Summary
We presenteren een muismodel van tibiale afleiding osteogenesis ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte afleider. Het gebruik van een muis als een doel van de analyse is gunstig voor de bevordering van onderzoek.
Abstract
Afleiding osteogenesis (DO) is een chirurgische ingreep dat skeletale tissue regeneratie zonder cel transplantatie. Een-model bestaat uit de volgende drie fasen: de fase van de latentie na osteotomie en plaatsing van de externe afleider; de afleiding fase, waarin de gescheiden bot eindigt geleidelijk en continu afgeleid; en de consolidatiefase. Deze op maat gemaakte afleider gebruikt voor DO bestaat uit twee onvolledige acryl hars ringen en een schroef van de uitbreiding. Het proces werd ingeleid door een schimmel met siliconen indruk materiaal maken en vervolgens de op maat gemaakte afleider te maken. Tandheelkundige hars werd gegoten in de bekisting gemaakt van siliconen indruk materiaal, en het was toegestaan om te polymeriseren tot de onvolledige hars ringen nodig zijn voor de op maat gemaakte afleider. Deze ringen waren vast met een schroef van de uitbreiding met behulp van transparante hars. De op maat gemaakte afleider gemaakt via deze aanpak werd vastgemaakt aan het scheenbeen van muizen. Het scheenbeen was bevestigd aan het apparaat met behulp van een paar van 25 G naalden proximally, één paar 27 G naalden distally, en acryl hars. Na een latentieperiode van 5 dagen, werd de afleiding ingeleid tegen een tarief van 0,2 mm/12 h. De verlenging werd voortgezet gedurende 8 dagen, wat resulteert in een totale kloof van 3.2 mm. De muizen werden opgeofferd 4 weken na afleiding. Biomineralisatie in de afleiding kloof werd bevestigd met behulp van zowel radiografie en histologie.
Introduction
Afleiding osteogenesis (DO) is een gevestigde behandelingsmethode voor een verscheidenheid van skeletale aandoeningen, zoals de ledematen lengte verschillen, bot gebreken en ledematen misvormingen1. Deze unieke behandeling strategie is gebaseerd op het "beginsel van de spanning-stress" voorgesteld door Ilizarov. De methode vereist enkele dagen voor de latency, enkele weken voor actieve afleiding en enkele maanden voor consolidatie totdat het volwassen bot gevormd2.
De plaatselijke hypoxische omstandigheden als gevolg van de blokkade van de bloed stroom3,4 en mechanische stimulatie5,6 zijn bijzonder belangrijk in het genezingsproces van. Hypoxie-geïnduceerde angiogenese draagt cellen nodig voor weefselherstel lokaal via de bloedstroom, zuurstof, voedingsstoffen en oplosbare factoren. Mechanische stimulatie door uitbreiding werking zorgt ervoor dat biologische reacties zoals differentiatie van mesenchymale stamcellen, biomineralisatie, verkalking en remodeling. Seriële behandeling kan de vorming van niet alleen de harde weefsels, maar ook de zachte weefsels, met inbegrip van zenuwen, spieren en bloedvaten huid weefsels, zonder de noodzaak voor stamceltransplantatie. Daarom is een-model wordt gezien als een uitstekend model voor het analyseren van de regeneratie van verschillende weefsels.
Honden en konijnen zijn de meest gebruikte dieren in fundamenteel onderzoek voor DO; Er zijn echter enkele analysetools beschikbaar voor deze dieren. Het gebruik van een muismodel vergemakkelijkt een meer gedetailleerde analyse. Het is met name geschikt voor experimenten met behulp van knock-out muizen. Echter, wanneer u een muis als een proefdieren, een extensie-apparaat moet worden gemaakt. Hier ontwikkeld presenteren wij onze een muis tibiale model met behulp van een op maat gemaakte afleider gemaakt met behulp van een tandheelkundig laboratorium tool en techniek, die is gebruikt in een eerdere studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van onze instelling. Steriliseren alle instrumenten vóór de ingreep.
1. bereiding van een mal voor het maken van de op maat gemaakte afleider
- Maak twee onvolledige ringen (buitendiameter, 20 mm, binnendiameter, 10 mm), die deel van de distractor, met een vel papier van paraffine (145 x 74 mm uitmaken) met behulp van een Evans wax carver.
- Maak 4 van dezelfde stukken. Gebruik een spatel-wax verwarmd met een gasbrander. Stapel de vier ringen voor een dikte van 5 mm. Geef ruimte voor expansie schroef en naald 8 x 2 mm, 5 x 2 mm respectievelijk met de Evans wax carver (figuren 1A, 1B).
- Insluiten wax patronen in het materiaal van siliconen indruk en het maken van een mal voor de hars ringen (Figuur 1C).
- Na het uitharden van het silicone indruk materiaal (ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur), verwijder de wax patronen.
