeführt werden soll.

Nachdem die 2D Streuung Bilder aufgenommen werden, müssen diese Daten für eine 1D Handlung der Intensität im Vergleich zu Q - eine Funktion der Streuwinkel reduziert werden. Während der Datenreduktion gelten auch Bildkorrekturen wie Pixel Empfindlichkeit Masken und dunklem Hintergrund Subtraktionen. MantidPlot-Software wurde entwickelt, um die rohe Bio interpretieren-SANS Gerätedaten. Die NSS hilft im Allgemeinen verringern und die endgültigen Daten am Ende des Experiments abrufen.

Abbildung 7 gibt einen Überblick über die Remoteanalyse Cluster Zugriff, MantidPlot und im Skriptfenster zur Datenreduktion. RAW-Daten sind gegen die Remoteanalyse Cluster (analysis.sns.gov) über UCAMS/XCAMS Benutzerauthentifizierung zugänglich. Nach dem Einloggen in den remote Desktop, kann die MantidPlot-Software über ein terminal-Fenster gestartet werden, durch Ausführen von "MantidPlot" einfach unter einem beliebigen Pfad. Öffnen Sie das Skript-Fenster in MantidPlot und bearbeiten Sie der Benutzer Reduktion Skript, auf Weisung der NSS. Ausführung dieses Skripts wird die reduzierte Daten-Dateien generieren, die dann auf einem lokalen Computer für Analyse mit sicheres FTP übertragen werden können.

Abbildung 8 zeigt, Plotten und Anzeige der Daten nach der Ausführung der Benutzer weniger Skript weniger Daten im Fenster "Arbeitsbereiche" erscheint. Standardmäßig werden endgültige zusammengeführte Daten das Suffix _f angehängt haben. Mit der rechten Maustaste ermöglicht Plot Spectrum mit Fehlern ausgewählt werden und Daten gezeichnet werden. Display-Einstellungen erfolgt durch Auswählen von Einstellungen über das Menü "Ansicht". Formatierung von Achsen und Plotten Palette ist leicht zugänglich durch Doppelklicken auf die Achsen. Streuung Profile der Puffer, die keine streuenden Partikeln von signifikanter Größe enthalten sollte als eine relativ flache Linie (konstanter Intensität) angezeigt werden. Für Proben Intensität am unteren Streuwinkel (Q) mit exponentiellen Zerfall zu einem flachen inkohärent Hintergrund zu beachten.

Abbildung 9 gibt einen Überblick über geeignete Puffer Subtraktion mit dem SAS Data Analysis (oder Primusqt) Softwarepaket nach Datenreduktion. Nicht selten ist der inkohärente Hintergrund (Intensität bei High-Q) etwas unpassenden zwischen der Probe und Puffer. Für die korrekte Subtraktion sollten Daten in dieser Region überschneiden. Skala Korrektur gilt eine Intensität Skalierungsfaktor für die Daten, die in überlappenden Daten ergibt sich, und die Subtraktion durchgeführt werden kann. Ergibt der Skalierungsfaktor Puffer Datenpunkte mit größerer Intensität als entsprechende Punkte in der Probe, werden diese Punkte negativ und in einem Log-Plot nicht gerendert werden. Wenn negative Werte in der Datei Puffer subtrahiert reichlich vorhanden sind, machen Sie eine geringfügige Verringerung in den Puffer Skalierungsfaktor und führen Sie erneut die Subtraktion.

Abbildung 10 stellt Beispiel Verwendungen der Primus Guinier und Entfernung Verteilung Assistenten. Eine Guinier-Analyse liefert eine vorläufige Schätzung des Partikel-Radius der Gyration aus den niedrigen Winkel Streuung-Daten. Wenn Daten Null nähern, sollte eine lineare Region in den Daten vorhanden sein. Einbau einer Zeile in dieser Region ermöglicht die R-g von der Piste und ein I ermittelt werden0 bis von der Intensität Schnittpunkt bei Q = 0 extrapoliert werden. Eine steigende Tendenz in den Daten zeigt wie Q gegen Null geht Aggregation in der Probe während Abwärtstrends in der Regel der Oberflächenkräfte Abstoßungen hinweisend sind. Diese Trends sind am deutlichsten zu Tage, wenn die Verteilung der Residuen nicht stochastische ist. Die Obergrenze der Guinier fit für kugelförmige Teilchen ist abhängig von Q * Rg < 1,3 ('s "anstelle von Q in der ATSAS-Software verwendet wird).

