Summary
カスタムメイド ディス トラクターを使用して開発されたマウス脛骨気晴らし骨形成モデルを提案します。解析対象としてマウスの使用は、研究を推進するため有利です。
Abstract
仮骨延長法 (DO) は、細胞移植なし骨格組織再生を含む外科手術です。行うモデルは、次の 3 つの段階: 骨切り術と外部ディス トラクター; の配置後潜伏段階気晴らし段階前記分離骨端が徐々 にかつ継続的に気を取られて;統合段階。このカスタムメイドの妨害を行うのために使用は、2 つの不完全なアクリル樹脂リングと拡大ネジで構成されます。プロセスは、シリコーン印象材と金型を作るし、カスタムメイドのディス トラクターを作成によって開始されました。歯科用レジン製シリコーン印象材の型枠に注ぎ、カスタムメイドのディス トラクターに必要な不完全な樹脂リングを作成する重合するようになりました。これらのリングは、透明樹脂を用いた拡大ネジで修正されました。この方法で作成したオーダーメイドのディス トラクターは、マウスの脛骨についていた。脛骨を修正しました、近位 25 G 針の 1 つのペアを使用してデバイスに 1 組 27 G 針の遠位, アクリル樹脂。5 日間の待ち時間後気晴らしは 0.2 mm/12 h の速度で開始されました。3.2 mm のギャップの合計で 8 日間、続けた延長します。マウスが気晴らしの後 4 週間を犠牲になった。撮影と組織の両方を使用して気晴らしギャップの骨形成が確認されました。
Introduction
仮骨延長法 (DO) は、様々 な手足の長さの不一致、骨欠損四肢奇形1などの骨格障害の確立された治療方法です。このユニークな治療戦略は、イリザロフによって提案された「緊張ストレスの原理」に基づきます。メソッドでは、成熟した骨が形成された2になるまで、待機時間、アクティブな気晴らしのため数週間、統合の数ヶ月の数日が必要です。
血流3,4機械的刺激5,6の閉塞のためにローカル低酸素の条件は、かの治癒過程で特に重要です。低酸素血症による血管新生は、酸素、栄養素、可溶性因子、血流を介してローカル組織の修復に必要な細胞を運ぶ。拡張操作による機械的刺激は、間葉系幹細胞、骨の形成、石灰化、改造の分化などの生物学的反応を引き起こします。シリアルの行う治療は、硬組織だけでなく、神経、筋肉、血管、および幹細胞移植を必要とせず、皮膚組織などの軟組織の形成を可能します。したがってはモデルは、さまざまな組織の再生を分析するための優れたモデルであると見なされます。
ウサギと犬は、DO の基本的な研究の最も広く使用される動物しかし、これらの動物に使用できるほとんどの解析ツールがありません。マウスはモデルの使用より詳細な分析を促進します。ノックアウト マウスを用いた実験に特に適しています。ただし、実験動物としてマウスを使用する場合、拡張デバイスを作成する必要があります。ここでは、現在マウス脛骨を行うモデルを開発した技工ツール以前の研究で使用されている手法を使用して作成されたカスタム メード ディス トラクターを使用します。
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Protocol
動物のケアと当院の利用委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。手続きの前にすべての器具を滅菌します。
1. 金型のカスタムメイドの妨害を作成するための準備
- 2 不完全なリング (外径 20 mm; 内径 10 mm)、パラフィン ワックス (145 mm × 74 mm) の 1 つのシートでのエヴァンス ワックス彫刻家を使用しての妨害の一部であるを確認します。
- 同じ作品の 4 を作る。ガスバーナーで加熱したワックス ヘラを使用します。厚さの 5 mm. 拡大ネジや針、8 mm × 2 mm、エバンス ワックスの彫刻家 (図 1 a、1 b) にそれぞれ 5 mm × 2 mm のための提供するスペースの 4 つのリングをスタックします。
- シリコーン印象材でワックス パターンを埋め込み、樹脂リング (図 1C) のための金型を作成します。
- シリコーン印象材 (室温で約 5 分) を硬化後のワックス パターンを削除します。
2. オーダーメイドのディス トラクターの生産