2. productie van de op maat gemaakte afleider
- Solliciteer vaseline dun en gelijkmatig aan de siliconen mal. Meng 3 g polymerisatie tandheelkundige hars en giet het onmiddellijk in de siliconen mal. Instellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de gepolymeriseerde hars-ring van de schimmel en het Pools met een hardmetalen bar en een tandheelkundige micromotor te verwijderen van de burr (ongeveer 1 minuut). Twee hars ringen zijn vereist voor elke custom-made afleider.
- Herhaal de procedure voor het maken van het vereiste aantal hars ringen (Figuur 1D).
- Laat een kloof van ongeveer 2 mm te lossen de hars ringen met hulpprogramma wax en beveiligen van de buitenkant van de schroef van de uitbreiding volledig met transparante hars. De hars voor 5 min vastgesteldop RT. Als polymerisatie voltooid is, verwijdert u de knop schroef expansie (Figuur 1E).
3. chirurgische Protocol
- Gebruik 8 week-oude mannelijke muizen.
- Induceren verdoving met een intraperitoneale injectie van medetomidine hydrochloride op 0,3 mg/g, midazolam bij 4 mg/kg en Butorfanol tartraat bij 5 mg/kg lichaamsgewicht.
- Zorgvuldig scheren en desinfecteren van het chirurgische gebied met 10% jodiumoplossing en vervolgens beheren 0,5% lidocaïne hydrochloride op rechts onderste extremiteit.
- Het maken van een longitudinale huid incisie (ongeveer 15 mm lengte) aan de rechterkant lager been met een scalpel No. 15. Ronduit scheiden de onderliggende spieren, verzorgen niet om alle te verwijderen van het beenvlies. Benadering van buitenaf te gemakkelijk bereiken de fibula. Snijd de broche met een schaar.
- Pak de enkel met een smalle dunne steriele Tang, en gebruik een steriele 27 G naald om een gaatje te maken in het been ongeveer 5 mm van de hiel. De naald moet doordringen in de huid, bot en huid in die volgorde. Wanneer de naald doordringt, snijd het uiteinde en de wortel met een nipper, zodat de naald is ongeveer 15 millimeter.
- Maak een ander gat op dezelfde wijze, ongeveer 2-3 mm proximale. Houd rond de enkel en twee 25 G naalden onder de knie doorgeven op dezelfde manier. Nadat de naalden doordringen, snij de uiteinden en de wortels met een nipper (Figuur 1F).
- Plaats de op maat gemaakte afleider zodanig dat er parallel aan de uitbreiding richting. Het herstellen van de naalden en het apparaat met genoeg polymerisatie tandheelkundige hars te vullen van de groeven van het apparaat. Wachten voor de polymerisatie voltooid (ongeveer 5 min) (Figuur 1G).
- Wees voorzichtig niet te beschadigen de omliggende weefsels. Snijd het midden van de diaphysis van de tibia met behulp van een schijf erg dun snijden tijdens het toepassen van een zoutoplossing (1-2 mL).
- Sluit de wond met een 4-0 nylon hechtdraad.
- Subcutane injecties van buprenorfine (0,1 mg/kg) voor analgesie geven onmiddellijk na de operatie. Buprenorfine elke 12 h tot postoperatieve dag 7 en zo nodig daarna blijven.
4. afleiding Protocol
Opmerking: Er zijn verschillende rapporten over de latency periode en afleiding tarief, maar hier, representatieve protocollen worden weergegeven.
- Na een latentieperiode van 5 dagen, beginnen afleiding tegen een tarief van 0,2 mm/12 h. Voor uitbreiding, door de pincode gekoppeld aan de snelle expansie schroef te gebruiken. Verplaats de pin in de richting van de gele pijl gekoppeld aan de extensie schroef (Figuur 1E).
- Verdoving is niet nodig tijdens uitbreiding. Houd de staart met de kleine vinger en palm en repareren van de uitbreiding-apparaat met de wijsvinger en de duim.
- Uitbreiding (0.2 mm voor 1/4 turn) uitvoeren. Blijven verlengen voor 8 dagen, die in een totale verschil van 3.2 mm resulteren zal.
5. analyse
- Radiografie analyse: na voltooiing van de uitbreiding, bot regeneratie met computertomografie onder narcose te evalueren met behulp van 2,0% Isofluraan.