Rg bestimmt für d-MmIAP von diesem Guinier Fit 15,4 ± 1,1 Å mit einem geschätzten war ich0 als 0.580 ± 0,001 gegeben.

Die Entfernung Verteilungskonfigurations-Assistenten kann systematische Änderungen an Parametern der P(r) passen. Die P(r) Kurve ist eine indirekte Fourier-Transformation der Kurvenanpassung an die experimentellen Daten. Daher ist es wichtig zu überprüfen, ob die Passform in der linken Leiste die experimentellen Daten widerspiegelt. Für die Passform gezeigt, in diesem Beispiel eine Dmax 46 Å wurde erhalten.

Abbildung 11 zeigt häufige Fehler bei Dmax Auswahl. Eine Dmax, die oft künstlich groß ist verursacht P(r) Werte negativ werden, da die P(r) Funktion um die x-Achse oszilliert. Eine Dmax, das künstlich klein führt zu einer verkürzten P(r) Kurve mit einem abrupten Übergang zu Rmax = 0.

Die ersten Schritte in der Primus-Form-Assistent sind identisch mit den Guinier und Entfernung Verteilung Assistenten. Sobald diese Informationen bereitgestellt wurden, um gut passt zu den experimentellen Daten zu erhalten, ist die ab-initio -Modell Setup konfiguriert.

Abbildung 12 zeigt einen richtigen Input für den Primus-Form-Assistenten. Hier, experimentelle SANS Daten für das IAP wurde mit einer Skala in Angström versehen, und der erwarteten Datei-Präfix von "SANSEnvelope" erhielt. Eine Reihe von 17 erste dummy Atom-Modelle wurden aufgefordert, mit "schnell" Modellmodus mit keine Symmetrie (P1) angewendet und keine Anisometry ausgewählt erzeugt werden. Der Satz von 17 Modelle wird ausgerichtet, gemittelt und mit DAMAVER und dem durchschnittlichen Modell verfeinert mit DAMMIN gefiltert. Inspektion der Präfix-damsel.log Text-Dokument gibt einen Überblick über das Auswahlkriterium und alle Modelle aus der Gruppe gelöscht. Das endgültige verfeinerte Modell wurde als SANSEnvelope-1.pdb geschrieben.

Das Programm SUPCOMB verwendet, um eine Überlagerung von SANS Umschlag durchführen Modell mit dem hochauflösenden Modell mit nur zwei PDB Struktur Dateien als Eingabe. Standardmäßig ist "R" an den neu ausgerichtet und überlagerten Dateinamen angehängt.

Einmal die SANS Umschlag und hochauflösende Struktur überlagert worden, diese Modelle mit molekularen Grafiken anzeigen Programm visualisiert werden können. Die Ergebnisse von PyMOL eignen sich für Publikation Bildqualität und können zur biophysikalischen Ergebnisse in Bezug auf die strukturellen Untersuchung zu betonen. Hier zeigen wir ein paar Grundfunktionen PyMOL verwendet, um 3D Darstellungen und Ansichten der daraus resultierenden überlagerten Strukturen bereitzustellen.

