Summary
我们提出了一个小鼠胫骨牵张成骨模型开发使用定制的牵引器。利用鼠标作为分析目标, 有利于推进研究。
Abstract
牵张成骨 (do) 是一种无需细胞移植的骨骼组织再生的外科手术。do 模型由以下三个阶段组成: 截骨术后的潜伏期和外部牵引器的放置;分散的阶段, 其中分离的骨端是逐渐和持续的分心;和整合阶段。这种定制的干扰器用于 do 是由两个不完整的丙烯酸树脂环和一个膨胀螺丝。这个过程是通过制造硅胶印模材料, 然后创建定制的牵引器开始的。将牙科树脂倒入硅胶印模材料的模板中, 并允许聚合, 以创建定制的分散体所需的不完整树脂环。这些环是用透明树脂的膨胀螺钉固定的。通过这种方法创建的定制干扰器附着在小鼠胫骨上。胫骨固定在设备上, 近端使用一对 25 g 针, 远端一双 27 g 针, 并使用丙烯酸树脂固定。经过5天的潜伏期, 以 0.2 mm 12h 的速度启动了干扰。延长了 8天, 总间隙为3.2 毫米。老鼠在分心4周后被牺牲。通过影像学和组织学方法证实了牵张间隙的骨形成。
Introduction
牵张成骨术 (do) 是一种既定的治疗方法, 治疗各种骨骼疾病, 如肢体长度差异、骨缺损和肢体畸形1。这种独特的治疗策略是基于 ilizarov 提出的 "紧张应激原理"。这种方法需要几天的延迟, 几个星期的主动分心, 和几个月的巩固, 直到成熟的骨骼形成2。
由于血流量堵塞3、4和机械刺激5, 6 引起的局部缺氧条件在 do 的愈合过程中尤为重要。低氧诱导的血管生成携带氧气、营养物质、可溶性因子和细胞, 这些都是组织通过血液流动局部修复所必需的。通过扩展操作进行机械刺激会引起生物反应, 如骨髓间充质干细胞的分化、骨的形成、钙化和重塑。串行 do 治疗不仅可以形成硬组织, 还可以形成软组织, 包括神经、肌肉、血管和皮肤组织, 而不需要干细胞移植。因此, do 模型被认为是分析各种组织再生的一个很好的模型。
兔子和狗是在基础研究中最广泛使用的动物 do;然而, 很少有分析工具可用于这些动物。鼠标 do 模型的使用有助于进行更详细的分析。它特别适用于使用敲除小鼠的实验。然而, 当使用鼠标作为实验动物时, 应创建一个扩展装置。在这里, 我们提出了一个小鼠胫骨 do 模型开发使用定制的牵引器创建使用牙科实验室工具和技术, 这已在以前的研究中使用。
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Protocol
所有实验都是根据本机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。在手术前对所有仪器进行消毒。
1. 创建定制分散体的模具的准备
- 制作两个不完整的圆环 (外径, 20 毫米; 内径, 10 毫米), 这是干扰器的一部分, 与一页石蜡 (145 毫米 x 74 毫米) 使用埃文斯蜡雕刻机。
- 做4个相同的部分。使用用燃气燃烧器加热的蜡铲。将四个环堆叠在一起, 厚度为5毫米. 为膨胀螺钉和针头提供空间, 分别为8毫米 x 2 毫米和5毫米 x 2 毫米与埃文斯蜡雕刻机 (图 1 a, 1b)。
- 在硅胶印模材料中嵌入蜡图案, 并为树脂环创建一个模具 (图 1c)。
- 固化后的硅胶印模材料 (室温下大约 5分钟), 去除蜡图案。
2. 定制牵引器的生产
- 将石油果冻稀薄均匀地涂在硅胶模具上。将3克聚合牙科树脂混合, 立即将其倒入硅胶模具中。室温 (rt) 可设置为5分钟。
- 从模具中取出聚合树脂环, 用硬质合金棒和牙科微电机抛光, 以去除毛刺 (约 1分钟)。每个定制的牵引器都需要两个树脂环。
- 重复此过程以创建所需数量的树脂环 (图 1d)。
- 留下约2毫米的间隙, 用实用蜡固定树脂环, 并用透明树脂完全固定膨胀螺钉的外部。将树脂设置为5分钟。聚合完成后, 卸下膨胀螺钉旋钮 (图 1e)。
3. 手术协议
- 使用8周大的雄性小鼠。
- 以 0.3 mgp 的腹腔注射盐酸美替胺, 在 4 mg/kg 时注射盐酸美托米定, 并以体重 5 mgkg 的速度注射酒石酸丁胺和酒石酸丁胺。
- 小心地刮胡子和消毒手术区域用10% 的碘溶液, 然后, 在右下肢服用0.5% 的盐酸利多卡因。
- 用15刀在右小腿做一个纵向皮肤切口 (长约15毫米)。清楚地分离基础肌肉, 注意不要删除所有的骨膜。从外面靠近, 很容易到达腓骨。用剪刀剪断腓骨。
- 用狭窄的薄型无菌钳抓住脚踝, 用无菌的27g 针在离脚后跟约5毫米的骨头上打一个洞。针头应该按这个顺序穿透皮肤、骨头和皮肤。当针头穿透时, 用钳子切割尖端和根部, 使针头约为15毫米。
- 以同样的方式制造另一个孔, 近端约2-3 毫米。抓住脚踝, 以同样的方式在膝盖下传递两个 25 g 针。针头穿透后, 用钳子切割尖端和根部 (图 1f)。
- 放置定制的干扰器, 使其与扩展方向平行。用足够的聚合牙科树脂固定针头和设备, 以填充设备的凹槽。等待聚合完成 (约 5分钟) (图 1g)。
- 注意不要损坏周围的组织。使用非常薄的切割盘切割胫骨的中间, 同时使用盐水溶液 (1-2 ml)。
- 用4-0 尼龙缝合线缝合伤口。