Opmerking: Als zorgvuldigheid heeft betracht ten aanzien van de stand van de inrichting van de uitbreiding, is het mogelijk te evalueren met eenvoudige radiografie zelfs met het apparaat is aangesloten. - Histologische analyse: zorgvuldig verwijderen van het apparaat dus niet te leiden tot een breuk afleiding site gedurende de bemonstering. Corrigeer het monster in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Decalcify met Morse oplossing (Natriumcitraat 10%, 20% mierenzuur) 's nachts bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuren 1A en 1B presenteren onvolledig ringen (buitenste diameter, 20 mm binnen diameter, 10 mm; dikte, 5 mm) met paraffine. Twee wax patronen werden ingesloten in silicone indruk materiaal, en een schimmel voor de hars ringen (Figuur 1C) werd gevormd. Gepolymeriseerde hars werd onmiddellijk gegoten in deze mal en hars ringen werden verkregen (Figuur 1D). Een op maat gemaakte afleider is gemaakt door een combinatie van twee hars ringen en een expansie schroef (Figuur 1E). Figuur 2 A typische radiografie bevindingen presenteert op 4 weken na afleiding in het model. Nieuw gevormde bot werd waargenomen op de site van afleiding. Figuur 2B presenteert de haematoxyline en eosine-kleuring resultaten. Een nieuw gevormde bot brug werd waargenomen en het nieuw gevormde bot kan gemakkelijk worden onderscheiden van het oorspronkelijke bot. Er was geen intraoperatieve fractuur of postoperatieve infectie in de 5 muizen gebruikt in dit experiment.
Figuur 1 : Op maat gemaakte afleider. (A, B) De geschatte afmetingen van de ring zijn als volgt: buitendiameter, 20 mm; Binnendiameter, 10 mm; dikte 5 mm. De ruimten voor de uitbreiding schroef (witte pijlpunt) en de naald (zwarte pijlpunt) zijn beveiligd. (C) Wax patroon ingebed in het materiaal van siliconen indruk. (D) voltooid hars ringen. (E) de twee hars ringen en de schroef van de uitbreiding worden beveiligd met hars. (F) vier naalden worden ingevoegd in de proximale en distale metaphysis van het scheenbeen. (G) afleiding apparaat geplaatst in de ledematen van de muis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Radiologische en histologische bevindingen. (A) radiologisch, nieuw gevormde bot wordt waargenomen 4 weken na afleiding. (B) histologisch, de kloof is gevuld met nieuw gevormde bot (schaal bar = 500 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wanneer een groot dier wordt gebruikt als een experimenteel model, een kant en klare extensie-apparaat kan worden gebruikt, en het is gemakkelijk te verkrijgen van goede fixatie en beoordelen de werking van de uitbreiding zelf en het bedrag van de uitbreiding. Wanneer een muis wordt gebruikt als een experimenteel model, is het echter nodig zijn om sommige of alle van de apparatuur. Isefuku et al. Tay et al. het apparaat gemaakt en gemaakt van een muis model7,8. Carvahjo et al. aangenomen een methode waarbij fixatie van een kant en klare expansie-apparaat (afleider bijhouden: KLS Martin) met een ligatuur draad9. We kunnen ook een muismodel doen gebruikend bestaande producten voor extensie apparaten en het bedenken van een methode fixatie maken. Deze aanpak zou maken het gemakkelijk om de vervaardiging van het apparaat van de uitbreiding, uitbreiding uitvoeren en beoordelen van het bedrag van de uitbreiding. Bovendien wordt verwacht dat een tibiale regiogebonden defect-model kan worden gemaakt met behulp van hetzelfde apparaat. Bovendien, de lengte van het defect instelbaar in stappen van 0,2 mm, en dus, het apparaat wordt beschouwd als veelzijdig.
In een dergelijk experiment is het technisch moeilijk draad van de naald door het scheenbeen. In het bijzonder, de diameter van het distale deel van het scheenbeen is klein, en sommige opleiding is vereist om door te geven van twee naalden. Als voldoende bot niet wordt opgemerkt, is het noodzakelijk om te controleren of er goede fixatie wordt verkregen. Met het oog op een goede fixatie, is het wellicht beter om de naalden in een hoek en met een zo ruim mogelijke opening tussen de naalden7,8. Bovendien, als de snelheid van genezing en de histologie tijdens genezing volgens de methode van osteotomie veranderen zou, is het nodig voor het uitvoeren van de procedure op een bepaalde manier.
De grootte van de proefdieren kan worden beschouwd als een beperkende factor van dit experiment. Er zijn geen problemen wanneer de muis groot is; echter, als het te klein, chirurgie zelf niet mogelijk. Eerder we gebruikt 4-week-oude muizen en waren in staat om uit te voeren van de experimenten zonder enige problemen10. Ten aanzien van de evaluatieperiode, kunnen extensie apparaten worden geïnstalleerd zonder problemen tot 42 dagen na het snijden van het bot. Als verdere opmerkingen niet gemaakt werden, is aanvullend onderzoek echter nodig in de toekomst. Het voorkomen van complicaties wellicht een probleem wanneer bevordering van experimenten. Breuk tijdens de operatie kan optreden bij ongeveer 1 van de 30 muizen. Postoperatieve wondinfectie kan ook optreden bij ongeveer 1 van de 30 muizen.
Tot slot voorgesteld hebben we een tibiale muismodel ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte afleider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Ms. Makiko Kato voor het verstrekken van aanmoediging voor het voltooien van deze studie. Wij danken ook de verdeling van de proefdieren en medische onderzoek Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, voor de huisvesting van muizen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