Abbildung 13 gibt einen Überblick über die PyMOL Visualisierungsprozess. Sobald die PDB-Dateien Struktur in PyMOL geöffnet haben, sollten die Modelle im PyMOL Viewer-Fenster sichtbar sein. Ändern Sie die Darstellungen der jedes Modell mit der "Button neben jeder Dateiname. Verwenden Sie eine Oberfläche Darstellung für die SANS-Umschlag und eine Cartoon-Darstellung der das Protein Rückgrat aus dem hochauflösenden Modell. Wählen Sie eine geeignete Farbschema Optionen finden Sie unter der Taste "C". Für Proteinketten bietet eine "Chainbow" Farbgebung einen Farbverlauf aus N -, C-Terminus Auslegung unterstützen. Transparenz wird die Oberfläche Darstellung erlauben bessere Visualisierung der Protein-Struktur innerhalb des Umschlags. Für Publikation Bilder empfiehlt ein weißer Hintergrund. Sobald diese Visualisierung Warteschlangen angewendet wurden, können die 3D Strukturen untersucht werden. Manipulationen der Perspektive und Molekül Drehung/Übersetzung können durch Klicken und ziehen der Struktur durchgeführt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Nutzung des Moduls MULCh Kontrast Kontrast für Komponenten des Dodecyl maltosid (DDM) ermittelt. Input-Werte werden im Fenster auf der linken Seite mit dem späteren Ausgang auf der rechten Seite angezeigt. Die Kontrast-Modul-Eingabeseite erfolgt durch Klicken auf "Kontrast" (grüner Kreis) aus dem Navigationsmenü auf der linken Seite jedes Bildschirms. Eingabebereiche für den Titel des Projekts, Puffer Komponenten und Untereinheiten 1 und 2 sind als solche gekennzeichnet. Ausgabeseiten enthalten wichtige Informationen und Kontrast Partikeleigenschaften für das beschriebene System. Entsprechenden Tabellen und berechnete Matchbälle haben in Orange aus Gründen der Übersichtlichkeit boxed worden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Nutzung des Moduls MULCh Kontrast Kontrast für Komponenten der Membran-Protein-Reinigungsmittel-Anlage ermittelt. In diesem Fall ist Eingang gegeben worden, um das Gesamtsystem der PDC in gepufferte Lösung zu beschreiben. Untereinheit 1 beschreibt gemischt Micelle komponiert von DDM mit 43 % von Maulwurf als d25-DDM den Kontrast angepasst. Untereinheit 2 beschreibt das Membranprotein mit der Aminosäure-Sequenz für die MmIAP Eingabe als Formel. Deuterierung Ebene (grüner Kreis) beschreibt das Protein Grad der Deuterium-Substitution und hat einen direkten Einfluss auf die SLD und berechnete Matchball, die für das Protein geschätzt wird. Ergebnisse (orange Box) deuten darauf hin, dass Matchball für das gemischte Waschmittel 48,5 % D2O, auftreten wird, während das Protein Matchball bei ca. 90 % D2O. tritt Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Probenvorbereitung-Bioreaktor Spur. Der Prozesswerte angezeigt sind, Temperatur-Sollwert (orange Linie), gelösten Sauerstoff (DO) Sollwert (blaue Linie), Agitation Sollwert (rote Linie) und komprimierte Luft Durchfluss (rosa Linie). Pumpe 1 (grüne Linie) wurde für die Kontrolle des pH-Werts verwendet. Der-Spike am 18:40 signalisiert Erschöpfung der anfänglichen Glycerin und wurde zur Fütterung von Glycerin-Lösung per Pumpe 2 (schwarze Linie) zu initiieren. X-Achse bezeichnet Stunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Probenvorbereitung-FPLC und SDS-PAGE Charakterisierung der Probe. Endgröße Ausgrenzung Chromatogramm für d- MmIAP equilibriert mit 20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl, 48,5 % D2O und 0,05 % insgesamt DDM, von denen 44 % (w/V) Tail deuterierter d25-DDM ist. Einschub: SDS-PAGE-Analyse mit Coomassie-Färbung. Gepoolte Brüche sind mit der Bezeichnung A, B, und C. Region "B" wurde verwendet in der SANS-Experiment. Kommentierte Molekulargewicht Marker ist im kDa. Bild reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Naing Et al. 65 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 5
Abbildung 5. Datenerfassung – Quarz Banjo probieren Zelle und Autosampler-Setup. (A) eine leere Quarz-Banjo-Zelle zeigt gegen den Autosampler Block ruht. Zellen sind mit Probe gefüllt und in einem der 15 verfügbaren Positionen eingefügt. (B) die probenblock ist hinter einer Blende-Selektor (nicht dargestellt) zwischen dem Strahl Rohr Extender und Silizium Fenster am Eingang zum Detektor Tank montiert. Schläuche verbinden mit einem temperierten Wasserbad und Kanäle in die probenblock bieten Temperaturregelung auf die Probe stellen. Der Pfeil zeigt die Richtung des neutronenstrahls. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Datenerfassung – Überblick über SPICE Operationen und Table-Scan. Die Tabelle Scan-Vorgänge sind über die Schaltfläche "Tabelle scannen" im linken Menü die SPICE-Instrument-Steuerungs-Software. Grüne Pfeile bezeichnen die aktive Registerkarte am oberen Rand des Bildschirms und orange Felder markieren Sie Bereiche in der Tabelle für aktive Benutzer-Eingaben. (A) die erste Registerkarte der Table-Scan wird verwendet, um Informationen über die Probenwechsler und Probe Zelle Positionen. Jede Position in der Probenwechsler verwendet vorsehen Sie Etiketten, Probe dicken und Probentypen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Scannen" wird die entsprechende Zeile der Tabelle Scan Warteschlange hinzufügen. (B) auf der zweiten Registerkarte erfasst Informationen über die Instrument-Konfiguration und Messung Zeit für jede Probe (in Sekunden). Instrumentenkonfigurationen sind von dem Neutron Scattering Wissenschaftler vorkonfiguriert und Benutzern anhand der Angaben in den Strahl Zeit und Instrument-Vorschlag zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Parameter können die Gerätesteuerung, wie die Fähigkeit, Temperatur-Sollwerte zu definieren und Haltezeiten während der Messung-Warteschlange hinzugefügt werden. (C) die letzte Registerkarte bietet einen Überblick über die Messungen für jede Zeile in der Tabelle vorgenommen werden. Wenn keine Änderungen erforderlich sind, wird der automatische Scan durch Klicken auf die Schaltfläche "ausführen-Scans" initiiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7. Datenreduktion – Überblick über Reduktion Skript und MantidPlot Operationen. MantidPlot-Software ist auf dem Cluster Analyse zugänglich durch Eingabe von "Mantidplot" in einer terminal-Eingabeaufforderung auf einem beliebigen aktiven Verzeichnis (gelber Kreis und Pfeil werden zur Hervorhebung hinzugefügt). Sobald die Software geöffnet ist, rufen Sie das Skriptfenster (Umschalten von Taste grün markiert) und öffnen Sie das Skript von der Neutron Scattering Wissenschaftler zur Verfügung gestellt. Folgen Sie den Anweisungen im Skript, das nur erfordern, sollte die Scan Zahlen für jede Probe und Puffer für automatisierte Reduktion in eine Liste eingetragen werden, sowie die Zahlen für die leere Zelle