- シリコーン型に薄く、均等に石油ゼリーを適用します。重合レジンの 3 g を混ぜるし、すぐにシリコーン型にそれを注ぐ。室温 (RT) で 5 分に設定します。
- 重合樹脂リングを金型から外し、超硬バーと (約 1 分) のバリ除去する歯科用マイクロモータ ポーランド語。2 つの樹脂リング各特注ディス トラクターに必要です。
- 樹脂リング (図 1D) の必要な数を作成する手順を繰り返します。
- ユーティリティ ワックスと樹脂リングを修正し、透明樹脂で完全に拡大ネジの外側を保護する約 2 mm のギャップを残します。室温 5 分樹脂を設定します。重合が完了したら、拡張ねじノブ (図 1E) を削除します。
3. 外科手術
- 8 週齢雄マウスを使用します。
- メデトミジン塩酸 0.3 mg/g で、4 mg/kg、ミダゾラム、5 mg/kg 体重でブトルファノール酒石酸の腹腔内注射で麻酔を誘導します。
- 慎重に剃ると 10% のヨード、外科領域で消毒して、右下肢で 0.5% リドカイン塩酸塩を管理.
- 縦切開 (長さ約 15 mm) 右の第 15 メスで足を下げるを作る。にべもなく骨膜のすべてを削除しないように注意して、基になる筋肉を区切ります。腓骨に容易に達するために外側からのアプローチします。腓骨をハサミでカットします。
- 狭いの薄い滅菌ピンセットで足首をつかみ、かかとから約 5 mm の骨に穴を作るため滅菌 27 G 針を使用します。針は、皮膚、骨と順に皮膚浸透する必要があります。針が浸透し、針が約 15 mm、ニッパーでチップと根をカットします。
- 同様に、2-3 mm 程度の近位の別の穴を作る。足首周りを保持し、同じように膝から下の 2 つの 25 G 針を渡します。針を貫通後、ニッパー (図 1F) でのヒントを根をカットします。
- 延長方向に平行になるよう、カスタムメイドのディス トラクターを配置します。針とデバイスをデバイスの溝を埋めるに十分な重合レジンで固定します。重合 (約 5 分) を完了するを待つ (図 1G)。
- 周囲の組織を損傷しないように注意します。食塩 (1-2 mL) を適用している間非常に薄い切削ディスクを使用して脛骨の骨幹の中央をカットします。
- 4-0 ナイロン縫合糸で傷口を閉じます。
- 操作後すぐに鎮痛のためブプレノルフィン 0.1 mg/kg の皮下注射を与えます。ブプレノルフィン術後 7、必要に応じてその後を介してすべての 12 h を続行します。
4. 気晴らしプロトコル
注: 遅延期間と気晴らし率に様々 な報告がありますが、ここでは、代表的なプロトコルが表示されます。
- 5 日間の待ち時間後、速度 0.2 mm/12 h で気晴らしを開始します。拡張機能の急速な拡大ネジに接続されているピンを使用します。拡張子ネジ (図 1E) に接続されている黄色の矢印の方向にピンを移動します。
- 麻酔は、拡張機能の中には必要ではありません。小指と手のひら、尾を押し、人差し指と親指で拡張デバイスを修正します。
- (1/4 回転で 0.2 mm) の拡張子を実行します。3.2 mm のギャップの合計になります 8 日延長を続けます。
5. 分析
- 撮影解析: 拡張の完了後、2.0% イソフルランを用いた全身麻酔下で腹部の骨再生を評価します。
注: 拡張デバイスの位置に関して注意しましたが、簡単な撮影と接続されているデバイスをも評価することが可能。 - 組織学的解析: 装置を慎重に削除サンプリング中に破壊気晴らしサイトが生じないようにします。室温で 24 時間 10% 中性緩衝ホルマリンでサンプルを修正します。4 ° C で一晩モースのソリューション (クエン酸ナトリウム 10%、20% ギ酸) とめし
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Representative Results