- 在手术后立即注射丁丙诺非 (0.1 mg/kg) 进行镇痛。在术后第7天每12小时继续丁丙诺非, 并根据需要在术后继续。
4. 分散注意力议定书
注: 有关于延迟时间和干扰率的各种报告, 但这里显示了具有代表性的协议。
- 经过5天的延迟期后, 以 0.2 mm 12h 的速度开始分散注意力。对于扩展, 请使用连接到快速膨胀螺钉上的引脚。向连接到扩展螺钉的黄色箭头方向移动引脚 (图 1e)。
- 在伸展过程中不需要麻醉。用小手指和手掌握住尾巴, 用食指和拇指固定延伸装置。
- 执行延长 (0.2 毫米为一个回合)。继续加长 8天, 这将导致总间隙3.2 毫米。
5. 分析
- 影像学分析: 延长完成后, 使用2.0% 异氟烷, 用计算机断层扫描评估全身麻醉下的骨再生。
注: 如果已注意扩展设备的位置, 即使连接设备, 也可以使用简单的放射成像对其进行评估。 - 组织学分析: 小心取出仪器, 以免在取样过程中造成骨折干扰部位。将样品固定在10% 中性缓冲福尔沙林中, 在室温下固定24小时。在4°c 下与莫尔斯溶液 (10% 柠檬酸钠, 20% 甲酸) 在4°c 下过夜进行分解。
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Representative Results
图 1 a 和1b显示不完整环 (外径, 20 毫米; 内径, 10 毫米; 厚度, 5 毫米) 与石蜡。在硅胶印模材料中嵌入了两种蜡图案, 形成了树脂环的模具 (图 1c)。聚合物树脂立即倒入该模具中, 并获得树脂环 (图 1d)。通过将两个树脂环和一个膨胀螺钉结合在一起, 创建了一个定制的牵引器 (图 1e)。图 2一个提出了典型的放射检查发现后4周分心的模型。在分散注意力的部位观察到新形成的骨头。图 2b 显示了血红素和 eosin 染色结果。观察到新形成的骨桥, 新形成的骨很容易与原生骨区分开来。本实验中使用的5只小鼠均未发生术中骨折或术后感染。
图 1: 定制的干扰器.(a、b)圆环的近似尺寸如下: 外径, 20 毫米;内径, 10 毫米;厚度, 5 毫米。膨胀螺钉 (白色箭头) 和针 (黑色箭头) 的空间是固定的。(c) 蜡图案嵌入硅胶印模材料中。(d) 已完成的树脂环。(e) 两个树脂环和膨胀螺钉用树脂固定。(f) 将四针插入胫骨的近端和远端形而上学中。(g) 放置在小鼠肢体内的分散装置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 放射学和组织学发现.(a) 放射学上, 新形成的骨骼在分散注意力后4周被观察到。(b) 组织学上, 缝隙是由新形成的骨头 (刻度杆 = 500μm) 填充。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
当大型动物被用作实验模型时, 可以使用现成的延伸装置, 很容易获得良好的固定, 并对延伸手术本身和延伸量进行评估。然而, 当鼠标被用作实验模型时, 有必要开发部分或全部设备。Isefuku等人和 tay等人制造了这个装置, 并制作了一个 7,8的鼠标模型。carvahjo等人采用了一种方法, 将现成的扩张装置 (轨道干扰器: kls martin) 固定在一根结扎线9 上。我们还可以使用现有产品的扩展设备创建鼠标 do 模型, 并设计固定方法。这种方法可以方便地制造扩展设备、执行扩展和评估扩展量。此外, 预计可以使用相同的设备创建胫骨节段缺陷模型。此外, 缺陷的长度可以调整0.2 毫米的步骤, 因此, 该设备被认为是多功能的。
在这样的实验中, 在技术上很难将针头穿过胫骨。特别是胫骨远端部分的直径很小, 需要进行一些训练才能通过两针。如果没有注意到足够的骨头, 有必要检查是否获得了良好的固定。为了获得良好的固定, 最好是以一定的角度传递针头, 并在针头7、8 之间尽可能宽的缝隙。此外, 由于愈合率和愈合过程中的组织学会根据截骨术的方法发生变化, 因此有必要以一定的方式进行手术。
实验动物的大小可以被认为是这个实验的一个限制因素。当鼠标较大时, 没有任何问题; 当鼠标较大时, 没有任何问题。然而, 如果它太小, 手术本身可能是不可能的。以前, 我们使用4周大的老鼠, 能够进行实验, 没有任何问题10。关于评估期, 延长装置可以安装, 没有问题, 直到切割骨头后42天。然而, 由于没有提出进一步的意见, 今后有必要进行更多的研究。在推进实验时, 并发症的发生可能是一个问题。手术中可能发生骨折, 大约30只小鼠中有1只。同样, 大约30只小鼠中大约有1只可能发生术后伤口感染。
最后, 我们提出了一个使用定制的牵引器开发的小鼠胫骨 do 模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提交人感谢 makiko kato 女士为完成这项研究提供的鼓励。我们还感谢名古屋大学医学研究生院实验动物和医学研究工程系为小鼠提供住房。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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