für die Subtraktion und leere Balken für die Übertragung und Strahl zu scannen Zentrum-Bestimmung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Datenanalyse – Plotten von Daten mithilfe von MantidPlot. Daten sind als "Arbeitsbereiche" in MantidPlot referenziert. Der Arbeitsbereich wird mit Dateinamen gefüllt werden, wie durch die Benutzer-Reduktion-Skript erzeugt. Daten zum Arbeitsbereich für 1D Datensätze können geplottet werden, indem im Arbeitsbereich mit der rechten Maustaste und wählen "Plot Spectrum mit Fehlern...". Zusätzliche Daten können durch einfaches Ziehen und ablegen Arbeitsbereiche für die aktuelle Handlung hinzugefügt werden. Formatierung von Plot-Fenster (z. B. Log-Log Grundstücke) kann durch Auswahl "Einstellungen" in der Menüleiste "Ansicht", oder Doppelklicken Sie auf die Achsenbeschriftungen durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9. Datenanalyse – ATSAS Software: Grundoperationen und Puffer Subtraktion. Die Primusqt Anwendung (SAS-Daten-Analyse) bietet Visualisierung für richtige Hintergrundabzug (Puffer). Die Puffer-Datei sollte für die Subtraktion skaliert werden, dass Daten an High-Q überlappen (wo ist Streuung durch verbleibende Signal aus zusammenhanglosen Hintergrund flach). Wenn diese High-Q-Palette von Daten ausgewählt wird, wird die Skalierung einen Skalierungsfaktor der unteren Datendatei in der Tabelle zuweisen, die Überlappung in der definierten Region produziert. Nach dem skalieren kann die Puffer-Datei subtrahiert werden, um das Profil net Streuung des Teilchens nachzugeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10. Datenanalyse – Guinier und fallt (Entfernung Verteilung) Bestimmung. (A) der Primus Guinier-Assistent wird verwendet, um eine Guinier-Analyse durchführen, bietet eine erste Einschätzung von I,0 und Rg. Die Teilchenart und Datenbereich passen werden verwendet, um die Passform zu definieren. Ein Grundstück von der Passform und entsprechenden Residuen sind auf der linken Seite, während Guinier Begriffe gezeigt (ich0 und Rg), Q * Rg Grenzen und Qualität der lineare Anpassung dienen als Ausgabe in der Gegend, geprägt von der orange Box. (B) der Primus Abstand Verteilungskonfigurations-Assistenten wird verwendet, um die Entfernung Verteilungsanalyse durchführen bietet die P(r) Kurve definiert die Wahrscheinlichkeit, dass interatomare Entfernungen innerhalb des Partikels Streuung und beinhaltet das Dmax oder maximum interatomare Distanz. Parameter von der orange Box können systematisch untersucht werden, um eine Verteilungsfunktion der richtige Abstand zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11. Falsche Ergebnisse aus der Distanz Verteilungsanalyse. Eine richtig ausgewählte Dmax sollte eine P(r) Kurve zu produzieren, die Spitzen mit einer allmählichen Zerfall auf NULL. DMAX-Werte, die zu groß sind werden negative P(r) Werte liefern oder Schwingungen in der Nähe der x-Achse bei hohen Werten von r. Dmax-Werte, die oft künstlich klein sind Folge fallt Kurven, wo die obere Grenze abgeschnitten erscheint. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12. Modellierung – Ab-initio -Modell Setup mit dem Assistenten zum Primus Form. Ab-initio Modellierung Parameter sind in einer einzigen Eingabe-Fenster zur Verfügung gestellt. Ein Präfix wird für die Ausgabe-Datei-Namen mit anderen Optionen für die Verarbeitung zur Verfügung geliefert. Glühen Verfahren kann schnell (größere Perlen mit schnellere Abkühlung) oder langsam (kleinere Perlen mit langsamer Kühlung). Anzahl von Wiederholungen sollten ausreichend dimensioniert, Reproduzierbarkeit der Modellelemente zu prüfen sein. Partikel-Symmetrie und Anisometry können bereitgestellt werden, wenn bekannt. Eckige Skala sollte die Einheiten der gemessenen Daten entsprechen. DAMAVER durchschnittlich ausrichten und durchschnittlich alle dummy Atom-Modelle und wenden Sie dann ein Auswahlkriterium die Ausreißer Modelle ausschließt. Ein Kern der festen Atome aus dem gemittelten Modell werden weiter verfeinert mit DAMMIN, wenn diese Option ausgewählt ist. Dieses raffinierte Modell sollte die 3D mit niedriger Auflösung Umschlag des experimentellen SANS Profil darstellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 13
Abbildung 13. Visualisierung – experimentelle SANS Umschlag und Overlay mit hochauflösenden Modell mit PyMOL. Nach der Eröffnung der PDB-Dateien Struktur in PyMOL, Modelle in PyMOL Viewer angezeigt. Aktive Modelle sind in der Tabelle auf der rechten Seite, zusammen mit Aktionsschaltflächen aufgeführt, die verwendet werden können, um das Modell und seine Darstellung zu manipulieren. Grundlegende Operationen dienen zur Visualisierung von diesen Models die Regionen der Vereinbarung (oder Nichtübereinstimmung) zwischen den SANS-Umschlag und hochauflösende Struktur identifiziert werden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1. Physikalische Eigenschaften von Waschmitteln in Membran-Protein-Untersuchungen gebräuchliche. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Strukturbiologie Forscher nutzen Sie ergänzende strukturelle Techniken wie Lösung Streuung, Biochemische und strukturelle Details (z. B. Größe und Form) von Biomolekülen in Lösung zu erhalten. SANS ist eine besonders attraktive Technik zur Bestimmung geringer Auflösung Strukturen von Membranproteinen, ein Schwerpunkt der modernen Strukturbiologie und Biochemie. SANS erfordert Mengen der gereinigten Proteine vergleichbar mit denen von kristallographischen Studien (1 mg/Probe). Die vor kurzem wachsende kommerzielle Verfügbarkeit von hochreinen deuterierte Reinigungsmittel für Membran-Protein-Studien macht zugänglich ein Mittel, um diese Wasserstoff/Deuterium für SANS Experimente der Membran-Protein-Reinigungsmittel-komplexe Inhalte zu manipulieren, so dass das Protein-Signal direkt aufgezeichnet werden. Wenn erfolgreich, kann ein ab-initio -Modell molekularen Umschlag aus Daten, die in nur einigen Stunden berechnet werden. So können Membrane Protein Biochemiker, Biophysiker und strukturbiologen leicht SANS zu begehrten ersten 3D-Modelle der Membranproteine in Lösung, Strukturen im Komplex mit verbindlichen Partner oder Substrate und Modelle erhalten nutzen von SANS werden allmähliche Beugung Daten verwendet. Routinemäßigen Einsatz von SANS Membranproteine charakterisieren würde transformative für das Membran-Protein-Biochemie-Feld und Wellen-Effekte von der Grundstruktur Funktion zur Wirkstoffforschung und -Entwicklung. Der zusätzliche Vorteil des Neutron Kontrast matching mit Deuterium Ersetzung macht SANS eine wertvolle Technik für die Untersuchung von Protein-Protein, Protein-DNA oder anderen biomolekularen-komplexe, die sich in ihrem Wasserstoff/Deuterium Inhalt leicht manipuliert werden können.