図 1 aおよび1 bは、パラフィン ワックスと不完全なリング (外側直径、20 mm 内側直径、10 mm; 厚み 5 mm) を提示します。シリコーン印象材に埋め込まれた 2 つのワックス パターンと樹脂リング (図 1C) の型が形成されました。重合樹脂はこの金型を投入した直後に、樹脂リング (図 1D) が得られました。カスタムメイド ディス トラクターは、2 つの樹脂リングと拡大ネジ (図 1E) を組み合わせることによって作成されました。図 2Aモデルで気晴らしの後 4 週間で典型的な撮影結果を提示します。新たに形成された骨は、気晴らしのサイトで観察されました。図 2Bは、ヘマトキシリンとエオシン染色の結果を示します。新たに形成された骨架橋を観察し、新たに形成された骨は、ネイティブの骨から簡単に区別すること。術中骨折やこの実験で使った 5 マウスにおける術後感染症はありませんでした。
図 1: カスタムメイド ディストラクタ。(A, B)リングのおおよその寸法は次のとおりです: 外径、20 の mm;内径 10 mm厚み 5 mm。拡大ネジ (白い矢印) と針 (黒矢印) のためのスペースを確保します。(C) シリコーン印象材に埋め込まれたワックス パターン。(D) 完成品樹脂リング。(E) 2 つの樹脂リングと拡大ネジは、樹脂で保護されます。(F) 4 本の針は、脛骨の近位および遠位骨幹端に挿入されます。(G) 気晴らしデバイス マウス肢内に配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 放射線学的および組織学的所見です。(A) には行えた、新たに形成された骨は気晴らしの後 4 週間を観察。(B) 組織学的ギャップでいっぱいです新しく骨を形成 (スケールバー = 500 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
大型動物実験モデルとして使用する場合既製拡張デバイスを使用できますと良い固定を取得し、拡張操作自体と拡張量評価に簡単です。ただし、マウスを実験モデルとして使用する場合は、いくつかまたはすべての装置を開発する必要は。Isefukuらとテイらデバイス、マウス モデル7、8を作成します。Carvahjoらは、既製の拡張デバイスの固定を含む方式を採用 (ディス トラクターを追跡: KLS マーティン) 合を持つワイヤー9。マウスはモデル拡張デバイスの既存の製品を使用して、固定方法を工夫することを作成することもできます。このアプローチは、拡張デバイスを製造し、拡張子を実行拡張する容量を評価する簡単になります。また、脛骨の分節欠陥モデルは、同じデバイスを使用して作成される可能性が期待されます。また、欠陥の長さは 0.2 mm の段階で調整することができます、したがって、デバイスが汎用性であると見なされます。
このような実験では、脛骨を通して針を糸に技術的に困難です。特に、脛骨遠位部の直径が小さいと 2 本の針を渡すいくつかのトレーニングが必要です。十分な骨が示されていない場合、良好な固定性が得られるかどうかを確認する必要です。良い固定を得るために針7,8間針をできるだけ広く隙間と角度で通過すると良いことがあります。さらに、治癒率、治癒過程における組織学を変更すると骨切り術法によると、特定の方法の手順を実行する必要は。
実験動物のサイズは、この実験の制限要因として考慮することができます。マウスが大きい場合、問題がないです。しかし、それが小さすぎる、手術そのものは可能かもしれない。以前は、4 週齢のマウスを使用し、任意問題10なく実験を行うことができました。評価期間について、拡張デバイスは、骨を切断した後 42 日まで問題なくインストールでした。しかし、それ以上の観察は行われていないと追加研究が必要、将来的に。合併症の発生実験を進むと問題になる可能性があります。約 30 のうち 1 マウスで手術中に骨折があります。同様に、約 30 のうち 1 マウスで術後創感染があります。
結論としては、カスタムメイド ディス トラクターを使用して開発されたマウス脛骨を行うモデルを提案します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、この研究を完了するための励ましを提供するため加藤真紀子さんをありがとうございます。マウスの住宅の実験動物部門と医療工学研究、名古屋大学大学院医学部、また感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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