Weitere Details zu kleine Winkel Streuung Instrumentendesign und Theorie, werden die folgenden Bewertungen empfohlen: die Bio-SANS Instrument in der High Flux Isotop Reaktor des Oak Ridge National Laboratory,79 kleine Winkel Streuung für Strukturbiologie – Ausbau der Grenze unter Vermeidung der Fallstricke,72 und kleine Winkel zerstreuungsstudien von biologischen Makromolekülen in Lösung. 80 das Neutron Scattering Wissenschaftler können auch aktuelle Instrumentenkonfigurationen und die optimalen Parameter für ein bestimmtes System diskutieren. Daten bei niedriger Q (das ist eine Funktion der Streuung Winkel und Neutron Wellenlänge) ist beispielsweise in der Regel für größere Systeme erwünscht. Die am häufigsten verwendeten Gerätekonfiguration im Bio-SANS bietet ein Qmin von 0,003 Å-1 und eignet sich für größere Proteinkomplexe bis zu Hunderten von kDa. Eine Lösung mit ~ 3 mg mL-1 Membranprotein der ungefähren Größe von 30 kDa (Monomer) im Kontrast angepasst Micellen mit 48,5 % D2O in Lösung erfordert eine typische Messung dauert ca. 8 Stunden für Probe, Puffer und leere Zelle (24 Stunden = 1 Tag insgesamt). Instrument Messzeiten bei bestimmten Kontrast Zustand können je nach Produkt die Streuung Partikel Molekülmasse und Konzentration etwa skaliert werden. Allerdings müssen streuenden Partikeln unter nicht-wechselwirkenden Bedingungen, einschließlich einer unspezifischen Proteinaggregation, stellt eine praktische Obergrenze an der Konzentration der Probe gemessen werden. Einstündige Messungen setzen Grenzen die Stabilität bestimmter Proteine. Glücklicherweise, SANS Messungen kann erfolgen routinemäßig bei gekühlten Temperaturen Protein Lebensdauer zu verbessern, und der Beschäftigte Strahl des Niedrigenergie-Neutronen verursachen keine Strahlungsschäden während der Messung.

Einen Überblick über diesen Prozess und Bestimmung der viele Schlüsselfaktoren zur erfolgreichen Aufnahme der Neutronenstreuung aus einer Stichprobe gemessen an den Kontrast Matchball des Waschmittels präsentieren wir in diesem Manuskript. Dazu gehören den entscheidende Schritt in Richtung Erhalt eine vollständige Übereinstimmung der aggregierten Reinigungsmittel durch eine reinigende Mischung mit einem einheitlichen Neutron Kontrast zwischen dem Waschmittel Kopfgruppe und Alkyl Kette Komponenten entwerfen. Messungen an diesem einzigen Waschmittel Matchball geben ein Streuung Profil nur die Membranprotein des Interesses zugeschrieben und erlaubt einen ab-initio Umschlag, darstellt das Membranprotein aus den Daten rekonstruiert werden. Die Datenanalyse und - ab-initio Protokolle auch Modellierung zeigen den möglichen Informationen auf solche Untersuchungen, die Ziel verfolgt, könnte auf Gesamtstruktur, Konformationsänderungen, Oligomere Staaten, unter anderem. Eine Einschränkung ist, dass bisher nur sehr wenige Reinigungsmittel mit Deuterium Substitutionen im Handel erhältlich sind. 19

Während Perdeuteration möglicherweise nicht notwendig, das Ziel in diesem Fall sollte sein, dass ein Protein mit > 65 % Deuterium Kennzeichnung des Proteins. Alternativ wenn Reinigungsmittel mit selektiv deuterierter Kopfgruppen und Tails ist verfügbar, und der CMP der Waschmittel Micelle tritt in der Nähe von 100 % D2O, dann ausreichender Kontrast aus dem Protein erreicht werden, ohne die Notwendigkeit für die Kennzeichnung von Deuterium. Bestimmen Sie die geeignete Deuterierung des Proteins, ausreichende Streuung gemessen an den Kontrast-Matchball des Waschmittels zu erreichen. Es gibt zahlreiche Herausforderungen im Zusammenhang mit Membran-Protein-Expression und Reinigung,81 , die über den Rahmen dieses Artikels hinaus zu bleiben. Leider sind hohe Deuterierung derzeit (noch) nicht für eukaryotic Systeme möglich. Wir verstehen, dass dies eine Einschränkung für einige eukaryotic Proteine, zwar die meisten Membranproteine bakterielle Orthologe wofür diese Methode geeignet ist.

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Disclosures

Die Autoren Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss und Ryan C. Oliver sind vertraglich durch UT-Battelle mit uns DOE zur Unterstützung der Neutron Science Anwenderprogramm und Bio-SANS Instrument am Oak Ridge National Laboratory in diesem Artikel verwendet.

Diese Handschrift ist von UT-Battelle, LLC, unter Vertrag DE-AC05-00OR22725 mit der uns Department of Energy (DOE) Co-Autor gewesen. Behält sich die US-Regierung und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nicht-ausschließliches, eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder das veröffentlichte Formular dieser Handschrift zu reproduzieren oder zu ermöglichen andere zu tun, für die US-Regierung Zwecke. DOE bieten den Zugang der Öffentlichkeit zu diesen Ergebnissen der vom Bund geförderte Forschung im Einklang mit dem DOE den Zugang der Öffentlichkeit zu planen. 82

Acknowledgments

Das Büro von biologischen und Umweltforschung unterstützt Forschung im ORNL Center für strukturelle Molekularbiologie (CSMB) und Bio-SANS mit Einrichtungen, unterstützt durch die wissenschaftlichen Nutzer Einrichtungen Division, Office Basic Energiewissenschaften, US Department der Energie. Strukturarbeiten am Membranproteine im Labor Lieberman wurde von NIH (DK091357, GM095638) unterstützt und NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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